Nghiên cứu đặc tính lý hóa và khả năng hấp thụ curcumin của màng bacterial cellulose (LV02589)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 PHẠM THỊ LAN HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH LÝ HÓA VÀ KHẢ NĂNG HẤP THỤ CURCUMIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 4

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

PHẠM THỊ LAN HƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH LÝ HÓA VÀ KHẢ NĂNG

HẤP THỤ CURCUMIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN XUÂN THÀNH

HÀ NỘI, 2017

và khả năng hấp thụ Curcumin của màng Bacterial cellulose” tại Viện

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo, TS Nguyễn Xuân Thành, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, phòng Vi sinh, cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin được cảm ơn tới Ban giám hiệu trường THPT Kim Anh - Sóc Sơn - Hà Nội, nơi tôi đang công tác, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi tham gia và hoàn thành khóa học đào tạo thạc sĩ này Xin cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất, nhưng do hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân chưa thấy được Tôi rất mong được sự đóng góp của quý thầy cô và các bạn để luận văn của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2017

Học viên

Phạm Thị Lan Hương

Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu đặc tính lý hóa và khả năng hấp thụ Curcumin của màng Bacterial cellulose” là công trình nghiên cứu

của cá nhân tôi, thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy giáo, TS Nguyễn Xuân Thành Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống

kê, không có số liệu sao chép hay trùng với bất kỳ luận văn nào Các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan, các trích dẫn được lấy từ các công bố chính thức và có ghi chú rõ ràng Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2017

Học viên

Phạm Thị Lan Hương

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu đề tài 3

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 4

6 Ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn 4

7 Đóng góp mới của đề tài 4

NỘI DUNG 6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Tổng quan về Acetobacter xylinum 6

1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum 6

1.1.2 Đặc điểm của A xylinum 6

1.2 Tổng quan màng BC tạo bởi A xylinum 7

1.2.1 Tính chất độc đáo của BC 8

1.2.2 Sinh tổng hợp BC 9

1.2.3 Ứng dụng của màng BC 10

1.2.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum 10

1.2.5 Các phương pháp sản xuất BC từ A xylinum 11

1.2.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam 11

1.3 Tổng quan về curcumin 15

1.3.1 Giới thiệu 15

1.3.2 Tính chất lý - hóa của curcumin 16

1.3.3 Hoạt tính sinh học của curcumin 18 1.3.4 Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng sinh khả

CỨU 23

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Giống vi khuẩn 23

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter, chế tạo hệ mạng lưới BC chứa curcumin từ màng cellulose vi khuẩn 25

2.2.2 Xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc, xác định pH, lượng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết của màng BC 27

2.2.3 Xây dựng đường chuẩn Curcumin Xác định các thông số tối ưu của quá trình hấp thụ thuốc Cur vào màng BC 29

2.2.4 Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC 35

2.2.5 Xác định các đặc tính lý hóa của hệ màng BC chứa curcumin 36

2.2.6 Phương pháp xử lý thống kê 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter, chế tạo hệ mạng lưới BC chứa curcumin từ màng cellulose vi khuẩn 42

3.1.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter 42

3.1.2 Kết quả tạo hệ mạng lưới BC và thu màng BC 44

3.2 Kết quả xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc, xác định pH, lượng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết của màng BC 45

3.2.1 Xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc 45

3.2.2 Kết quả đo pH của màng BC tinh chế 47

3.2.3 Kết quả xác định lượng BC tạo thành: 48

của quá trình hấp thụ thuốc Cur vào màng BC 50 3.3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn Curcumin 50 3.3.2 Kết quả khảo sát thông số tối ưu của quá trình hấp thụ thuốc vào màng

BC bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm toàn phần 52 3.4 Xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng 59 3.5 Kết quả xác định các đặc tính lý hóa của hệ màng BC chứa curcumin 64 3.5.1 Kết quả xác định cấu trúc hệ màng BC chứa curcumin bằng kính hiển

vi điện tử quét (SEM– Scanning Electron Microscope) 643.5.2 Kết quả xác định tương tác của hệ màng BC với curcumin bằng máy

đo phổ FT-IR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) 66 3.5.3 Kết quả đo khả năng cho hấp thụ nước của màng BC sau khi nạp Curcumin 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

sinh khả dụng thương mại hóa 22

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.3 Môi trường lên men tạo màng BC 26

Bảng 2.4 Các mức biến thiên và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình hấp thụ thuốc Cur vào các màng BC khác nhau 34

Bảng 2.6 Mẫu chuẩn bị cho chụp SEM 37

Bảng 2.7 Mẫu chuẩn bị cho chụp FT- IR 38

Bảng 2.7 Thành phần tạo môi trường thạch dinh dưỡng 39

Bảng 3.1 Kết quả thu màng BC tươi (n = 3) 45

Bảng 3.2 Kết quả thu màng BC tươi (n = 3) 46

Bảng 3.4 Bảng nồng độ Cur và giá trị OD427 nm 51

Bảng 3.5 Các mức thí nghiệm 53

Bảng 3.6 Ma trận quy hoạch thực nghiệm với các yếu tố theo tỉ lệ thực và hiệu suất thu được 54

Bảng 3.7 Kết quả hiệu suất hấp thụ ở những điều kiện dự đoán 57

Bảng 3.8 Mật độ quang lượng thuốc Cur trong dung dịch sau khi thực hiện quá trình hấp thụ Cur vào màng BC ở điều kiện tối ưu (n = 3) 59

Bảng 3.9 Kết quả quá trình hấp thụ Cur vào màng BC kích thước 10 x 5cm (độ dày màng 0,5 và 1cm; phương trình tuyến tính y = 0,1566x + 0,0035; R² = 0,9994; n = 3) 61

Bảng 3.10 Kết quả quá trình hấp thụ Cur vào màng BC kích thước 5 x 3cm (độ dày màng 0,5 và 1cm; phương trình tuyến tính y = 0,1566x + 0,0035; R² = 0,9994; n = 3) 62

0,1566x + 0,0035; R² = 0,9994; n = 3) 63

Bảng 3.12 Khả năng hấp thụ nước của hệ màng BC sau khi nạp Cur 66 Bảng 3.13 Tốc độ mất nước của hệ màng BC- Cur 67

vi điện tử quét ( x 10 000 lần) 7

Hình 1.2 Sự chuyển đổi cấu trúc của curcumin trong điều kiện pH khác nhau 17

Hình 3.1 Trang vi khuẩn trên đĩa petri 42

Hình 3.2 Ủ ấm đĩa petri chứa VK 42

Hình 3.3 Khuẩn lạc sau 4 ngày 42

Hình 3.4 Cấy thuần (a) sau đó chuyển sang thạch nghiêng (b) 42

Hình 3.5 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Acetobacter (độ phóng đại 1000 lần) 43

Hình 3.6 a,b Phân giải CaCO3 của các mẫu vi khuẩn A Xylinum 43

Hình 3.7 Hoạt hóa chủng vi khuẩn Acetobacter 44

Hình 3.9 BC tạo từ nước vo gạo, nước dừa già, môi trường chuẩn HS 44

Hình 3.10 Đo kích thước độ dày và đường kính các loại màng 45

Hình 3.12 Màng BC tạo ra từ vi khuẩn A xylinum 47

Hình 3.13 Kết quả tìm sự hiện diện của glucose trong dịch chiết màng BC 49 Hình 3.14 Kết quả tìm sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng BC 49

Hình 3.15 Kết quả đo phổ hấp thụ của Cur trong ethanol 50

Hình 3.16 Phương trình đường chuẩn của Curcumin trong dung môi ethanol 51

Hình 3.17 Lượng hấp thụ Cur vào màng BC kích thước 10 x 5cm 62

Hình 3.18 Lượng hấp thụ Cur vào màng BC kích thước 5 x 3cm 63

Hình 3.19 Lượng hấp thụ Cur vào màng BC kích thước d1,5cm 64

Hình 3.20 Hình ảnh chụp SEM của sợi cellulose của các loại màng BC không nạp và có nạp Cur 65

Hình 3.21 Kết quả đo phổ của màng BC-MTC; BC-Cur-MTC; mẫu trắng Cur 66

Hình 3.24 Kết quả đo phổ của mẫu nạp thuốc và mẫu Cur tinh khiết 68 Hình 3.25 Khả năng cản khuẩn của gạc vô trùng trong thử nghiệm 1 68 Hình 3.26 Khả năng cản khuẩn của hệ màng BC- Cur trong thử nghiệm 2 69

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis of variance (Phân tích phương sai)

A - BC Agitade – Bacterial cellulose

rpm tốc độ quay (vòng/phút )

S – BC Static-Bacterial Cellulose

SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

SEM Scanning Electron Micros (Kính hiển vi điện tử quét)

Tmax Time of maximum plasma drugconcentration

(Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa) UV-Vis Ultraviolet - Visible

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cây nghệ (Curcuma longa Linn.) hay còn gọi là cây Nghệ vàng, trong

đông y gọi là Khương Hoàng, hay Uất Kim

Từ lâu ông cha ta đã biết sử dụng phần thân củ để dùng làm thức ăn cho phụ nữ sau khi sinh con, chữa kinh nguyệt không đều, bế kinh ứ máu, vùng ngực bụng trướng Nghệ dùng làm thuốc kích thích, thuốc bổ, giảm đau, cầm máu và tăng cường chuyển hóa, trị loét dạ dày tá tràng… Ở các nước Đông Nam Á, nghệ được xem như là một loại gia vị, thuốc gia truyền lành tính[13]

Thành phần chính trong củ nghệ là hỗn hợp Curcuminoid bao gồm Curcumin 1, 2, 3, tương đối trơ và không gây độc đối với người kể cả khi sử dụng quá liều Những nghiên cứu gần đây cho thấy Curcumin có nhiều hoạt tính quan trọng như: chất chống ung thư, chống oxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ và kháng viêm, điều trị HIV, Alzheimer (trong một số nghiên cứu của Trường Y khoa Havard) [18]…

Bacterial cellulose (viết tắt là BC) là sản phẩm của một loại vi khuẩn,

đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum Màng sinh học BC có cấu trúc và đặc

tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các gốc glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit), cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc [9] Trên thế giới, màng BC đã được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [10], [19] Trong lĩnh

vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng [16], [10] Điều trị loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người [16] Amin et al [26]

đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bọc cho paracetamol bằng cách

sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết quả cho thấy màng BC có khả năng giữ thuốc

và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC mới được quan tâm gần đây và

đã đạt được kết quả bước đầu Đề tài của Nguyễn Văn Thanh – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2006 [19] đã “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị

bỏng từ Acetobacter xylinum” Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC

được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp Về mặt tính chất, BC có độ tinh sạch lớn hơn nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn [17] Ngoài ra BC còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, khả năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, màng BC còn có

ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài [19],… Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid [9]

Với mục đích thiết kế hệ thống hấp thụ thuốc dựa trên màng BC giúp Curcumin giải phóng một cách kéo dài, từ đó với mong muốn nghiên cứu định hướng tăng tác dụng của thuốc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã lựa chọn

đề tài “Nghiên cứu đặc tính lý hóa và khả năng hấp thụ Curcumin của màng Bacterial cellulose”

2 Mục đích nghiên cứu đề tài

+ Khả năng hấp thụ Curcumin của màng BC và đặc tính lý hóa của màng BC sau khi hấp thụ thuốc Giúp định hướng sử dụng bào chế hệ trị liệu phóng thích dược chất Curcumin kéo dài của màng Bacterial cellulose

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Lên men màng BC

từ 3 môi trường: nước vo gạo, nước dừa già, môi trường chuẩn (Hestrin – Schramm)

3.2 Xử lý màng BC trước khi cho hấp thụ thuốc, xác định lượng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết của màng BC

3.3 Khảo sát tối ưu hóa khả năng hấp thụ curcumin vào màng BC 3.4 Nạp Curcumin trong ethanol 99,50 vào màng BC ở kích thước khác nhau, về độ dày, độ rộng, ở các điều kiện đã tối ưu hóa, từ đó so sánh lượng thuốc hấp thụ trong mỗi trường

3.5 Nghiên cứu, đánh giá đặc tính lý hóa và khả năng hấp thụ của màng BC sau khi được hấp thụ thuốc

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

+ Khả năng hấp thụ Curcumin của màng BC và đặc tính lý hóa của màng BC sau khi hấp thụ thuốc

+ Các thí nghiệm được tiến hành ở quy mô trên phòng thí nghiệm.

5 Ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn

* Ý nghĩa khoa học

Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tiềm năng của màng BC để áp dụng loại màng này vào nhiều lĩnh vực khác nhau trong thực tiễn đời sống Từ kết quả nghiên cứu trên, mở ra những hướng nghiên cứu mới trong việc hấp thụ thuốc

và áp dụng trong sản xuất dược liệu

* Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng BC làm hệ thống hấp thụ thuốc nhằm nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Curcumin, từ đó làm tăng khả năng hấp thu của thuốc Cải thiện những nhược điểm của thuốc

*Đóng góp mới của đề tài

- Đây là đề tài bước đầu sử dụng màng BC làm hệ thống hấp thụ thuốc Curcumin, nhằm nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của màng BC

- Kết quả nghiên cứu có thể được tiếp tục nghiên cứu mở rộng như khả năng giải phóng thuốc trong phòng thí nghiệm invitro và trên cơ thể động vật invivo để định hướng cho sử dụng bào chế hệ trị liệu phóng thích dược chất kéo dài dùng cho đường uống và đường da

6 Phương pháp nghiên cứu

6.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế

tạo hệ mạng lưới BC chứa curcumin từ màng cellulose vi khuẩn

6.2 Phương pháp xử lý màng BC trước khi cho hấp thụ thuốc, xác định lượng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết của màng BC

6.3 Phương pháp đánh giá và tối ưu hóa khả năng hấp thụ curcumin của màng BC

6.4 Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC

6.5 Phương pháp xác định các đặc tính lý hóa của hệ màng BC chứa curcumin

6.6 Sử dụng phương pháp thống kê, phần mềm excel 2013 để xử lý kết quả thu được

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Acetobacter xylinum

1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum (A xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi

Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhung mao

và sản xuất cellulose ngoại bào [18]

Theo khóa phân loại của Bergey, A xylinum thuộc:

Vi khuẩn A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước

ngang khoảng 0,6 – 0,8µm, dài khoảng 2 – 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi

tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi:

tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [9]

* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A xylinum:

Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc

tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucose thành acid, chuyển hóa glycerol thành dihydroaceton

A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc

vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; ở 370

C vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose

là 5,5 [19], [44], [45]

Trong môi trường nuôi cấy lỏng, ở trạng thái tĩnh, vi khuẩn sử dụng chất dinh dưỡng chuyển hoá thành cellulose tạo váng dày trên bề mặt của cơ chất Ở trạng thái động, cellulose tạo thành sẽ có hình elip hoặc dạng sợi nhỏ Khi tạo cellulose, vi khuẩn đồng thời tích lũy khoảng hơn 4 % acid acetic, điều này sẽ làm pH môi trường giảm đi từ 1-2 so với pH môi trường ban đầu

Tuy nhiên, A xylinum có khả năng chịu được pH thấp Ứng dụng ưu điểm

này, khi nuôi cấy người ta thường cho thêm acid acetic để tránh nhiễm các loại vi khuẩn lạ [18]

Hình 1.1 Hình chụp A xylinum trong mạng lưới cellulose

dưới kính hiển vi điện tử quét ( x 10 000 lần)

Nguồn: Yamanaka S Watanabe K (1994) Application of bacterial cellulose

1.2 Tổng quan màng BC tạo bởi A xylinum

- Màng cellulose vi khuẩn được tổng hợp bởi một số chi vi khuẩn phổ

biến như Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes,

Azotobacter, Escherichia, Gluconacetobacter, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina và Zoogloea [17]

- Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer β-1,4-glucopyranose không phân nhánh Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản

của BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [10]

- Theo AJ Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm kết hợp với nhau Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm

- Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy: + Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - BC: Static-Bacterial

Cellulose), A xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên

bề mặt môi trường Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống

đỡ cho quần thể tế bào A xylinum Màng BC thu được dẻo dai, dày, có màu

trắng trong hơi ngả màu vàng [26]

+ Khi nuôi cấy động (A - BC: Agitated-Bacterial Cellulose), một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng huyền phù phân tán trong đó chuỗi β- 1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên BC được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự

do sự dao động của môi trường nuôi cấy

+ Lượng BC được sinh ra giữa hai phương pháp nuôi cấy động và tĩnh cũng khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động nhỏ hơn so với nuôi cấy tĩnh [17], [20]

gần 200 lần), độ tinh khiết cao [16], [17] BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp không có chứa ligin hay hemicellulose Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn [16]

Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhỏ, độ bền đáng kể [52]

Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, có thể hút 600-700 lần trọng lượng của nó

Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình tổng hợp, có khả năng hình thành các sợi biến động, tạo độ bền theo một trục

Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp BC thì

có thể làm thay đổi những thuộc tính của BC Nếu cho thuốc nhuộm vào môi trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lí của cellulose trong quá trình tổng hợp [16], [17]

1.2.2 Sinh tổng hợp BC

Các vị trí tổng hợp cellulose của A xylinum là những lỗ nằm trên bề

mặt tế bào, có đường kính 3,5nm sắp xếp song song trên đường thẳng trục dọc của vi khuẩn Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10nm chứa các enzym có chức năng trong sự polyme hóa để tổng hợp cellulose và các protein hỗ trợ liên quan đến các chức năng khác [23]

A xylinum hấp thụ đường glucose vào trong tế bào, kết hợp với một

acid béo tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết

ra ngoài tế bào cùng với enzym để thực hiện quá trình polyme hóa tạo cellulose Các sợi siêu nhỏ 1,5nm tạo nên các dãy glucan tạo thành các sợi, sau đó kết hợp với nhau thành bó sợi nhỏ Các bó sợi này sẽ được phun vào môi trường nuôi cấy [26]

1.2.3 Ứng dụng của màng BC

Ở Việt Nam, nghiên cứu và ứng dụng màng BC đã được bắt đầu từ những năm 2000 [16], [17] Những nghiên cứu trong nước bước đầu đã thành công trong tuyển chọn chủng có đặc tính quí, sản xuất thử nghiệm màng BC

và thử nghiệm ứng dụng làm bao bì, gạc và mặt nạ Ở vi khuẩn, đoạn gen 16S rRNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu định loại trong thời gian dài, tạo nên cơ sở dữ liệu trình tự phong phú trong ngân hàng gen Các trình tự mồi sử dụng phổ biến được công bố Công nghệ tổng hợp trình tự nucleotide hóa học phát triển mạnh tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện nghiên cứu

ở khắp nơi trên thế giới kể cả ở các nước có trình độ khoa học, thiết bị vừa phải [17]

Trên thế giới đã có rất nhiều những công trình nghiên cứu ứng dụng màng BC trên nhiều các lĩnh vực khác nhau như: lĩnh vực thực phẩm (màng bảo quản trái cây, chất ổn định thực phẩm…) Gần đây người ta sử dụng màng BC làm vật liệu mang thuốc curcumin để nhận biết sự thay đổi pH của sản phẩm thủy sản bằng cách đánh giá cảm quan sự thay đổi màu sắc của Cur [1], [2] Trong lĩnh vực y học người ta ứng dụng màng BC để: tạo ruột giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân tạo trong điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt

nạ dưỡng da [16], [17], [37], [53],…

1.2.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [10], [17], [35]

A xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn

cacbonhydrat Nguồn cacbonhydrat mà A xylinum sử dụng là glucose,

fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol,

acetate Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong

môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A xylinum khác nhau [17]

Nhu cầu sử dụng đường ở A xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng

trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây và pho mát, nước dừa già và nước mía, nước vo gạo, cao nấm men để làm nguyên

liêu nuôi cấy A xylinum [17]

1.2.5 Các phương pháp sản xuất BC từ A xylinum

1.2.5.1 Lên men tĩnh

Môi trường dinh dưỡng để lên men A xylinum được cho vào các khay,

cốc, ống nghiệm lên men có bề mặt thoáng rộng, phù hợp với kích thước màng cần cho thí nghiệm Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng gạc y tế có độ xốp, thanh trùng, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên Sau 7-10 ngày thu được màng BC nổi trên bề mặt nuôi cấy [16], [17]

1.2.5.2 Lên men động

Vi khuẩn A xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy

lắc Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy

đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt

ở 28 - 30ᴼC, 180-200 vòng/phút [16], [17]

1.2.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam

*Tình hình nghiên cứu trong nước:

Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [19] đã tiến hành nuôi cấy, tinh

chế và thu màng cellulose vi khuẩn BC từ A xylinum đạt hiệu quả cao Đồng

thời nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm in vivo ứng dụng màng BC

điều trị bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn Kết quả nghiên cứu cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn

Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự (2013) [16], [17] đã từ 14 mẫu

nguyên liệu phân lập được 65 chủng vi khuẩn, trong đó chủng A xylinum

BHN2 có khả năng tạo màng BC tốt nhất Màng BC do chủng A xylinum BHN2 tổng hợp có sợi cellulose nhỏ, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ thấm hút

nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng

*Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng

BC trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [17], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng

BC và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite

BC được sử dụng trong một vài hệ thống để phân phối thuốc qua đường uống Amin M.C.I.M và cộng sự [26] đã báo cáo việc sử dụng BC làm màng bọc paracetamol bằng cách sử dụng kỹ thuật phun phủ Kết quả cho thấy màng BC giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả

sử dụng của thuốc Gần đây, Huang L và cộng sự [34] nghiên cứu việc sử

dụng màng BC cho việc kiểm soát in vitro của berberine Ngoài nghiên cứu

thử nghiệm thẩm thấu qua da, nghiên cứu sự kiểm soát giải phóng thuốc qua màng BC còn được thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột Các kết quả thu được cho thấy berberine đã được giải phóng với một tốc độ chậm

Một số nghiên cứu tập trung vào việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Nghiên cứu của Wei B và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu được

sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy

là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại hoạt động

của S.aureus và B.Subtilis [52] Nghiên cứu khác cho thấy việc sử dụng

nanocomposite bạc với BC đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [52]

Tiềm năng vận tải và phân phối thuốc của màng BC qua da đã được nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không được chiếu xạ BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hưởng của BC chiếu xạ Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC không chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng thuốc qua màng [39] Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua

da của nhiều thuốc cho kết quả tích cực Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc

bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ

ẩm cho bề mặt da Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm in vitro cho

thẩm thấu qua da [19] và so sánh với cách thức thông thường Kết quả cho thấy ibuprophen là chất ưu mỡ thấm qua màng BC cao hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400; lidocaine hydrochloride thẩm thấu qua màng chậm hơn ibuprophen, do màng BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỷ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc mà không gây tình trạng quá mẫn [16] Luan J và cộng sự (2012) [37], đã nghiên cứu màng BC cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng Nó đã được chứng minh rằng sau khi sử dụng màng BC ngâm tẩm sulfadiazine bạc, hoạt động kháng khuẩn

đối với P aeruginosa, E.coli và S.aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi

thông thường

Nghiên cứu năm 2013, 2014 của Nguyễn Xuân Thành và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng màng BC làm chất mang cho berberin hydrochloride [39]

Gần đây, sử dụng BC để phát triển một cảm biến dựa trên curcumin cho các phát hiện của các amin dễ bay hơi được mô tả [39] Trong nghiên cứu này, curcumin được cố định vào màng BC bằng phương pháp hấp thụ Cảm biến BC-curcumin đã làm việc dựa trên sự tăng pH do amin dễ bay hơi hư hỏng được sản xuất dần trong khoảng trống của gói, và sau đó màu sắc của cảm biến sẽ thay đổi từ màu vàng sang màu da cam, rồi đến đỏ cam cho dấu hiệu hư hỏng, điều này dễ dàng nhìn thấy bằng mắt thường

1.3 Tổng quan về curcumin

1.3.1 Giới thiệu

Trong đời sống, các polyphenol là thành phần của nhiều món ăn như chocolate đen, đậu phộng, trà xanh, rượu vang đỏ, dầu olive, bột nghệ và các gia vị khác Nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa được sử dụng trong y học cổ truyền châu Á

Bột nghệ là một dạng polyphenol và thành phần của củ nghệ được sử dụng trong các món ăn, trong công nghiệp thực phẩm như: chất phụ gia, hương liệu, chất bảo quản, phẩm màu… Trong đó, các curcuminoid là các polyphenol có nhiều hoạt tính sinh học [6]

Bột nghệ gồm 3 curcuminoid chính: curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin Trong đó curcumin chiếm phần lớn so với 2 dẫn xuất còn lại Curcumin là phẩm màu an toàn được đưa vào hệ thống đánh số quốc

tế INS (International Numbering System) cho phụ gia thực phẩm với mã E100 [47]

*Curcumin: chiếm tỷ lệ khoảng 75% [48]

- Tên IUPAC: (1E, 6E)-1,7-bis heptadien-3,5- dion

- Khối lượng phân tử: 338

- pKa = 9,3

*Bisdemethoxycurumin: chiếm tỷ lệ khoảng 8%[28]

- Danh pháp quốc tế: 1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5- dione

- Tên gọi khác: p,p-dihidroxydicinnamoylmethane

- Công thức hóa học: C19H16O4

- Khối lượng phân tử: 308

- pKa = 10,69

Ngoài ra, còn có cyclocurcumin chiếm tỷ lệ khoảng 1%

1.3.2 Tính chất lý - hóa của curcumin

+ Nhiệt độ thường: Curcumin ở dạng bột màu vàng đậm

+ Nhiệt độ nóng chảy: 179 – 1830

C

+ Tính tan: Curcumin tan kém trong nước, Curcumin tan tốt trong dầu, dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, acetylacetone, chloroform, acetic acid, dem- ethyl sulfoxide, benzene, toluene, carbon tetrachloride [32], [36]…

Curcumin có thể hòa tan trong nước bằng cách phối hợp với chất hoạt động bề mặt khác nhau như sodium dodecyl sulfate, cetylpyridinium bromide, gelatine, polysaccharides, polyethyl- ene glycol và cyclodextrins Trong dung dịch, curcumin tồn tại ở dạng hỗ biến enol-keto tùy thuộc vào loại dung môi, dạng enol có thể chiếm đến 90%

Curcumin có cực đại hấp phụ λmax = 420 - 430 nm trong quang phổ

UV – Vis tùy theo loại dung môi Trong dung dịch, curcumin có màu vàng ở

pH acid và màu đỏ ở pH kiềm [21]

Sự hình thành 2 dạng hỗ biến của curcumin phụ thuộc vào pH Trong môi trường acid, trung hòa và ở dạng rắn, dạng bis-keto tồn tại chủ yếu, ở

dạng này curcumin là chất cho proton rất mạnh, còn dạng enol tồn tại chủ yếu trong môi trường kiềm và phần phenolic đóng vai trò chính là nhóm tử Trong môi trường sinh lý, dạng bis-keto và dạng enol của curcumin tồn tại cân bằng với nhau [47]

Curcumin kém bền với ánh sáng, kém bền trong môi trường kiềm và bị phân hủy nhanh chóng trong vòng chưa đầy 30 phút Trong môi trường acid, tốc độ phân hủy của curcumin giảm dưới 20% curcumin bị phân hủy trong vòng 1 giờ Vì vậy, curcumin có tính ổn định trong ống tiêu hóa cũng như những môi trường có pH = 1-6 Trong dung dịch, curcumin bị phân hủy thành

trans-6-(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)-2,4- dioxo-5-hexanal, anillin, feruloylmethane và ferulic acid [47]

curcumin demethoxycurcumin

bisdemethoxycurcumin cyclocurcumi

Hình 1.2 Sự chuyển đổi cấu trúc của curcumin

trong điều kiện pH khác nhau

1.3.3 Hoạt tính sinh học của curcumin

1.3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của curcumin và ba dẫn xuất đã được nghiên cứu bởi Sharma (năm 1976), Ruby và cộng sự (năm 1995), Sugiyama và cộng

sự (năm 1996) [48], [49] Các nhà khoa học này đã chứng minh việc sử dụng curcumin giúp bảo vệ hemoglobin khỏi quá trình oxy hóa ở nồng độ rất thấp 0,08 mM Hoạt tính chống oxy hóa của curcumin còn được thể hiện gián tiếp thông qua ức chế các enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase, catalase và glutathione peroxidase Năm 1999, Khopde và cộng sự đã phát hiện rằng curcumin có hoạt tính chống oxyhóa mạnh hơn vitamin E khoảng10 lần Trong phân tử curcumin, nhóm hydroxy và methoxy trên vòng phenyl và

hệ thống 1,3- diketone là những đặc tính quan trọng tạo nên khả năng chống oxy hóa của curcumin [21], [28]

1.3.3.2 Hoạt tính kháng viêm

Không như các thuốc kháng viêm steroid và không steroid, curcumin là hoạt chất có nguồn gốc từ nhiên tiềm năng với hoạt tính kháng viêm mạnh mà không gây nhiều tác dụng phụ [21]

Curcumin là chất chống oxy hóa mạnh, hoạt tính chống oxy hóa cũng góp phần vào hoạt tính kháng viêm

Tất cả các tác dụng này làm giảm sự hình thành của những hợp chất gây viêm và ngăn chặn đáp ứng viêm Kết quả này mang lại lợi ích cho tình trạng bệnh tự miễn [21]

1.3.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Dịch chiết curcumin có khả năng diệt các loại vi khuẩn như Lactocillus,

Staphylococcus và ngăn chặn sự phát triển của Helicobacter pylori [28]

Curcumin và các chất có nguồn gốc từ củ nghệ Curcuma longa L có

khả năng kháng lại một số loại nấm gây bệnh Tác dụng diệt nấm của

curcumin có thể so sánh với tác nhân diệt nấm chlorothalonil [28].

1.3.3.4 Hoạt tính kháng ung thư

Curcumin là tác nhân kháng ung thư mạnh, có khả năng ngăn chặn các loại ung thư da, tuyến vú, miệng phổi, gan, thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già,…Cur có khả năng giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ và làm tăng hồng cầu, loại bỏ cholesterol xấu, điều hòa huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn chặn béo phì, làm cho da dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp, sức lực và cả tuổi thọ [24]…

Cur là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế hủy diệt từng bước các tế bào ác tính Cur được coi là chất tiêu biểu nhất cho thế

hệ mới các chất chống ung thư vừa rất hiệu lực vừa an toàn, không gây tác dụng phụ [24] Curcumin ức chế sự sinh sản của tế bào ung thư, ngăn chặn các gene gây ung thư, ức chế các protein liên quan đến chu trình tế bào, ức chế sự hình thành khối u, ức chế sự chuyển hóa sinh học của các chất gây ung thư Cảm ứng hoạt tính của enzyme glutathion S-transferase (GST)

1.3.3.5 Hoạt tính kháng virus của Curcumin

Curcumin là chất ức chế hiệu quả quá trình sao chép protein BZLF1

yếu tố hoạt hóa chính của Epstein-Barr virus (EBV) trong các tế bào Raij LUC Những chất cảm ứng EBV như 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, sodium butyrate và β-TGF làm gia tăng nồng độ của BZLF1 m-RNA ở thời

DR-điểm 12-48 giờ sau khi điều trị, quá trình này được ngăn chặn hiệu quả bởi curcumin [24]

Curcumin cũng có hoạt tính kháng HIV bằng cách ức chế HIV-1 intergase, chất cần thiết cho quá trình nhân bản của virus Curcumin cũng ức chế sự biểu hiện của gene HIV nhạy cảm ánh sáng UV Vì vậy, curcumin và những chất có cấu trúc tương tự có nhiều tiềm năng để phát triển thành thuốc mới chống lại HIV [48]

Cur giúp cơ thể chống lại các vi khuẩn sống kí sinh trong ruột, đặc biệt tốt cho hệ tiêu hóa Các nghiên cứu cho thấy, nghệ có thể kích thích tiêu hóa

và giải phóng các enzim tiêu hóa, phá vỡ liên kết cacbonhydrat và các chất béo Chất Cur có tự nhiên trong củ nghệ được các nhà khoa học chứng minh

có khả năng dễ dàng thẩm thấu và tiếp cận tới từng tế bào viêm do có khả năng [6]

1.3.3.6 Curcumin giúp tăng cường chữa lành vết thương

Quá trình làm lành vết thương và sửa chữa mô là quá trình phức tạp Curcumin có tác dụng chữa lành vết thương, giúp mau liền sẹo một cách hiệu quả Vì vậy, các loại mỹ phẩm có thành phần curcumin hay chiết xuất từ củ nghệ vàng có tác dụng trị mụn, giúp mau liền sẹo được bán rộng rãi trên thị trường [7]

Mặc dù, các nghiên cứu thử nghiệm cho thấy khả năng trị liệu tuyệt vời

đó của Cur, tuy nhiên thách thức lớn nhất là Cur ít tan trong nước Khi dùng theo đường uống, Cur hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống tiêu hóa, chỉ 7 - 10% Cur được hấp thu vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của Cur chỉ đạt 2 - 3%, nên Cur chưa được ứng dụng nhiều trong phòng và trị bệnh [6]

1.3.3.7 Sinh khả dụng

Vấn đề khó khăn đối với việc sử dụng curcumin trên lâm sàng là sinh khả dụng (SKD) thấp Nghiên cứu dược động học của curcumin được báo cáo bởi Yang K và cộng sự cho thấy: nồng độ tối đa curcumin trong huyết tương chuột cống sau khi uống liều 500 mg/kg là 0,06 ± 0,01µg/ml, chứng tỏ SKD đường uống chỉ khoảng 1% [49] Tương tự, theo nghiên cứu của Shoba G và cộng sự, nồng độ curcumin cao nhất trong huyết tương là 1,35 ± 0,23 µg/ml sau 1 giờ dùng đường uống với liều 2 g/kg trên chuột cống, trong khi người tình nguyện khỏe mạnh (khối lượng 50-75 kg) uống liều đơn 2 g curcumin (4 viên nang 500 mg), nồng độ trong huyết tương rất thấp, chỉ khoảng 0,006 ± 0,005 µg/ml trong 1 giờ [24] Trong nghiên cứu đánh giá SKD trên chuột

cống của Allam A N và cộng sự, với liều 340 mg/kg trên chuột cống, lượng curcumin không hấp thu trong nhung mao ruột và lượng tìm thấy trong tế bào nhày khá lớn, trong khi lượng curcumin trong huyết tương không thể tìm thấy Điều này còn chứng tỏ curcumin có tính thấm kém qua hệ thống dạ dày-ruột [22]

Sau hấp thu, curcumin bị chuyển hóa qua gan (chuyển hóa lần đầu) Sự chuyển hóa curcumin thông qua liên hợp glucuronid, sulfat và quá trình khử thông qua alcol dehydrogenase, tạo ra nhiều chất chuyển hóa như dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, hexahydrocurcuminol, acid ferulic, acid dihydroferulic, curcumin glucuronid và curcumin sulfat [20] Sau đó, curcumin bị thải trừ nhanh ở dạng liên hợp với glucuronid và sulfat Khoảng 60-70% curcumin dùng đường uống được thải trừ qua phân, [24]

Nhiều công trình nghiên cứu về dược động học của curcumin cho thấy:

độ tan thấp, chuyển hóa mạnh và thải trừ nhanh là các lý do chính dẫn đến SKD của curcumin thấp Do đó, các biện pháp cải thiện SKD của curcumin chủ yếu tập trung các biện pháp làm tăng độ tan, mức độ hòa tan và giảm chuyển hóa hoặc sử dụng chất ức chế quá trình chuyển hóa của curcumin và giảm thải trừ, kéo dài thời gian lưu thông trong đường tiêu hóa của curcumin

Để đạt được mục tiêu này, các nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã đề cập đến các biện pháp cải thiện SKD của curcumin Để cải thiện độ tan và tốc

độ hòa tan của curcumin, các công trình nghiên cứu đã đề cập đến các biện pháp làm thay đổi đặc tính vật lý của DC như giảm KTTP xuống kích cỡ nanomet (bào chế hệ nano tinh thể) và tạo dạng bào chế trung gian chứa curcumin như hệ phân tán rắn, hệ micel, vi nhũ tương, nhũ tương nano, hệ tự nhũ hóa hoặc dạng liên hợp…

1.3.4 Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng sinh khả dụng thương mại hóa

Hiện nay, các chế phẩm chứa curcumin đã được thương mại hóa có thể

là dạng tiểu phân nano polyme, tiểu phân nano lipid rắn, liposome hoặc micel… Một số chế phẩm được đưa ra thị trường ngoài nước và tại Việt Nam được trình bày ở bảng 1.4

Bảng 1.1 Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng

sinh khả dụng thương mại hóa STT Tên chế phẩm nano Công ty Đặc tính

1 NanoLiposomal

Curcumin

NanoLiposomal tritionals., USA

Nu-Tiểu phân nano curcumin

vi nang trong liposome phospholipid lecithin

2 N-Curcusorb Konark Herbals &

Health Care, India

Nhũ tương nano chứa curcumin

3 NanocurcTM SignPath Pharma,

Orthomo-Canada

Tiểu phân nano lipid rắn

6 Longvida® Verdure Sciences,

USA

Tiểu phân nano lipid rắn

8 Curmin Lead Nafaco, Việt Nam

Micel curcumin

9 Cumar Gold Việt Nam

10 Nano Curma Việt Nam

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn là Acetobacter xylinum (A xylinum) thuần chủng được

nuôi cấy tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

*Hóa chất sử dụng tạo môi trường nuôi cấy:

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

4 Disodium phosphate Trung Quốc

8 Natri hidroxit Việt Nam

9 Nước cất 2 lần Viện NCKH&UD TrườngĐHSP Hà Nội 2

10 Ethanol 960, 900, 700 Nhà máy hóa chất Đức Giang

11 Methanol Nhà máy hóa chất Đức Giang

12 MgSO4.7H2O Trung Quốc

13 KalidiHidrophotphat Trung Quốc

*Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu:

- Bột Curcumin thương phẩm Ấn Độ, độ tinh khiết 95%

- Hóa chất đặc biệt: cao nấm men

- Dung môi là Ethanol 99,50 từ nhà máy hóa chất Đức Giang, nước cất

2 lần và vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng có nguồn gốc

từ Trung Quốc và Việt Nam, được cung cấp từ Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Màng BC (99% hàm lượng nước) được tạo bằng cách sử dụng Vi

khuẩn A xylinum lên men trong môi trường dinh dưỡng

Nhật Bản Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam Máy đo phổ FTIR IRA

Vis 2450

Shimadru - Nhật Bản Viện NCKH&UD Trường

ĐHSP Hà Nội 2 Cân phân tích Sartorius- Thụy Sỹ Viện NCKH&UD Trường

ĐHSP Hà Nội 2 Buồng cấy vô trùng Haraeus Viện NCKH&UD Trường

ĐHSP Hà Nội 2

Tủ sấy, tủ ấm Binder - Đức Viện NCKH&UD Trường

ĐHSP Hà Nội 2

Khuấy từ gia nhiệt IKA- Đức Viện NCKH&UD Trường

ĐHSP Hà Nội 2

Máy lắc tròn tốc độ chậm Orbital

Shakergallenkump - Anh

Viện NCKH&UD Trường

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter, chế tạo hệ mạng lưới BC chứa curcumin từ màng cellulose vi khuẩn

2.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter

Quy trình phân lập gồm 5 bước [16]

Bước 1: chọn dịch huyền phù chứa vi khuẩn, lắc đều bằng máy Vontex

trong 10 phút, thu được huyền phù vi sinh vật

Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau từ 10-3

đến 10-8Dùng pipet hút 50µl mẫu ở các độ pha loãng từ 10-3

đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều Sau

đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp từ 2 đến 3 ngày

Bước 2: Phân lập, thu các chủng vi khuẩn

Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ ấm 40

Bước 5: Xác định khả năng hình thành màng xenlulose

2.2.1.2 Chế tạo hệ mạng lưới BC chứa curcumin từ màng cellulose vi khuẩn

- Lên men thu màng BC từ một số môi trường:

Bước 1: Chuẩn bị môi trường

Bảng 2.3 Môi trường lên men tạo màng BC

bằng HCl hoặc NaOH pH tốt nhất cho sự phát triển của A xylinum là 6 để

tránh sự phát triển của nấm mốc và vi khuẩn khác [19]

Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường ở 1130

C trong 15 phút

Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi

để nguội môi trường

Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho

giống phân bố đều trong dung dịch

Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên

cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày

ở 280

C

Bước 6: Thu màng BC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước

2.2.2 Xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc, xác định pH, lượng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết của màng BC

2.2.2.1 Xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc

Mục đích: loại bỏ được các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng

thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn

Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, BC tạo thành màng dày ở mặt

môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường

+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ

+ Sau khi ngâm NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng BC cần đạt là trung tính, ta thu được BC tinh khiết [39]

2.2.2.2 Xác định pH của màng BC tinh chế

Sau khi tinh chế pH của màng phải nằm trong khoảng pH trung tính

Đo pH dịch chiết màng bằng máy đo pH Cân và cho màng BC vào 1 bình

nón chứa nước khử khoáng theo tỉ lệ màng và nước là 1:100 (khối lượng/thể tích) Đặt bình vào máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ Lấy dịch chiết và đo

2.2.2.4 Đánh giá độ tinh khiết của màng BC

Mục đích: Nhằm đảm bảo màng BC sau khi xử lý đã loại được các tạp

chất có thể gây độc hại Chất được khảo sát là đường glucose và protein của

vi khuẩn

* Tìm sự hiện diện của glucozo trong màng BC tinh chế

Nguyên tắc: + Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện

diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ [17], [41]

Tiến hành:

+ Dịch thử của màng BC các loại sau khi đã xử lý hóa học

+ Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose

+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc

thử Fehling rồi ngâm trong cốc nước nóng

+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm

*Tìm sự hiện diện của protein trong màng BC tinh chế

Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo

kết tủa của protein với acid triclor acetic

Tiến hành: Màng BC tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất,

lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng Mẫu chứng

âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn) Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục So sánh

với mẫu chứng âm không chứa protein [7], [17], [41]

Màng BC tinh chế dùng để tạo màng nạp thuốc curcumin phải đạt được những tính chất sau:

+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt

+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô [29]

2.2.3 Xây dựng đường chuẩn Curcumin Xác định các thông số tối ưu của quá trình hấp thụ thuốc Cur vào màng BC

2.2.3.1 Xây dựng đường chuẩn Curcumin

Phương pháp: Dùng máy quét quang phổ UV-Vis

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phương

pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử Chúng tôi sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm [38] Chúng tôi sử dụng hai cóng đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±0,005cm Các cóng đo được làm sạch và thao tác thận trọng [5]

* Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10,0mg Curcumin chuẩn hòa tan

trong 10ml ethanol 960, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung môi ethanol 99,50 pha loãng tới vạch, lắc kỹ được dung dịch A (nồng độ 10g/ml) Hút chính xác 2ml dung dịch A cho sang bình định mức 50ml, thêm dung môi