THỬ NGHIỆ M NUÔI TẢO MICROCYSTIS SPP. VỚI MỘ T SỐ MÔI TRƯỜ NG ĐƠN GIẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆ M

Việc nghiên cứu độc tố của các loài vi khuẩn lam rất có ý nghĩa thực tế, nhất là trong điều kiện môi trường hiện nay khi mà nguy cơ bùng nổ sự phì dưỡng do ô nhiễm hữu cơ ở nhiều sông

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA THỦY SẢN 

THỬ NGHIỆM NUÔI TẢO MICROCYSTIS SPP VỚI MỘT SỐ

MÔI TRƯỜNG ĐƠN GIẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN KHÓA: 2008 – 2012

SINH VIÊN THỰC HIỆN: TRƯƠNG THỊ THÚY HẰNG

Tháng 08/2012

THỬ NGHIỆM NUÔI TẢO MICROCYSTIS SPP VỚI MỘT SỐ

MÔI TRƯỜNG ĐƠN GIẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Thực hiện bởi

TRƯƠNG THỊ THÚY HẰNG

Khóa luận được đề trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng kĩ sư Nuôi Trồng Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn

ĐẶNG THỊ THANH HÒA

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2012

L ỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Cô Đặng Thị Thanh Hòa đã tận tình hướng dẫn, góp ý và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô giáo đã giảng dạy tôi trong bốn năm qua, những kiến thức mà tôi nhận được trên giảng đường đại học sẽ là hành trang giúp tôi vững bước trong tương lai

Xin cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản, các bạn lớp DH08NY, các bạn lớp DH08NT, các anh chị đang nghiên cứu và công tác tại trại thực nghiệm Thủy Sản Trường Đại

Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cùng toàn thể bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong khoảng thời gian thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn anh Vương, anh Út đã tạo điều kiện cho tôi thu mẫu trong suốt quá trình làm luận văn Xin chúc các anh thật nhiều sức khỏe và làm

TÓM T ẮT

Đề tài nghiên cứu “ Thử nghiệm nuôi tảo Microcystis spp trong một số môi

trường đơn giản” được thực hiện tại phòng P301 khoa Thủy Sản trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Thời gian từ tháng 10/2011 đến tháng 01/2012 Thí nghiệm khảo sát một yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong các bình tam giác (250 ml, 500 ml và 1000ml) , chai nước biển 500 ml, bình nhựa (5 lít và 10 lít) Kết quả chúng tôi thu được như sau:

Microcystis spp được thu hai đợt vào tháng 10/2011 ở Tiền Giang và tháng 12/2012 ở An Giang vớt lấy lớp váng nổi trên mặt nước Trong bốn môi trường Walne,

Emerson, phân NPK và phân bò thì Microcystis spp phát triển tốt nhất ở môi trường phân bò với mật độ trong hai đợt lần lượt khoảng 1,2x106

tế bào/ml và 4,7x105

tế bào/ml.Với môi trường phân bò, Microcystis spp phát triển tốt ở mức 3,6 g/l với mật

độ cực đại lần lượt ở đợt một khoảng 4,5x105

tế bào/ml và ở đợt hai khoảng 6,4x105

tế bào/ml

Mật độ Microcystis spp nuôi cấy ban đầu khoảng 1,2x105 tế bào/ml trong môi trường phân bò 3,6 g/l đạt mật độ cao nhất

Microcystis spp không tăng trưởng khi bố trí sục khí.Trong thử nghiệm nuôi sinh khối, thể tích nuôi càng lớn mật độ Microcystis spp đạt cực đại càng thấp, mật độ

cực đại đạt khoảng 6x105

tế bào/ml ở 0,4 lít; khoảng 4,7x105

tế bào/ml ở 1 lít và khoảng 4x105 tế bào/ml ở 4 lít

Hàm lượng microcystin có trong các mẫu nuôi > 0,5 µg/L

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ viii

PHỤ LỤC ix

PHỤ LỤC ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đại cương về vi khuẩn lam 3

2.1.1 Hình thái và cấu trúc 3

2.1.2 Sinh thái và phân bố của VKL 4

2.2 Giới thiệu chung về chi Microcystis 6

2.2.1 Đặc điểm chung của chi Microcystis 6

2.2.2 Phân loại học chi Microcystis 7

2.2.3 Chu trình sống của chi Microcystis 7

2.3 Độc tố Microcystin 8

2.3.1 Cấu trúc hóa học của microcystin 8

2.3.2 Ảnh hưởng của microcystin 9

2.4 Tình hình nghiên cứu chi Microcystis và độc tố microcystin 10

2.4.1 Lịch sử phân loại Microcystis trên thế giới 10

2.4.2 Tình hình nghiên cứu độc tố của Microcystis trên thế giới 11

2.4.3 Tình hình nghiên cứu độc tố của Microcystis ở Việt Nam 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.3 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3.1 Dụng cụ 17

3.3.2 Hóa chất 17

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Điều kiện chung 18

3.4.2 Các thí nghiệm 18

3.4.2.1 Thử nghiệm môi trường 18

3.4.2.2 Thử nghiệm mật độ 19

3.4.2.3 Thử nghiệm sục khí 19

3.4.2.4 Thử nghiệm nuôi sinh khối 20

3.4.3 Xác định hàm lượng Microcystin trong các môi trường nuôi 20

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Kết quả thử nghiệm môi trường 21

4.2 Kết quả kiểm tra độc tố microcystin trong các dịch nuôi ở hai đợt thu mẫu 31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WHO: World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)

microcystin-LR: dạng leucine (L) và arginine (R)

microcystin-RR: dạng arginine (R) và arginine (R)

microcystin-YR: dạng tyrosine (Y) và arginine (R)

W1: Nghiệm thức môi trường Walne mẫu thu Tiền Giang

E1: Nghiệm thức môi trường Emerson mẫu thu Tiền Giang

NPK1: Nghiệm thức môi trường phân NPK mẫu thu Tiền Giang

PB1: Nghiệm thức môi trường phân bò mẫu thu Tiền Giang

W2: Nghiệm thức môi trường Walne mẫu thu An Giang

E2: Nghiệm thức môi trường Emerson mẫu thu An Giang

NPK2: Nghiệm thức môi trường phân NPK mẫu thu An Giang

PB2: Nghiệm thức môi trường phân bò mẫu thu An Giang

N1.1: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,06 g/l mẫu thu Tiền Giang

N1.2: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,12 g/l mẫu thu Tiền Giang

N1.3: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,18 g/l mẫu thu Tiền Giang

N1.4: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,24 g/l mẫu thu Tiền Giang

N2.1: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,06 g/l mẫu thu An Giang

N2.2: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,12 g/l mẫu thu An Giang

N2.3: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,18 g/l mẫu thu An Giang

N2.4: Nghiệm thức môi trường phân NPK có nồng độ phân 0,24 g/l mẫu thu An Giang

P1.1: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 1,2 g/l mẫu thu Tiền Giang

P1.2: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 2,4 g/l mẫu thu Tiền Giang P1.3: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 3,6 g/l mẫu thu Tiền Giang P1.4: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 4,8 g/l mẫu thu Tiền Giang P2.1: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 1,2 g/l mẫu thu An Giang P2.2: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 2,4 g/l mẫu thu An Giang P2.3: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 3,6 g/l mẫu thu An Giang P2.4: Nghiệm thức môi trường phân bò có nồng độ phân 4,8 g/l mẫu thu An Giang M1.4: Nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu 4x104 tế bào/ml mẫu thu Tiền Giang M1.8: Nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu 8x104

tế bào/ml mẫu thu Tiền Giang M1.12: Nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu 1,2x105 tế bào/ml mẫu thu Tiền Giang

M1.16: Nghiệm thứ c có mật độ nuôi cấy ban đầu 1,6x105

tế bào/ml mẫu thu Tiền Giang

M2.4: Nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu 4x104

tế bào/ml mẫu thu An Giang M2.8: Nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu 8x104

tế bào/ml mẫu thu An Giang M2.12: Nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu 1,2x105 tế bào/ml mẫu thu An Giang M2.16: Nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu 1,6x105

tế bào/ml mẫu thu An Giang W: Nghiệm thức môi trường Walne có sục khí

E: Nghiệm thức môi trường Emerson có sục khí

NPK: Nghiệm thức môi trường phân NPK có sục khí

PB: Nghiệm thức môi trường phân bò có sục khí

K1: Nghiệm thức nuôi cấy ở thể tích 0,4 lít

K2: Nghiệm thức nuôi cấy ở thể tích 1 lít

K3: Nghiệm thức nuôi cấy ở thể tích 4 lít

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc chung của microcystin 9

Đồ thị 4.1: Tăng trưởng của Microcystis spp trong bốn môi trường nuôi từ mẫu thu

Tiền Giang 21

Đồ thị 4.2: Tăng trưởng của Microcystis spp trong bốn môi trường nuôi từ mẫu thu ở

An Giang 22

Đồ thị 4.3: Tăng trưởng của Microcystic spp ở bốn mức nồng độ phân NPK từ mẫu

thu ở Tiền Giang 23

Đồ thị 4.4: Tăng trưởng của Microcystic spp ở bốn mức nồng độ phân NPK từ mẫu

Đồ thị 4.7: Tăng trưởng của Microcystis spp trong môi trường phân bò với bốn mức

mật độ tảo ban đầu, mẫu thu từ Tiền Giang 27

Đồ thị 4.8: Tăng trưởng của Microcystis spp trong môi trường phân bò với bốn mức

mật độ tảo ban đầu, mẫu thu từ An Giang 28

Đồ thị 4.9: Tăng trưởng của Microcystis spp trong bốn môi trường nuôi có sục khí 29

Đồ thị 4.10: Tăng trưởng của Microcystis spp với ba mức thể tích nuôi 30

Chương 1

1.1 Đặt vấn đề

Trong các chi thuộc ngành vi khuẩn lam (Cyanobacteria) thì chi Micocystis

phân bố hầu như toàn cầu nhất Microcystis tồn tại trong các thủy vực nước ngọt nói chung và các thủy vực dạng ao hồ nói riêng, đặc biệt Microcystis thường xuất hiện

trong những vùng nước giàu dinh dưỡng và thường gây nên hiện tượng nở hoa nước (water blooms) ở các ao hồ trên thế giới

Ở Việt Nam trường hợp nở hoa của Microcystis tại các thủy vực nước ngọt đã

được ghi nhận ở một số nơi như sông Như Ý- tỉnh Thừa Thiên Huế, Hồ Xuân Hương –

Đà Lạt, Hồ Gươm – Hà Nội và một số tuyến sông Hậu khu vực Huyện Châu Thành đến Phường Mỹ Thới (thành phố Long Xuyên) (Nguyễn Thị Thu Liên và, 2010)

Microcystis là chi được tìm thấy đầu tiên có sản xuất heptatotoxins, một loại độc tố của vi khuẩn lam (Botes và cộng sự, 1982) chất này sau này được gọi là microcystins (Carmichael, 1995) Đến nay, người ta đã tách ra được khoảng hơn 80 loại microcystin từ các chủng của loài Microcystis Động vật và con

cyclic-peptide-người nhiễm loại độc tố này thường bị các triệu chứng như nôn mửa, lạnh, tiêu chảy,

thở mạnh, gây tổn thương đến gan, và có thể gây rối loạn tuần hoàn (Dương Đức Tiến, Trịnh Tam Kiệt)

Sự phát triển và bùng nổ của tảo độc phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện môi trường như: nhiệt độ, ánh sáng, độ pH,….và việc kiểm soát nguồn nước

Việc nghiên cứu độc tố của các loài vi khuẩn lam rất có ý nghĩa thực tế, nhất là trong điều kiện môi trường hiện nay khi mà nguy cơ bùng nổ sự phì dưỡng do ô nhiễm

hữu cơ ở nhiều sông hồ nước ngọt là một trong những nhân tố thuận lợi cho sự phát triển và sản xuất độc tố của vi khuẩn lam gây độc

Để nghiên cứu độc tố thì việc nuôi sin h khối là vấn đề đầu tiên phải giải quyết ,

vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Thử nghiệm nuôi tảo Microcystis spp với

một số môi trường đơn giản trong phòng thí nghiệm”

1.2 M ục tiêu đề tài

Khảo sát sự phát triển của Microcystis spp trong một số môi trường đơn giản như Walne, Emerson, phân bò và phân NPK

Tìm hiểu sự phát triển của Microcystis spp trong môi trường phân bò và phân

NPK có nồng độ khác nhau và mật độ nuôi cấy ban đầu khác nhau

Tìm hiểu sự tăng trưởng của Microcystis spp trong điều kiện có sục khí

Khảo sát sự tăng sinh khối của Microcystis spp ở các thể tích nuôi khác nhau

Kiểm tra độc tố của Microcystis spp trong các dịch nuôi bằng test ELISA

Chương 2

2.1 Đại cương về vi khuẩn lam

2.1.1 Hình thái và c ấu trúc

Hình thái của vi khuẩn lam (VKL) có thể được chia thành dạng sống đơn bào, các tế bào liên kết thành tập đoàn dạng hình cầu, dạng sợi hay dạng nhánh Dạng sống đơn lẻ các tế bào có thể là hình cầu, hình trụ, có đường kính từ 0,6 – 30 µm Dạng tập đoàn gồm các tế bào sắp xếp có qui luật như đối xứng, hay thành dạng bản, hoặc không theo một qui luật nào cả Các dạng sợi thường có cấu trúc gồm mao tản ở bên trong bao nhầy, đường kính mao tản từ 0,4 – 45 µm, hoặc có thể lên đến 100 µm Ở tất

cả các chi, mao tản được chia thành nhiều tế bào bởi các vách ngăn ngang phát triển hướng tâm từ vách ngoài của mao tản (Fogg và ctv, 1973)

Dưới kính hiển vi quang học, VKL luôn có hình dạng cố định và thường được bao bọc trong vỏ bằng chất nhầy Chất nhầy bao bọc xung quanh một tế bào, tập đoàn hay sợi Nó thường gặp trong các quần thể tự nhiên và có thể thấy được bằng kính hiển

vi phản pha hay khi được nhuộm Bao nhầy thường có màu nâu, xanh hay vàng hay không màu tùy thuộc vào điều kiện môi trường mà nó phát triển (Fogg và ctv, 1973)

Vách tế bào VKL gồm nhiều lớp, có thể chống lại áp suất thẩm thấu của thể nguyên sinh và có nhiệm vụ tạo ra hình dạng tế bào (Drews và ctv, 1973) Màu sắc của

tế bào VKL bị ảnh hưởng bởi nhiều loại sắc tố khác nhau VKL chứa hai sắc tố xanh là phycocyanin và allophycocyanin và một sắc tố đỏ là phycoerythrin Ngoài ra VKL còn chứa diệp lục a và nhiều loại carotene (Hoek và ctv, 1995)

Một đặc điểm đặc trưng của nhiều VKL là sự hiện diện của không bào khí (khí

thể) trong tế bào, chúng có thể làm cho tế bào nổi Cấu trúc này tương tự với các vi khuẩn sống trôi nổi, kể cả các vi khuẩn quang dưỡng, nhưng hoàn toàn vắng mặt ở các

tảo có nhân Khí thể là những phần tử màu hơi đen dưới ánh sáng yếu, màu hơi đỏ dưới ánh sáng mạnh và dễ dàng được nhận ra trong tế bào Ở ánh sáng phản pha, chúng hơi sáng và nổi lên so với nền đen của nguyên sinh chất Ngoài chức năng giúp

tế bào nổi, khí thể còn có tác dụng chắn sáng cho tế bào Khí thể là đặc trưng nhất của những loài sống trôi nổi trong các ao hồ (Fogg và ctv, 1973)

Một số đặc điểm hình thái học của tế bào và sợi có tầm quan trọng trong việc phân biệt VKL.Trong vài trường hợp, chúng cũng chỉ thị tốt cho điều kiện môi trường Một số dạng sợi hình thành những tế bào đặc biệt khác với tế bào dinh dưỡng là dị bào, đây là nơi xảy ra sự cố định nitơ

VKL chỉ có sinh sản vô tính bằng các cấu trúc như tảo doạn, bì bào tử, nội bào

tử, ngoại bào tử và nannocyst Tảo đoạn là đặc trưng của tất cả VKL sợi Đó là một đoạn ngắn của mao tản có khả năng tách rời sợi, di chuyển khỏi bố mẹ và phát triển thành sợi mới Ở một số loài, mao tản tự gãy thành tảo đoạn, trong khi ở một số khác,

có sự trợ giúp của tế bào chết Đôi khi tảo đoạn được bao bọc kín trong một bao nhầy dày hay mỏng Các cơ thể này phát triển thành tản mới Bì bào tử là những cấu trúc

sống lâu do tế bào dinh dưỡng phát triển thành, thường gặp ở họ Nostocaceae, Rivulariaceae và một vài đại diện của họ Stigonemaceae Bì bào tử trưởng thành có kích thước lớn hơn nhiều so với tế bào dinh dưỡng bình thường và có hình dạng thay đổi từ hình cầu đến hình trụ, với chiều dài lớn hơn nhiều lần nhiều rộng Dưới điều

kiện thích hợp, bì bào tử sẽ nảy mầm thành đoạn sinh sản hay trực tiếp thành mao tản (Fogg và ctv, 1973)

2.1.2 Sinh thái và phân bố của VKL

Phân b ố

VKL có nơi ở đa dạng nhất, như ở trong các thủy vực nước ngọt, mặn, lợ hay ở trên các dạng đài vật như đá, sỏi và thậm chí ở trong các môi trường khắc nghiệt như sông băng, sa mạc hay suối nước nóng Vài VKL xuất hiện ở cả hai môi trường, nhiều loài nước ngọt có thể sống ở nước mặn và một vài loài nước mặn có thể sống ở nước

lợ (Hoek và ctv, 1995) Chúng là đặc trưng chung của nhiều thủy vực ôn đới và nhiệt đới nhưng với mật độ tế bào, thành phần loài và sự phân bố trong cột nước, tuổi thọ và thời gian của quần thể khác nhau (Oliver và ctv, 2000)

Sự thay đổi theo mùa

Ở những hồ sâu vùng ôn đới nơi khí hậu có sự phân biệt theo mùa rõ rệt, thời tiết êm ả vào mùa hè và mùa thu là lúc các hoa nước của VKL ở tầng mặt thường phát triển cùng với nồng độ dinh dưỡng của tầng này ở mức thấp Vùng ôn đới ở nữa bán

cầu bắc, trong các hồ cạn, dinh dưỡng tốt, nước thường đục và được trộn đều, VKL chiếm ưu thế suốt mùa hè với các loài của chi Oscillatoria Vài hồ sạch vùng ôn đới, khi ánh sáng truyền đến vùng đáy, các loài như Aphanizomenon flosaquae và

Oscillatoria agardhii hình thành những quần thể lớn (Oliver và ctv, 2000)

Ở vùng nhiệt đới, các hoa nước VKL và lớp váng ở tầng mặt có thể hình thành

bất kỳ thời gian nào trong năm bởi vì năng lượng nhận vào và nhiệt độ không khí ít thay đổi Tuy nhiên những thay đổi về khí tượng và thủy văn đã quyết định cấu trúc của quần xã phiêu sinh thực vật

Nhiều nghiên cứu đã nêu câu hỏi tại sao VKL lại phân bố trong điều kiện rộng

về môi trường như vậy Có nhiều giả thiết giải thích sự phân bố rộng của VKL là nhờ: i) Chúng có khả năng nổi nhờ tế bào có chứa khí thể hay VKL ưa thích cường độ ánh sáng thấp; ii) VKL ít khi là đối tượng săn mồi của phiêu sinh động vật; iii) VKL di trú thì thuận lợi trong việc cạnh tranh bởi có sự dự trữ phospho từ nền đáy; iv) Giả thiết TN/TP (tổng Nitơ/tổng Phospho) giải thích sự thành công của VKL nhờ tỉ lệ TN/TP

thấp (Schindler, 1997) Giả thiết Nitơ vô cơ giải thích rằng những VKL không cố định đạm ưa thích ammonium trong khi các vi tảo có nhân khác ưa thích nitrat (Blomqvist

và ctv, 1983) Các VKL cố định đạm thì thuận lợi hơn khi Nitơ trong môi trường nước

trở nên khan hiếm (Annadotter, 2006) Một hay vài yếu tố trên xuất hiện cùng nhau là

lý do chính để VKL chiếm ưu thế, nhưng những đặc trưng về hình thái, sinh lý và sinh thái của từng loài đã nói lên rằng những nhân tố thúc đẩy loài này sẽ không thúc đẩy loài khác Chẳng hạn như Microcystis aeruginosa có thể cùng xuất hiện với Anabaena

flos – aquae nhưng không cùng xuất hiện với Oscillatoria rubescens (trích Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Sự hình thành hoa nước

Hiện tượng nở hoa (sự nở hoa hay “bloom”) để chỉ một sinh khối phiêu sinh

thực vật cao hơn đáng kể so với mức trung bình của hồ (Oliver và ctv, 2000) Sự xuất hiện của các hoa nước phản ánh điều kiện môi trường và nhiều phiêu sinh thực vật có

thể hình thành nên các hoa nước khi gặp điều kiện thuận lợi Tuy nhiên một đặc trưng

của tất cả các loài gây nên hiện tượng nở hoa là sự hiện diện của túi khí trong tế bào

Riêng các hoa nước ở tầng mặt thường xuất hiện rất nhanh, chỉ trong vài giờ và được quan sát tình cờ mà không có sự cảnh báo trước về sự hiện diện của một sinh vật

nào Nhưng thực ra sự xuất hiện đột ngột này là kết quả di trú lên phía trên của một quần thể và không phải là kết quả của sự phát triển nhanh tế bào Sự xuất hiện đột ngột này thường kết hợp với điều kiện không bị xáo trộn và không có gió đã cho phép các sinh vật nổi lên mặt nước (Oliver và ctv, 2000)

Do vậy những hoa nước hình thành ở tầng mặt chỉ xảy ra với những sinh vật có

khả năng nổi hay chuyển động và thỉnh thoảng tích tụ lại để tạo thành những lớp váng

ở trên mặt Thường các hoa nước này bao gồm các VKL có chứa khí thể Chúng gặp ở một số chi với nhiều hình thái và kích thước khác nhau từ những sợi nhỏ cho đến

những tập đoàn lớn Các chi VKL này thường gặp đó là: Spirulina, Oscillatoria

(Planktothrix), Gloeotrichia, Cylindrospermopsis, Aphanizomenon, Anabaenopsis, Anabaena, Nodularia, Gomphosphaeria, Coelosphaerium, Microcystis Oliver & Ganf

(2000) cũng đã nhấn mạnh đến các VKL có chứa túi khí thể trong tế bào là đặc trưng

của những hồ phú dưỡng Ở các vùng khí hậu khác nhau, các hoa nước VKL có thời điểm xuất hiện và thời gian kéo dài khác nhau (Chorus I & J Bartram, 1999)

Các yếu tố môi trường cũng có tác động lên sự hiện diện của các hoa nước Sự giới hạn của Cacbon vô cơ được cho là có liên quan đến sự xuất hiện của các hoa nước VKL ở tầng mặt vì Cacbon vô cơ có thể thúc đẩy các tế bào nổi trong thời gian ngắn

do ngăn ngừa các khí thể vỡ Nitơ đặc biệt quan trọng đối với các VKL có khí thể, bởi

vì nó là thành phần chính yếu trong sự tổng hợp các túi khí Do đó sự giới hạn của Nitơ không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào mà còn ảnh hưởng đến khả năng nổi của tế bào và điều hòa khả năng này Nitơ bị giới hạn sẽ rất bất lợi cho các VKL hình thành hoa nước nhưng không cố định được Nitơ và là yếu tố chính trong

việc thay thế VKL bằng các loài sinh vật khác VKL dự trữ phospho dưới những hạt

dự trữ polyphosphate Sự dự trữ phospho ở VKL lớn hơn các vi tảo khác giúp chúng

có khả năng cạnh tranh mạnh Ngoài ra VKL chứ khí thể cũng có những đặc trưng cho phép chúng sử dụng phospho hiệu quả (Huisman và ctv, 2005)

2.2 Giới thiệu chung về chi Microcystis

2.2.1 Đặc điểm chung của chi Microcystis

Về mặt hình thái học, chi Microcystis bao gồm những loài vi khuẩn lam thường

sống trôi nổi trong các thủy vực nước ngọt như ao, hồ, sông và vùng đầm phá Chúng thường có dạng tập đoàn với hình dạng phong phú: dạng mắt lưới, dạng không có mắt

lưới, có thể phân thùy hoặc hình thành những tập đoàn con Tập đoàn Microcystis

được bao bọc bởi một bao nhầy không màu, thường đồng nhất hoặc chỉ là lớp mỏng,

một số có dạng khếch tán Các tế bào trong tập đoàn sắp xếp không theo quy luật, phân

bố với mật độ thưa thớt hoặc chiếm mật độ dày đặc trong tập đoàn Tế bào hình cầu hoặc bán cầu, thường chứa các aerotopes màu vàng nâu, nhờ thế mà chúng có thể trôi

nổi trên bề mặt của nước Đường kính tế bào từ 0.8 – 6 (9,4)µm Sinh sản nhân đôi

bằng cách phân chia tế bào trong ba mặt phẳng vuông góc (Nguyễn Thị Hoài Hà, 2007)

Chi Microcystis phân bố gần như toàn cầu và là một trong những chi quan trọng

nhất trong nghiên cứu về hồ (Dương Đức Tiến, 1996)

Microcystis sống thích hợp nhất ở những vùng nước phì dưỡng, hoặc những ao

hồ nước đọng và thường xuất hiện quanh năm khi điều kiện khí hậu thích hợp Chúng chiếm ưu thế ở nhóm thực vật phù du, hình thành “bloom” vào mùa hè và có thể gây nhiễm độc cho người và động vật bởi một số loài có thể sản sinh độc tố (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Hiện nay các nhà khoa học đã ghi nhận được khoảng 25 loài Microcystis Trong

đó có ít nhất 50% các loài trong chi này xuất phát từ vùng nhiệt đới và vùng cận nhiệt đới (Nguyễn Thị Hoài Hà, 2007)

2.2.2 Phân loại học chi Microcystis

Theo hệ thống phân loại của Van Den Hoek et al., 1995 cùng với J Komárek và

Kon Anagnostidis (1999) thì chi Microcystis được xếp vị trí như sau:

2.2.3 Chu trình sống của chi Microcystis

Trong những vùng nhiệt đới hàng năm nhiệt độ và cường độ ánh sáng cao với chênh lệch nhiệt độ giữa các mùa không lớn thì Microcystis có thể tồn tại và chiếm ưu

thế ở thủy vực quanh năm Nhưng trong những ao, hồ vùng ôn đới thì Microcystis chỉ

tồn tại chính trong mùa hè (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Ở những vùng ôn đới Microcystis tồn tại trong suốt mùa hè cho tới cuối thu, các

tập đoàn Microcystis mới biến mất hay lắng xuống ở tầng đáy của lớp nước Hiện tượng này xảy ra do sự giảm nhiệt độ vào cuối thu và do sự xáo trộn của các tầng nước trong cột nước Vì thế, chỉ có một số ít tập đoàn Microcystis của mùa hè năm này có

thể tồn tại và sống sót qua mùa đông (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Mùa đông khi tầng nước phía trên bị đóng băng, cường độ ánh sáng chiếu

xuống mặt nước giảm mạnh thì những tập đoàn Microcystis chìm xuống ở lớp trầm

tích của hồ và cố gắng tồn tại bằng cách hình thành bào tử Những tập đoàn

Microcystis sống sót được qua mùa đông sẽ phát triển quần thể trở lại nếu không bào khí còn nguyên vẹn và điều kiện nhiệt độ, ánh sáng đủ cao cho sự phát triển của chúng (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

2.3 Độc tố Microcystin

2.3.1 Cấu trúc hóa học của microcystin

Microcystin là loại độc tố dạng vòng hepatotoxic thuộc nhóm độc tố cylicpeptides của vi khuẩn lam có cấu tạo gồm 7 amino acid khác nhau, với 2 amino acid cuối cùng của dãy peptide nối liền lại hình thành nên phức hợp vòng Cấu trúc chung của microcystin như sau: Cyclo-(D-alanine-1

-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5glutamate6-Mdha7)

methyl-Hiện tại có hơn 70 dạng cấu trúc của microcystin với nhiều độc tính khác nhau

đã được xác định Mặc dù sự biến đổi cấu trúc có thể xảy ra trong cả 7 amino acid tuy nhiên dạng biến thể phổ biến nhất là microcystin-LR Những loại microcystin khác

nhau được sinh ra ở những điều kiện nhiệt độ và ánh sáng khác nhau

Microcystin có mặt ở trong một số chi của vi khuẩn lam như: Anabaena,

Microcystis, Oscillatoria (Planktothrix), Nostoc, Anabaenopsis, và 1 số loài trong chi

Hapalosiphon

Hình 1.1 Cấu trúc chung của microcystin

(Nguồn I Chorus và J Bartram 2005)

2.3.2 Ảnh hưởng của microcystin

Microcystin có thể gây sốc tuần hoàn máu do tổn thương tĩnh mạch, phá hủy các tế bào cấu trúc gan, mất cấu trúc gan, gia tăng trọng lượng của gan dẫn đến sự

xuất huyết trong gan trong vòng 2-24 giờ, máu và tim hoạt động yếu dẫn đến sự tử vong Một số cơ quan khác trong cơ thể cũng bị tấn công bởi độc tố microcystin như:

cật, phổi (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Ngoài ra độc tố microcystin có thể là những chất có khả năng gây ung thư vì microcystin có hoạt tính sinh học ức chế hoạt động của protein phosphatase 1 (PP1) và 2A (PP2A), đó là những enzyme hiện diện trong tế bào chất (cytosol) của tế bào động vật (những enzyme này rất quan trọng đối với nhiều quá trình tế bào như sự sinh trưởng, sự ngăn chặn các khối u) điều này dẫn đến mất khả năng polime hóa của các

sợi trung gian và vi sợi, làm co thắt các tế bào điều khiển sự lưu thông của máu trong gan gây ra sựu xuất huyết mạch máu của gan (Dương Đức Tiến và Trịnh Tam Kiệt)

Như vậy, sự hiện diện của những độc tố này trong nước uống biểu thị nguy cơ

rất nghiêm trọng đối với sức khỏe con người Nếu nồng độ rất thấp của những độc tố

này được hấp thụ trong một thời gian dài sẽ gây ra những bệnh gan kinh niên như ung thư gan hoặc hủ hoại tế bào gan

Tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng microcystin trong nước uống 1 µg/l là nguy cấp, dựa trên hàm lượng microcystin-LR (dạng đặc trưng của độc tố microcystin)

2.4 Tình hình nghiên cứu chi Microcystis và độc tố microcystin

2.4.1 Lịch sử phân loại Microcystis trên thế giới

Wesenburg-Lund (1904) nghiên cứu những dạng tập đoàn của Microcystis

aeruginosa và Microcystis flos-aquae đề xuất kích thước, hình dạng và khối nhầy của

tập đoàn là tiêu chuẩn để phân loại 2 chi này

Crow tìm thấy 17 loài Microcystis phù du ở hồ Ceylon năm 1932, ông và Wesenbers-Lund cho rằng hình dạng của tập đoàn và mép của bao nhầy tập đoàn nên xem là một trong những tiêu chuẩn phân loại trong khi đó Ostenfeld, Drouet và Daily

nhận thấy những đặc điểm nêu trên không ổn định Việc bảo quản mẫu bằng cách cố định formalin có thể ảnh hưởng đến đặc điểm của bao nhầy nên bao nhầy không thể là đặc điểm tin cậy để phân loại Cùng thời gian này Geitler (1932) cũng đã có kết luận tương tự

Sau này Stanier và cộng sự (1971) đề xuất chỉ những tế bào có không bào khí mới nên xem như là Microcystis Holt và cộng sự (1994) cho rằng Microcystis chính là

những tập đoàn có không bào khí, các tế bào có dạng cầu, có khuynh hướng kết hợp

lại hình thành tập đoàn bao nhầy không có hình dạng hoặc có vỏ bao Không bào khí

xem như là một tiêu chuẩn để định loại Microcystis ( trích Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Từ những năm cuối thế kỷ XX đầu thế kỷ XXI cùng với sự phát triển mạnh mẽ

của khoa học đặc biệt là công nghệ gen thì việc nghiên cứu các đặc điểm phân loại của

Microcystis vẫn tiếp tục gây tranh luận

Khởi đầu là nhóm nghiên cứu của Otsuka S với việc nghiên cứu các chủng

Microcystis trong phòng thí nghiệm, theo dõi sự thay đổi hình thái , kết hợp với việc phân tích trình tự gen và xây dựng cây phát sinh loài cho các chủng Microcystis Kết

quả Otsuka S và cộng sự thấy rằng các chủng của chi Microcystis có sự thay đổi về

hình thái Trên cơ sở đó ông kết luận những đặc trưng về tiêu chuẩn hình thái truyền

thống không còn phù hợp cho việc phân loại chi Microcystis (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Hơn nữa, khi phân tích trình tự gen 16s rDNA của sáu chủng Microcystis thuộc

5 loài Microcystis aeruginosa, Microcystis ichthyoblabe, Microcystis wesenbergii,

Microcystis viridis và Microcystis novacekii Otsuka S nhận thấy tất cả các giá trị DNA-DNA của các chủng được phân tích đều có sự tương đồng quá 70% từ đó ông đề xuất việc xuất việc hợp nhất 5 loài trên thành 1 loài với tên Microcystis aeruginosa (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Tuy nhiên quan điểm của Otsuka S vẫn chưa đủ tính thuyết phục Komárek và Komarkova (2002) nghiên cứu những loài Microcystis trong tự nhiên ở các nước châu

Âu cho rằng một số đặc trưng về hình thái của Microcystis vẫn có thể được sử dụng

trong phân loại bao gồm những đặc điểm sau:

- Hình dạng của tập đoàn

- Cấu trúc của bao nhầy

- Đường kính của tế bào

- Mật độ và tổ chức của các tế bào trong tập đoàn

- Hàm lượng sắc tố

- Chu trình sống

Komarkova và ctv (2005) cho rằng kích thước tế bào là đặc điểm hình thái ổn

định, một trong những đặc trưng chính để phân loại Microcystis

Việc phân loại dựa vào việc phân tích trình tự gen là cần thiết và đáp ứng được

sự phát triển của khoa học Tuy nhiên, tùy thuộc vào điều kiện nghiên cứu và mục đích nghiên cứu mà có những phương pháp phân tích cho phù hợp Hiện tại phương pháp phân loại truyền thống vẫn rất cần thiết đặc biệt cho những nghiên cứu quan trắc ngoài

tự nhiên

2.4.2 Tình hình nghiên cứu độc tố của Microcystis trên thế giới

Song song với những nghiên cứu về phân loại thì việc nghiên cứu độc tính của

Microcystis cũng được quan tâm hàng đầu Carmichael và ctv (1988) đã phát hiện ra

độc tố microcystin khi phân tách những hợp chất này từ loài vi khuẩn lam Microcystis

aeruginosa

Trong những báo cáo khác nhau về sự nhiễm độc tố của vi khuẩn lam đến con

người và vật nuôi thường do Microcystis gây ra Microcystin là nguyên nhân đầu tiên

gây cái chết của vật hoang dã và thú nuôi ở nhiều nước trên thế giới, chúng là mối

nguy hiểm cho sức khỏe con người nếu vô tình sử dụng nguồn nước có nhiễm loại độc

tố này trong các ao hồ và hồ chứa

Báo cáo đầu tiên về trường hợp nhiễm độc tố vi khuẩn lam có lẽ cách đây khoảng hơn 1000 năm khi một số binh lính của tướng Zhu Ge-Ling ( ở miền Nam Trung Quốc) bị nhiễm độc và chết khi uống nước từ dòng sông có màu xanh lam (Shun Zhang Yu, Pers Comm) Tuy nhiên trường hợp nhiễm độc tố vi khuẩn lam đầu tiên trên vật nuôi khi uống nước từ hồ Alexandria ở Australia được báo cáo chính thức trên tạp chí khoa học năm 1878 (Francis) Từ đó đến nay nhiều báo cáo về các trường

hợp nhiễm độc của con người và vật nuôi từ độc tố microcystin được công bố (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

“Bí ẩn bệnh ở đảo Palm” chỉ một trường hợp nhiễm độc tố vi khuẩn lam xảy ra năm 1979 tại đảo Palm ở Australia Có khoảng 140 người, phần lớn là trẻ con nhiễm

một bệnh không rõ nguyên nhân sau khi xuất hiện nở hoa của vi khuẩn lam tại vùng nước cấp cho sinh hoạt Các triệu chứng xảy ra như nôn, mửa, cật hoạt động khác thường, mất đường và protein huyết tương Kết quả phân tích máu cho thấy ở một số trẻ em có hàm lượng huyết thanh ở gan cao

Năm 1959 tại Sackatchewwan (Canada) mười ba người đa số là trẻ em bị nhiễm

bệnh với các triệu chứng như: co rút dạy dày, nôn mửa, tiêu chảy, sốt, đau đầu, đau đớn trong cơ và khớp xương, thể trạng yếu kém mà không rõ nguyên nhân Sau khi xét nghiệm chất bài tiết của một bệnh nhân các bác sĩ đã phát hiện ra số lượng tế bào

Microcystis spp và Anabaena circinalis có sản sinh ra microcystin-LR (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Trước tình hình nhiễm độc tố microcystin ngày một gia tăng và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người thì việc giám sát quản lý, nghiên cứu microcystin là

cần thiết và cấp bách để đảm bảo cho sức khỏe của cộng đồng

Trong bối cảnh đó tháng 9 năm 1989 tổ chức NRA (National Rivers Authority)

ra đời Đây là tổ chức nghiên cứu về chất lượng nước đầu tiên ở Anh, trong đó có một nhóm có nhiệm vụ chuyên nghiên cứu về độc tố của tảo Nhóm này chịu trách nhiệm đánh giá đầy đủ những vấn đề liên quan đến vi khuẩn lam và độc tố của tảo ở Anh và các nước khác trên thế giới Theo kết quả đánh giá năm 1989 của tổ chức này thì sự nở

hoa của vi khuẩn lam phân bố trên diện rộng nước Anh và có tới 60 - 70% trường hợp sản sinh ra độc tố

Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng độc tố microcystin tại các hồ nở hoa có sự thay đổi theo thời gian Sau một năm theo dõi “sự thay đổi theo mùa của độc tố

Microcystis và số lượng của microcystin ở hồ Suwa, Nhật Bản” Ho – Dong Park và

cộng sự (1996) nhận thấy có sự gia tăng hàm lượng microcystin trong tế bào trong pha phát triển hàm mũ của thời gian nở hoa Nồng độ cao nhất của microcystin lên đến 124 µg/L vào ngày 20/07/1992 Tuy nhiên hàm lượng microcystin trong nước hồ lọc cao

nhất lại vào thời điểm cuối của nở hoa nước (>20%) Điều này cho thấy rằng có sự phóng thích độc tố từ tế bào ra môi trường nước trong giai đoạn phân hủy của tế bào (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Giám sát độc tố của microcystin của vi khuẩn lam trong các hồ chứa cung cấp nước là một trong những mối quan tâm hàng đầu về chất lượng nước đối với sức khỏe con người

Kazuhiko Ozawa và cộng sự sau gần 3 năm (1998 – 2000) nghiên cứu giám sát

về quan trắc tại hồ chứa Biwa ở Northern Basin Nhật Bản (hồ cung cấp nước uống cho

14 triệu dân và là hồ lớn nhất ở Nhật Bản) nhận thấy Microcystis spp xuất hiện ở hồ

ngày càng gia tăng về mật độ trong quá trình nghiên cứu Khi phân tích hàm lượng độc

tố ở các mẫu tự nhiên và các chủng Microcystis nuôi cấy ở phòng thí nghiệm bằng phương pháp phân tích ELISA và HPLC thấy rằng nồng độ microcystin tại các điểm quan trắc cao Cũng trong nghiên cứu này nhóm tác giả đã cho thấy mối liên hệ giữa

hàm lượng độc tố trong Microcystis aeruginosa với mật độ tế bào Microcystis (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

“Khoa nghiên cứu dịch tễ học ở thành phố Haimen và thành phố Fusui (thuộc

tỉnh Guangxi – Trung Quốc) đã phát hiện mối liên quan giữa phát triển ung thư gan sơ

khởi với nguồn nước uống được sử dụng từ những hồ và những mương nhỏ Kết quả điều tra cho thấy trong năm 1993 và 1994, nồng độ microcystin trong giới hạn từ 0.058 đến 0.460 µg/l Nồng độ cao nhất xuất hiện từ tháng 6 đến tháng 9 Khi điều tra trên 26 mẫu nước trong tỉnh Guangxi thấy rằng tần số xuất hiện microcystin cao trong nước hồ và sông, nhưng microcystin không thấy ở những giếng nước nông và sâu” (Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

H Susan và cộng sự (2003), nghiên cứu về sự thay đổi hình thái trong quần thể

Microcystis, và nồng độ microcystin trong hồ Elphinstone (Central Qeensland, Australis) từ năm 1997 đến năm 2002 Kết quả cho thấy có mối quan hệ giữa điều kiện

môi trường và sự sản sinh độc tố của M panniformis, nhất là điều kiện về nhiệt độ và

Đi sâu nghiên cứu trên phương diện phân tử, R Kurmayer và ctv (2001) nghiên

cứu đa dạng gen microcystin trong quần thể vi khuẩn lam Microcystis spp ở hồ Wannsee (Berlin, Đức), nhận thấy 75% M aeruginosa đều có sự hiện diện của gen

này Các tập đoàn sản sinh microcystin đều có sự tương đồng cao trong đoạn gen bao gồm những amino acid và microcystin-LR, microcystin-RR, microcystin-YR Việc xác

định gen Mcy sinh tổng hợp microcystin trong mỗi loài, chủng Microcystis sẽ là dự

liệu khoa học góp phần làm rõ khả năng gây độc của Microcystis

Có thể nói rằng, nghiên cứu độc tố microcystin từ nhiều khía cạnh như: sinh thái học, hóa học, độc tố học, phân tử học cũng như tìm ra các phương pháp phân tích độc tố nhanh gọn, rẻ tiền, chính xác là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về độc tố của vi khuẩn lam nói chung và độc tố microcystin nói riêng hiện nay

2.4.3 Tình hình nghiên cứu độc tố của Microcystis ở Việt Nam

Ở Việt Nam từ những năm 90 trở về trước nghiên cứu vi khuẩn lam nói chung

và chi Microcystis nói riêng đa số chỉ chú trọng đến phân loại và ghi nhận về các

trường hợp nở hoa của chi Microcystis ở các thủy vực nước ngọt chứ chưa đi sâu

nghiên cứu về cá thể, các đặc tính sinh thái cũng như nghiên cứu về độc tố

Mở đầu cho việc nghiên cứu tảo phù du nước ngọt ở Việt Nam là M Levre (1933), nghiên cứu tảo phù du ở các hồ trong vườn bách thảo Sài Gòn

Dương Đức Tiến (1996) trong cuốn phân loại vi khuẩn lam ở Việt Nam đã công

bố 224 taxon Cyanophyta trong đó mô tả 15 taxon loài và dưới loài Microcystis Đây

là công trình nghiên cứu có tính hệ thống và chi tiết nhất về vi khuẩn lam cho tới thời điểm hiện nay ở Việt Nam Năm 2001 Dương Đức Tiến đã thống kê ở Việt Nam có 18 loài và dưới loài thuộc chi Microcystis hiện diện

Khi tiến hành khảo sát Hồ Tây và các hồ ở Hà Nôi, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Huế,… hồ Dầu Tiếng (Tây Ninh) vào các thời điểm khác nhau từ năm 2000 – 2002, Dương Đức Tiến và Trịnh Tam Kiệt nhận thấy ở các thủy vực có diện tích mặt nước lớn, nước đứng hoặc chảy chậm, vi khuẩn lam phát triển khiến nước có màu xanh lam nhạt Hiện tượng nở hoa nước ở tất cả các thủy vực trên hầu hết co các loài thuộc chi Microcystis gây nên, trong môi trường nước có độ pH từ 6 – 7 hàm lượng N

và P trên giới hạn cho phép Trong báo cáo này tác giả mô tả 10 loài thuộc chi

Microcystis ( theo Hồ Thị Thu Hoài, 2007)

Tiếp tục nghiên cứu về hiện tượng nở hoa nước ở sông Như Ý, trong “ Dẫn liệu

về quan hệ giữa một số yếu tố môi trường và sự nở hoa tảo lam ở sông Như Ý, tỉnh Thừa Thiên Huế” Đặng Thị Như Ý (2005 – 2006) nhận thấy nở hoa ở sông Như Ý xảy

ra khi môi trường nước trung tính hoặc có tính kiềm cao, nhiệt độ cao (>24°C), hàm lượng PO43- cao (>0,052 mg/l) và tỉ lệ N/P phù hợp (>0,052) Trong điều kiện thí nghiệm tảo Oscillatoria sp và Microcystis aeruginosa có tốc độ sinh trưởng nhanh khi nhiệt độ, pH và hàm lượng chất dinh dưỡng cao (Đặng Thị Như Ý, Phạm Thị Ngọc Lan & Tôn Thất Pháp, 2005)

Luận án tiến sĩ của Nguyễn Thị Thu Liên (2007) với đề tài “Planktic

cyanobacteria from freshwater locatities in Thuathien-Hue province, Vietnam” được xem như là công trình đầu tiên nghiên cứu vi khuẩn lam ở Huế với mô tả đầy đủ 23 loài vi khuẩn lam, phát hiện loài mới Annamia toxica cho khoa học Trong luận án này

tác giả đã mô tả 6 loài thuộc chi Microcystis, 11 chủng của loài Microcystis là M

aeruginosa, M panniformis, M botrys và M flos-aquae được tác giả phân lập và tiến hành phân tích ELISA, HPLC Kết quả cho thấy chỉ có 3 chủng của loài M flos-aquae

không phát hiện độc tố microcystin Tuy nhiên khi phân tích trình tự gen mcyA trên chủng H42 (M flos-aquae) tác giả ghi nhận có sự hiện diện của gen này

Theo đề tài nghiên cứu khoa học (2007 – 2008) của Nguyễn Thị Hoài Hà

“Nghiên c ứu đặc điểm sinh học và khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis phân l ập ở Hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội” thì với thể tích nuôi cấy nhỏ, các

chủng Microcystis đều sinh trưởng tốt trên các môi trường Bold 3N với số lượng tế

bào đạt từ 32,94 – 68,6x106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy Trên môi trường J, các chủng Microcystis sinh trưởng số lượng tế bào của các chủng đạt từ 40,42 –

76,46x106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy Trên môi trường B12, số lượng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78x106 tế bào/ml sau 12 đến 15 ngày nuôi cấy

Chương 3

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Giống Microcystis có nguồn gốc từ các ao nuôi cá tra quy mô nhỏ ở Tiền

Lame và lamella, giấy thấm, buồng đếm Sedwick - Rafter, kính hiển vi

Tủ sấy, máy hấp autoclave , máy sục khí, đèn huỳnh quang…

Test ELISA của công ty Zeu

3.3.2 Hóa chất

 Môi trường phân bò

Phân bò khô được lấy từ trại nuôi bò khoa Chăn Nuôi Thú Y Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, rồi đem phân đi ủ oai trong 3 – 5 ngày Sau đó chúng tôi tiến hành lọc bỏ phân chỉ giữ lại nước đã được ủ Phân được cân và ủ 1,2 kg/l nước

 Môi trường phân NPK

Chúng tôi sử dụng phân NPK tỉ lệ 16 – 16 – 8 Phân được cân và ngâm 60 g/l nước trước vài ngày cho phân tan ra trước khi pha vào môi trường

 Môi trường Emerson

Chúng tôi tiến hành pha chế theo công thức Phụ lục 2 pha trong 1 lít nước với

nồng độ đậm đặc lên 50 lần Sau đó mang đi hấp autoclave

 Môi trường Walne

Được pha chế theo công thức (Phụ lục 2) pha trong 1 lít nước cất với nồng độ đậm đặc 100 lần

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Điều kiện chung

Mẫu thu trong hai đợt Tiền Giang và An Giang tại các ao ương cá tra giống với quy mô nhỏ Ao ở Tiền Giang thu vào tháng 10/2011 thời điểm trời mưa, một tháng chưa thay nước Ao ở An Giang thu vào thời điểm tháng 12/2012 trời nắng, trước đó là

ao ương cá tra giống nhưng hiện tại là ao nuôi thịt và cá đã xuất bán còn lại trong ao

một ít cá

Microcystis dạng tập đoàn được đếm bằng cách tiến hành đếm số lượng tế bào

của 10 tập đoàn ở độ phóng đại x 400, sau đó lấy giá trị trung bình số tế bào của một tập đoàn, trên sơ sở đó đếm số lượng của tập đoàn rồi suy ra số lượng tế bào, còn

Microcystis dạng tế bào chúng tôi tiến hành đếm từng tế bào

Với các mẫu có mật độ dày thì tiến hành pha loãng từ 10 lần đến 20 lần tùy theo mật độ Microcystis nhiều hay ít, dạng tập đoàn hay dạng đơn bào mà ta lựa chọn cách đếm cho phù hợp

Mỗi nghiệm thức được bố trí với ba lần lập lại

Các nghiệm thức bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

Thời gian theo dõi được kéo dài cho tới khi tảo ở pha cân bằng hay pha tàn lụi

Sự tăng mật độ tảo được theo dõi bằng cách sử dụng buồng đếm Sedwick Rafter, đếm

số lượng tảo hàng ngày

Mỗi ngày tảo được lắc đều và chiếu sáng liên tục

3.4.2 Các thí nghiệm

3.4.2.1 Th ử nghiệm môi trường

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự tăng trưởng của Microcystis spp.ở bốn môi trường Walne, Emerson, phân NPK, phân bò

Thí nghiệm một yếu tố gồm bốn nghiệm thức W1, E1, NPK1, PB1 và W2, E2, NPK2, PB2 tương ứng với hai đợ t thu mẫu với b ốn môi trường: môi trường Walne, môi trường Emerson, môi trường phân NPK và môi trường phân bò ở nồng độ là 1,2 g/l được bố trí trong bình tam giác 250 ml

Thí nghiệm 2: Khảo sát tăng trưởng của Microcystis spp ở môi trường có bốn

mức nồng độ phân NPK khác nhau

Thí nghiệm một yếu tố gồm 4 nghiệm thức N1.1, N1.2, N1.3, N1.4 và N2.1, N2.2, N2.3, N2.4 tương ứng với hai đợt thu mẫu với b ốn mức nồng độ phân NPK: 0,06 g/l; 0,12 g/l ; 0,18 g/l ; 0,24 g/l

Thí nghiệm 3: Khảo sát tăng trưởng của Microcystis spp ở môi trường có bốn

mức nồng độ phân bò khác nhau

Thí nghiệm một yếu tố gồm 4 nghiệm thức P1.1, P1.2, P1.3, P1.4 và P2.1, P2.2, P2.3, P2.4 tương ứng với hai đợt thu mẫu với b ốn mức nồng độ phân bò : 1,2 g/l; 2,4 g/l; 3,6 g/l; 4,8 g/l

3.4.2.2 Th ử nghiệm mật độ

Thí nghiệm 4: Khảo sát tăng trư ởng của Microcystis spp trong môi trường

phân bò với bốn mức mật độ tảo khác nhau

Thí nghiệm một yếu tố gồm bốn nghiệm thức M1.4, M1.8, M1.12, M1.16 và M2.4, M2.8, M2.12, M2.16 tương ứng với hai đợt thu mẫu với b ốn mức mật độ ban đầu khoảng: 4x104

sục khí 24/24

3.4.2.4 Th ử nghiệm nuôi sinh khối

Thí nghiệm 6: Khảo sát sự tăng sinh khối của Microcystis spp ở các thể tích

3.4.3 Xác định hàm lượng Microcystin trong các môi trường nuôi

Dùng test ELISA của công ty Zeu (có chứng nhận của EU) theo quy định chung khuyến cáo Sau khi cho các loại hóa chất theo chỉ dẫn rồi đem ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 30 phút rồi đọc ở bước sóng 405 nm và so sánh với ống chuẩn

Bước sóng mẫu (AS) Lượng microcystin

AS > A0,5 < 0,5 µg/L (Mức 1)

AS > A2,5 < 2,5 µg/L (Mức 3)

AS < A2,5 > 2,5 µg/L (Mức 4)