ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM Colletotrichum GÂY BỆNH HÉO ĐEN ĐẦU LÁ TRÊN CÂY CAO SU

Đề tài “Định danh và nghiên cứu đa dạng di truyền một số mẫu phân lập nấm Colletotrichum trên cây cao su” được thực hiện tại viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại học Nông L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM Colletotrichum

GÂY BỆNH HÉO ĐEN ĐẦU LÁ

TRÊN CÂY CAO SU

Sinh viên thực hiện : CAO NGỌC HẢI

Tháng 7/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM Colletotrichum

GÂY BỆNH HÉO ĐEN ĐẦU LÁ

TRÊN CÂY CAO SU

ThS BÙI ĐÌNH NINH

Tháng 7/2012

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP HCM, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

PGS.TS Lê Đình Đôn và Th.S Bùi Đình Ninh đã tận tình hướng đã hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này

KS Mai Thị Thúy Kiều tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời thực hiện khóa luận

Các bạn lớp DH08SH luôn bên tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực tập và hoàn thành khóa luận

Gia đình đã sinh thành, nuôi dưỡng và ủng hộ tôi học tập cho đến ngày hôm nay

ii

TÓM TẮT

Bệnh héo đen đầu lá gây ra bởi nấm Colletotrichum là một trong những bệnh

gây hại nghiêm trọng trên cây cao su Hằng năm bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành cao

su Các biện pháp hóa học đã được áp dụng để xử lý nhưng gây tác động xấu đến môi trường, ngoài ra cũng gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế Kiểm soát bệnh bằng di truyền là phương pháp được hi vọng sẽ mang lại kết quả tốt hơn

Đề tài “Định danh và nghiên cứu đa dạng di truyền một số mẫu phân lập nấm

Colletotrichum trên cây cao su” được thực hiện tại viện Công Nghệ Sinh Học và Môi

Trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí minh nhằm định danh và đánh

giá đa dạng di truyền một số dòng nấm Colletotrichum gây ra trên cây cao su, để từ đó

kiểm soát có hiệu quả bệnh do nấm này gây ra

Tiến hành phân lập, nhân sinh khối các dòng nấm Colletotrichum, ly trích

DNA, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các vùng gen: ITS - RNA; Partial actin; tubulin; Calmodulin; Glutamine synthetase và Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase Sử dụng chương trình BLAST trên NCBI để so sánh các loài khác trên GenBank để định danh phân tử và đánh giá đa dạng di truyển của các dòng nấm

β-Colletotrichum

Kết quả của nghiên cứu đã định danh được một số dòng nấm Colletotrichum gây bệnh trên cây cao su Có ít nhất hai dòng đã được xác định là C acutatum và C gloeosporioides Định danh phân tử và phân tích đa dạng di truyền dựa trên các trình

tự vùng gen: ITS-RNA; Partial actin; β-tubulin; Calmodulin; Glutamine synthetase và Glyceraldehyde – 3 – phosphate dehydrogenase là một kỹ thuật hữu hiệu, độ chính xác cao, có thể áp dụng rộng rãi phương pháp này cho nhiều loại nấm khác

iii

SUMMARY

“Identification and genetic diversity of Colletotrichum species isolates on the

rubber trees" was carried out at the Institute of Biotechnology and the Environment, Agriculture and Forestry University, Ho Chi Minh City to identify and assessment of

genetic diversity in some Colletotrichum strains causing disease on the rubber tree, so

that effective control of diseases caused by this fungus

Every year, disease caused by Colletotrichum seriously damage to the rubber

industry Chemical controls are effective but they could harm the environment Genetic controls are hoped to bring better effect

Content of this research includes isolation of Colletotrichum, extraction of

DNA and amplification the ITS – rDNA region, partial actin, β-tubulin, almodulin, glutamine synthetase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes Those genes have been compared with data in GenkBank using BLAST tool in NCBI to

identify and assess the diversity of Colletotrichum isolates and test the results of

identification morphology Phylogenetic tree has been constructed by using Neigbor Joining in MEGA

The result of research showed that at least two distinct Colletotrichum species has infected rubber trees in Vietnam including C acutatum and C gloeosporioide

This preliminary study would be useful for a better understanding of disease outbreaks on rubber trees, predicting future disease development and developing effective strategy in breeding for disease resistant lines of rubber trees It is indicated

that this method could extended to identify and assess variation in Colletotrichum

isolates from rubber trees

iv

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nôi dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây cao su 3

2.1.1 Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam 3

2.1.2 Tình hình sản xuất cao su trên thế giới và Việt Nam 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật học cây cao su 4

2.2 Tình hình bệnh hại trên cây cao su 5

2.2.1 Sự phân bố và tác hại của bệnh héo đen đầu lá 6

2.2.2 Triệu chứng bệnh héo đên đầu lá cao su 6

2.3 Sơ lược về nấm Colletotrichum 7

2.3.1 Vị trí phân loại 7

2.3.2 Đặc điểm của nấm Colletotrichum 7

2.3.3 Tình hình nghiên cứu định danh Colletotrichum trên thế giới và trong nước 8

2.3.3.1 Tình hình nghiên cứu định danh Colletotrichum trên thế giới 8

2.3.3.2 Tình hình nghiên cứu định danh Colletotrichum trong nước 9

2.4 Kỹ thuật PCR 10

2.4.1 Giới thiêu kỹ thuật PCR 10

2.4.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR 10

2.4.3 Các thành phần tham gia phản ứng PCR 11

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 12

v

2.5 Tổng quan về các vùng gen sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 14

2.5.1 Tổng quan vùng ITS – RNA 14

2.5.2 Tổng quan vùng Tubulin, Partial actin, Calmodulin, Glutamine synthetase, Glyceraldehyde – 3 – phosphate dehydrogenase 14

2.6 Giới thiệu cây phát sinh loài 15

2.6.1 Khái niệm cây phát sinh loài 15

2.6.2 Cấu trúc cây phát sinh loài 16

2.6.3 Một số lưu ý về cây phát sinh loài 17

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Nội dung và phương pháp 18

3.2.1 Phương pháp phân lập và nhân sinh khối mẫu nấm Colletotrichum 18

3.2.1.1 Dụng cụ và hóa chất 18

3.2.1.2 Phương pháp phân lập 19

3.2.1.3 Nhân sinh khối 19

3.2.2 Ly trích DNA các mẫu phân lập nấm Colletotrichum 19

3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất 19

3.2.2.2 Phương pháp ly trích 20

3.2.2.3 Kiểm tra sự có mặt của DNA 20

3.2.3 Khuếch đại các vùng gen 21

3.2.3.1 Các hóa chất và dụng cụ cần thiết 21

3.2.3.2 Quy trình phản ứng PCR 21

3.2.3.3 Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose 24

3.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

3.2.4.1 Xử lý chuỗi trình tự ban đầu 24

3.2.4.2 So sánh các vùng với GenBank 24

3.2.4.3 Tạo cây phát sinh loài 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả lấy mẫu và phân lập nấm Colletotrichum 26

4.2 Kết quả nhân sinh khối và ly trích DNA các mẫu nấm 28

4.2.1 Kết quả nhân sinh khối 28

vi

4.2.2 Kết quả ly trích DNA 29

4.3 Kết quả khuếch đại trình các vùng gen 29

4.4 Kết quả phân nhóm các loài Colletotrichum trong nước và nước ngoài 31

4.5 Kết quả định danh các dòng nấm Colletotrichum 32

4.5.1 Kết quả định danh dòng ColletQNPB1 33

4.5.2 Kết quả định danh dòng ColletTNGT1 36

4.5.3 Kết quả định danh dòng ColletBDR05 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid

ISSR: Inter-Simple Sequence Repeat

ITS: Internal Transcribed Spacer

IRRDB: International Rubber Research and Development Board NCBI: National Center for Biotechnology Information

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

SSR: Simple sequence repeat

TBE: Tris borate ethylene diamine tetraacetic acid

TE: Tris ethylene diamine tetraacetic acid

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần môi trường PDA, PSA 18

Bảng 3.2 Danh sách các mẫu nấm phân lập từ các vùng địa lý khác nhau 19

Bảng 3.3 Danh sách các mồi và trình tự 22

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho các mồi của đoạn gene Calmodulin 23

Bảng 3.6 Chu trình nhiệt cho các mồi của các đoạn gene: GS và GAPDH 23

Bảng 3.7 Các thành phần để thực hiện phản ứng PCR 23

Bảng 4.1 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA dòng ColletQNPB1 trên GenBank 33

Bảng 4.2 Độ tương đồng trình tự partial actin dòng ColletQNPB1 trên GenBank 33

Bảng 4.3 Độ tương đồng trình tự β – tubulin dòng ColletQNPB1 trên GenBank 34

Bảng 4.4 Độ tương đồng trình tự GS dòng ColletQNPB1 với các loài trên GenBank 35

Bảng 4.5 Độ tương đồng trình tự GAPDH dòng ColletQNPB1 với các loài GenBank 35

Bảng 4.6 Độ tương đồng trình tự calmodulin dòng ColletQNPB1 trên GenBank 36

Bảng 4.7 Độ tương đồng trình tự ITS-rDNA dòng ColletTNGT1 trên GenBank 37

Bảng 4.8 Độ tương đồng trình tự ACT dòng ColletTNGT1 với các loài trên GenBank 37

Bảng 4.9 Độ tương đồng trình tự β-tubulin dòng ColletTNGT1 trên GenBank 38

Bảng 4.10 Độ tương đồng trình tự GS dòng ColletTNGT1 với các loài trên GenBank 38

Bảng 4.11 Độ tương đồng trình tự vùng GAPDH dòng ColletTNGT1 trên GenBank 38

Bảng 4.12 Độ tương đồng trình tự calmodulin dòng ColletTNGT1 trên GenBank 39

Bảng 4.13 Độ tương đồng trình tự ITS-rDNA dòng ColletBDR05 trên GenBank 39

Bảng 4.14 Độ tương đồng trình tự patial actin dòng ColletDB trên GenBank 40

Bảng 4.15 Độ tương đồng trình tự β-tubulin dòng ColletBDR05 trên GenBank 40

Bảng 4.16 Độ tương đồng trình tự GS dòng ColletBDR05 trên GenBank 41

Bảng 4.17 Độ tương đồng trình tự GAPDH dòng ColletBDR05 trên GenBank 41

Bảng 4.18 Độ tương đồng trình tự calmodulin dòng ColletBDR05 trên GenBank 42

Bảng 4.19 Kết quả định danh 3 dòng nấm Colletotrichum dựa trên trình tự sáu vùng 42

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Colletotrichum 7

Hình 2.2 Sơ đồ vùng ITS – RNA ở tế bào nhân chuẩn 14

Hình 2.3 Các loại cây phát sinh loài 17

Hình 4.1 Triệu chứng bệnh héo đen đầu lá trên cây cao su 26

Hình 4.2 Kết quả phân lập một số dòng nấm Colletotrichum trên môi trường PGA 27

Hình 4.3 Hình dạng bào tử nấm Colletotrichum 28

Hình 4.4 Kết quả điện di DNA tổng số các dòng nấm Colletotrichum 29

Hình 4.5 Kết quả điện di các sản phẩm PCR một số dòng nấm Colletotrichum 30

Hình 4.6 Kết quả điện di các sản phẩm PCR một số dòng nấm Colletotrichu 30

Hình 4.7 Cây phân nhóm các loài Colletotrichum dựa trên vùng ITS – rDNA .32

1

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, cây cao su đang trở thành một cây trồng thế mạnh

và thu hút được nhiều người trồng bởi giá trị kinh tế to lớn Nông dân ở các tỉnh trồng nhiều cao su như Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh, Quảng Trị, Đăk Lăk cũng giàu lên nhờ cây cao su Sản lượng cao su thiên nhiên của Việt Nam trong mấy năm qua tăng khá mạnh Vị thế của ngành cao su Việt Nam trên thế giới ngày càng được khẳng định Chúng ta đang đứng ở vị trí thứ tư trên thế giới về xuất khẩu mặt hàng này Tuy nhiên ngành cao su đang đứng trước một thách thức lớn là tình hình dịch bệnh đang xảy ra ngày càng ngiêm trọng, năng suất và sản lượng mủ bị tác động mạnh mẽ

Bệnh héo đen đầu lá là bệnh gây hại phổ biến trên cao su và đến nay bệnh đã hiện diện trên tất cả các quốc gia trồng cao su Nó cũng gây hại trên lá, tuy không nguy hiểm như bệnh vàng rụng lá nhưng ở giai đoạn kiến thiết cơ bản, bệnh gây hại trên chồi và lá non làm rụng và chết chồi dẫn đến cây sinh trưởng, phát triển chậm, giảm chất lượng gỗ ghép và tỷ lệ ghép sống thấp Ở một số nước khác, bệnh gây hại trên vườn cao su đang khai thác còn làm giảm năng suất và sản lượng mủ của cây trưởng thành Các nghiên cứu về loại nấm này hiện đang được nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Cách phòng chống dịch bệnh hiện đang được ứng dụng phổ biến là dùng hóa chất để phòng trị Điều này gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng

và gây ô nhiễm môi trường

Nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm Colletotrichum trên cây cao su là một viêc cần thiết nhằm tìm mối quan hệ di truyền của Colletotrichum với tính kháng của một số dòng cao su Hiểu biết về đa dạng di truyền của nấm Colletotrichum gây bệnh

trên cao su ở Việt Nam là một công cụ hỗ trợ đắc lực cho việc kiểm soát bệnh có hiệu quả Hiện nay sinh học phân tử đã đưa ra nhiều phương pháp đáng tin cậy trong việc phân loại, đặc biệt là sự xác định loài, quan hệ bên trong loài và giữa các loài

Colletotrichum Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử dụng trong định danh và đánh giá đa dạng di truyền của nấm Colletotrichum như: phân tích trình tự DNA, kỹ thuật

ISSR, kỹ thuật RAPD, AFLP

2

Đề tài sử dụng phương pháp phân tích trình tự các vùng DNA: ITS – RNA, Partial actin, β – tubulin, Calmodulin, Glutamine synthetase và Glyceraldehyde – 3 –

phosphate dehydrogenase để định danh các dòng nấm Colletotrichum gây bệnh héo

đen đầu lá trên cây cao su

1.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập nấm Colletotrichum từ các mẫu lá bệnh

Nhân sinh khối và ly trích DNA của các dòng nấm

PCR khuếch đại các vùng gen

Đọc trình tự các vùng gen và sử dung chương trình BLAST

Định danh và phân tích đa dạng di truyền các dòng nấm Colletotrichum

1.3 Nôi dung thực hiện

Phân lập các dòng nấm Colletotrichum trên các mẫu lá thu thập

Nhân sinh khối và ly trích DNA các mẫu nấm phân lập được

Khuếch đại các vùng gen ITS – rDNA, Partial actin (ACT), β – tubulin (TUB2), Calmodulin (CAL), Glutamine synthetase (GS) và Glyceraldehyde – 3 – phosphate dehydrogenase (GPDH)

Định danh và xác định mối quan hệ di truyền các dòng nấm Colletotrichum

dựa trên trình tự các vùng gen

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây cao su

2.1.1 Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam

Cây cao su (Hevea brasiliensis Mull – Arg) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới,

lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ), được Henry Wichkham du nhập vào Châu Á năm

1876 và trồng gần 11 triệu ha (năm 2004) ở nhiều nước, trồng chủ yếu ở các vùng nhiệt đới như một cây trồng độc canh Nó đã và đang đóng góp nhiều cho nền kinh tế cũng như môi trường và xã hội, nhất là các nước Đông Nam Á Sản lượng cao su toàn thế giới vào khoảng 11 triệu tấn (năm 2004) và tiếp tục gia tăng hàng năm Phần lớn diện tích cao su trên thế giới thuộc tư nhân quản lý (chiếm trên 85%), sự thiệt hại do bệnh, côn trùng và cỏ dại không những trực tiếp gia tăng giá thành sản xuất mà còn gián tiếp ảnh hưởng tới đời sống của người trồng cao su

Vào đầu thế kỷ 20, nhiều người cho rằng “Cây cao su không bị một loại bệnh

và côn trùng nào đe dọa” Tuy nhiên, sau thời gian canh tác cùng với phương pháp trồng tập trung trên diện tích lớn trong vùng ẩm độ và nhiệt độ cao, các loại bệnh và côn trùng dần xuất hiện và gây thiệt hại không nhỏ Hơn nữa, trong những thập niên vừa qua sản lượng cao su không ngừng được cải thiện qua những tiến bộ trong công tác cải tiến giống, kỹ thuật nông nghiệp, nhưng thiệt hại do bệnh cũng gia tăng đáng kể

do công tác tạo tuyển giống thường chú trọng vào chỉ tiêu sinh trưởng và sản lượng

Tại Việt Nam, cây cao su du nhập từ năm 1897 và đến đầu thế kỷ 20 được trồng thành đồn điền tại Đông Nam Bộ, đến thập niên 50 một số diện tích cao su cũng định hình tại Tây Nguyên Tiếp theo mở rộng ra miền Trung và vươn đến phía Bắc Hiện nay, diện tích cao su tại nước ta đạt khoảng 740.000 ha được trồng trên nhiều vùng khác nhau, cho nên công tác bảo vệ thực vật ngày càng đóng trò cần thiết nhằm giảm thấp nhất thiệt hại do bệnh, côn trùng và cỏ gây ra (Phan Thành Dũng, 2004)

2.1.2 Tình hình sản xuất cao su trên thế giới và Việt Nam

Trong những năm gần đây mức sản xuất và tiêu thụ cao su tự nhiên trên thế giới có xu hướng ngày càng tăng gắn liền với xu hướng tăng trưởng kinh tế thế giới và nhu cầu phát triển các ngành kỹ thuật Nước đứng đầu là Thái Lan, kế đến là

là Ấn Độ và Trung Quốc, tăng khá nhanh (khoảng 7% mỗi năm)

Diện tích cao su ở Việt Nam ngày càng tăng, năm 2005 cả nước có khoảng 480.200 ha, đến năm 2007 tăng lên 549.600 ha, tăng bình quân khoảng 7% mỗi năm Các vùng trồng cao su chủ yếu là Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, Duyên hải miền Trung

và miền Bắc Các vùng này chiếm tỷ lệ lần lượt là 65,2%, 23%, 8% và 3,8% trong tổng diện tích cao su của cả nước (Tổng cục Thống kê, 2007)

Sản lượng cao su tự nhiên của Việt Nam cũng tăng tương ứng từ 468.600 tấn (2005) lên 601.700 tấn (2007), bình quân tăng 13,3% mỗi năm Những năm gần đây, nhu cầu cao su thiên nhiên trên thế giới ngày càng tăng, đã thúc đẩy giá mủ cao su lên cao (Báo cao su Việt Nam, 2008)

2.1.3 Đặc điểm thực vật học cây cao su

Cây cao su là cây mọc khỏe thân thẳng, vỏ có màu xám và tương đối láng Đây là loài cây cao nhất trong số các giống cây cho mủ trong điều kiện hoang dại cây cao su có thể mọc cao khoảng 30 m, vành thân có thể đạt 5 – 7 m và sống trên 100 năm Hiện nay, cây cao su trưởng thành cao khoảng 20 – 25 m, nguyên nhân là do ảnh hưởng của việc khai thác mủ và chu kỳ sống được giới hạn từ 20 – 25 năm Khi năng suất thấp cây cao su được thanh lý và trồng lại (Nguyễn Thị Huệ, 1997)

Rễ cao su có hai loại, rễ cọc và rễ bàng: rễ cọc mọc thẳng vào trong lòng đất giữ cho cây đứng vững; hệ rễ bàng rất phong phú và mọc lan rộng 6 – 9 m rễ bàng thường mọc trên lớp đất mặt sâu khoảng 30 cm, rễ có đường kính khoảng 1 mm màu nâu vàng mang nhiều lông, để dễ hấp thu chất dinh dưỡng nuôi cây Lúc cây trưởng thành, trọng lượng toàn bộ hệ thống rễ chiếm 15% trọng lượng toàn cây

Lá cao su thuộc loại lá kép gồm ba lá chẹt với cuống là mọc cách Khi lá mới bắt đầu mọc ra, lá non uốn cong gần như song song với cuống lá Lá non có màu tím sậm, khi các lá này lớn dần có màu xanh lục nhạt và vươn thẳng ra Lá trưởng thành có

Hoa cao su là hoa đơn tính đồng chu, hoa màu vàng nhạt, cuống hoa ngắn, có mùi hương nhẹ, dạng hoa hình chuông với năm lá đài, nhưng không có cánh hoa Hoa đực và hoa cái không nở cùng lúc nên thường xảy ra sự thụ phấn chéo giữa các cây khác nhau (Webster và Baulkwil, 1989)

Cây cao su bắt đầu cho thu hoạch mủ sau khi trồng từ 6 – 7 năm và chu kỳ khai thác khoảng 20 – 25 năm Cây phát triển tốt ở vùng nhiệt đới ẩm, có nhiệt độ trung bình từ 22oC đến 30oC (tốt nhất ở 26oC đến 28oC), cần mưa nhiều (tốt nhất là 2.000 mm) nhưng không chịu được sự úng nước và gió Cây cao su có thể chịu được nắng hạn khoảng 4 đến 5 tháng, tuy nhiên năng suất mủ sẽ giảm

Tại Việt Nam có thể trồng được trên nhiều loại đất, song cây cao su chủ yếu thích hợp với vùng đất đỏ bazan và đất xám Đông Nam Bộ (Nguyễn Hữu Trí, 2004)

2.2 Tình hình bệnh hại trên cây cao su

Cây cao su bị nhiễm rất nhiều loại bệnh và chủ yếu do nấm gây ra, có hơn 550 loài vi sinh vật có liên quan đến cây cao su, và trong đó có 24 loài có tầm quan trọng

về kinh tế (Chee, 1987) Tùy theo vị trí bị hại, chúng được chia ra thành các nhóm sau: bệnh lá, bệnh thân cành, bệnh mặt cạo và bệnh rễ Bệnh lá được xem là có tác hại lớn nhất và cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và mở rộng diện tích

cao su trên thế giới Các bệnh lá được quan tâm là: bệnh phấn trắng do Oidium heveae, bệnh héo đen đầu lá do Colletotrichum, bệnh đốm mắt chim do Drechslera heveae, bệnh rụng lá mùa mưa Phytophthora botryosa, bệnh rụng lá do Corynespora Ngoài ra

còn có các bệnh trên thân như: bệnh loét sọc mặt cạo, bệnh nấm hồng, bệnh xì mủ ở thân Các bệnh trên làm giảm đáng kể đến năng suất và sản lượng mủ của cây cao su, gây thiệt hại lớn về kinh tế

6

2.2.1 Sự phân bố và tác hại của bệnh héo đen đầu lá

Ghi nhận trên cây cao su lần đầu tại châu Á (Malaysia) năm 1905, sau đó bệnh xuất hiện tại châu Phi (Uganda) năm 1920 và Châu Mỹ (Brazil) năm 1926, ngày nay bệnh đã hiện diện tại tất cả các quốc gia trồng cao su Gây hại trong mọi giai đoạn phát triển của cây cao su và phổ biến vào mùa mưa do nấm cần ẩm độ cao để phát sinh

và gây bệnh

Trong điều kiện tại Việt Nam, bệnh chỉ xuất hiện vào mùa mưa và gây hại cho vườn nhân, vườn ươm và vườn cây trồng trong thời gian kiến thiết cơ bản, nhất là tại các vùng trồng cao su ở Tây Nguyên, miền Trung Tuy nhiên, do xảy ra vào mùa mưa (tháng 6 – 10) khi lá đã ổn định nên ít có tác hại cho cây cao su khai thác Bệnh gây hại chồi và lá non, làm rụng lá và chết chồi dẫn đến chậm sinh trưởng, giảm chất lượng gỗ ghép và tỷ lệ ghép sống thấp Ở một số nước khác, bệnh làm giảm đến 45 % sản lượng của vườn cao su khai thác (Phan Thành Dũng, 2004)

Theo Jayasinghe và cs (1997) nguyên nhân gây bệnh héo đen đầu lá trên cây cao su ở nhiều nước trên thế giới như: Brazil, Malaysia, India và Thailand là do nấm

Colletotrichum gloeosporioides Mầm bệnh có thể tấn công vào bất cứ phần xanh nào

của cây bao gồm lá non, chồi và vỏ xanh Nó tạo nên hình dạng bất thường, bệnh héo đen đầu lá là nguyên nhân gây rụng lá thứ cấp ở cây cao su kết quả làm thiệt hại kinh

tế rất lớn

2.2.2 Triệu chứng bệnh héo đên đầu lá cao su

Lá cao su từ 1 – 10 ngày tuổi là giai đoạn mẫn cảm nhất đối với bệnh, vết bệnh đầu tiên trên lá non có đốm màu nâu nhạt và thường xuất hiện ở đầu lá, sau đó vết bệnh lan rộng tạo vùng thâm đen tại đầu lá và gây rụng từng chét, sau cùng cả cuống lá

bị rụng Lá trên 14 ngày tuổi, không bị rụng mà để lại những đốm u lồi trên phiến lá có chứa nhiều bào tử (do triệu chứng trên lá già, một số nơi còn gọi là đốm mắt cua) Ngoài ra, nấm còn có khả năng gây hại cho trái và chồi non, vết bệnh có màu nâu đến nâu đậm dẫn đến chết chồi và khô trái (Phan Thành Dũng, 2004)

Lá non bị nhiễm bệnh sau một thời gian, nếu bị ở mức độ nhẹ không rụng thì

sẽ bị quăn queo, phần bị thâm đen sẽ bị khô và mất đi còn lại phần lá có diện tích không nguyên vẹn Nếu nấm tấn công trên lá trưởng thành làm lá biến dạng nhưng vẫn còn tồn tại trên cành Các đốm bệnh hình tròn có đường kính nhỏ hơn 2 mm, bên trong

2.3.2 Đặc điểm của nấm Colletotrichum

Theo IRRDB (1998), nấm Colletotrichum là nấm đa ký chủ, nguồn bệnh hoại

sinh, nó lây nhiễm trên nhiều loại cây hoang dại và cây trồng, và thường sinh trưởng ở vùng nhiêt đới Mầm bệnh có giai đoạn tiềm ẩn và bào tử có thể tồn tại trong một thời gian dài Bào tử lây lan theo nước mưa bắn tung tóe và trong luồng không khí ẩm ướt

Bào tử nấm Colletotrichum có thể tồn tại trong điều kiện ẩm độ thấp (62%)

trong 1 đến 2 tuần và sau đó vẫn có thể nảy mầm trở lại nếu được đặt trở lại trong điều kiện ẩm độ 100% (Arauz, 2000)

Sợi nấm Colletotrichum có các đặc điểm như: nội sinh, mảnh, phân nhánh,

không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào, nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm, khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bệnh xoắn

lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng Colletotrichum chỉ sinh sản vô tính

bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ Một vài loài

Colletotrichum có hoặc không có lông cứng có thể được kiểm soát bởi sự thay đổi độ

Hình 2.1 Colletotrichum

Nguồn: Đặng Thị Thuyền, 2007

8

ẩm Sự hình thành một số lớn của bào tử gây nứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử mọc từ một đến nhiều ống mầm để hình thành hệ sợi nấm Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi

là hậu bào tử Nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới (Cao Ngọc Diệp, 2007)

Nấm cần nước tự do để phát sinh và gây bệnh, nhiệt độ thích hợp cho hình thành và nảy mầm của bào tử từ 26 – 32oC, và tối ưu ở 28oC, trên 50oC sẽ làm chết bào

tử và khuẩn ty Bào tử có khả năng năng nảy mầm ở phạm vi ẩm độ 80 – 100 % và thích hợp nhất khi ẩm độ tuyệt đối Ánh sáng mặt trời và tia cực tím làm giảm sinh trưởng và hình thành bào tử Nấm phát triển và hình thành số lượng lớn bào tử trên nhiều loại môi trường nhân tạo Khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm, khuẩn ty màu trắng - hơi nâu không có vách ngăn và biến thiên lớn về đặc tính sinh học cũng như khả năng gây bệnh từ nguồn nấm cùng một ký chủ trên vùng địa lý khác nhau Hơn nữa, nấm còn có khả năng sống hoại sinh trên tàn dư thực vật Ngoài cây cao su, nấm còn ký sinh nhiều cây khác: ca cao, cam chanh, sầu riêng, xoài, một số loài cỏ dại (Phan Thành Dũng, 2004)

2.3.3 Tình hình nghiên cứu định danh Colletotrichum trên thế giới và trong nước 2.3.3.1 Tình hình nghiên cứu định danh Colletotrichum trên thế giới

Colletotrichum là một trong những nấm gây bệnh cây trồng phổ biến trên thế

giới, việc định danh chính xác loài là yếu tố quan trọng để kiểm soát hiệu quả mầm bệnh hiệu quả Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xây định các loài

Colletotrichum gây bệnh ở nhiều nơi trên thế giới

Photita và cs (2005) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của những

loài Colletotrichum từ những cây trồng nhiệt đới tại Thái Lan, kiểm tra xem liệu sự

phân loài dựa trên các đặc điểm hình thái có giống với những phân tích trình tự phân

tử 34 dòng Colletotrichum spp được phân lập từ chuối, gừng, Euphatorium thymifolia, đậu nành, nhãn, xoài, và Draceana sanderiana Vùng ITS1 – 5,8S – ITS2

được khuếch đại sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 (White và cs, 1990) Vùng trình tự này được so sánh với cơ sở dữ liệu trên GenBank sử dụng chương trình BLAST

Trong nghiên cứu này hầu hết những dòng Colletotrichum từ cùng vật chủ với cùng

9

những đặc điểm hình thái được xác định là cùng loài khi sử dụng những dữ liệu phân

tử Những dòng Colletotrichum từ cùng vật chủ nhưng có đặc điểm hình thái khác

nhau được xác định là những loài khác nhau và điều này đúng với dữ liệu phân tử Tuy

nhiên có một dòng Colletotrichum từ chuối có những đặc điểm hình thái giống với các

dòng khác nhưng lại tách thành một nhóm riêng trong phân tích phát sinh loài Tóm lại, từ sự phân tích trình tự vùng ITS có thể cung cấp thêm những hiểu biết về phân

loại Colletotrichum nhưng việc sử dụng những phân tích phân tử sử dụng những

gene khác nhau hay những phương pháp tốt hơn là cần thiết

Freenam và cs (2000) thực hiện những phân tích phân tử những loài

Colletotrichum từ quả hạnh và những trái cây khác Những dòng Colletotrichum spp

từ quả hạnh, lê tàu, dâu tâu Israel và những dòng từ quần thể quả hạnh tại Mỹ được phân tích sử dụng nhiều phương pháp khác nhau và được so sánh với định danh hình

thái Những primer khuếch đại đặc hiệu bao gồm ITS4 – CaInt2 cho C acutatum và ITS4 – CgInt cho C gloeosporioides, khuếch đại vùng ITS1 dùng cặp mồi ITS1 – ITS4 Những primer đặc hiệu cho thấy những dòng từ lê tàu thuộc loài C gloeosporioides, những dòng quả hạnh Mỹ, dâu tây Israel là C acutatum

2.3.3.2 Tình hình nghiên cứu định danh Colletotrichum trong nước

Hiện nay trong nước ta cũng có nhiều công trình nghiên cứu nhằm định danh

loài Colletotrichum gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau Nghiên cứu một số

biện pháp quản lý bệnh thán thư hại nho theo hướng sản xuất nho an toàn tại Ninh Thuận của Mai Văn Đào và phối hợp với CABI định danh được tác nhân gây bệnh

thán thư trên nho tại Bình Thuận là do nấm Elsinoe ampelina và C gloeosporioides Trong đó C gloeosporioides xuất hiện và gây hại chủ yếu

Phân loại nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên xoài và sầu riêng tại

đồng bằng sông Cửu Long của Lê Hoàng Lệ Thủy và Phan Văn Kim (2005), 105 chủng nấm gây bệnh thán thư, trong đó trên xoài 73 chủng và sầu riêng 32 chủng, được phân lập từ các mẫu bệnh thu thập tại các tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, An Giang, Sóc Trăng, Cần Thơ, Cà Mau và Trà Vinh Dựa trên đặc tính sinh học và bảng phân loài của Sutton (1980), Simmonds (1965), Mordue (1971), Swart

(1999) và CABI (2003) đã xác định được tên hai loài nấm là C gloeosporioides và C acutatum và một loài nấm còn lại chưa xác đinh được tên là Colletotrichum sp

10

Nghiên cứu bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum spp gây ra trên một

số dòng vô tính cao su tại Bình Dương của Đặng Thị Thuyền (2007) Nghiên cứu này

đã phân lập được hai dòng Colletotrichum gây bệnh trên cao su Dựa vào đặc tính sinh

học và hình thái sợi nấm và bào tử nấm của Yoshida (2002) và Jayasinghe (1997) đã

xác định hai dòng nấm này là C gloeosporioides và C acutatum Sự xuất hiên của loài C gloeosporioides trên lá cao su nhiều hơn loài C.acutatum, cả hai đều gây bệnh trên lá non nhưng mức độ bệnh do C gloeosporioides gây ra nhẹ, ít gây rụng lá, trong khi mức độ bệnh do C acutatum gây ra nặng hơn và có thể gây rụng lá

nhiều hơn (Đặng Thị Thuyền, 2007)

2.4 Kỹ thuật PCR

2.4.1 Giới thiêu kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cs phát minh năm 1985 Ðây là phương pháp in vitro để nhân bản một đoạn DNA nào đó, có

độ nhạy rất cao, mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các tính chất của quá trình tái bản DNA Nhưng nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việc tách dòng và thao tác với DNA dễ dàng và hiệu quả hơn Việc sử dụng kỹ thuật PCR trong lĩnh vực DNA tái tổ hợp đã tạo ra một bước tiến mang tính cách mạng đối với di truyền học phân tử nói riêng cũng như với sinh học phân tử nói chung

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase đều cần mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh (Lê Duy Thành, 2009)

2.4.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR

Bước 1: Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 94oC – 96oC trong vòng

30 giây - 1 phút (tùy thuộc vào vật liệu) để tách 2 mạch của DNA đích

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng

45 – 60oC và kéo dài từ 30 giây - 1 phút Các mồi nhận biết và gắn vào các mạch của DNA theo nguyên tắc bổ xung

Cuối cùng được kết thúc bằng một giai đoạn kéo dài ở 72oC trong 5 phút, sau

đó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ 4oC Số bản sao DNA được tạo ra nhờ kỹ thuật PCR được tính như sau:

Taq polymerase: là enzyme xúc tác cho quá trình phản ứng PCR xảy ra nhanh, chính xác và đặc hiệu Taq polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nước

nóng Thermophilus aquaticus, có hoạt tính chịu nhiệt cao, nhiệt độ tối ưu là 70oC và tương đối bền vững ở nhiệt độ biến tính DNA (92 – 94oC)

Các oligonucleotide primer hay primer: việc lựa chọn primer rất quan trọng cho một phản ứng PCR Đoạn mồi cần có kích thước hợp lý, từ 18 – 25 nu, có trình tự

bổ sung với trình tự 2 đầu mạch khuôn Mồi càng dài khả năng tổng hợp DNA mới càng chính xác Ngược lại, khi mồi ngắn quá sự bắt cặp giữa mồi và khuôn không thuận lợi nên kết quả PCR kém độ chính xác Có 2 loại mồi là mồi xuôi (forward primer, kí hiệu là F), và mồi ngược (reverse primer, kí hiệu là R) tham gia phản ứng

12

PCR Mồi xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’ 3’, mồi ngược bắt cặp

bổ sung gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’ 5’

dNTP: các loại nucleotide triphosphate dNTP thường dùng ở nồng độ 10 mM (2,5 mM mỗi loại) được bảo quản ở -20oC Hàm lượng của các dNTP trong khoảng 20 –

200 µM cho kết quả ổn định, chính xác và đặc hiệu 4 loại dNTP được sử dụng có nhiệt độ tương đương nhau để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền

Dung dịch đệm: là buffer thích hợp và MgCl2, nồng độ của Mg2+

có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính DNA khuôn mẫu, quá trình ủ của các primer, tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính của taq và độ chính xác của kết quả

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Mồi (primer): Mồi dùng trong phản ứng PCR thường có chiều dài 10 – 40 nu, tùy thuộc vào mức độ khuếch đại đặc hiệu đối với trình tự đích (trình tự cần khuếch đại) Việc lựa chọn trình tự các mồi trên một đoạn DNA có tính chất quyết định đối với phản ứng PCR Trong đa số trường hợp, mồi dùng cho PCR nên thỏa mãn một số yêu cầu sau:

Tỷ lệ GC ở các mồi thường chiếm khoảng 40 – 75% để đảm bảo liên kết gắn mồi với khuôn bền vững Tuy nhiên, trình tự dinucleotide GC không lặp lại quá nhiều trong một mồi

Khoảng cách giữa các mồi thường không dài quá 3kb; các mồi không có các nu

bổ sung để tránh hiện tượng hai mồi bắt cặp với nhau Hơn nữa, trình tự của từng mồi không được tạo cấu trúc kẹp tóc do liên kết giữa các nu ngay trong một mồi

Nhiệt độ Tm của hai mồi không quá chênh lệch nhau nhằm đạt được sự bắt cặp tối ưu giữa các mồi với khuôn ở cùng một nhiệt độ gắn mồi; sợi DNA được tổng hợp khi đầu 3’ của mồi đã liên kết với khuôn mặc dù đầu 5’ có thể tự do Do đó đầu 5’ của mồi có thể được gắn thêm linker, hoặc đoạn nu điều khiển (promoter)

Nồng độ mồi khoảng 0,1 – 0,5 µM Nồng độ thường được xác định dựa vào giá trị OD đo ở 260 nm

Liên kết giữa mồi và DNA khuôn: mồi gắn vào sợi khuôn DNA nhờ liên kết tạo cặp bổ sung giữa chúng Liên kết này phụ thuộc thời gian, nhiệt độ, nồng độ mồi cũng như nồng độ sợi khuôn Khi nồng độ mồi rất lớn so với nồng độ khuôn, thời gian gắn mồi với khuôn thường không cần thiết phải quá lâu Nhiệt độ ở giai đoạn này phụ

13

thuộc chủ yếu vào chiều dài của mồi và hàm lượng GC Đối với oligo mồi gồm 12 –

15 nu, nhiệt độ gắn mồi khoảng 40 – 35oC

Nhiệt độ 72oC là nhiệt độ thích hợp đối với hoạt tính của Taq polymerase Đây

là enzyme DNA polymerase có hoạt tính tổng hợp DNA và bền ở nhiệt độ cao Khi nhiệt độ thay đổi từ giai đoạn gắn mồi lên 72oC ở giai đoạn tổng hợp, các mồi ngắn thường bị biến tính rách ra khỏi sợi khuôn Ngoài ra, trong trường hợp mồi được tổng hợp xuất phát từ trình tự acid amin thì liên kết giữa mồi với DNA khuôn không hoàn toàn bổ sung do tính chất thoái hóa của mã di truyền Do đó, mồi loại này dễ dàng tách

ra khỏi sợi khuôn ở nhiệt độ tổng hợp DNA 72oC Vì vậy trong trường hợp này, thời gian gắn mồi có thể kéo dài hơn so với mồi có trình tự xuất phát trực tiếp từ đoạn cần nhân bản Nhiệt độ và thời gian ở giai đoạn gắn mồi đặc biệt quan trọng, nhiệt độ quá cao gây biến tính, nhiệt độ quá thấp tạo ra các liên kết không đặc hiệu (mồi có thể bám vào vị trí bất kỳ có độ tương đồng chứ không đảm bảo chính xác) Ngoài ra khi DNA khuôn chiếm tỷ lệ rất nhỏ (một đoạn DNA trong genome), thời gian cần thiết để mồi tìm đúng vị trí liên kết đặc hiệu và tạo cặp với khuôn thường khoảng 2 phút trong một

số chu kỳ đầu tiên Điều đáng lưu ý, khi chỉ vài nu ở đầu 3’ của mồi đã liên kết với khuôn thì Taq polymerase sẽ kéo dài sợi mồi thành sợi DNA mới bất chấp mồi chưa liên kết hoàn toàn với khuôn ở đầu 5’

DNA khuôn: phản ứng PCR có ưu điểm là chấp nhận DNA khuôn không tinh sạch, không đòi hỏi điều kiện bảo quản lạnh, lượng DNA cần rất ít DNA rất đa dạng,

có thể là DNA genome tách ra từ tế bào, DNA từ các ngân hàng genome hoặc cDNA, các DNA bất kỳ, RNA tổng số hoặc mRNA Nồng độ DNA khuôn thường < ng với cDNA, hoặc < µg với DNA genome

Nồng độ một số ion: trong môi trường, một số ion có ảnh hưởng đến phản ứng PCR Nồng độ thích hợp của Mg2+ cao sẽ làm cho phân tử DNA sợi đôi ổn định hơn

và ngăn ngừa được sự biến chất hoàn toàn (mở xoắn để giải phóng sợi đơn của sản phẩm PCR trong mỗi chu kỳ) làm cho kết quả PCR nghèo đi Mặt khác nó còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả (tại những vị trí không tương đồng) ổn định hơn dẫn đến xuất hiện những sản phẩm PCR không đặc hiệu với số lượng khá lớn Ngược lại, nếu nồng độ của Mg2+

quá thấp sẽ ảnh hưởng xấu đến hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu của sản phẩm PCR (Võ Thị Hương Lan, 2006)

Hình 2.2 Sơ đồ vùng ITS – RNA ở tế bào nhân chuẩn (Wikipedia)

Các rDNA 5,8S; 18S và 25S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen

kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS) Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm Kích thước của mỗi vùng lặp lại nằm trong khoảng 7,7 – 24 kbp (Guarro, 1999)

2.5.2 Tổng quan vùng Tubulin, Partial actin, Calmodulin, Glutamine

synthetase, Glyceraldehyde – 3 – phosphate dehydrogenase

Vi ống là yếu tố thực hiện nhiều chức năng thiết yếu và được cấu tạo chủ yếu

từ α – tubulin và β – tubulin Các gene mã hóa các thành phần của vi ống là một phần của liên họ tubulin Các gen alpha, beta and gamma tubulin được tìm thấy trong tất cả các tế bào nhân chuẩn Alpha và beta tubulin hiện diện trong hầu hết các thành phần

Glutamine synthetase là enzyme có mặt khắp nơi đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát việc sử dụng nitơ trong các tế bào Glutamine cũng như được sử dụng

để tạo nên các protein, cung cấp các nguyên tử nitơ để các enzyme tạo nên các phân

tử giàu nitơ, chẳng hạn như DNA và các axit amin Glutamine synthetase chuyển hóa nitơ bằng cách tác động vào sự ngưng tụ của glutamate và amoniac để tạo thành glutamine (Eisenberg và cs, 2000)

Calmodulin một protein mang thông tin bằng liên kết canxi (calcium-binding)

Nó được biểu hiện trong tất cả các tế bào nhân chuẩn Calmodulin là một protein mang thông tin đa chức năng, truyền những tín hiệu canxi bằng liên kết ion canxi và sau đó sửa đổi các tương tác của nó với các protein mục tiêu khác Calmodulin là chất trung gian gây ra nhiều thay đổi quan trọng của canxi trong các hoạt động của tế bào

Actin là loại protein khung (cytoskeletal) liên quan đến tính di động của tế bào, là thành phần của nhiều loại tế bào Actin tham gia vào vô số các quá trình của tế bào bao gồm: vận động, bài tiết, truyền tế bào chất, thực bào, và phân chia tế bào Actin là một trong những protein của tế bào nhân chuẩn được bảo tồn nhất với ít nhất sáu đồng dạng Bốn trong số các đồng dạng đại diện cho các dấu hiệu khác biệt của các mô cơ và hai được tìm thấy ở gần như tất cả các tế bào ( McDowel và cs, 1995)

2.6 Giới thiệu cây phát sinh loài

2.6.1 Khái niệm cây phát sinh loài

Cây phát sinh loài là sơ đồ hình cây miêu tả lịch sử tiến hóa của một nhóm các loài với những đặc tính khác nhau nhưng có cùng mối quan hệ họ hàng với nhau và cùng hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ Trong một cây phát sinh loài, mỗi

16

node bao gồm những thành viên có cùng một tổ tiên chung gần nhất, chiều dài của nhánh trong một số cây tương ứng với ước lượng thời gian Mỗi node tương ứng với một đơn vị phân loại (Kliman và Sheehy, 2008)

2.6.2 Cấu trúc cây phát sinh loài

Cây phát sinh loài gồm hai loại: cây có gốc (rooted tree) và cây không gốc (unrooted tree) Cả hai loại đều bao gồm những nhánh, node trong và node ngoài Chiều dài của nhánh có thể chỉ thời gian tiến hóa, khoảng cách di truyền node trong là HTU (hydrothetical taxonomic units), node ngoài là OTU (operation taxonomic units) Những cây có gốc vừa chỉ con đường tiến hóa từ một tổ tiên chung tới những OTU và mối quan hệ giữa những OTU trong khi cây không gốc chỉ cho biết mối quan hệ giữa các OUT

Cây phát sinh loài có thể được xây dựng từ những dữ liệu hình thái hay dữ liệu phân tử (trình tự DNA và protein) Ngày nay, cây phát sinh loài thường dựa trên các

dữ liệu phân tử, do dữ liệu phân tử có nhiều thuận lợi hơn so với các dữ liệu hình thái: những dữ liệu phân tử có thể được ghi nhận một cách rõ ràng, mỗi cá thể có thể cung cấp nhiều dữ liệu khác nhau

Hình 2.3 Các loại cây phát sinh loài (a) Cây có gốc; (b) Cây không gốc; A, B, C là những HTU; D,E,F,G,H là những OTU (Chính Hoàng, 2005).

Cây có gốc có thể được tạo bằng cách thêm vào một outgroup trong dữ liệu Một outgroup là một OTU chứa những thông tin bên ngoài mà phân nhánh trước tiên trong cây phát sinh loài Topology là trật tự của các node trên cây phát sinh loài Một vài yếu tố ảnh hưởng đến trật tự của các node trên cây phát sinh loài: trình tự DNA hay protein dùng trong phân tích; phương pháp áp dụng: Distance hay Parasimony; số OTU có trong alignment; thứ tự của các OTU trong alignment; sự lựa chọn một outgroup phù hợp

17

2.6.3 Một số lưu ý về cây phát sinh loài

Hiện nay chưa có ứng dụng lý thuyết hoặc thực tiễn của bất lỳ thuật toán nào được chấp nhận bởi cả cộng đồng khoa học Việc ứng dụng các phần mềm khác nhau với cùng một dữ liệu có khả năng cho những kết quả khác nhau và những thay đổi nhỏ của dữ liệu cũng có thể thay đổi lớn tới kết quả Quan hệ được tạo ra từ dữ liệu trình tự thực chất thể hiện mối quan hệ giữa các gen, không luôn luôn thể hiện mối quan hệ giữa các vi sinh vật Trình tự của một số gen hay một số dạng khác của dữ liệu trình tự

có thể không có cùng lịch sử tiến hóa với loài mà có những trình tự này Những gen khác nhau tiến hóa với tốc độ khác nhau và luôn có khả năng xảy ra sự di chuyển gen ngang (do lai giống, hay nhận trực tiếp DNA) (Chính Hoàng, 2005)

Hiện nay, không có phương pháp xây dựng cây phát sinh loài nào đảm bảo chắc chắn phản ánh đúng quan hệ tiến hóa của một dữ liệu trình tự Mặc dù đã có nhiều cố gắng để so sánh độ tin cậy của phương pháp, tuy nhiên chưa có một mô hình thống kê nào để so sánh những cây tạo ra từ những phương pháp khác nhau

18

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày 03/01/2012, đến hết ngày 30/06/2012 tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Nội dung và phương pháp

3.2.1 Phương pháp phân lập và nhân sinh khối mẫu nấm Colletotrichum

3.2.1.1 Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ: máy lắc, bình chứa môi trường, bình tam giác, dao cấy, ống nghiệm, đĩa petri, kéo, giấy thấm vô trùng, đèn cồn, pence, dao cấy, becher, nồi hấp Tomy, tủ sấy

Hóa chất: Môi trường PDA

Bảng 3.1 Thành phần môi trường PDA, PSA

Thành phần Môi trường PDA (g/l) Môi trường PSA (g/l)

Thêm 20 g agar và bổ xung nước cho vừa đủ 1 l và thêm 20 g đường glucose

Đun sôi, khuấy đều cho agar và đường tan đều

Phân vào các bình chứa môi trường (250 ml/bình) và ống nghiệm (10 ml/ống)

và đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

Các bình chứa môi trường sau khi hấp xong để nguội (khoảng 60oC) rồi đem

đổ vào các đĩa petri (20 ml/đĩa)

19

3.2.1.2 Phương pháp phân lập

Mẫu lá cao su bệnh lấy về được khử trùng bằng cách ngâm trong ethanol 70% khoảng 30 – 60s, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần Đốm lá bệnh được cắt thành những mẫu nhỏ để trên giấy thấm cho mẫu khô, sau đó cho mẫu vào đĩa petri có chứa sẵn môi trường PGA, khi nấm trên mẫu lá bệnh phát triển, cấy chuyền sang đĩa petri khác

Bảng 3.2 Danh sách các mẫu nấm phân lập từ các vùng địa lý khác nhau

3.2.1.3 Nhân sinh khối

Các mẫu nấm sau khi được phân lập thuần được nhân sinh khối bằng cách cấy chuyền sang bình tam giác có chứa sẵn môi trường PG, sau đó chuyển sang nuôi cấy trong máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng từ 3 – 4 ngày Tiến hành thu sinh khối sợi nấm và bảo quản ở -20o