ẢNH HƯỞNG CỦA MANNAN OLIGOSACCHARIDE (MOS) TRONG CHẾ PHẨM ACTIGEN LÊN SỰ CẢI THIỆN HỆ MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Họ và tên sinh viên: NGÔ LÂM TRUNG NGUYÊN Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành: NGƯ Y Niên khóa: 200

Ảnh hưởng của MOS Actigen lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra sau 10 tuần nuôi thí nghiệm sử dụng thức ăn bổ sung MOS Actigen .... Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ẢNH HƯỞNG CỦA MANNAN OLIGOSACCHARIDE (MOS)

HỆ MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus)

H ọ và tên sinh viên: NGÔ LÂM TRUNG NGUYÊN Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Chuyên ngành: NGƯ Y Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07/2012

Ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide (MOS) trong chế phầm Actigen

lên sự cải thiện hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus)

TRANG TỰA

Tác giả NGÔ LÂM TRUNG NGUYÊN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư Nuôi Trồng Thủy Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:

PGS - TS LÊ THANH HÙNG ThS HỒ THỊ TRƯỜNG THY

Tháng 07 năm 2012

LỜI CẢM TẠ

Để có thể hoàn thành tốt khóa luận, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, Ban chủ nhiệm khoa Thủy

sản, cùng tất cả các quý thầy cô giáo đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khoảng thời gian học tại trường

Đặc biệt, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Thanh Hùng, cô Hồ Thị Trường Thy, cô Truyện Nhã Định Huệ và cô Võ Thị Thanh Bình đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn chị Đào Ngọc Thủy, anh Lê Hồng Ngọc, các anh em ở

trại cũ khoa thủy sản trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, cùng tất cả các bạn trong và ngoài lớp DH08NY đã đồng hành cùng tôi và giúp đỡ tôi trong khoảng thời gian qua

Và xin gởi lời tri ân chân thành đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ tôi, tạo cho tôi sức mạnh để có thể phấn đấu trên con đường học tập, cảm ơn anh chị em cùng

tất cả những bạn bè quanh tôi đã cổ vũ, động viên những lúc tôi phải gặp khó khăn

Cuối cùng, chân thành cảm ơn công ty Alltech đã cung cấp chế phẩm MOS (Actigen) để tôi có thể thực hiện đề tài này

Do có những hạn chế về mặt thời gian cũng như về mặt kiến thức nên khóa luận này không thể tránh khỏi những thiếu sót, khuyết điểm Rất mong nhận được những ý

kiến đóng góp của quý thầy cô cùng các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012

Ngô Lâm Trung Nguyên

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide (MOS) trong chế

phẩm Actigen lên sự cải thiện hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được tiến hành tại Trại thực nghiệm Thủy Sản (trại cũ), phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, khoa Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 8/2011 đến tháng 3/2012 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên

Thí nghiệm được tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide (MOS) có trong chế phẩm Actigen lên sự cải thiện sức khỏe của cá tra

Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức (NT ĐC, NT A1, NT A2, NT A3) với các tỷ lệ

bổ sung MOS (Actigen) vào thức ăn khác nhau lần lược là 0; 0,4; 0,8 và 1,2 g/kg thức

ăn và tiến hành cho cá tra ăn trong thời gian 10 tuần

Sau đó, chúng tôi tiến hành thu mẫu máu cá tra để kiểm tra lượng bạch cầu và lysozyme trong máu Tiếp theo cá được cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Kết quả thu được:

- Lượng bạch cầu trong máu cá tăng theo thứ tự NT ĐC, NT A1, NT A3, NT A2 Trong đó, sự khác biệt giữa NT A2 và NT A3 so với NT ĐC là có ý nghĩa về mặt

thống kê và khác biệt một cách tương đối so với NT A1 Còn giữa NT A2 và NT A3 thì hoàn toàn không có sai khác Bên cạnh NT A2 có tác dụng làm tăng số lượng bạch

cầu rõ rệt thì NT A3 cũng làm tăng số lượng bạch cầu một cách đáng kể

Kết luận: khi bổ sung MOS (Actigen) từ 0,8 g/kg thức ăn trở lên (đến 1,2 g/kg thức ăn) giúp làm tăng số lượng bạch cầu trong máu cá tra và sự sai khác này (tăng) có

ý nghĩa về mặt thống kê so với NT ĐC

- Hoạt lực lysozyme trong huyết thanh của máu cá tăng theo thứ tự NT ĐC, NT A2, NT A1, NT A3 Trong đó, sự khác biệt giữa NT A3 so với NT ĐC là có ý nghĩa

về mặt thống kê Bên cạnh đó, giữa NT A3 so với NT A2 và NT A1 vẫn có sự sai khác một cách tương đối về mặt thống kê

Kết luận: bổ sung MOS (Actigen) đến mức 1,2 g/kg thức ăn giúp làm tăng hoạt lực của lysozyme trong máu cá tra và sự sai khác này (tăng) có ý nghĩa về mặt thống

kê so với NT ĐC

- Cảm nhiễm với vi khuẩn E ictaluri: tỉ lệ cá sống ở các nghiệm thức tăng dần

theo thứ tự NT ĐC, NT A1, NT A2, NT A3 Trong đó, NT A3 có tỉ lệ sống cao nhất Đồng thời sự khác biệt của NT A3 so với NT ĐC, NT A1 là có ý nghĩa và khác biệt một cách tương đối so với NT A2 về mặt thống kê

Kết luận: bổ sung MOS (Actigen) đến mức 1,2 g/kg thức ăn giúp làm tăng tỉ lệ

sống của cá tra khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn E ictaluri ở nồng độ 1x106

CFU/mL

và sự sai khác này (tăng) có ý nghĩa về mặt thống kê so với NT ĐC

Tóm lại, thí nghiệm cho thấy lượng MOS (Actigen) bổ sung mang lại hiệu quả

tối ưu trên cá tra là 1,2 g/kg thức ăn Ở mức này, sự sai khác về số lượng bạch cầu trong máu cá, hoạt lực của lysozyme trong huyết thanh cũng như khả năng chống lại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri khi gây cảm nhiễm ở 1x106

CFU/mL của cá tra có ý nghĩa

về mặt thống kê so với NT ĐC (P < 0,05)

MỤC LỤC

TRANG TỰA i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

DANH SÁCH CÁC BI ỂU ĐỒ xi

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm sinh học cá tra 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 3

2.1.4 Điều kiện môi trường sống 4

2.1.4.1 Hàm lượng oxy hoà tan 4

2.1.4.2 pH 4

2.1.4.3 Nhiệt độ 4

2.1.4.4 Độ mặn 4

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 4

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng 4

2.1.7 Đặc điểm sinh sản 5

2.2 Sơ lược về bệnh Gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây trên cá tra 5

2.2.1 Lịch sử bệnh 5

2.2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 6

2.2.2.1 Phân loại 6

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 7

2.2.2.3 Chuẩn đoán 8

2.2.2.3 Dịch tể bệnh 8

2.2.4 Dấu hiệu bệnh lý 10

2.2.4.1 Triệu chứng 10

2.2.4.2 Bệnh tích đại thể 10

2.2.4.3 Bệnh tích vi thể 10

2.2.5 Phòng bệnh 10

2.2.6 Trị bệnh 11

2.2.7 Một số đối tượng cảm nhiễm khác của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 11

2.3 Prebiotic 11

2.3.1 Saccharomyces cerevisiae 12

2.3.2 Mannan oligosaccharide (MOS) 13

2.3.2.1 Giới thiệu MOS 13

2.3.2.2 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của MOS 14

2.3.2.3 Tác động của MOS 15

2.3.3 Những nghiên cứu và khảo nghiệm của MOS ở động vật thuỷ sản 17

2.3.4 MOS trong chế phẩm Actigen 19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm 21

3.2 Vật liệu 21

3.2.1 Vật liệu 21

3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 21

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra 21

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng đề kháng của cá tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 22

3.2.3 Nguồn nước 23

3.2.4 Thức ăn 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng miễn

dịch không đặc hiệu của cá tra 23

3.3.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm cho cá tra ăn thức ăn bổ sung MOS (Actigen) 23

3.3.1.2 Kiểm tra số lượng bạch cầu trong máu cá 24

3.3.1.3 Phân tích lysozyme 26

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng đề kháng của cá tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 27

3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm 27

3.3.2.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn 27

3.3.2.3 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm 28

3.3.2.4 Phương pháp theo dõi thí nghiệm 30

3.3.2.5 Xét nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh 31

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Các yếu tố chất lượng nước trong thời gian tiến hành thí nghiệm 32

4.1.1 Các yếu tố môi trường nước trong quá trình thí nghiệm (10 tuần) cho cá ăn thức ăn có chứa MOS (Actigen) 32

4.1.2 Các yếu tố môi trường nước trong quá trình gây cảm nhiễm cá với vi khuẩn E ictaluri 32

4.2 Ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra sau 10 tuần nuôi thí nghiệm sử dụng thức ăn bổ sung MOS (Actigen) 33

4.2.1 Số lượng bạch cầu trong máu cá 33

4.2.2 Hoạt lực lysozyme trong huyết thanh máu cá 34

4.3 Ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng đề kháng của cá tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 47

D ANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

µm: micrometer

ADG: Average Daily Gain

BHIA: Brain Heart Infusion Agar

BHIB: Brain Heart Infusion Broth

BKC: Benzalkonium Chloride

CFU: Colony Forming Unit

cm: centimeter

ctv: cộng tác viên

DO: Dissolved Oxygen

EDTA: Ethylen Diamin Tetra Acetat

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ESC: Enteric Septicemia of Catfish

OD: Optical Density

PCR: Polymerase Chain Reaction

pH: Potential of hydrogen

TN: thí nghiệm

TSA: Tryptic Soy Agar

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các đặc điểm sinh hóa của E.ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006) 7

Bảng 2.2: Khả năng kết dính mầm bệnh của MOS 16

Bảng 4.1: Biên độ dao động của các yếu tố môi trường trong thời gian 10 tuần cho cá thí nghiệm ăn thức ăn có bổ sung MOS (Actigen) 32 Bảng 4.2: Số lượng bạch cầu đếm được trong các mẫu máu cá tra thí nghiệm 33

Bảng 4.3: Hoạt lực lysozyme trong huyết thanh của cá thí nghiệm 35Bảng 4.4: Tỷ lệ sống của cá tra sau 14 ngày gây cảm nhiễm bởi vi khuẩn E ictaluri 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái bên ngoài cá tra 3

Hình 2.2: Nhuộm Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7

Hình 2.3: Nội tạng cá tra xuất hiện các đốm mủ trắng 10

Hình 2.4: Nấm men Saccharomyces cerevisiae 12

Hình 2.5: Cấu trúc vách tế bào Saccharomyces cerevisiae 13

Hình 2.6:Cấu trúc hoá học của α-D-mannan chiết xuất từ Saccharomyces cerevisiae 14

Hình 2.7: Cách thức kết dính mầm bệnh của MOS 16

Hình 2.8: Cấu trúc của MOS (Actigen) 20

Hình 3.1: Cỡ cá tra thí nghiệm 21

Hình 3.2: Thức ăn thí nghiệm 23

Hình 3.3: Bố trí giai và bể thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung MOS (Actigen) 24

Hình 3.4: Hút máu cá thí nghiệm bằng ống tiêm 1cc 25

Hình 3.5: Buồng đếm hồng cầu Neubauer 26

Hình 3.6: Huyết thanh cá thu được sau khi ly tâm máu 27

Hình 3.7: Đo OD của hỗn hợp huyết thanh và vi khuẩn M lysodeikticus sau 1’ và 5’ thực hiện phản ứng ở 25oC 27

Hình 3.8: Vi khuẩn được tăng sinh trong bình tam giác chứa môi trường BHIB 28

Hình 3.9: Cấy ria để phân lập vi khuẩn từ nội tạng cá thí nghiệm 28

Hình 3.10: Cấy trang để xác định mật độ vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm 29

Hình 3.11: Bố trí xô ngâm cá gây bệnh 29

Hình 3.12: Vi khuẩn và dụng cụ gây bệnh 30

Hình 3.13: Cá được ngâm với vi khuẩn và có sụt khí liên tục 30

Hình 3.14: Cá được chuyển lại bể Composite sau khi ngâm với vi khuẩn 30

Hình 4.1: Các đốm mủ trắng xuất hiện trên nội tạng của cá thí nghiệm 37

Hình 4.2: Cá bị xuất huyết vây, hàm dưới, da 37

Hình 4.3: Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh 38

Hình 4.4: Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh 38

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Số lượng bạch cầu trong máu cá ở các NT sau 10 tuần thí nghiệm 34 Biểu đồ 4.2: Hoạt lực lysozyme trong huyết thanh máu cá sau 10 tuần thí nghiệm 35

Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ cá chết ở các NT khi gây cảm nhiễm bởi E ictaluri 36

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Nghề nuôi trồng thủy sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành đóng góp đáng kể trong kim ngạch sản xuất Trong đó, cá tra đang là đối tượng thủy

sản xuất khẩu với nhiều mặt hàng chế biến đa dạng được xuất khẩu qua nhiều nước trên thế giới Trước những giá trị lợi nhuận cao do cá tra mang lại đã dẫn đến mức độ nuôi thâm canh cao và diện tích nuôi nhanh chóng được mở rộng Từ đó đã dẫn đến sự phát sinh của nhiều loại bệnh gây tỷ lệ chết ngày càng gia tăng Dịch bệnh do vi khuẩn gây ra là một trong những trở ngại chính của mô hình nuôi thủy sản thâm canh (Kohler, 2000)

Để phòng trị bệnh do vi khuẩn, người nuôi thường sử dụng kháng sinh Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong việc điều trị bệnh tạo ra một hệ lụy nghiêm trọng

là sự tồn dư của kháng sinh trong cơ thịt cá ảnh hưởng đến người tiêu dùng, dễ tạo ra những dòng vi khuẩn kháng thuốc và có thể làm tác động đến môi trường, hệ sinh thái của khu vực (Sarter và ctv., 2007) Điều này dẫn đến việc điều trị bệnh ngày càng gặp nhiều khó khăn

Vì vậy, việc duy trì tình trạng sức khỏe tốt của động vật thủy sản nuôi nói chung và cá tra nói riêng thông qua việc quản lý tốt ao nuôi kết hợp sử dụng những hợp chất có hoạt tính sinh học như Mannan Oligosaccharide (MOS), Galacto Oligosaccharide (GOS), Fructo Oligosaccharide (FOS) nhằm hạn chế việc sử dụng kháng sinh đang là xu hướng phổ biến hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực dinh dưỡng sử dụng các loại hoạt chất sinh học bổ sung vào thức ăn và được đánh giá là chúng có khả năng nâng cao đáp ứng miễn dịch cũng như tăng trưởng và cải thiện tỉ lệ sống của nhiều loài vật nuôi

MOS (Actigen) - là sản phẩm của công ty Alltech - được cắt nhỏ từ Bio-Mos®

, thành phần chứa Mannan Oligosaccharide được ly trích từ tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae, có tác dụng điều chỉnh khả năng đáp ứng miễn dịch, cải thiện tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn (Miguel và ctv., 2004) Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá việc bổ sung MOS (Actigen) vào các loài vật nuôi Các nghiên

cứu của MOS (Actigen) trên heo, gà thịt, gà tây và một số loài khác cho thấy có thể sử dụng MOS (Actigen) liều thấp hơn nhiều lần so với Bio-Mos® (Tài liệu kỹ thuật của Alltech, 2010) Tuy nhiên, hiện tại chưa có nghiên cứu về tác động của MOS (Actigen) đối với cá tra

Trước những yêu cầu đặt ra là tăng cường sức đề kháng và cải thiện tỷ lệ sống

để nâng cao hiệu quả kinh tế trên cá tra, đề tài “Ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide (MOS) trong chế phẩm Actigen lên sự cải thiện hệ miễn dịch

không đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được tiến hành

Chương 2

2 1 Đặc điểm sinh học cá tra

Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)

Hình 2.1: Hình thái bên ngoài cá tra

2 1.2 Phân bố

Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê – kông Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên thuộc địa phận Việt Nam do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê – kông để sinh sống và tìm nơi sống tự nhiên

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Thân dài, hẹp ngang, đầu nhỏ vừa phải Có hai đôi râu trong đó đôi râu hàm trên ngắn hơn ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới ngắn hơn chiều dài đầu Gai trên cùng mang thưa và ngắn nên không có tác dụng lọc thức ăn như cá ăn sinh vật phù du Vây lưng và vây ngực có gai cứng mang răng cưa ở mặt sau Vây mỡ nhỏ, vây hậu môn tương đối dài Da trơn không có vẩy, hơi xanh trên mặt lưng

2.1.4 Điều kiện môi trường sống

2.1.4.1 Hàm lượng oxy hoà tan

Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên chịu được hàm lượng oxy hòa tan thấp Do

đó, cá có thể nuôi trong các ao nước tù, dơ bẩn, nơi có nhiều chất hữu cơ hay nuôi trong bè với mật độ dày (www.fistenet.gov.vn)

2.1.4.2 pH

Cá có khả năng chịu đựng pH từ 5 – 11, nhưng pH thích hợp cho cá phát triển

nhất là 6,5 – 7,5 Ở pH = 5 cá có biểu hiện mất nhớt, các đôi râu teo dần, hoạt động

chậm chạp, khi pH = 11 cá sẽ hoạt động lờ đờ và mất nhớt

2.1.4.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ sống thích hợp cho cá tăng trưởng dao động trong khoảng 26 – 30o

C (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2001) Cá tra là loài chịu lạnh kém vì cá tra là một trong những loài đặc trưng cho loài phân bố ở vùng nhiệt đới

Ở nhiệt độ 15o

C thì cường độ bắt mồi của cá giảm, nhưng cá vẫn sống, ở nhiệt độ

39oC cá sẽ bơi lội không bình thường (Trần Thanh Xuân, 1994)

2.1.4.4 Độ mặn

Cá tra là loài sống chủ yếu ở nước ngọt, không sống được ở vùng nước mặn Nhưng có khả năng sống trong vùng nước lợ, độ mặn có thể chịu đựng tối đa là 10‰ (Mai Đình Yên và ctv., 1992)

2 1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống Vì vậy, chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu cá ương không được cho ăn đầy đủ Dạ dày của cá phình to hình chữ U và co giãn được, ruột cá tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục

Dạ dày to và ruột ngắn là đặc điểm của cá thiên về ăn thịt Khi cá lớn thể hiện rõ tính

ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi thức ăn Trong điều kiện thiếu thức ăn cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu

cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10 - 12cm (khoảng 14 - 15g) Từ

khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể Cỡ

cá 10 tuổi trong tự nhiên tăng trọng rất ít và có thể sống trên 20 năm, kích thước tối đa đạt được là 1,8 m Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 – 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 – 6 kg/năm tùy môi trường, loại thức ăn sử dụng

2 1.7 Đặc điểm sinh sản

Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành

thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông thuộc địa

phận Campuchia và Thái Lan

Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ nên nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phân biệt được đực, cái Ở thời kỳ thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn

gọi là buồng tinh, cá cái gọi là buồng trứng Tuyến sinh dục của cá tra bắt đầu phân biệt đực cái từ giai đoạn II tuy màu sắc chưa khác nhau nhiều Các giai đoạn sau,

buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có hình dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần sang màu trắng sữa

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch, cá

có tập tính di cư sinh sản tự nhiên trên khúc sông có điều kiện sinh thái thích hợp thuộc địa phận Campuchia và Thái Lan, không sinh sản tự nhiên ở phần sông Việt Nam Cá đẻ trứng dính vào giá thể thường là rể của loài cây sống ven sông Gimenlasiatica sau 24 giờ thì trứng nở thành cá bột và trôi về hạ nguồn

Trong sinh sản nhân tạo có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm), cá tra có thể tái phát dục từ 1 – 3 lần trong 1 năm Sức sinh sản tuyệt đối từ 200.000 đến vài triệu trứng Sức sinh sản tương đối 135.000 trứng/kg cá cái Trứng sắp đẻ có đường kính trung bình 1mm sau khi đẻ ra và hút nước có thể tới 1,5 - 1,6mm

2.2 Sơ lược về bệnh Gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

2.2.1 Lịch sử bệnh

Tại Hoa Kỳ vào năm 1976, bệnh được ghi nhận, phân lập và định danh đầu tiên

trên cá nheo Ictalurus punctatus (Hawke, 1979)

Bệnh được mô tả khá đầy đủ về triệu chứng và bệnh tích đặc trưng vào năm

1979, tuy nhiên chưa xác định được nguyên nhân gây ra bệnh (Hawke, 1979)

Vào năm 1981, nguyên nhân gây bệnh lần đầu tiên được xác định là do vi khuẩn gây ra, vi khuẩn được đặt tên là Edwardsiella ictaluri (Shotts và ctv.,1981) Tên

bệnh là Enteric Septicemia of Catfish - ESC, được dịch là “Bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột”, hay có tên gọi là Hole in the head disease hay “Bệnh lổ đầu”

Đến năm 1987, ở Thái Lan đã xảy ra dịch bệnh trên cá trê Clarias bactrachus

do vi khuẩn E ictaluri gây ra

Cho đến năm 1992, bệnh đã xuất hiện trên cá tra, cá basa nuôi trong ao, bè ở

Việt Nam với những đốm hoại tử trên gan, thận, lách nhưng không rõ tác nhân gây

bệnh

Vào cuối năm 1998, bệnh xuất hiện và được mô tả lần đầu tiên trên cá tra nuôi

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (Ferguson và ctv., 2001)

Bệnh được người nuôi gọi tên là bệnh mủ gan hay bệnh gan thận mủ

Ferguson và ctv (2001) đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh gan

thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam, vi khuẩn được định danh là Bacillus sp

Cho đến năm 2002, các nhà nghiên cứu đã đính chính lại nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv., 2003)

Năm 2004, ở Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh xuất hiện trên cá hồi cầu vồng Oncorhynchus mykiss Phát hiện mới đây cho thấy vi khuẩn cũng gây bệnh trên cá Ayu Plecoglossus altivelis (Nhật)

2.2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Hình 2.2: Nhuộm Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

E.ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, gây bệnh bắt buộc Nó có khả năng gây

bệnh cho cá khoẻ, vi khuẩn kén vật chủ Đây là trực khuẩn gram âm, kích thước 0,75 x 1,25 µm, di động yếu, hình que mảnh, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm

mao E ictaluri cho phản ứng catalase dương tính, oxidase âm và lên men trong môi trường O/F glucose, H2S (-) tính, Indol (-) tính Có từ 1 – 3 plasmid liên kết với

E.ictaluri, những plasmid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với

kháng sinh (Speyerer và Boyle, 1987; Newton và ctv., 1988) Thành phần Guanin và Cytozin trong AND là 55 – 59 % (Bùi Quang Tề, 2006) E.ictaluri là một trong những

loài khó phát triển của giống Edwardsiella Vi khuẩn phát triển chậm trong môi trường

nuôi cấy, cần từ 36 – 48 giờ mới phát triển thành những khuẩn lạc nhỏ trong môi trường thạch BHIA (Brain Heart Infusion Agar) ở 28 – 30 oC và tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng ở nhiệt độ 37 o

C (Valerie và ctv., 1994)

Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, lách) trên môi trường BHIA, NA hay TSA + 5 % máu Tuy nhiên, môi trường BHIA giúp vi khuẩn phát triển tốt hơn Khuẩn lạc của E.ictaluri có hình tròn nhỏ, màu trắng đục, ở tâm khuẩn

lạc có màu hơi vàng, rìa có răng cưa (Bùi Quang Tề, 2006)

Bảng 2.1: Các đặc điểm sinh hóa của E.ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006)

Di động ở 25o

Di động ở 35o

Sinh Indol -

Sinh H2S trong triple sugar iron -

Sinh H2S trong pepton iron agar -

Phát triển ở nồng độ muối 1,5% +

Phát triển ở nồng độ muối 3 % -

2.2.2.3 Chuẩn đoán

Dựa vào dấu hiệu bệnh và phân lập mẫu bệnh phẩm từ các vị trí gan, thận, lách

của cá bệnh trên môt số môi trường như: BHIA, TSA+ 5% máu cừu Trên các môi

trường này khuẩn lạc của E.ictaluri thường nhỏ li ti sau 24h ủ ở 30o

C, sau 48h ủ khuẩn

lạc phát triển lớn hơn và rõ nét hơn

Ngoài ra có thể sử dụng một số phương pháp kỹ thuật khác như: PCR, ELISA,

miễn dịch, các bộ kit định danh thương mại có bán trên thị trường

2.2.2.3 Dịch tể bệnh

Vi khuẩn E ictaluri thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc, có thể gây bệnh ngay cả trên cá khỏe mạnh Cỡ cá mắc bệnh thường có trọng lượng khoảng từ 0,2 g – 300g/con (cá giống và cá thịt) Cá giống có tỉ lệ chết cao hơn cá thương phẩm, tỷ lệ cá giống chết có thể lên đến 100% sau 5 ngày mắc bệnh, cá thương phẩm mắc bệnh chết

30 - 50% sau 1 đợt dịch

Vi khuẩn tồn tại trong gan, thận, não cá sau khi khỏi bệnh được vài tháng Chính vì vậy mà có sự kích thích tạo thành đáp ứng miễn dịch có thể giúp cá vượt qua được các sự nhiễm trùng và các dịch bệnh xảy ra sau này

E ictaluri có khả năng sinh tồn dạng yếu do nó chỉ sống được trong nước một

thời gian ngắn, khoảng 8 ngày (Hawke, 1979) Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại trong bùn đến 95 ngày ở 25o

1994) Vi khuẩn này tấn công vào mũi làm giảm chức năng của niêm mạc mũi ở lớp

màng nhầy Khi quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy có sự hiện diện E ictaluri trên bề

mặt màng nhầy và trong biểu mô

- E ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa Đầu tiên vi khuẩn qua đường miệng, phát triển ở ruột, gan, thận và cơ trong vòng 2 tuần gây cảm nhiễm làm ruột trương to, đầy hơi (Fracis – Floyd và ctv., 1987) Bằng con đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu

- E ictaluri cũng xâm nhập qua mang Thí nghiệm chứng minh trong suốt quá

trình ngâm, vi khuẩn sống thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng lớn , sau đó gia tăng ở gan và ít phát triển ở thận sau, ruột và não (Nusbaum và Plumb, 1996)

Phương thức lây lan: Vi khuẩn được bài thải từ phân, xác cá chết vào trong nước đây là con đường truyền lây trực tiếp từ cá này sang cá khác trong ao nuôi Bệnh cũng có thể lây lan một cách gián tiếp như: chim, động vật, người, dụng cụ sử dụng như lưới, vợt dùng chung cho các ao

Bệnh thường bộc phát mạnh vào mùa xuân, mùa thu ở các tỉnh miền Bắc và trong các ao nuôi mật độ cao, chất lượng nước xấu và trong nuôi cá lồng bè (Từ Thanh Dung, 2000; Bùi Quang Tề, 2003) Bệnh cũng thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ và kéo dài đến mùa khô, thời điểm bùng phát bệnh cũng khác nhau tùy theo từng năm Bệnh còn xảy ra phổ biến trong các tháng có thời tiết chuyển mát (tháng 9 - 12), trong

thời gian này nhiệt độ nước có thể giảm thấp đến 26 - 28o

C (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thị Thanh Loan, 2007)

Theo Hawke và ctv (1998), E.ictaluri có khả năng gây bệnh cao nhất cho cá nheo Ictalurus punctatus nuôi ở Hoa Kỳ khi nhiệt độ nước trong khoảng 20 - 28o

C

Như vậy, có khả năng E.ictaluri gây bệnh trên cá tra tại Việt Nam có đặc điểm gây

bệnh trong điều kiện nhiệt độ nước mát tương tự như trên cá nheo (Nguyễn Hữu Thịnh

và Trương Thị Thanh Loan, 2007) Nhưng gần đây do mật độ nuôi ngày càng cao, môi trường ô nhiễm, mầm bệnh tích tụ trong ao nên bệnh cũng xuất hiện thường xuyên trong tháng thời tiết nóng (tháng 4, 5 và 6) mặc dù mức độ thiệt hại có thấp hơn (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thị Thanh Loan, 2007)

Vi khuẩn có khả năng gây bệnh cao nhất khi nhiệt độ nước thấp, khoảng 20 -

28oC, đặc biệt khi nhiệt độ 25 - 28oC, nhưng khi nhiệt độ nước khoảng 30oC trở lên, cá

phản ứng kích thích thường chậm chạp, cá bị mất thăng bằng và bơi bơi xoay vòng Cá

bỏ ăn ngay sau khi nhiễm khuẩn

2.2.4.2 Bệnh tích đại thể

Khi quan sát biểu hiện bên ngoài cá bệnh thường thấy cá bị xuất huyết quanh

hậu môn, miệng, bụng và các gốc vây Thỉnh thoảng có tích dịch dưới da vùng sọ (cá

bị phù đầu), mang cá bị nhạt màu

Hình 2.3: Nội tạng cá tra xuất hiện các đốm mủ trắng ( Nguồn: http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=11)

2 2.5 Phòng bệnh

Cải tạo ao đúng quy trình kỹ thuật

Chọn con giống khỏe mạnh có nguồn gốc rõ ràng, không bị nhiễm bệnh

Nuôi với mật độ vừa phải, tránh gây stress cho cá, đặc biệt là vào thời gian có nhiệt độ nước thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn 20-28o

C

Hạn chế sử dụng hóa chất diệt kí sinh trùng như CuSO4 vì có thể sẽ làm giảm

chất lượng nước và khả năng đề kháng của cá

Đối với cá bệnh, cá yếu, cá chết nên vớt và chôn hố có rải vôi

Giảm lượng thức ăn hoặc ngưng cho ăn để giảm ô nhiễm nước ao và giảm khả năng lây lan vi khuẩn khi thấy xuất hiện cá bệnh

Dụng cụ sử dụng nên phơi nắng hay ngâm Chlorine, BKC để diệt mầm bệnh tốt

nhất sử dụng dụng cụ riêng cho mỗi ao để tránh lây lan mầm bệnh

2.2.6 Trị bệnh

Bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri gây ra nên do đó có thể điều trị bằng

kháng sinh Song việc sử dụng kháng sinh phải đúng nguyên tắc đó là: đúng liều, đúng lượng, đúng loại kháng sinh, đúng liệu trình, tránh phối hợp các loại kháng sinh ức chế nhau

Tuy nhiên với việc sử dụng kháng sinh tràn lan như hiện nay đã dẫn đến hệ quả

là vi khuẩn không còn nhạy cảm với kháng sinh, gây tốn kém và không đạt hiệu quả trong điều trị Do đó nguyên tắc chính trong nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi cá tra nói riêng vẫn là phòng bệnh hơn chữa bệnh

2.2.7 Một số đối tượng cảm nhiễm khác của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn E ictaluri có khả năng gây bệnh tự nhiên trên nhiều loài cá như bệnh viêm ruột và nhiễm trùng máu trên cá nheo Ictalurus punctatus (Hawke, 1979; Hawke

và ctv., 1981); cá dao xanh Eigemannia virescens (Kent và Lyons, 1982); cá danio Danio devano (Blazer và ctv., 1985, Waltman và ctv., 1985), và cá trê Clarias batrachus (Kasornchandra và ctv., 1987)

Vi khuẩn E ictaluri còn gây bệnh trên một số loài trong điều kiện thí nghiệm như cá hồi chinook Oncorhynchus tshauytscha và cá hồi vân Oncorhynchus mykiss

(Baxa và ctv., 1990; trích dẫn bởi Võ Thị Thanh Bình, 2008)

2.3 Prebiotic

Prebiotic được định nghĩa là những thành phần thức ăn không tiêu hóa được nhưng có tác dụng kích thích sự phát triển hoặc tăng cường hoạt động của các vi

khuẩn có ích trong đường ruột và từ đó cải thiện đường tiêu hóa của vật nuôi (Gibson

và Roberfroid, 1995)

Một số prebiotic thường gặp là Fructo Oligosaccharide (FOS), Galacto Oligosaccharide (GOS), Mannan Oligosaccharide (MOS), và inulin (Teitelbaum và Walker 2002) MOS, GOS hay FOS là những hợp chất oligosaccharide thuộc nhóm carbohydrate

Ở động vật trên cạn prebiotic có tác dụng: Kích thích vi khuẩn Lactobacillus spp và Bifidobacter spp.; Ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh như

Salmonella, Listeria, Escherichia…; tăng cường dinh dưỡng và năng lượng trong khẩu phần ăn Trên động vật thủy sản chúng có tác dụng cải thiện tốc độ tăng trưởng, tăng cường hệ thống miễn dịch không đặc hiệu, tăng khả năng phòng bệnh… (Mahious và ctv., 2006)

2.3.1 Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae là một trong những loài nấm quan trọng nhất trong

lịch sử loài người Chúng được dùng để sản xuất đồ uống có chứa cồn và bánh mì do

đó tên thông dụng của chúng là “men bia” hay “men bánh mì” Chúng là một trong

những loài nấm được thương mại hóa nhiều nhất

Hình 2.4: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

(Nguồn:

http://www.psmicrographs.co.uk/yeast-cell saccharomyces-cerevisiae-/science-image/80014325)

Saccharomyces cerevisiae được dùng như một loại probiotic bổ sung vào để tăng dinh dưỡng trong khẩu phần ăn cho cả người và động vật Chiết xuất từ nấm men

rất giàu acid amin, vitamin và khoáng chất Đặc biệt chúng còn là một trong những nguồn cung cấp vitamin B lớn

Saccharomyces cerevisiae có một lớp vỏ carbohydrate bao bọc, chứa hầu hết là β-glucan và mannan, là những cấu trúc đường đa giống tinh bột và cellulose

Hình 2.5: Cấu trúc vách tế bào Saccharomyces cerevisiae

(Ngu ồn: http://biotop.boku.ac.at/Projects/koellensperger1.html) Vách tế bào Saccharomyces cerevisiae có khả năng hấp thụ hoặc kết dính các độc tố, các tác nhân kháng vitamin, virus, vi khuẩn có hại nên được chiết xuất để bảo

vệ môi trường đường ruột

2.3.2 Mannan oligosaccharide (MOS)

2.3.2.1 Giới thiệu MOS

Carbohydrate (hay còn gọi là đường đơn) đóng vai trò độc nhất trong sự sống, chức năng của carbohydrate rất đa dạng nhờ vào cấu trúc và vị trí của chúng trong hệ

thống sinh học Carbohydrate là thành phần quan trọng của phần lớn cấu trúc bề mặt tế bào (Osborn và Khan, 2000) Và cũng là nguồn năng lượng chuyển hóa chủ yếu trong thức ăn Các oligosaccharide được hình thành từ 2 đến 10 phân tử monosaccharide Hơn 10 phân tử monosaccharide sẽ liên kết lại với nhau và tạo thành một polysaccharide Mannose là một monosaccharide để xây dựng lên MOS Ở ruột non MOS sẽ không bị phá vỡ liên kết bởi các enzyme tiêu hóa, vì vậy MOS sẽ không bị

biến tính khi tới ruột già (Strickling và ctv., 2000)

MOS được ly trích từ vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae và thu

nhận bằng phương pháp ly tâm nấm men đã được tách vỏ (Spring và ctv., 2000) Chúng có tác dụng tương tự như β – glucan Do đó, trong sản xuất, phối hợp cả β – glucan và MOS trong cùng một sản phẩm sẽ kích hoạt hệ miễn dịch của động vật thủy sản (Lê Thanh Hùng, 2008)

2.3.2.2 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của MOS

 Cấu trúc

Saccharomyces cerevisiae có một lớp vỏ carbohydrate bao bọc, chứa hầu hết là

β – glucan và mannan, là những cấu trúc đường đa giống tinh bột và cellulose

Mannan là mannoprotein, chứa nhiều mannose liên kết cộng hóa trị với protein

Nó là một trong những thành phần chính của vách tế bào (Cid và ctv., 1995) Mannose

là đường đơn xây dựng nên MOS, nhiều vi khuẩn đường ruột có receptor gắn với nó (Grigg và Jacob, 2005)

MOS có khả năng kháng nguyên cao nhờ vào thành phần đường mannan và glucan trong cấu tạo phân tử MOS có cấu trúc mạch chính dài chứa liên kết α-1,6 gắn

với các mạch bên ở vị trí α-1,2 và α-1,3 nằm trong những chuỗi manoprotein ở phía ngoài cùng tế bào nấm men, gắn với cấu trúc trung tâm N-acetyl glucosamine2-Asparagine (GlcNAc2-Asn)

Hình 2.6:Cấu trúc hoá học của α-D-mannan chiết xuất từ Saccharomyces cerevisiae

carbonhydrate được bổ sung trên bề mặt tế bào biểu mô của ký chủ và từ đó những tế bào vi khuẩn sẽ được gắn kết với carbonhydrate này để thải bỏ ra ngoài (Dawson và ctv., 2003) Khi vật nuôi ăn thức ăn có chứa MOS, mannose trên bề mặt biểu mô ruột

có tác dụng như một thụ thể kết dính với những mầm bệnh chứa lectin chuyên biệt với mannose, sau đó các lectin đi ra ngoài mà không có khả năng chuyển hóa đường (Ofek

và Beachey, 1978; Oyofo và ctv., 1989b; Spring và ctv., 2000; Röckendorf và ctv., 2002) Kết quả là ngăn ngừa sự xâm nhập của những mầm bệnh này vào trong cơ thể,

từ đó giảm tỷ lệ bệnh do vi khuẩn và nâng cao hoạt động cũng như tỷ lệ sống của động

vật nuôi

2.3.2.3 Tác động của MOS

Khi bổ sung MOS vào thức ăn của động vật nuôi, MOS hoạt động chủ yếu trên

3 phương diện Đó là: sự kết dính với những vi khuẩn gây bệnh; điều chỉnh đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật nuôi và gia tăng mật độ, chiều dài nhung mao ruột

Tác dụng của MOS là sự kết dính vi khuẩn Lectin trong vi khuẩn kết dính phân

tử carbonhydrate được bổ sung trên bề mặt tế bào biểu mô của ký chủ và từ đó sẽ gắn kết với những tế bào vi khuẩn để thải bỏ ra ngoài (Dawson và ctv., 2003)

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kết dính mầm bệnh trong ống tiêu hóa của vật nuôi như khả năng kết dính vi khuẩn Salmonella typhimurium trong đường ruột của gà con (Oyofo và ctv., 2003), vi khuẩn Salmonella và E.coli trong

đường ruột của heo nái (Lou và ctv., 1995) Ngoài ra, MOS còn có khả năng kết dính

vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản (Staykov và Zhou, 2005)

Nghiên cứu của Zhou và Li (2004) cá chép Jian ăn thức ăn có bổ sung 2,4 g MOS/kg thức ăn cho kết quả: sự giảm đáng kể số lượng vi khuẩn E.coli trong đường

ruột còn số lượng vi khuẩn có lợi bifidobacterium và lactobacillus được gia tăng đáng

kể

Theo Sweetman (2008), khi bổ sung MOS vào thức ăn cho tôm cá kết quả cho thấy MOS có khả năng kết dính và làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh như

Edwardsiella ictaluri hay Aeromonas

Hình 2.7: Cách thức kết dính mầm bệnh của MOS (Ngu ồn: http://www1.royal-canin.de/index.php?id=869)

B ảng 2.2: Khả năng kết dính mầm bệnh của MOS

 Điều chỉnh đáp ứng miễn dịch của cơ thể động vật nuôi

Đã có nhiều nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của MOS đến đáp ứng miễn dịch

giúp gia tăng kháng thể IgG trong huyết tương và kháng thể IgA trong mật của của gà con (Savage, 1996)

Theo Newman và ctv (2001), khi heo nái được cho ăn thức ăn có bổ sung MOS

14 ngày trước khi sinh và trong suốt thời gian nuôi con cho một lượng kháng thể IgG

và IgM trong sữa đầu cao hơn so với những heo nái không bổ sung MOS

Nghiên cứu của Swanson và ctv (2002) bổ sung hàm lượng 1 g MOS/kg thức ăn cho chó cái trưởng thành, cho chó ăn liên tục trong vòng 14 ngày Kết quả cho thấy,

tổng số tế bào bạch cầu và phần trăm lympho bào có xu hướng gia tăng với liều bổ sung MOS

Staykov và ctv (2006) nghiên cứu về ảnh hưởng của MOS lên tăng trưởng và tình trạng miễn dịch của cá hồi vân (Salmo gairdneri irideus G) và cá chép (Cyprinus carpio L) cho kết quả: hoạt lực lysozyme được gia tăng ở liều bổ sung MOS 2 g/kg

thức ăn (P < 0,05) Thí nghiệm trên cá chép Jian cho kết quả gia tăng hoạt lực của lysozyme khi cá ăn thức ăn có bổ sung MOS với liều 2,4 g/kg thức ăn (Zhou và Li, 2004)

 Cải thiện hệ nhung mao đường ruột của động vật nuôi

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh MOS giúp gia tăng mật độ và chiều dài của nhung mao ruột từ đó dẫn đến việc tiêu hóa và hấp thu các dưỡng chất trong thức

ăn tốt hơn, giúp động vật nuôi lớn nhanh hơn, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn, tăng hiệu quả kinh tế

Thí nghiệm trên gà tây, khi bổ sung hàm lượng 1 g MOS/kg thức ăn và cho ăn liên tục trong 8 tuần tuổi, cho thấy độ cao nhung mao ruột gia tăng so với nghiệm thức không bổ sung MOS (Savage, 1997) Nghiên cứu trên cá tầm Acipenser oxyrinchus ở

chế độ ăn có bổ sung MOS giúp cho dạ dày, ruột có van xoắn dài hơn, lông nhung dài,

rộng hơn và mật độ dày so với nghiệm thức đối chứng (Newman, 1994) Nghiên cứu trên cá hồi cũng cho kết quả tương tự (Sweetman và ctv., 2008) Nghiên cứu của Salze

và ctv (2008) về khẩu phần ăn có chứa MOS cho thấy tăng khả năng phát triển đường

ruột của ấu trùng cá bớp Dưới kính hiển vi điện tử cho thấy ruột giữa của cá phát triển, nhung mao ruột dài hơn ở nghiệm thức bổ sung MOS

2 3.3 Những nghiên cứu và khảo nghiệm của MOS ở động vật thuỷ sản

 Trên cá hồi (Salmo gairdneri irideus)

Nghiên cứu của Staykov và ctv (2005) về ảnh hưởng của MOS lên tăng trọng

và tỷ lệ sống ở cá hồi được tiến hành với lượng là 2 g/kg thức ăn cho cá hồi ăn trong

vòng 42 ngày Kết quả cho thấy, sau 42 ngày thí nghiệm, cá ăn thức ăn có bổ sung MOS đã cải thiện 9% hiệu quả sử dụng thức ăn và 8% trọng lượng trung bình so với đối chứng Tổng trọng lượng cá lô đối chứng là 611,44 kg thấp hơn 15% so với nhóm

sử dụng thức ăn có bổ sung MOS, đồng thời tỷ lệ chết cũng giảm đi so với lô đối chứng

 Trên cá rô phi (Oreochromis niloticus)

Nghiên cứu của Samrongpan và ctv (2008) về ảnh hưởng của MOS lên tăng

trưởng, tỷ lệ sống và sức đề kháng với bệnh của cá rô phi bột (Oreochromis niloticus)

MOS được thử nghiệm với 4 nồng độ là 0, 2, 4 và 6 g/kg thức ăn cho cá rô phi bột ăn trong 21 ngày Kết quả cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) giữa trọng lượng trung bình, chiều dài và tăng trọng trung bình hằng ngày (ADG) Trọng lượng, chiều dài và ADG của cá rô phi được cho ăn với 4 và 6 g/kg MOS cao hơn có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (P < 0,05) Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về FCR và

tỷ lệ sống giữa tất cả các nghiệm thức thí nghiệm và nghiệm thức đối chứng Kết quả cho thấy lợi ích của MOS trong việc bổ sung vào thức ăn đối với tăng trưởng và sức đề kháng bệnh của cá rô phi bột

 Trên cá chẽm Châu Âu (Dicentrarchus labrax)

Torrecillas và ctv (2007) nghiên cứu về kích thích miễn dịch và sức đề kháng lại các bệnh truyền nhiễm trên cá chẽm Châu Âu (Dicentrarchus labrax) khi cho ăn

thức ăn trộn với MOS được ly trích từ vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

(Bio-Mos®, Alltech Inc, USA) Cá thí nghiệm có trọng lượng 35g được bố trí với mật

độ ban đầu 3 kg/m3 Cá được cho ăn thức ăn có 0; 2; 4 g MOS/kg thức ăn trong 67 ngày Kết quả mô học các tính năng gan cho thấy lipid thấp hơn và hình thái học xung quanh khoảng xoang tế bào gan cho thấy việc sử dụng các chất dinh dưỡng ngày càng

tốt hơn Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về đánh giá hình thái học của ruột Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) về chỉ số thực bào với nghiệm thức 4 g MOS/kg thức ăn Sau kết thúc thí nghiệm tiến hành gây cảm nhiễm bằng 2 phương pháp là tiêm trực tiếp Vibrio alginolyticus vào cá và nuôi chung với cá bệnh với tỷ lệ

3:1 Sau 24 giờ gây cảm nhiễm không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức, sau 48

giờ tổng số cá nhiễm bệnh ở nghiệm thức đối chứng gấp đôi các nghiệm thức 2 và 4 g MOS/kg thức ăn Kết quả theo dõi trong 21 ngày cho thấy với phương pháp nuôi

chung thì ở nghiệm thức đối chứng có 33% cá nhiễm bệnh, 0% ở nghiệm thức bổ sung

 Trên cá chép (Cyprinus carpio)

Bổ sung 2 g MOS/kg thức ăn làm tăng 11,6% trọng lượng so với đối chứng FCR và tỷ lệ chết giảm rất nhiều so với nghiệm thức đối chứng (P < 0,01) ( Staykov và ctv., 2005)

Theo Zhou và ctv (2005), nghiên cứu trên cá chép (Cyprinus carpio), thí

nghiệm được thực hiện tại Trung Quốc với hàm lượng bổ sung 2,4 g/kg MOS vào thức

ăn, kết quả thí nghiệm cải thiện được tăng trọng, FCR, và các chỉ số miễn dịch

(P < 0,01)

 Cá da trơn Châu Âu (Silurus glanis)

Nghiên cứu ở trên cá da trơn Châu Âu (Silurus glanis) trong khẩu phần ăn có

bổ sung hàm lượng 2 g MOS/kg thức ăn, kết quả tăng trọng trung bình khoảng 9,7%, FCR giảm 11,6%, tỷ lệ chết giảm xuống 16,67% so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt giữa các nghiệm thức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01) (Bogut và ctv., 2006)

 Cá tầm (Acipense oxyrinchus)

Nghiên cứu trên cá tầm (Acipenser oxyrinchus) ở chế độ ăn có bổ sung

MOS giúp cho dạ dày ruột có van xoắn dài, lông nhung dài, rộng và mật độ dầy so với

chế độ ăn đối chứng (Newman, 1994)

2.3.4 MOS trong chế phẩm Actigen

MOS chứa trong Actigen được chế xuất từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, là sản phẩm được cắt nhỏ từ Bio-Mos®của công ty Alltech

Đây là những dòng carbohydrate nhỏ được tách từ những dòng nấm men chuyên biệt

Với thí nghiệm bổ sung MOS (Actigen) vào thức ăn chăn nuôi, ta thấy rằng chỉ cần bổ sung liều bằng 40% liều bổ sung của Bio-Mos®

đã giúp cải thiện một cách ổn định năng suất như đã thấy trên Bio-Mos® trước đây (Tài liệu kỹ thuật của Alltech, 2010)

Lợi ích cơ b ản của MOS chứa trong Act igen là phát triển và duy trì hệ thống tiêu hoá Do giúp hệ vi sinh vật đường ruột hoạt động nên có ảnh hưởng tốt lên v ật nuôi, bao gồm sự tuần hoàn của các tế bào thành ruột, sự cạnh tranh các dưỡng chất,

sự thay đổi của hệ tiêu hóa, sự cạnh tranh loại trừ các vi khuẩn gây bệnh, cơ chế tiết

dịch ruột và các thể dịch

Hình 2.8: Cấu trúc của MOS (Actigen)

Chương 3

3 1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 8/2011 đến tháng 3/2012 tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3 2.1 Vật liệu

 Cá thí nghiệm

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống khỏe mạnh, sạch bệnh, kích cỡ

đồng đều, có trọng lượng trung bình từ 8 – 10 g/con

Sau khi mua về, cá trước thí nghiệm được nuôi trong bể xi măng và cho ăn thức

ăn công nghiệp trong vòng 15 ngày để cá thích nghi với điều kiện môi trường và ổn định sức khỏe

Hình 3.1: Cỡ cá tra thí nghiệm

- Thức ăn với các tỉ lệ MOS (Actigen) khác nhau (0; 0,4; 0,8; 1,2 g/kg thức ăn)

- Hệ thống sục khí, ống xi phông, thau, xô, vợt

- Test đo pH và DO

- Nhiệt kế đo nhiệt độ

- Thuốc gây mê Ethylenglycol monophenylether (MS222)

- Dụng cụ và hóa chất phân tích bạch cầu:

+ Dung dịch pha loãng bạch cầu là dung dịch có tác dụng phá vỡ hồng cầu,

đó là dung dịch acid acetic 2 – 3%

+ Kính hiển vi xem được ở độ phóng đại 100x

- Dụng cụ và hóa chất phân tích lysozyme:

+ Eppendorf

+ Vi khuẩn Micrococcus lysodeikticus

+ Dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M (pH=6,2)

+ Máy ly tâm

+ Máy so màu

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng

đề kháng của cá tra đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

- Bể composite (100 lít)

- Vi khuẩn sử dụng cho thí nghiệm là vi khuẩn E.ictaluri phân lập từ cá tra

bệnh, vi khuẩn được lưu trữ ở -20oC trong môi trường NB (Nutrient Broth) tại phòng thí nghiệm, Khoa Thủy sản trường Đại học Nông Lâm T.P Hồ Chí Minh

- Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) và môi trường BHIB (Brain Heart Infusion Broth)

- Bộ test định danh IDS 14GNR của công ty Nam Khoa

- Kính hiển vi, lame

- Cân điện tử

3.2.3 Nguồn nước

Nước sử dụng cho thí nghiệm được cung cấp từ nguồn nước máy sinh hoạt và cho vào bể xi măng một tuần để khử khí chlor, sau đó sử dụng trong suốt quá trình nuôi

3.2.4 Thức ăn

Trong thí nghiệm, thức ăn được ép đùn với 28% protein thô được sử dụng MOS (Actigen) được bổ sung vào thức ăn ép đùn theo các tỉ lệ 0; 0,4; 0,8; 1,2 g/kg

Hình 3.2: Thức ăn thí nghiệm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của MOS (Actigen) lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra

3.3.1.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm cho cá tra ăn thức ăn bổ sung MOS (Actigen)

Thí nghiệm được tiến hành trong hệ thống gồm 4 bể xi măng (2 x 3 x 1,5 m) bố trí ở ngoài trời Các bể được vệ sinh sạch sẽ, xử lý bằng formol và chlorine trước khi đưa vào sử dụng

Bố trí 16 giai (1 x 1 x 1 m) trong 4 bể xi măng Tương ứng 4 nghiệm thức (NT)

với 4 lần lặp lại (tương ứng với 4 lô)

4 nghiệm thức tương ứng với 4 tỉ lệ bổ sung MOS (Actigen) vào trong khẩu phần thức ăn là:

+ Nghiệm thức 1 (Nghiệm thức đối chứng): Không bổ sung MOS (Actigen) vào

thức ăn

+ Nghiệm thức 2: Bổ sung 0,4 g/kg thức ăn MOS (Actigen) vào thức ăn

+ Nghiệm thức 3: Bổ sung 0,8 g/kg thức ăn MOS (Actigen) vào thức ăn

+ Nghiệm thức 4: Bổ sung 1,2 g/kg thức ăn MOS (Actigen) vào thức ăn

Cá thí nghiệm được nuôi trong 16 giai, mỗi giai chứa 100 con, có kích cỡ trung bình 8 – 10 g/con Bố trí thí nghiệm theo phương pháp bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên

Trong suốt quá trình thí nghiệm chúng tôi tiến hành cho cá ăn ngày 2 lần/ngày: sáng (8 – 10 giờ), chiều (3 – 5 giờ) Cho cá ăn lượng tối đa cho đến khi thỏa mãn

Trong quá trình thí nghiệm tiến hành thay nước 2 lần/tuần và mỗi lần thay 1/3 lượng nước trong bể kết hợp với xi phông đáy Khi lượng thức ăn tích tụ nhiều nên thay nước từ 3 – 4 lần/tuần

Cá được cho ăn với thức ăn thí nghiệm trong 10 tuần

Hình 3.3: Bố trí giai và bể thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung MOS (Actigen)

3.3.1.2 Kiểm tra số lượng bạch cầu trong máu cá

- Cách lấy mẫu máu

Hình 3.4: Hút máu cá thí nghiệm bằng ống tiêm 1cc

- Pha loãng

Lắc đều mẫu máu trước khi hút máu vào ống trộn

Hút máu vào ống trộn bạch cầu đến vạch 0,5 Sau đó, hút acid acetic 2 - 3% cho đến vạch 11 (bạch cầu được pha loãng 20 lần)

Lắc đều ống trộn trong 2 phút

- Đếm tế bào bạch cầu

Đặt một miếng lamelle lên buồng đếm hồng cầu Neubauer

Sau đó nhỏ dung dịch từ ống trộn vào buồng đếm sao cho dung dịch lan ra đều các khu vực đếm

Trên buồng đếm Neubauer đếm 4 ô vuông lớn ở 4 góc (tổng số 64 ô vuông nhỏ)