Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở quảng trị

Vì vậy, biện pháp sử dụng vi sinh vậtđối kháng sẽ là một trong những giải pháp thiết thực để có một nền sản xuất nông nghiệpbền vững [52].Với ý nghĩa thực tiễn trên, tôi đã tiến hành thự

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT

NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Mã số : 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG

Hà Nội 2014

-LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ, bên cạnh sự nỗ lực cố gắng của bảnthan còn có sự hướng dẫn nhiệt tnh của quý Thầy Cô, cũng như sự ủng hộ động viên của giađình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường-Viện trưởngViện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,người đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.Đồng thời, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới PGS.TS.Nguyễn Thị Kim Cúc cùng các anhchị em Phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam; Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô –Viện Nghiên cứu Khoa học MiềnTrung - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tnh giúp đỡ tôi trong quá trìnhnghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn Vi sinhvật học đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợinhất trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để cho tôi có thể hoàn thiện đề tài

Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, những người đãkhông ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gianhọc tập và thực hiện luận văn

Hà nội, ngày 30 tháng 09 năm 2014

Học viên

Trần ThịHồng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANHM

ỤC CÁ

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……….…….3

1.1 Đặc điểm của một số vi nấm gây bệnh ở thực vật……….… 3

1.1.1 Khái quát về nấm gây bệnh……… ……… 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biểu hiện của Fusarium oxysporum……… 4

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biểu hiện của Fusarium solani 6

1.1.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biểu hiện của Phytophthora spp……….6

1.2 Tổng quan về cây tiêu………8

1.3 Tình hình nghiên cứu về các loại vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp phòng trừ trong và ngoài nước ……….9

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước……… 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước………14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……… 21

2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ………21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……… 21

2.1.2 Vật liệu 21

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP……….24

2.2.1 Phương pháp phân lập và làm sạch vi sinh vật 24

2.2.1.1 Phương pháp phân lập và làm sạch nấm 24

2.2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng 24

2.2.2 Nuôi cây và lưu giữ các chủng vi sinh vật 24

2.2.3 Phương pháp nhuộm

Gram 25

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm gây bệnh của các chủng nấm phân lập 26

2.2.5 Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch nuôi 27

2.2.6 Phương pháp sinh học phân tử 27

2.2.6.1 Quy trình tách chiết ADN genom 27

2.2.6.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 28

2.2.6.3 Trình tự và thông số cặp mồi sử dụng để tến hành PCR 29

2.2.6.4 Kỹ thuật PCR 29

2.2.6.5 Điện di ADN trên gel agaroza 31

2.2.6.6 Xác định trình tự nucleott của gen 31

2.2.6.7 Xử lý trình tự ADN và phân tích số liệu bằng phần mềm máy tính 32

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nguồn bệnh nấm thực vật của một số chủng tuyển chọn trên cây cà chua 32

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……….34

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG……….34

3.1.1 Phân lập và tuyển chọn nấm 34

3.1.2 Định danh các chủng vi nấm phân lập 35

3.1.3 Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng nguồn bệnh nấm của các vi nấm phân lập……… 39

3.2 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT

TÍNH ĐỐI KHÁNG……… 42

3.2.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn 42

3.2.2 Tách dòng và giải trình tự gen mã hoá 16s rARN của bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu 47

3.2.2.1 Tách ADN genome từ vi khuẩn 48

3.2.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom 48

3.2.2.3 Giải trình tự gen của 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu 49

3.3 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG 54

3.3.1 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 54

3.3.2 Tách dòng và giải trình tự 16S ARN của 2 chủng xạ khuẩn 55

3.3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số của chủng xạ khuẩn XK3 và XK28 56

3.3.2.2 Kết quả nhân gen 16S-rARN bằng PCR 57

3.3.2.3 Giải trình tự gen của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 57

3.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NGUỒN BỆNH F.OXYSPORUM CỦA CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN TRÊN MÔ HÌNH CÂY CÀ CHUA 59

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….64

4.1 KẾT LUẬN……….64

4.2 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO……… 65

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN……… 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….67

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT

TẮT

NCBI : National Center for Biotechnology Information

BLAST : BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

EtBr : Ethidium bromide

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

SDS : Sodium dodecyl sulphate

Bp, Kb : Base pair, Kilo base CFU

: Colony forming units mRNA : Messenger RNA

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic acid

RNase : Ribonuclease

TAE : Tris-Acetate-EDTA

Taq polymerase : Polymerase Thermus aquarius

TE : Tris- EDTA

PIMG : Percentage of inhibition of growth

đtg : Đồng tác giả CSK : Chất kháng sinh

CLĐ : Mẫu đất lấy từ huyện Cam Lộ- Quảng Trị CLR

: Mẫu rễ lấy từ huyện Cam Lộ- Quảng Trị VLĐ : Mẫu đất lấy từ huyện Vĩnh Linh- Quảng Trị VLR : Mẫu rễ lấy từ huyện Vĩnh Linh- Quảng Trị PDA : Potato dextrose agar PSA : Potato sucrose agar DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian lấy mẫu……… 21

Bảng 2.2: Trình tự và thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho Vi khuẩn……… 29

Bảng 2.3: Trình tự và thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho xạ khuẩn……… …29

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn……… 29

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR cho xạ khuẩn……… 30

Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm……… 33

Bảng 3.1: Đặc điểm bào tử của các chủng nấm phân lập………35

Bảng 3.2: Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh của các vi nấm phân lập sau 7 ngày nuôi cây 39

Bảng 3.3: Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh của các vi nấm phân lập sau 7 ngày nuôi cây 40

Bảng 3.4: Hình thái tế bào của các chủng đối kháng……… 43

Bảng 3.5: Khả năng đối kháng một số nguồn bệnh nấm của các chủng vi khuẩn… 44

Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nghiên cứu……… 47

Bảng 3.7: Kết quả xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ ADN (µg/ml) của các chủng nghiêncứu……….48

Bảng 3.8: Kết quả nhận dạng các chủng vi sinh vật nghiên cứu sau khi so sánh bằng

BLAST……….50

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nghiên cứu trên môi trường

ISP4……… 54

Bảng 3.10: Khả năng kháng nấm kiểm định của các chủng xạ khuẩn 55

Bảng 3.11: Kết quả xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ ADN (µg/ml) của các chủng nghiêncứu 56

Bảng 3.12: Kết quả nhận dạng các chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau khi so sánh bằng

Hình 1.1: Triệu chứng cây tiêu bị nhiễm Phytopthora spp……… 16

Hình 1.2: Triệu chứng cây tiêu bị nhiễm Fusarium oxysporum……… 16

Hình 2.1: Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp……… 26

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc đặc trưng của nấm sợi phân lập từ các mẫu vật…… 34

Hình 3.2: Hình thái bào tử đặc trưng của một số chủng nấm sợi phân lập………….39

Hình 3.3: Khả năng đối kháng của nấm P.oxalicum và T.harzianum với nấm

bệnh……… 41

Hình 3.4: Khả năng đối kháng của 1 số vi khuẩn phân lập với nấm F.oxyporum… 45

Hình 3.5: Khả năng tồn tại trong môi trường MPA của một số chủng vi khuẩn

đối kháng……… 46

Hình 3.6: Điện di đồ DNA genom của các chủng nghiên cứu………48

Hình 3.7: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16 S-rRNA của các chủng nghiên cứu… 49

Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 30.1………50

Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 31.3………51

Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 31.6……… 51

Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại chủng CLRvk 31.8……… 52

Hình 3.12: Khả năng đối kháng của hai chủng xạ khuẩn CLĐ XK3, VLĐ XK 28 với nấm F.solani và F.oxysporum……… 55

Hình 3.13: Ảnh điện di AND tổng số của 2 chủng xạ khuẩn……… 56

Hình 3.14: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S-rARN của 2 chủng xạ khuẩn…… 57

Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐxk3……… 58

Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại chủng VLĐ xk28……… 58

Hình 3.17: Khả năng đối kháng F.oxysporum của các chủng CLĐ VK30.1, CLĐ XK3, VLĐ XK28……….…61

MỞ ĐẦU

Hàng năm, bệnh cây đã gây ra những tổn thất to lớn cho nông nghiệp, chúng pháhủy các loại nông sản chủ yếu, chiếm 12% tổng sản lượng nông nghiệp trên Thế giới Đã cóhơn 11000 loại bệnh cây được phát hiện, nguyên nhân là do khoảng 120 chi nấm, 30 loạivirut và 8 chi vi khuẩn Thiệt hại do nấm hại cây chiếm khoảng 80% tổng thiệt hại mùa

màng, trong đó bệnh do Fusarium, Phytophthora gây ra chiếm tỷ lệ tương đối lớn Đây

là các tác nhân chủ yếu gây nên bệnh chết héo, tắc mạch dẫn và thối rễ thối thân ở nhiềuloại cây trồng như : lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bông…[6]

Nền nông nghiệp nước ta có vai trò rất quan trọng, nó không chỉ cung cấp lương thực,thực phẩm, mà còn tạo ra hàng hóa có giá trị xuất khẩu cao, đặc biệt là các cây công nghiệpnhư: tiêu, bông, cà phê…Tuy nhiên năng suất và chất lượng cây trồng đã và đang phải đốimặt với rất nhiều vấn đề hết sức khó khăn, đặc biệt là bệnh cây trồng do nấm gây ra

Hiện nay, biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến và xem như hữu hiệu nhất trongphòng trừ bệnh cho cây trồng Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệptrong đó có thuốc trừ nấm ngày càng nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và làm giảmchất lượng sản phẩm khi dư lượng thuốc cao, chi phí phòng trị bệnh cao Ngoài ra, đất đaibạc màu, làm chết các sinh vật có ích, làm tăng khả năng kháng thuốc của sinh vật gây hại,kết quả là việc sản xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khăn Đặc biệt là khu vực Miền

Trung cây tiêu và cây cà phê thường bị thối cổ rễ do Fusarium oxysporum, F solani , Phytophthora và một số tác nhân khác [4], [5].

Để góp phần khắc phục tồn tại này, các nhà khoa học đang chú ý đến nguồn tài nguyênlớn thứ ba của giới tự nhiên – Tài nguyên vi sinh vật có ích để bảo vệ môi trường sinh thái.Phương pháp sử dụng vi sinh vật trong bảo vệ môi trường không những mang lại hiệu quảcao, an toàn, sản phẩm thu hoạch không ảnh hưởng tới người sử dụng, có lợi cho cân bằngsinh thái, mà còn giảm phần lớn lượng thuốc hoá học sử dụng

Quảng Trị nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với đặc trưng khí hậu nóng ẩm,lượng mưa hàng năm lớn, là điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật, mà điển hình là nấmbùng phát, gây hại cho cây trồng, dẫn đến tổn thất lớn cho sản xuất nông nghiệp Mỗi nămchi phí trong việc phòng, trừ bệnh cây là rất cao, mà phần lớn là sử dụng thuốc hoá học Trênthực tế, phương pháp này có hiệu quả tức thời nhưng nếu sử dụng lâu dài sẽ dẫn đến tnhtrạng thoái hoá đất và kháng thuốc của các nguồn bệnh Vì vậy, biện pháp sử dụng vi sinh vậtđối kháng sẽ là một trong những giải pháp thiết thực để có một nền sản xuất nông nghiệpbền vững [52].

Với ý nghĩa thực tiễn trên, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài ” Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu

ở Quảng Trị.”

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng caonhất với một số nấm gây bệnh hại thực vật từ đất trồng tiêu tại Quảng Trị

- Xác định được hoạt tính đối kháng nấm F.oxysporum in vivo trong điều kiện phòng thí

nghiệm trên mô hình cây cà chua của một số chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng cao với nấm

F.oxysporum, F.solani, Phytophthora sp từ đất trồng cây tiêu ở Quảng Trị.

- Định loại bằng đặc điểm hình thái, bào tử (đối với nấm) và định danh bằng phương phápsinh học phân tử (giải trình tự gen 16S ADN riboxom, đối với vi khuẩn và xạ khuẩn); nghiêncứu quan hệ phát sinh loài của các chủng triển vọng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng triển vọng lên cây cà chua ở quy mô phòng thínghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.4 Đặc điểm của một số vi nấm gây bệnh ở thực vật

1.1.1 Khái quát về nấm gây bệnh

Thực vật bị tấn công bởi hàng trăm nguyên nhân gây bệnh khác nhau, trong đó cácnguồn bệnh chủ yếu có nguồn gốc từ nấm, vi khuẩn và virus Bệnh hại chính cây trồng trong

giai đoạn trước và sau thu hoạch do các nhóm như: Phytophthora, Xanthomonas, Erwinia, Pythium, Pseudomonas, Fusarium, Aspergillus, Rhizopus Những dịch bệnh này trên thực

tế có thể phá hủy toàn bộ vụ thu hoạch của các cây trồng quan trọng như: tiêu, cà phê,khoai tây, cà chua, Ước tính khoảng 40% cây trồng các loại bị hủy hoại bởi bệnh dịchthực vật [19]

Hiện nay, có hơn 80.000 loài nấm được biết có khả năng gây bệnh cho câytrồng, phần lớn sống theo kiểu bán hoại sinh, trong đó có một vài loài nấm có thể gây hạitrên nhiều loại cây trồng Nấm là sinh vật dị dưỡng, nguồn năng lượng cần thiết cho hoạtđộng sống lấy từ các chất hữu cơ, chúng tập trung ở các tầng đất phía trên do các chất hữu

cơ ở đây phong phú Nấm chịu tác động chính của các yếu tố như: nồng độ ion H+, chế độnước, nhiệt độ, cấu trúc đất Bệnh do nấm gây ra rất khó phòng trừ vì chúng có khả năngtồn tại lâu trong đất Hơn nữa, nhiều loài nấm có thể phát triển trong khoảng pH rấtrộng, từ pH axit cho đến pH kiềm cao [10]

Các loại nấm thường gây bệnh cho cà chua gồm 8 loài Pythium, một vài chủng Rhizoctonia solani và Fusarium sp Pythium phát triển mạnh nhất trong 2 giai đoạn: thời kỳ

hạt nảy mầm đến thời kỳ cây non và thời kỳ cây bắt đầu tạo quả đến lúc quả chín Thời kỳ

cây ra hoa quần thể Pythium trong vùng rễ là thấp nhất Ngoài ra, nhiệt độ thấp, độ ẩm đất cao và tỉ lệ C/N thấp là những điều kiện tốt cho Pythium phát triển.

Rhizoctonia solani còn gây bệnh thối rễ ở củ cải đường, làm giảm năng suất đến

25% (Mỹ) Nhưng thiệt hại về năng suất có thể lên đến 50% phụ thuộc vào lịch sử trồngtrọt và môi trường xung quanh Ở Mỹ, năm 1998 có 27,2% diện tích trồng trọt bị nhiễm bệnh,năm 1999 là 23,7% Trong vùng tưới tiêu phía Tây của Mỹ, 42,3% năm

1998 và 30,4% đất trồng trọt năm 1999 bị nhiễm bệnh Hoa anh thảo cũng là đối tượng

dễ nhiễm bệnh F.oxysporum và R.solani R.solani không tạo bào tử, vì vậy nấm là đơn

vị phân tán và sống sót Hạch nấm rất khó kiểm soát bởi thuôc diệt nấm [36]

Ngoài các loại nấm trên, Vertcillium dahliae cũng là một loại nấm gây bệnh héo rũ

và Phytophthora caetorum gây bệnh thối rễ cho dâu tây Tiểu hạch nhân Vertcillium dahliae

sống trong mô già của những cây chết có thể tồn tại trong đất vài năm, vì vậy không thể sửdụng biện pháp hóa học để tiêu diệt [34]

Trong số 24 bệnh lúa ở Việt Nam thì có tới 13 bệnh phát sinh có nguồn gốc từ nấm,

chủ yếu là bệnh đạo ôn (Pyricularia Oryzae), bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani), bệnh héo xanh (Ralstonia solanacearum) và bệnh thối thân, thối rễ hay còn gọi là bệnh đổ rạp (Fusarium oxysporum) Trong các bệnh cây có nguồn gốc do nấm, Fusarium oxysporum là

một trong những loài gây bệnh thiệt hại nặng nề nhất cho cây trồng Chúng có khả năngthích ứng rất nhanh với những thay đổi điều kiện sống bằng cách thay đổi các đặc điểm hình

thái, sinh lý trong quá trình sinh trưởng và phát triển Ngoài ra, Fusarium còn có thể sống

trong đất một thời gian dài vì có khả năng sống hoại sinh, chống chịu với các hoạt động đốikháng của các vi sinh vật trong đất, kết quả đã dẫn đến sự gia tăng số loài trong những điềukiện địa lý sinh thái khác nhau [30]

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biểu hiện của Fusarium

oxysporum

Chi Fusarium bao gồm trên 30 loài, trong đó loài F.oxysporum là loài phổ biến và cũng là loài gây bệnh nguy hiểm nhất ở cây trồng F.oxysporum gây ra hiện tượng tắc mạch dẫn của

cây là nguyên nhân trực tiếp của bệnh thối thân, thối rễ ở thực vật Bệnh ít khi xuất hiện sớm

mà thường gây hại mạnh nhất vào giữa giai đoạn sinh trưởng của cây

F.oxyporum là loại nấm đa bào phân nhánh, màu sắc tản nấm trắng, phớt hồng Trong

quá trình sinh sản chúng sinh ra hai loại bào tử khác nhau: Bào tử hậu và bào tử phân sinh.Bào tử hậu có màu sẫm, vỏ dày có hình ovan, được hình thành từ sợi nấm hay từbào tử lớn

Bào tử phân sinh có 2 loại: Bào tử loại lớn: có hình lưỡi liềm hoặc bầu dục, ngắn thẳng,hoặc cong nhẹ, thường có ba ngăn ngang, ổ màu da cam; Bào tử loại nhỏ: dạng đơn bào,hình elip hoặc quả thận, hình thành bọc giả trên cành đơn nhánh, không màu.

Cành bào tử nhiều nhánh, bào tử phân sinh mọc thành từng cụm 2 đến 3 chiếc trênđỉnh cành Kích thước tản phụ thuộc vào nhiệt độ Ở 250C tản phụ có kích thướckhoảng 3.5cm, ở 300 khoảng 2.8cm Tản có màu nhạt hoặc tím đậm Nấm vẫn có thể mọcđược ở 420C trên các môi trường thông thường Dưới 200C nấm vẫn mọc nhưng phát triểnchậm Nhiệt độ tối thích là 25 - 300C, phát triển trong 4-5 ngày và ở độ ẩm rất cao 90-95%

Cơ chế gây bệnh và biểu hiện:

F.oxysporum là loại nấm có phạm vi ký chủ rộng, có mặt ở hầu hết các vùng trồng trọt

trên thế giới Ở Hawaii, vật chủ của nấm này là khoai tây, mía, cây họ cà phê, hạt tiêu, bông.Chúng gây bệnh đổ rạp ở nhiều loại thực vật như cà phê, hạt tiêu, cọ dừa, lúa, cà chua, dưachuột

Có thể khái quát cơ chế gây bệnh của F.oxysporum như sau: Sau khi xâm nhập, F.oxysporum lan tràn khắp thực vật nhờ một ống chứa đầy bào tử hoặc sợi khuẩn ty Sợi

khuẩn ty tiến đến hệ thống xylem, từ đây chúng tiếp tục lan tới hệ thống gân lá, nhờ dòngnhựa, chúng đi tới toàn bộ hệ thống mạch của thực vật Nấm phát triển mạnh, ảnh hưởng tớiviệc cung cấp nước và chất khoáng khiến cho lá cây chuyển sang màu vàng, bắt đầu từ rễ,thân phía dưới bị thối dần lên phía trên Quá trình héo rũ lan nhanh ngày qua ngày cho đếnkhi thực vật đổ rạp xuống và kết quả là cây bị chết Biểu hiện rõ nét trong suốt giai đoạn từkhi cây ra hoa cho đến khi kết trái [19]

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biểu hiện của Fusarium solani

Fusarium solani là một nấm trong chi Fusarium Các tản nấm F.solani có màu trắng

tới màu kem, một số có sắc tố hơi xanh lá cây đến xanh lam

Bào tử của F.solani lớn trong khối bào tử to gang so với chiều dài và lớn hơn

bào tử của F.oxysporum Bào tử nhỏ có kích thước lớn, thường có 1-3 vách ngăn và

được hình thành trong bọc giả gắn trên các tế bào sinh bào tử rất dài hoặc trên các vách bào

tử phân sinh phân nhánh

F.solani chủ yếu gây bệnh thối rễ và cổ rễ Một số dạng F.solani gây thối cổ rễ cây

con họ đậu như đậu Hà lan, đậu cove, và thối rễ ở các cây trưởng thành Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực gốc thân cây lớn, như cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trường làm stress và do các bệnh khác

Xâm nhiễm: sợi nấm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâmnhiễm vào rễ con còn non và lan dần vào các mạch xylem Nấm bệnh sau đó sẽ phát triểntrong mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân, quá trình này sẽ gây phản ứngcủa cây tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu Những hợp chất này gây ra hiệntượng hóa nâu của mạch dẫn, một dấu hiệu để dễ nhận thấy của bệnh héo khi cắt ngangthân Hiện tượng tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cho cây bị

bệnh héo rồi chết Bệnh héo ở Fusarium thường liên hệ với tuyến trùng nốt sưng Nấm Fusarium xâm nhiễm vào cây qua vết thương do tuyến trùng gây ra.

1.1.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biểu hiện của Phytophthora

spp.

Đặc điểm hình thái, sinh lý của Phytophthora sp [13].

Các chi Phytophthora thuộc lớp Oomycetes trong giới Chromista Như vậy chúng

không phải là nấm thực mà là vi sinh vật giống nấm

Một số loài Phytophthora tạo ra bào tử ngay trên môi trường Agar, trong khi nhiều

loài khác cần dược nuôi cấy trong nước, dung dịch muối khoáng và dịch trích từ đất phaloãng trước khi chúng tạo ra bào tử Điều quan trọng hơn là sự tạo ra bào tử trên

Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng.

Sinh sản vô tính: sinh sản vô tính tạo thành các cấu trúc gọi là bọc bào tử động, nơihình thành và giải phóng du động bào tử, những du động bào tử này di chuyển được và

có vai trò quan trọng trong chu kỳ bệnh, đặc biệt là chức năng lan truyền trên đất ướt hoặc

trên bề mặt cây trồng Các loài Phytophthora này tạo ra các túi bào tử có

những hình dạng nhất định một cách rõ rệt trên cành mang bọc bào tử Các du động bào

tử hình thành trong bọc bào tử và được giải phóng trực tiếp từ bọc bào tử Một số loài như

P.infestans và P.palmivora tạo các bọc bào tử rất dễ rụng ra khỏi cành mang bọc bào tử và có

thể được phân tán nhờ gió

Cấu trúc sinh sản hữu tính: Khoảng một nửa các loài Phytophthora ở dạng đồng tản

(homothallic) chúng sẽ sản xuất bộ phận sinh sản đực, bộ phận sinh sản cái và bào tử độngtrên cùng một môi trường Phần còn lại là dạng dị tản (heterothallic) với hai kiểu lai A1 vàA2 Dạng dị tản tạo ra túi giao tử (túi giao tử đực và túi noãn) chỉ khi có sự hiện diện của mộtdòng phân lập mọc đối trên cùng môi trường.Việc xác định loài nấm thuộc nhóm đồng tảnhay dị tản phụ thuộc vào túi bào tử đực của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực nằmquanh thân túi noãn) hay paragynuos (túi giao tử đực nằm tiếp theo túi noãn)

Cơ chế gây bệnh và biểu hiện:

Phytophthora là nguyên nhân gây rất nhiều bệnh trên cây ăn quả, cây công nghiệp và

rau màu Các bệnh bao gồm thối rễ; thối thân và thối quả sầu riêng; thối rễ ớt; thối nõndứa, thối gốc (chết nhanh) cây tiêu; thối rễ đu đủ … và một số cây trồng khác

Cây bị nhiễm Phytophthora có biểu hiện như chết dần từ ngọn cây và có thể có triệu

chứng thối rễ và nứt ở phần thân gần mặt đất Các cây rau bị thối rễ, như ớt trở lên còi cọc vàhéo Cây thường chết nhanh khi các triệu chứng héo trầm trọng xảy ra

Cách thức xâm nhiễm của Phytophthora tùy thuộc từng loài Tuy nhiên, bào tử trứng,

bọc bào tử và du động bào tử tạo điều kiện cho việc xâm nhiễm vào các bộ phận khác nhaucủa cây Mưa tạt phân tán bào tử lên bộ lá của cây vì vậy quá trình xâm nhiễm có thể bắt

đầu từ thân, lá và quả, tùy thuộc loài Phytophthora và ký chủ Côn trùng bò hoặc bay cũng

có thể mang nấm từ đất tới các bộ phận phía trên của cây [17]

1.5 Tổng quan về cây tiêu

Hồ tiêu (Piper nigrum L.) thuộc họ Piperaceae Là một loại cây dây leo thân gỗ lâunăm Hồ tiêu có nguồn gốc từ Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Nam Mỹ và Tây Ấn nhưng cũngđược trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới.

Cây hồ tiêu được trồng ở Việt Nam từ thế kỷ 17 nhưng sản xuất hồ tiêu chỉ thực sựphát triển mạnh từ sau năm 1997 khi giá hồ tiêu trên thị trường tăng nhanh Năm

1998 cả nước có 9.800 ha hồ tiêu, sau 7 năm (2004) đã có 52.500 ha, tốc độ tăng trên

6000 ha/năm đưa Việt Nam trở thành nước sản xuất, xuất khẩu hồ tiêu hàng đầu thếgiới (chiếm 35% sản lượng và gần 50% thị phần thế giới, giá trị xuất khẩu niên vụ

2005 đạt 150 triệu USD, VPA) Hiện nay, diện tích hồ tiêu vẫn tiếp tục tăng, năm

2012, cả nước đã trồng trên 58.000 ha, vượt 8000 ha so với chỉ đạo của Chính phủ

Tiêu là cây ưa điều kiện khí hậu nóng ẩm Nhiệt độ thích hợp là 25-280C, lượng mưahàng năm yêu cầu vào khoảng 1200-2500mm Tiêu có thể trồng trên nhiều loại đất khácnhau đất sét pha, đất đỏ bazan, đất xám Đất trồng tiêu cần có độ dày từ 80-

100 cm, mạch nước ngầm > 2m, kết cấu tơi xốp, thành phần cơ giới từ nhẹ đến trung bình

dễ thấm và thoát nước và độ chua thích hợp từ 5-6

So với nhiều loại cây công nghiệp, hồ tiêu là cây truyền thống và cũng vừa là cây côngnghiệp mũi nhọn của tỉnh Quảng Trị Theo kết quả điều tra đánh giá phân hạng tài nguyênđất tỉnh Quảng Trị của Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp, tổng diện tích đất thích nghiphát triển cây hồ tiêu có hơn 46 ngàn ha Trong đó, mức độ thích nghi nhất có hơn 18 ngàn

ha thuộc các vùng đất đỏ bazan ở miền Tây huyện Gio Linh; thị trấn Khe Sanh thuộc huyệnHướng Hóa; huyện Cam Lộ và huyện Vĩnh Linh Kết quả đánh giá đất đai và từ thực tế của thịtrường chỉ ra các xã Gio An, Gio Sơn và Hải Thái của huyện Gio Linh; các xã Vĩnh Hòa, VĩnhHiền, Vĩnh Nam huyện Vĩnh Linh và các xã Cam Thành, Cam Nghĩa, Cam Chính huyện Cam Lộ

có mức độ thích nghi đối với hồ tiêu là cao nhất và cây hồ tiêu cho hạt có chất lượng tốt nhất.Những vùng đất kể trên là trọng điểm phát triển kinh tế trồng trọt của tỉnh Quảng Trị, đángchú ý nhất là cây hồ tiêu Chính cây hồ tiêu đã góp phần làm thay đổi cuộc sống từ khó khăntrở nên đủ ăn và giàu có cho bao phận người trên vùng đất đỏ bazan Quảng Trị [52]

Tuy nhiên hệ lụy tất yếu của việc lạm dụng hóa chất trong sản xuất hồ tiêu là dịch hạiphát sinh tràn lan, nguy hiểm nhất là các bệnh chết nhanh, chết chậm, tuyến trùng, rệpsáp áp lực đến mức phát bệnh “Tiêu điên” không thể phòng trừ, nhiều vườn tiêu đã suykiệt trầm trọng, tuổi thọ vườn tiêu giảm hẳn, thậm chí bị mất trắng, hơn nữa tồn dư hóachất trong sản phẩm là điều khó tránh khỏi Nhiều nghiên cứu gần đây đã khẳng định đểbảo đảm sản xuất nông nghiệp bền vững nhất là đối với các nước nhiệt đới, cần thiết phảigiảm thiểu hợp lý phân vô cơ, đặc biệt chú trọng sử dụng phân hữu cơ.

1.6 Tình hình nghiên cứu về các loại vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp phòng trừ trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Một trong những vi sinh vật quan trọng sống trong đất gây hại cho cây tiêu

đó là nấm Phytophthora spp Nấm gây hiện tượng chết nhanh và phân bố rộng rãi

trên thế giới, đặc biệt là vùng Đông Nam Á, Châu Á, Úc Ngoài ra còn có các loài nấm

khác gây chết cây như Fusarium spp., Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani [13].

Theo Kularatne (2002), các bệnh quan trọng nhất trên cây tiêu gồm bệnh chết

nhanh do Phytophthora, bệnh chết chậm do Fusarium, và bệnh lá nhỏ do virus ở Mã Lai Đối với bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp là tác nhân gây bệnh chính Bệnh chết nhanh trước tiên được ghi nhận là do nấm Phytophthora palmivora var piperis, nhưng sau đó nấm được đặt lại tên Phytophthora palmivora MF4 [47] Tên nấm bệnh được Alizadeh và Tsao (1985) đã xác định lại chủng P palmivora MF4 phân lập từ cây

ca cao và hồ tiêu với tên P capsici, theo nghĩa rộng, và cuối cùng là Phytophthora capsici sensu lato [46] Việc làm cỏ trong vườn tiêu bị bệnh sẽ làm phát tán bệnh nhanh hơn

[31], và nấm gây bệnh có thể tồn tại 20 tuần trong đất ở độ thủy dung 100% Bệnh

thối rễ chết nhanh do P capsici gây thất thoát sản lượng từ 5–10 % hàng năm ở Mã Lai Hiện tượng vàng lá của cây có thể do sự cộng hợp của các tác nhân Fusarium sp., Rhyzoctonia sp., và

tuyến trùng Meloidogyne sp., rệp sáp hại rễ, và do cây thiếu dinh dưỡng Hiện chưa

có biện pháp phòng trị hữu hiệu cho cây bị nhiễm Fusarium [48].

Theo Mai (1985), bệnh vàng lá tiêu là do phối hợp giữa loài tuyến trùng

Radopholus similis và nấm bệnh gây ra, bệnh này đã giết chết ngành công nghiệp tiêu

đen ở nhiều nơi của Indonesia Trên cây tiêu ở Sumatra của Indonesia mức độ quần thể

2 con/100g đất và 25 con/10g rễ được ghi nhận gây bệnh vàng lá [30]

Theo Eng (2002) tuyến trùng Meloidogyne có sự quan hệ với bệnh do nấm Pythium

sp và Fusarium sp., tuyến trùng chích hút tạo vết thương vùng rễ cây tiêu gây nên các vết thương tạo cơ hội cho nấm Fusarium tấn công rễ tiêu Năng suất tiêu sẽ giảm nghiêm trọng với sự kết hợp của hai tác nhân tuyến trùng rễ Meloidogyne và virus.

Các động tác làm cỏ vệ sinh vườn cũng vô tình tạo vết thương cho nấm xâm nhập [22].Thành phần của các loài gây hại trên cây tiêu tương tự nhau ở các vùng trồng tiêuchính trên thế giới [20], [24], [27]

Đối với bệnh chết nhanh gây thối rễ, cần áp dụng đồng bộ các biện pháp: thoát thủytốt, tạo sự thông thoáng cho vườn trong mùa mưa, loại bỏ chôn vùi các tàn dư thực vậtquanh gốc tiêu trong mùa mưa, vệ sinh vườn làm sạch cỏ dại, đốt bỏ cành nhánh bị bệnh,tưới đẫm gốc tiêu với dung dịch bordeaux 1% [27], [31] Sarma and Saju (2004) với kháiniệm quản lý bệnh hại tổng hợp (IDM, Integrated Disease Management) đã đề xuất nênchú ý việc sử dụng các tác nhân phòng trừ sinh học thân thiện với môi trường [41]

Bệnh chết nhanh gây thối rễ do Phytophthora capsici, điều trị bằng

metalaxyl, hoặc acid phosphoric, fosetyl-Al rất có hiệu quả Trên cây sầu riêng,Phosphonate được bơm trực tiếp vào mạch gỗ và libe của cây hạn chế được bệnh do

nấm Phytophthora palmivora gây chảy nhựa thân cây sầu riêng Kinh nghiệm này được

Wong (2002) thử nghiệm trên các gốc tiêu có đường kính rễ 7,5–10mm với dung dịch acidphosphoric 1-2% [49]

Eng (2001) cho rằng có thể sử dụng biện pháp sinh học phòng trừ tuyến

trùng rễ với nấm Verticilium chlamydosporium và Paecilomysec lilacinus ký sinh trên

trứng tuyến trùng Biện pháp phòng trừ tổng hợp cần được xây dựng trong đó có biệnpháp tăng cường sự hoạt động của các tác nhân phòng trừ sinh học có sẵn trong môi

trường rễ tiêu nhất là các loài nấm Paecilomysec lilacinus và Pasteuria penetrans [21].

Theo Eng (2002) chỉ có thể áp dụng biện pháp tổng hợp phòng bệnh cho cây tiêunhư dùng giống kháng, vật liệu trồng sạch bệnh, vườn ươm sạch bệnh, luân canh,quảng canh, loại bỏ tàn dư thực vật và rửa sạch dụng cụ làm vườn [22]

Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong kiểm soát nguồn bệnh:

Sử dụng vi sinh vật đối kháng để diệt trừ những loại nấm gây bệnh cho cây là phươngpháp hữu hiệu thay thế cho phương pháp hóa học đảm bảo an toàn cho con người, môitrường sinh thái Vì vậy khả năng sử dụng vi khuẩn phân lập từ đất hoặc rễ để thay thế hoặc

bổ sung vào hóa chất diệt nấm đã được nhiều tác giả nghiên cứu

Có hơn 1.600 loài vi khuẩn có ích, chúng giữ vai trò quan trọng trong cải tạo đất vàtrong đời sống của cây trồng Chúng tham gia quá trình phân giải chất hữu cơ làm thức ăncho cây trồng, làm tăng độ mùn, tơi xốp, háo ký, tăng khả năng giữ nước cho đất, nhờ đó câyhấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn, đồng thời góp phần bảo vệ cây trồng, giảm tác hại của kýsinh gây bệnh, bảo vệ cây trồng Trong tập đoàn vi sinh vật có ích, một lượng lớn vi sinh vậtđối kháng ngăn chặn hữu hiệu sự phát triển của sinh vật gây hại nói chung và của nấm gây

bệnh nói riêng Một số vi khuẩn như: Bacillus subtlis, B.mycoides; Pseudomonas fluorescents, P.cepacia; Pimelobacter sp; Agrobacterium radiobacter k84 không gây bệnh và

một số loại vi khuẩn đối kháng khác đã và đang được sử dụng trong phòng trừ bệnh hại câytrồng [50], [51]

Anith và cs (2002) đã thành công trong việc phân lập dòng vi khuẩn đối kháng

với Phytophthora capsici từ vùng rễ cây tiêu, đã chọn được chủng

PN-026, có khả năng hạn chế Phytophthora capsici gây héo cây trong vườn ươm [12].

Ngoài vi khuẩn đối kháng, Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết

đến nhiều trong vai trò kiểm soát nấm bệnh thực vật Hyung Won Suh, 1997 đã phân

lập được Streptomyces sp WYE 20 và WYE 324 có hoạt tính kháng nấm mạnh mẽ chống lại Rhizoctonia solani và Phytophthora capsici và có thể được sử dụng trong nhiều cách khác

nhau để làm giảm các bệnh nấm trên cây trồng như dưa chuột, tiêu Năm 1999, khángsinh lospomal HA – 92 ra đời, được tách chiết từ xạ khuẩn Str e ptomyces C DRLL –312

tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài

ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Năm 2002 tại Ấn Độ đã phânlập được chủng Strep to myces sp. 201 có khả năng sinh kháng sinh mới là z - methylheptyliso- nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnhnhư Furas iu m oxyspo r u m , F solani…[11].

Một số loài của giống nấm Trichoderma đã được thử nghiệm như là một trong những

tác nhân kiểm soát sinh học chống lại một số tác nhân gây bệnh và tuyến trùng kí

sinh Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium Quá trình đó được gọi là: ký sinh nấm (mycoparasitism) Trichoderma tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của các loài nấm

khác Sau đó nó có thể tấn công vào bên trong loài nấm gây hại đó và tiêu thụ chúng [25].Đối với nấm đối kháng trong phòng trừ sinh học, cần quan tâm đến các thông sốmôi trường có khả năng ảnh hưởng đến tác nhân phòng trừ sinh học này trong đất Cácthông số có thể kể là nhiệt độ đất, ẩm độ đất, pH đất, thuốc trừ sâu, các ion kim loại, vàcác vi khuẩn đối kháng của nấm trong đất, kể cả kỹ thuật canh tác Nhiệt độ thấpcũng có thể làm giảm họat tính của nấm [21]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Vi sinh vật gây hại trên cây hồ tiêu ở Việt Nam được ghi nhận từ những năm đầuthế kỷ 20, diện tích trồng tiêu (tính bằng số lượng trụ tiêu) ở Hà Tiên, Phú Quốc, Rạch Giá,

và Bà Rịa từ 930.000 trụ năm 1910 giảm xuống còn khoảng 540.000 trụ năm 1927 dobệnh thối gốc cây tiêu Công trình nghiên cứu của Barat (1952) tập trung nhiều vào biệnpháp canh tác, dù vậy ông đã tìm thấy một số loài nấm bệnh

như Phytophthora sp., Pythium complectens, Fusarium solani var minus,

Botryodiplodia theobromae, Gloeosporium sp., Pestalozzia sp…[53].

Theo Ngô Vĩnh Viễn (2007), trên hồ tiêu có 3 nhóm dịch hại có ý nghĩa kinh tế vàcần được quan tâm nghiên cứu giải quyết là: 1 bệnh chết nhanh; 2 bệnh chết chậm; 3.bệnh virus Tác giả cũng cho rằng bệnh chết nhanh là nguyên nhân gây suy thoái vườn tiêucủa nhiều địa phương như Cam lộ (Quảng Trị), Chư Sê (Gia Lai), Xuân Lộc (Đồng Nai),Phú Quốc (Kiên Giang) Về nguyên nhân gây bệnh chết nhanh, tác giả cho rằng do hai

nhóm nấm Phytopthora và Pythium gây ra bao gồm P capsici, P nicotanae, P cinnamomi và Pythium sp Về bệnh chết chậm do tác động cộng hưởng của nhiều tác nhân như: tuyến trùng, nấm Fusarium, Pythium, rệp sáp và mối [10].

Một số loài nấm thuộc chủng Phytophthora gây thiệt hại ngày càng cao trên một

số cây trồng ở Việt Nam, bao gồm cây ăn quả, rau, cây gia vị, và các cây công

nghiệp Mười ba loài Phytophthora đã được định danh ở nước ta, trong đó có hai loài gây thiệt hại nặng là P infestans trên cây cà chua và P capsici trên hồ tiêu [17].

Nguyễn Tăng Tôn (2005) cho rằng bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora capsici là bệnh quan trọng nhất hiện nay trên cây tiêu ở Việt Nam Ngoài ra một số nấm gây bệnh khác như Fusarium spp., Pythium sp., Rhizoctonia solani cũng là các tác

nhân quan trọng Phân hữu cơ giúp cho đất tơi xốp đây là điều kiện cần thiết cho bộ

rễ tiêu sinh trưởng tốt, ngoài ra còn cung cấp lượng lớn vi sinh vật vào trong đất, tạocân bằng sinh học cho vùng đất quanh cây tiêu Việc sử dụng các loại phân hữu cơ nhưphân bò, phân gà, phân rác đã hạn chế được sự phát triển của bệnh chết nhanh trên câytiêu so với không bón Với một số loại phân hữu cơ chất lượng cao khi bón cho hồ

tiêu, khả năng khống chế quần thể tuyến trùng Meloidogyne rất có ý nghĩa so với không

bón

Kết quả nghiên cứu của Tran Thi Thu Ha (2007) cho thấy bệnh chết nhanh do

nấm Phytophthora capsici trên cây tiêu ở Quảng Trị là cản ngại chính

cho sản xuất hồ tiêu tại địa phương Xử lý hom tiêu trước khi trồng với thuốc trừ

nấm có khả năng giảm thiệt hại do nấm Phytophthora gây ra cho vườn tiêu [45].

Theo đánh giá của Cục Bảo vệ Thực vật (2007), trên cây tiêu có 17 loại bệnh gâyhại, trong đó bệnh: thán thư, cháy đen lá, mốc hồng, tuyến trùng, virus, chết nhanh,chết chậm gây hại nặng và khá phổ biến ở nhiều vùng Các bệnh khác như nấm mạngnhện, tảo đỏ, rụng gié, chết thân, thối rễ do vi khuẩn, khô vằn là những bệnh tuy có xuấthiện nhưng tác hại không lớn [1]

Nhìn chung bệnh hại hồ tiêu hiện nay đang là mối lo của rất nhiều người kể cả cácnhà quản lý và người sản xuất Hàng năm bệnh hại thường xuất hiện khá phổ biến vàchủ yếu vào giai đoạn giữa và cuối mùa mưa, gây thiệt hại rất lớn cho người trồngtiêu Nhiều nhà khoa học, nhiều công trình nghiên cứu đã tập trung tìm hiểu tác nhân gâyhại và xây dựng các biện pháp phòng trừ, tuy nhiên trong thực tế các vườn tiêu bị nhiễmbệnh và chết vẫn không giảm

Bệnh hại nghiêm trọng nhất hiện nay đối với hồ tiêu là bệnh chết nhanh,

nguyên nhân gây bệnh là do loài nấm Phytophthora palmivora kí sinh trên rễ và thân

ngầm gây ra (Đoàn Nhân Ái, 2007) Theo nhận xét của tác giả bệnh phụ thuộc rất nhiềuvào quá trình tích luỹ của nấm bệnh ở trong đất, nếu có thêm những tác nhân từ bênngoài tác động vào, bệnh sẽ dễ dàng phát triển thành dịch Khi dịch đã phát sinh, sự lâylan nhanh chóng của bệnh theo kiểu vết dầu loang do nước mưa chảy tràn Bằngnhững công trình nghiên cứu gần đây nhất cho thấy bệnh chết nhanh trên cây tiêu

do loài nấm Phytopthora capsici gây nên Ở một số quốc gia khác như: Ấn Độ, Malaysia, Trung Quốc, Thái Lan, Philippines còn xuất hiện thêm loài nấm P nicotanae

và loài nấm P palmivora còn xuất hiện ở Indonesia, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Brazil [

2 ]

Nghiên cứu về tnh hình dịch hại và đề xuất các biện pháp phòng trừ đối với vùngtrồng tiêu thuộc các tỉnh Tây Nguyên, Trần Thị Kim Loang (2007) cho rằng bệnh hại rễ làcác đối tượng xuất hiện phổ biến, gây thiệt hại nghiêm trọng và rất khó phòng trừ

Nấm Phytopthora spp và tuyến trùng Meloidogyne sp là quan

trọng Tác giả cho rằng để phòng trừ hiệu quả các loại bệnh hại nói trên cần phải kết hợpnhiều biện pháp, trong đó biện pháp thường xuyên sử dụng phân hữu cơ, phân bón lákết hợp sử dụng hợp lý thuốc bảo vệ thực vật sẽ đem lại hiệu quả cao hơn Hiệu quảkiểm soát tuyến trùng của các loại phân hữu cơ có thể kéo dài cả năm [4], [7].

Bệnh chết nhanh trên cây tiêu rất nguy hiểm, nấm gây bệnh tấn công trên tất cảcác phần của cây tiêu, và ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng của cây, trường hợp nấm bệnh tấn

công vào rễ hoặc cổ rễ sẽ gây cây chết đột ngột Bệnh do nấm Phytophthora spp gây ra Nấm Phytophthora spp có nguồn gốc thủy sinh nên chúng ưa thích và rất cần sự ẩm ướt để

sinh sản, phát triển và gây hại Bệnh phát triển, lây lan mạnh trong mùa mưa, nhiệt độ khôngkhí trên dưới 30ºC Bệnh có thể xâm nhập và gây hại ở tất cả các bộ phận của cây từ thân, lá,hoa, trái cho đến cổ rễ và rễ Nhưng nguy hiểm nhất và làm cho cây tiêu bị chết hàng loạt làkhi nấm tấn công vào phần cổ rễ và rễ Triệu chứng là cây tiêu đang tươi tốt thì xuất hiệnmột ít lá bị vàng úa, sau đó các lá tiếp tục bị vàng, cây tiêu héo rũ rất nhanh, có khi lá héo rũtrên cây, đến sáng sớm có thể thấy cây tiêu tươi trở lại do ướt sương vào ban đêm Sau

đó các đốt thân cũng biến màu thâm đen và rụng Hiện tượng rụng lá và đốt thường bắtđầu từ ngọn trở xuống Bệnh xâm nhiễm vào cây tiêu bắt đầu ở vùng cổ (ngang mặt đất) hoặcphần bên dưới mặt đất làm thối cổ rễ và thối đen rễ, sau đó phần hư thối này lan dần lêntrên và cây tiêu biểu hiện các triệu chứng như đã nêu Bênh tiến triển rất nhanh từ khi pháthiện thấy lá tiêu hơi rũ xuống cho đến khi lá rụng ào ạt có khi chỉ 5-7 ngày và đến khi tiêuchết hoàn toàn có thể trong vòng 1-2 tuần [52]

Bệnh vàng lá thối rễ hồ tiêu (chết chậm) cho thấy cây có triệu chứng sinh trưởngchậm, lá chuyển từ màu xanh sang xen kẻ màu vàng, sau đó màu vàng nhạt và dần dần vàng

cả lá Bệnh xuất hiện khi cây bị nhiễm các đối tượng Meloidogyne incognita, Radopholus similis hoặc nhiễm các loại nấm có sẵn trong đất (Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Pythium

sp.) Bệnh này làm cây tiêu sinh trưởng chậm, èo uột, rụng đốt, thối rễ và gốc, phần mạchdẫn nhựa thân cây có màu nâu đen Từ khi cây bệnh đến khi cây chết kéo dài vài ba tháng

đến một năm Bệnh “chết chậm” do nấm Fusarium

oxysporum hay do tác nhân khác gây ra thường xuất hiện và gây hại nặng trên những

vườn tiêu bị ngập úng, thoát nước kém, ít thoáng khí, bón thừa đạm [53]

Hình 1.1 Triệu chứng cây tiêu bị nhiễm

Phytopthora spp

Hình 1.2 Triệu chứng cây tiêu bị

nhiễm Fusarium oxysporum

Theo nhận xét của Ngô Vĩnh Viễn (2007), bệnh hại hồ tiêu có hướng gia tăng vàngày càng trở nên nghiêm trọng hơn ở các vùng trồng tiêu trong cả nước Người sản xuấtmong đợi những giải pháp phòng trừ có hiệu quả nhưng những phương pháp phòngtrừ mới ít được phổ biến và ngày càng có nhiều vườn tiêu bị huỷ hoại do bệnh hại

Ở nước ta hiện nay, việc phòng trừ dịch hại trên cây tiêu chủ yếu bằng biện pháphóa học và thường gặp nhiều khó khăn Nguyên nhân chính là sinh vật gây hại sốngtrong đất và phát triển nhanh trong điều kiện ẩm ướt, vì thế hiệu lực của thuốc khôngcao do bị rửa trôi và hoà tan Trong những tháng mùa khô, nấm gây bệnh hình thànhbào tử có vách dày, đây là cấu trúc để tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt và không

bị tác động bởi thuốc hoá học Bào tử chỉ nảy mầm khi gặp ẩm độ thích hợp và môitrường dinh dưỡng cao Hơn nữa thuốc hóa học có thể tiêu diệt cả sinh vật gây bệnh vàsinh vật có ích, điều này rất dễ làm bùng phát dịch bệnh do quần thể sinh vật trong đất bịmất cân bằng nghiêm trọng

Thuốc hoá học sử dụng trong phòng trừ dịch hại phát sinh từ đất thường được ápdụng bằng cách tưới dung dịch thuốc vào đất ở vùng rễ gần gốc cây tiêu, thuốc có thểchảy tràn và ngấm sâu vào đất gây ô nhiễm môi trường đất mặt và vùng

nước ngầm ở vườn tiêu Điều đáng quan tâm là việc phòng trừ dịch hại bằng các loạihoá chất bảo vệ thực vật hiện đang được sử dụng phổ biến ở nước ta, một số nằm

trong danh mục độc hại theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Do vậy, việc

áp dụng các hoá chất nằm trong danh mục này cần phải thật cẩn trọng và phù hợp vớihướng dẫn, qui định và luật pháp của Việt Nam

Biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) và biện pháp canh tác hữu cơ chocây tiêu đã được nghiên cứu và áp dụng tại các nước sản xuất hồ tiêu trên thế giớinhưng chưa được nghiên cứu thấu đáo và ứng dụng ở nước ta Biện pháp ICM cho câytiêu bao gồm việc sử dụng giống ít bị nhiễm bệnh, hom giống tốt, phát hiện và phòng trừdịch hại kịp thời, sử dụng các hoá chất bảo vệ thực vật thân thiện với môi trường và ápdụng đúng kỹ thuật, khuyến cáo biện pháp sản xuất nông nghiệp tốt (GAP) như bồidưỡng đất, dùng cây họ đậu làm cây che phủ đất nhằm tạo môi trường đất tốt và cây tiêukhỏe, giúp cây tiêu chống chịu tốt với dịch hại và điều kiện bất lợi của môi trường.Việc sử dụng cây trụ sống có rong tỉa hợp lý, dùng thân lá rong tỉa từ cây trụ sống

tủ gốc tiêu và cây họ đậu che phủ đất phát huy hiệu quả trong việc giảm lượng hoá chất(phân bón và thuốc bảo vệ thực vật) cần thiết cho vườn tiêu; tăng cường sử dụng chếphẩm sinh học và vi sinh vật có ích (EM) như nấm kích thích phát triển rễ (arbuscularmycorrhizae, AM) giúp cây tăng trưởng khoẻ trong vườn ươm và vườn trồng chưa đượcnghiên cứu có hệ thống

Xác định giới hạn ngưỡng lây nhiễm, nhổ bỏ, cô lập và huỷ cây bị lây nhiễm dịchhại nghiêm trọng, việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học như bánh dầu xoanchịu hạn (neem cake) và những hoá chất ít độc hại như dung dịch Bordeaux vàPhosphonate để phòng dịch hại, giúp giảm thiệt hại cho cây tiêu nhưng chưa được chútrọng nhiều

Báo cáo “Nghiên cứu xây dựng mô hình phòng trừ tổng hợp bệnh vàng lá chết chậmtrên cây tiêu ở Đăk Lăk” cho thấy việc áp dụng đồng bộ các biện pháp kỹ thuật canh tác như:bón phân hữu cơ, trồng cây che bóng, vệ sinh đồng ruộng, tủ gốc, phát hiện bệnh sớm và

xử lý thuốc hoá học kịp thời góp phần hạn chế sự phát triển của bệnh vàng lá chết chậm

do tuyến trùng và nấm Fusarium solani, nhưng mô hình chỉ

mới được xây dựng trên hai tỉnh Đăk Lăk và Gia Lai [5].

Đề tài “Nghiên cứu các giải pháp khoa học, công nghệ và thị trường để phát triểnvùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến và xuất khẩu” (KC.06.11.NN) chỉ mới tập

trung đánh giá tnh hình gây hại của bệnh chết nhanh cây tiêu do nấm Phytophthora capsici gây ra ở Đông Nam Bộ, và phòng trừ bệnh chết nhanh trên tiêu kinh doanh

bằng biện pháp hoá học là chính; chưa có điều kiện để nghiên cứu tác nhân gây hại

khác như tuyến trùng, nấm Fusarium sp., Pythium sp., rệp sáp, biện pháp phòng trừ

dịch hại bằng các chế phẩm sinh học, vi sinh vật đối kháng và các kỹ thuật canh tác khác[9]

Đề tài “Nghiên cứu bệnh do nấm Phytophthora trên một số cây công nghiệp và

cây ăn quả ở Tây Nguyên” chỉ mới kết luận được các vườn tiêu ở Tây Nguyên đều

nhiễm nấm Phytophthora, tiêu trồng với trụ chết có khuynh hướng nhiễm Phytophthora nặng hơn so với cây trụ sống, vườn tiêu được bón nhiều phân hữu cơ có mức nhiễm Phyophthora nhẹ hơn các vườn bón ít hoặc không bón phân hữu cơ, chưa có

kết luận biện pháp phòng trừ hiệu quả [4]

Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong kiểm soát nguồn bệnh:

Hướng phòng trừ sinh học bệnh hại trên hồ tiêu đã được một số nhà khoa học nghiêncứu và có nhiều triển vọng Việc vận dụng tính chất đối kháng của một số loại vi sinh

vật như nấm Trichoderma đang được sử dụng khá phổ biến trong phòng trừ nấm Phytopthora Hiện nay Viện Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên đang nghiên cứu chế phẩm sinh học Trichoderma để phòng trừ bệnh do nấm Phytopthora

gây ra trên cây ca cao và cây tiêu

Nhiều tác giả cho rằng sự cân bằng dinh dưỡng trong đất, nhất là bổ sungnhiều hợp chất hữu cơ vào đất, các vi sinh vật trong đất sẽ phát triển phong phú và chínhquần thể vi sinh vật có ích này sẽ giúp cho cây trồng hấp thu đủ dinh dưỡng, phát triểnkhoẻ mạnh, tăng sức đề kháng sâu bệnh Các vi sinh vật đối kháng phát triển phong phú

sẽ khống chế kìm hãm các vi sinh vật gây bệnh, đây chính là hiệu quả của việc quản lídịch hại dựa trên cơ sở bảo vệ cân bằng sinh thái trong đất Trong tương lai biện phápsinh học sẽ được khuyến khích sử dụng trong quy trình chăm sóc cây tiêu để hạn chế sửdụng thuốc bảo vệ thực vật Nguyễn Thân (2004)

kết luận việc sử dụng nấm Trichoderma virens dòng T41 có hiệu lực mạnh trong phòng trừ nấm Phytophthora spp gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu, bệnh xỉ mủ cây sầu riêng

[8]

Trong đất, nấm gây bệnh thường bị khống chế bởi một số vi sinh vật khác

như nấm Trichoderma harzianum, T virens, Gliocladium sp., xạ khuẩn streptomyces sp., vi khuẩn Pseudomonas spp., Bacillus spp Do đó việc tạo môi trường đất cân đối bằng

các kỹ thuật nông học đảm bảo cho sự tồn tại, khống chế lẫn nhau giữa vi sinh vật đốikháng và vi sinh vật gây bệnh, tránh sự bộc phát bệnh là hướng nghiên cứu hiện nayđược chú trọng nhiều Bên cạnh đó việc sử dụng

gốc ghép kháng bệnh cũng là hướng mở ra nhiều triển vọng và có hiệu quả

Đầu năm 2005, các nhà khoa học tại Đại học Nông lâm Huế đã bắt tay vàonghiên cứu, thực nghiệm tại nhiều vườn tiêu bị bệnh trên cả nước Qua nghiên cứu, tm,

phân lập, các nhà Khoa học đã phát hiện trong rễ cây hồ tiêu có vi khuẩn Pseudomonas, là vi khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh chết nhanh Phytophthora capsici trên cây hồ tiêu.

Đây được xem là một phát hiện mang tính đột phá mang đến sự thành công sau này [53].Với đề tài KC04- 04, Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam đã phân lập và

tuyển chọn được một số chủng vi nấm đối kháng F.oxysporum gây bệnh thối rễ cà phê và tiêu, phân lập từ đất rễ cây cà phê ở Đắc Lắc và sơ bộ định loại đến chi Gliocladium và Trichoderma, hai chủng vi nấm khác (Metarhizium và Beauveria) có khả năng diệt côn trùng

và mối Ngoài ra, đã chọn được 2 chủng vi khuẩn đối kháng tốt F oxysporum và Ralstonia solanacearum (thuộc chi Bacillus), 8 chủng khác có hoạt tính đối kháng nhưng yếu hơn Cơ

chế đối kháng nấm của các chủng rất khác nhau, có chủng ức chế hoàn toàn sự phát triểncủa nấm, nhưng cũng có chủng làm gãy các khuẩn ty khí sinh của nấm gây bệnh [53]

Ngoài ra, Việt Nam gần đây đã tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh chất kháng

sinh của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm gây bệnh ở thực vật (như Streptomyces spp; Streptomyces griseus; Streptomyces longisporus ).

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 94 chủng vi khuẩn, 29 chủng xạ khuẩn và 26 chủng nấmđược phân lập từ đất, rễ của cây tiêu bị bệnh lấy từ các Huyện Cam Lộ, Vĩnh Linh của TỉnhQuảng Trị, thời gian, địa điểm lấy mẫu được trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian lấy mẫu

2.1.2 Vật liệu

Các chủng nấm Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Phytophthora sp gây bệnh hại

cây trồng từ bộ sưu tập giống của Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quảng Trị – Viện Hóasinh biển

Bộ BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) sử dụng cho

phản ứng đọc trình tự ADN; chỉ thị ADN chuẩn (Invitrogen); Tag ADN polymeraza (Perkin

Elmer);

Các cặp mồi để khuếch đại gen 16s rADN ( cặp mồi 16sF, 16sR dùng cho vi khuẩn [37];

và cặp mồi 27sF, 1527sR dùng cho xạ khuẩn [29] được đặt tại hãng Invitrogen

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

- Các loại hóa chất: Yeast Extract (DIFCO-Mỹ); EDTA; SDS; Tris (Sigma- Mỹ); Acid acetic,Ampicillin (Meck-Đức); Agar (Sigma, Mỹ); Cồn tuyệt đối; Ethidium bromide, tryptone, X-gal;Meat Extract, nước cất, chlorofom, TAE, isoamyalcohol, EDTA, ethanol, parafil lỏng, NaCl0.85%

- Các dung dịch để tách chiết DNA tổng số:

+ Dung dịch Chloroform: Isoamylacohol =24:1

+ Dung dịch TE

Tris- HCl :10mM pH=8,0

EDTA :1mM

+ Dung dịch đệm dành cho điện di:

Dung dịch đệm điện di TAE 1X được lấy từ dung dịch TAE 50X gốc có thành phần: Tris base

+ Dung dịch nhuộm gel: Ethidium bromide (EtBr)

Dung dịch gốc: 10mg/ml Pha 1g EtBr với 100ml nước cất, khuấy từ cho tan đều, giữtrong lọ tối màu ở nhiệt độ phòng

Khi sử dụng pha 20μl dung dịch gốc trong 100ml đệm TAE 1X

+ Đệm tra mẫu (loading bufer) 5X:

+ Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)

+ Máy ly tâm (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ)

+ Tủ lạnh cất giữ sinh phẩm (4°C và 0°C)

+ Tủ lạnh sâu -20°C ( Sanyo, Nhật Bản)

+ Tủ lạnh sâu -75°C ( Sanyo, Nhật Bản)

+ Máy khuấy trộn Vortex ( RotoLab, OSI)

+ Máy hút chân không ( Speed Vac Sc 110-Savant)

+ Máy soi chụp ảnh gel ( Bio-Rad)

+ Cân phân tích 10-4 g ( Mettler Toledo)

+ Bộ nguồn điện di ( Bio-Rad)

+ Tủ cấy vô trùng ( Sanyo).

+ Pipettman các loại ( Gilson)

+ Nồi khử trùng ( Nhật Bản)

+ Cân điện 10-2 g ( Mettler Toledo)

+ Bộ điện di ( Advance Tech, Nhật Bản)

Môi trường và dung dịch dùng cho cho quá trình phân lập, tuyển chọn được thống kê

10-20 phút, dùng pipetman hút 1ml dung dịch sang ống nghiệm có 9ml nước vô trùng (hoặcnước muối sinh lý) và tiếp tục pha loãng tới 10-3,10-4, 10-5 Từ mỗi nồng độ pha loãng cấy100µl vào đĩa petri đường kính 90mm chứa môi trường Czapeck-Dox Nuôi ở 24-30oC sau 1-

2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc

2.2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng

Mẫu đất, rễ nhỏ (10 g) lấy ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh được loại bỏ rác,nghiền nhỏ trong cối chày sứ vô trùng, bổ sung 90 ml nước cất vô trùng và chuyển sang bìnhnón, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong 10-20 phút Lấy 1 ml dung dịch chuyển sang ốngnghiệm có 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, và tiếp tục pha loãng tới 10-3,10-4,

10-5 Từ các ống nghiệm với nồng độ pha loãng khác nhau (10-3,10-4, 10-5), cấy trải 100

µl lên môi trường MPA hoặc King B (để phân lập vi khuẩn) và môi trường ISP4 (cho xạ

khuẩn) Nuôi ở 30oC và 37oC, sau 1-2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc

2.2.2 Nuôi cây và lưu giữ các chủng vi sinh vật

+ Nuôi cấy vi khuẩn: các chủng phân lập sau khi làm sạch được nuôi cấy từ 16-24h ở

300C và 370C trên môi trường lỏng MPA, King B

+ Nuôi cấy xạ khuẩn: Các chủng phân lập sau khi làm sạch được nuôi cấy từ 48- 72h ở

300C trên môi trường lỏng ISP4

+ Lưu giữ các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn: Bổ sung glyxerol vô trùng đến nồng độ cuốicùng 30% vào canh trường nuôi cấy vi khuẩn (qua đêm) và xạ khuẩn (48-72h) và giữ ở -800C

2.2.3 Phương pháp nhuộm Gram [3]

- Vật liệu, hoá chất:

+ Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 mletanol 95% + 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất Trộn hai dịch nói trên lạivới nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng

+ Dung dịch Iod: Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI

(Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản trong lọ tối

+ Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml

+ Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

+ Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

+ Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

+ Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.

+ Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong khôngkhí

+ Soi kính: dùng vật kính dầu 100x

-Kết quả:

Vi khuẩn Gram dương (+) bắt màu tím, Gram âm (-) bắt màu đỏ

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm gây bệnh của các chủng nấm phân lập [26], [28], [35].

Hai khoanh nấm (nấm phân lập và nấm bệnh) được cấy đối xứng nhau trên đường kínhđĩa Petri và mỗi bên cách tâm 3cm, trong đó nấm bệnh được cấy trước 1 ngày

Phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm (PIMG): Sau 7 ngày nuôi cấy đối khángtrực tiếp, đánh giá phần trăm ức chế nguồn bệnh bằng cách đo đường kính của khuẩn lạc nấmbệnh trên đĩa có chủng được cho là có hoạt tính đối kháng (R2) và đường kính của khuẩnlạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng (R1) Phần trăm ức chế được tính theo công thức:PIMG=(R1 –R2)/R1 ×100

Hình 2.1 Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp.

R1, R2: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh T : khuẩn lạc chủng nấm đối kháng

2.2.5 Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch nuôi [16].

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bình nón dung tích 250ml có chứa

100ml môi trường dịch thể, lắc trên máy lắc 220 vòng/phút Sau 1-2 ngày lọc lấy dịch trong,nhỏ vào lỗ thạch đã đục sẵn trong đĩa petri đã cấy vi sinh vật kiểm định Để tủ lạnh 30 phútcho chất kháng sinh khuếch tán vào thạch, sau đó nuôi ở 300C Sau 1-3 ngày xác định vòngkháng vi sinh vật

HTKS = D-d (mm)D: Đường kính vòng kháng khuẩn d:

Đường kính thỏi thạch

2.2.6 Phương pháp sinh học phân tử

2.2.6.1 Quy trình tách chiết ADN genom

Quy trình tách chiết ADN genom của vi khuẩn [39]:

+ Ly tâm huyền dịch vi khuẩn, loại bỏ dịch nổi

+ Cặn tế bào được hòa lại trong dung dịch đệm TE 10:1 (Tris HCl + EDTA)

+ Bổ xung SDS 10% và proteaza K, đảo đều, ủ ở 370C sau 1h để phá vỡ tế bào và loại bỏ protein

+ Bổ sung NaCl 5M, đảo đều, ủ ở 650C trong 10 phút

+Chiết ADN bằng dung dịch chloroform:isomylalcohol (24:1) và phenol

+ Ly tâm thu dịch nổi nằm trên lớp xác tế bào.

+ Chiết lại ADN bằng chloroform : izoamylalcohol (24:1) và phenol

+ Tủa ADN bằng cách bổ sung NAOAc 3M, cồn 100% và giữ ở 200C tối thiểu trong

1h

+ Ly tâm loại bỏ dịch nổi, rửa cặn ADN bằng cồn 70% làm khô ADN

+ Hòa lại cặn trong đệm TE chứa ARNaza (100µg/ml), ủ ở 370C trong 1h để loại ARN

+ Nồng độ và độ sạch của ADN được xác định bằng phổ hấp phụ trên máy quang phổ tử ngoại và điện di trên gel agaroza 1%

Quy trình tách chiết ADN genom của xạ khuẩn [39]:

+ Lấy khuẩn lạc cho vào epp 1,5 bổ sung 200µl TE 10nM pH=8.0, votex kỹ (hoặc nuôi dịch sau

đó ly tâm thu cặn)

+ Bổ sung 20µl SDS 20% (hoặc SDS 10%), votex nhẹ, ủ 650C trong 40-50p

+ Ly tâm 10000 vòng/ 10p/ 40C

+ Hút dịch phía trên sang ống epp mới, xác tế bào tiếp tục được xử lý

+ Epp chứa xác tế bào cho vào lò vi sóng ở cấp độ low level khoảng 130 giây, lặp lại 3 lần.+Trộn đều xác tế bào với dịch đã hút trước đó

+ Bổ sung 500µl CI (Chloroform:Isoamyl Alcohol), đảo đều, ly tâm 12000

vòng/10p/40C, hút pha trên chuyển sang epp mới

+ Tủa bằng 400 µl Isopropanol (1:1 v/v), 10% CH3COONa, giữ -200C trong 2-3h

+ Ly tâm 12000 vòng/10p/40C, đổ dịch Rửa tủa bằng 400 µl cồn 700C, ly tâm 10000 vòng/7p/40C

+ Làm khô mẫu bằng máy hút chân không DNA thu được hòa tan trong 20 µl nước

2.2.6.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại [39]

Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm(A260) nhờ máy quang phổ Hewlett Packard (Mỹ) với nồng độ pha loãng 50 lần trong H20khử ion Một đơn vị A260 tương ứng với nồng độ 50 µg/ml Do vậy nồng độ ADN được tínhtheo công thức: A260 x 50 x hệ số pha loãng= µg/ml

Độ hấp phụ của dung dịch chứa ADN cũng được đo ở bước sóng 280nm để xác địnhmức độ sạch của ADN đã tách chiết Độ tinh sạch được xác định bằng tỉ số A260/A280 ≥ 1,7thì có thể coi ADN tách chiết đủ độ sạch dùng cho các kỹ thuật sinh học phân tử tiếp theo

2.2.6.3 Trình tự và thông số cặp mồi sử dụng để tến hành PCR

Để thực hiện PCR, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi sau:

Bảng 2.2: Trình tự và thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho vi khuẩn

Bảng 2.3: Trình tự và thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho xạ

Chu trình nhiệt để tiến hành nhân gen : 940C -3 phút; 940C -1 phút; 640C – 1 phút;720C - 1phút 30 giây; 32 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4); 720C - 10 phút; kết thúc ở 40C.

2.2.6.5 Điện di ADN trên gel agaroza [39]

Các bước điện di ADN trên gel agaroza như sau:

 Đổ bản gel:

+ Cho gel agarose 0.8% vào lò vi sóng đun nóng trong khoảng 30 giây, lắc cho gel tan hoàn toàn

+ Để nguội ở nhiệt độ phòng đến 50oC – 60oC

+ Cài lược gel và đổ gel vào khuôn gel

+ Chờ cho gel đông tụ hoàn toàn (khoảng 30 phút), rồi sau đó tháo lược và đặt khuôn gel vào buồng điện di

 Chuẩn bị mẫu và điện di:

+ Cho vào ống eppendorf 1,5 ml 2 µl mẫu DNA và 1 µl dung dịch tải mẫu loading

dye, 7 µl nước cất vô trùng

+ Dùng pipetman nạp mẫu và nạp chuẩn ( 2 µl ) vào giếng gel

+ Đậy nắp buồng điện di và cắm điện cực

+ Điện di với hiệu điện thế 90 V – 120 V trong vòng 30 phút

 Nhuộm và hiển thị trên gel:

+ Sau khi nhuộm điện di xong, rút điện mở nắp và lấy bản gel ra

+ Cho bản gel vào dung dịch nhuộm ethidium bromide ngâm trong 10 – 15 phút

+ Vớt bản gel ra và soi kết quả trên đèn UV

2.2.6.6 Xác định trình tự nucleott của gen [39]