Lời cảm ơn 3 Lời mở đầu 4 PHẦN 1. TỔNG QUAN 5 1.1. Mô tả về loài thực vật 5 1.2. Sự phân bố và thu hái 5 1.3. Sơ lược về thành phần hóa học 6 1.4. Tác dụng dược lý 7 1.4.1. Bệnh Alzheimer 7 1.4.2. Dấu hiệu cảnh báo của bệnh Alzheimer 8 1.4.3. Điều trị Alzheimer từ thực vật 10 PHẦN 2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 11 2.1. Phương pháp 1 11 2.1.1. Sơ đồ khối 11 2.1.2. Thuyết minh 12 2.1.3. Thành phần 13 2.2. Phương pháp 2 14 2.2.1. Sơ đồ khối 14 2.2.2. Thuyết minh 15 2.2.3. Thành phần 15 2.3. Phương pháp 3 16 2.3.1. Sơ đồ khối 16 2.3.2. Thuyết minh 17 2.3.3. Thành phần 18 PHẦN 3. HOẠT TÍNH SINH HỌC 19 3.1. Hoạt tính ức chế ACh và AChE 19 3.1.1. Thí nghiệm ức chế sự hoạt động cholinesterase trong ống nghiệm 19 3.1.2. Vai trò của ACh và AChE 19 3.1.2.1. Vai trò của ACh trong bệnh Alzheimer 19 3.1.2.2. Vai trò của AChE trong bệnh Alzheimer 21 3.2. Một số chất có hoạt tính được phân lập từ Huperzia squarrosa 21 3.2.1. Huperzine A 21 3.2.2. Huperzine B 23 Kết luận 25 Tài liệu tham khảo 26
Trang 1Mục lục
Trang 2Lời cảm ơn
Lời đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Trường Đại học Báchkhoa Hà Nội đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em trong quá trình học tập,nghiên cứu để có thể hoàn thành đồ án của mình
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS LêThị Thùy, cảm ơn cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho chúng em nhiều kiến thức vàkinh nghiệm khoa học vô cùng quý báu Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trên từngbước đường trong suốt thời gian học tập và hoàn thành đồ án chuyên ngành tại bộ mônCông nghệ Hoá dược & Bảo vệ thực vật - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội
Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn các bạn trong lớp Hoá dược – K59, trườngĐại học Bách khoa Hà Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ trong quá trình học tập và thựchiện đồ án
Hà Nội, tháng 5 năm 2018Nhóm sinh viên
Trang 3Lời mở đầu
Ngành công nghiệp hoá dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên và các hợp chất
có hoạt tính sinh học là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được nhiềunhà khoa học quan tâm Trong đó, các loài cây thuốc là một nguồn tại nguyên hết sứcquý báu mà thiên nhiên đã mang tặng cho con người, chúng ta cần biết trân trọng và sửdụng hợp lý nguồn tài nguyên vô giá này Do vậy, sự hiểu biết cũng như việc nghiêncứu thành phần hoá học của những cây cỏ làm thuốc là hết sức cần thiết Việc xác địnhthành phần hoá học, tác dụng dược lý của cây thuốc có một ý nghĩa hết sức quan trọng,góp phần phát triển và cung cấp những hợp chất có giá trị cho công nghiệp hoá dược,thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm…, có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày,
và là vấn đề quan tâm của toàn xã hội
Cây Thạch tùng thân gập (tên khoa học là Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis, hay
còn có tên gọi khác là cây Thông đất) chứa hoạt chất Huperzine A và Huperzine B cótác dụng điều trị bệnh Alzheimer rất hiệu quả Chúng là các alcaloids ức chếAcetylcholinesterase (AChE) mạnh, thuận nghịch, có chọn lọc và được hứa hẹn sẽ làmột loại thuốc đầy tiềm năng cho việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer Hiện nay, cây Thạch tùng thân gập đang rất được quan tâm, nghiên cứu, khai thác
và ứng dụng trong điều trị các bệnh về rối loạn trí nhớ, tổn thương não nhất là bệnhAlzheimer Vì thế, đề tài “Tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
cây Thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa)” sẽ góp phần đánh giá, bổ sung về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của Huperzia squarrosa
Đồ án cung cấp những thông tin khoa học về quy trình chiết tách, xác định thành
phần hoá học được phân lập từ Huperzia squarrosa qua một số công bố khoa học trên
thế giới và ở Việt Nam Bên cạnh đó, tìm hiểu về hoạt tính sinh học của một số chất cóhoạt tính được phân lập từ cây, đặc biệt là khả năng ức chế AChE của chúng, nhằmđiều trị bệnh Alzheimer một cách hiệu quả
Nội dung của đồ án gồm 3 chương:
Chương 1: Tổng quan
Trang 4Chương 2: Thành phần hoá họcChương 3: Hoạt tính sinh học
PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.1. Mô tả về loài thực vật [1], [2], [7], [9]
Tên khoa học: Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis.
Tên đồng nghĩa: Lycopodium squarrosum (Forst.) Trevis
Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis thuộc Họ Thông đất (Lycopodiaceae), lớp Lycopodiopsida (bộ Lycopodiales); là loài thực vật chi Huperzia Bernh.
Tên Việt Nam: Râu rồng, Thạch tùng vảy, Thông đất nhám
Mô tả về loài thực vật: Cây thảo phụ sinh, thân thòng thường mập, hình trụ, mọcđứng ở phần gốc, sau gập thõng xuống dài 30-70 cm, dài 50-60 cm, 1-2 lần lưỡngphân, to 4-5 mm Lá hẹp, nhọn, xếp xoắn ốc hình dải - ngọn giáo, tỏa rộng ra, khôngcuống, mép nguyên, lá ở đỉnh thì ngắn hơn lá ở gốc Chùy dài ở dưới chót nhánh Bào
tử diệp không khác lá thường, chỉ hơi nhỏ hơn; bào tử nang hình thận, nở thành 2mảnh không bằng nhau Bộ phận sinh sản ở ngọn thân thành bông không phân nhánh,dài khoảng 10 cm, lá bào tử giống lá thật, nhưng ngắn hơn 2 lần, thẳng, nhọn, hơiphình ở gốc Túi bào tử hình thận, có 2 mảnh vỏ bằng nhau
Công dụng: Râu rồng có vị hơi đắng, tính bình; có tác dụng khư phong, trừ thấp,chỉ huyết Dân gian dùng toàn cây trị ngoại thương xuất huyết Có thể dùng trị đòn ngãtổn thương Ở Vân Nam (Trung Quốc) nhân dân địa phương dùng toàn cây trị đau dâythần kinh hông và đau lưng do phong thấp Ở Nepal, toàn cây râu rồng được dùng giãđắp trị đau lưng
1.2. Sự phân bố và thu hái [1], [9]
Sinh thái: Thường mọc ở thân cây, đá ẩm, vùng núi Râu rồng là cây ưa ẩm, ưabóng, thích nghi với điều kiện khí hậu mát và ẩm vùng núi Cây thường bám trên vách
Trang 5đá, hoặc trên thân, cành những cây gỗ lớn trong rừng kín thường xanh ẩm còn nguyênsinh hay tương đối nguyên sinh
Cây sinh sản bằng bào tử diễn ra trong môi trường nước (chủ yếu là nước mưa).Cây cũng có khả năng mọc chồi nhanh sau khi bị cắt hoặc bị gãy Hiện nay, tình trạngtrồng làm cảnh khác môi trường sống tự nhiên của nó và kích thước quẩn thể cây nhỏnên râu rồng có thể xếp vào nhóm cây đang bị đe dọa
Phân bố khá hẹp, ở một số vùng núi thấp, có khi cả núi trung bình của Cao Bằng(Trà Lĩnh), Thanh Hóa, Lâm Đồng (núi Lang Bian) và Khánh Hòa (hòn Vọng Phu).Còn gặp ở Lào, Campuchia cũng như nhiều nước thuộc xứ 6 hệ thực vật cổ nhiệt đới.Trên thế giới còn có ở Trung Quốc, Lào, từ Mađagátxca đến châu Đại Dương, ĐàiLoan và Himalaya
1.3. Sơ lược về thành phần hóa học [3], [10], [14]
Các alkaloid phân lập được từ Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis:
Lycosquarosine A (1), Acetylaposerratinine (2), Huperzine A (3), Huperzine B (4), hydrophlemariurine B (5), Huperzinine (6), Lycoflexine N-oxide (7), Phlegmariurine B (8), Lycoposerramine U N-oxide (9), 12-epilycodine N-oxide (10) và Pyrrolhuperzine
8α-A (11).
Bảng 1 Cấu trúc của các alkaloid trong Huperzia squarrosa
Trang 61.4. Tác dụng dược lý
1.4.1. Bệnh Alzheimer [3], [11], [12], [17]
Bệnh Alzheimer (AD) là một loại chứng mất trí gây ra vấn đề về trí nhớ, suy nghĩ
và hành vi Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh và là nguyên nhân phổbiến và chủ yếu gây ra chứng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi, kích thích suy giảm nhậnthức tiến triển, rối loạn tâm thần, mất trí nhớ, sự hiện diện của tuổi già, rối loạn dâythần kinh và giảm sự truyền cholinergic
Trang 7Triệu chứng thường phát triển chậm và trở nên trầm trọng hơn theo thời gian, trởnên nghiêm trọng đủ để can thiệp vào công việc hàng ngày.
Thần kinh học đã chứng minh rằng chức năng cholinergic làm suy giảm não trước
và vỏ não ở bệnh mất trí nhớ do tuổi già của chứng Alzheimer
Các vấn đề cơ bản của bệnh Alzheimer:
Bệnh Alzheimer là dạng bệnh mất trí nhớ phổ biến nhất, một thuật ngữ chung vềmất trí nhớ và các khả năng nhận thức khác nghiêm trọng ảnh hưởng đến cuộc sốnghàng ngày Bệnh Alzheimer chiếm từ 60 đến 80% trường hợp sa sút trí tuệ BệnhAlzheimer không phải là một phần bình thường của sự lão hóa.Yếu tố rủi ro được biếtđến nhiều nhất là tuổi càng ngày càng tăng, phần lớn những người mắc bệnhAlzheimer đều từ 65 tuổi trở lên Nhưng bệnh Alzheimer không chỉ là bệnh ở tuổi già.Khoảng 200.000 người Mỹ dưới 65 tuổi mắc chứng bệnh Alzheimer sớm (còn gọi làbệnh Alzheimer sớm khởi phát)
Bệnh Alzheimer hiện tại không có phương pháp điều trị, nhưng vẫn có các phươngpháp trị liệu cho các triệu chứng và vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu Mặc dù cácphương pháp điều trị hiện tại của Alzheimer không thể ngăn chặn bệnh Alzheimer tiếntriển, nhưng họ có thể tạm thời làm chậm lại các triệu chứng của chứng mất trí và cảithiện chất lượng cuộc sống cho những người có bệnh Alzheimer và những người chămsóc bệnh Alzheimer Ngày nay, trên toàn thế giới, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lựcnhằm tìm ra những phương pháp tốt hơn để điều trị bệnh Alzheimer, trì hoãn thời giankhởi phát và ngăn không cho nó phát triển
Các yếu tố nguy cơ của bệnh Alzheimer sớm:
Bệnh Alzheimer tiến triển theo thời gian, nơi các triệu chứng mất trí trở nên trầmtrọng hơn qua các năm Trong giai đoạn đầu, mất trí nhớ là nhẹ, nhưng với bệnhAlzheimer giai đoạn muộn có thể mất khả năng giao tiếp Bệnh Alzheimer là nguyênnhân thứ sáu gây tử vong ở Hoa Kỳ Những người bị bệnh Alzheimer sống trung bìnhtám năm sau khi các triệu chứng của họ trở nên đáng chú ý với người khác, nhưngsống sót có thể từ 4 đến 20 năm, tùy theo tuổi tác và các điều kiện sức khoẻ khác
1.4.2. Dấu hiệu cảnh báo của bệnh Alzheimer [18]
• Mất trí nhớ làm ảnh hường tới cuộc sống hằng ngày:
Trang 8Một trong những dấu hiệu phổ biến nhất của bệnh Alzheimer là mất trí nhớ, đặc biệt làquên những thông tin đã đọc gần đây Có thể bao gồm quên ngày hoặc sự kiện quantrọng; hỏi lại nhiều lần một vấn đề; ngày càng cần phải dựa vào các bộ phận trợ giúp
bộ nhớ (ví dụ như ghi chú nhắc nhở hoặc thiết bị điện tử) hoặc các thành viên trong giađình về những thứ họ tự xử lý
• Gặp khó khăn trong việc lên kế hoạch và giải quyết vấn đề:
Một số người có thể gặp những thay đổi trong khả năng của họ để lập kế hoạch và làmtheo kế hoạch hay làm việc với những con số Họ có thể quên một công thức quenthuộc hoặc theo dõi các hóa đơn hàng tháng Họ có thể gặp khó khăn trong việc tậptrung và mất nhiều thời gian hơn để làm việc giống trước đây đã làm
• Khó hoàn thành công việc hàng ngày:
Những người bị Alzheimer thường cảm thấy khó hoàn thành công việc hàng ngày Đôikhi, mọi người có thể gặp sự cố khi lái xe tới một vị trí quen thuộc, quản lý tiền bạchoặc ghi nhớ các quy tắc của trò chơi yêu thích
• Quên thời gian và địa điểm:
Những người bị bệnh Alzheimer có thể quên ngày, mùa và thời gian Họ có thể gặpkhó khăn để hiểu một điều gì đó nếu nó không xảy ra ngay lập tức Đôi khi họ có thểquên vị trí của họ và cách họ đến đó
• Gặp khó khăn để hiểu hình ảnh trực quan và không gian:
Đối với một số người, có vấn đề về thị lực là dấu hiệu của bệnh Alzheimer Họ có thểgặp khó khăn khi đọc, đánh giá khoảng cách và xác định màu sắc hoặc độ tương phản,điều này có thể gây ra vấn đề khi lái xe
• Gặp khó khăn trong nói và viết:
Những người có bệnh Alzheimer có thể gặp rắc rối khi theo dõi và tham gia cuộc tròchuyện Họ có thể dừng lại ở giữa một cuộc trò chuyện và không biết làm thế nào đểtiếp tục hay gặp khó khăn với từ vựng trong giao tiếp
• Để sai vị trí và quên đường đi:
Trang 9Một người có bệnh Alzheimer có thể để đồ đạc trong phòng nhầm chỗ Họ có thể bịmất đồ và quên đường.
1.4.3. Điều trị Alzheimer từ thực vật [3], [4], [8]
Theo đó, sự tăng cường truyền dẫn thần kinh cholinergic đã được coi là một trongnhững cách tiếp cận điều trị tiềm năng chống AD Mặc dù sinh bệnh học của AD phứctạp và liên quan đến nhiều con đường, hai giả thuyết lớn hiện đang được xem xét về cơchế phân tử là: giả thuyết cholinergic và giả thuyết cascade amyloid Do đó, trọng tâm
ở đây là các chất ức chế cholinesterase chọn lọc (ChE) để giảm bớt sự thiếu hụtcholinergic và cải thiện sự truyền dẫn thần kinh Theo đó, cả hai đều có thể được thiếtlập thành các mục tiêu điều trị hữu hiệu đối với AD
Một chiến lược điều trị để tăng cường chức năng cholinergic là sử dụng chất ức chếacetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) để tăng lượng acetylcholine, có trong cáckhớp thần kinh giữa nơ-ron thần kinh cholinergic Các chất ức chế AChE nhưdonepezil, rivastigmine và galantamine, được nghiên cứu rộng rãi nhất Các chất ứcchế AChE, đã được chứng minh là cải thiện đáng kể chức năng nhận thức trong AD.Các loài rêu (Lycopodiaceae) được biết đến là một nguồnalkaloid Lycopodiumphong phú có hệ dị vòng phức tạp và các đặc tính sinh học khác nhau Huperzine A,một loại alkaloid với bộ khung C16N2 được phân lập từ loài Huperzia serrata của
Trung Quốc đã được chứng minh là chúng có hiệu quả cao, đặc hiệu, và là chất ức chếthuận nghịch của AChE Cho đến nay, hơn 300 alkaloids Lycopodium đã được công
bố Hầu hết các alkaloids Lycopodium có hoạt tính ức chế AChE như huperzine A,huperzine B, và N-methylhuperzine B thuộc nhóm Lycodine Người ta đang nỗ lựckhông ngừng để tìm kiếm các alkaloid Lycopodium cấu trúc và hoạt tính sinh học thú
vị, đặc biệt là trong Lycopodium spp từ Việt nam, một alkaloid kiểu C16N1 mới,lycosquarosine A đã được phân lập cùng với năm alkaloid Lycopodium đã biết đến từ
loài Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis Trước đây, Lycopodium squarrosum (H squarrosa) có nguồn gốc từ Thái Lan, được nghiên cứu về mặt hóa thực vật và có một
số alkaloid fawcettimine đã được mô tả
Trang 10PHẦN 2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC
2.1. Phương pháp 1 [14]
2.1.1. Sơ đồ khối
Trang 11Phân đoạn F3.1Phân đoạn F3.2Phân đoạn F3.3Phân đoạn F3.4Sephadex LH-20 (103,17g);
MeOH:CH2Cl2 (1:1) (400ml)
Trang 1212-epilycodine N-oxide (10)
2.1.2. Thuyết minh
Toàn bộ cây tươi (rhizome-stem-sporangia) của H.squarrosa (1,25kg) được ngâm
trong MeOH (12Lx3) ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày, thu được dịch chiết MeOHvà cho
bay hơi đến khô Cặn chiết thô (107.67g) được hoà tan với axit tar-taric 3% (800mL)
Trang 13Dịch nước được chiết với EtOAc (400mLx3), kiềm hóa với NaHCO3 (pH=10), và sau
đó được chiết với CH2Cl2 (500mLx5)
Pha hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4 khan và cho bay hơi thu được phân đoạnalkaloid(1,86g) Phân đoạn này được tiến hành sắc ký cột trên Sephadex LH-20 (980g)
sử dụng hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 (1:1, v/v) (500ml) thu được các phân đoạn F1 đếnF4 Phân đoạn F3 (1,33g) được tiến hành sắc ký cột lần 2 trên Sephadex LH-20(103,17g) sử dụng hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 (1:1, v/v) (400ml) thu được 4 phânđoạn F3.1 đến F3.4
Phân đoạn 3.3 được tiếp tục tinh chế bằng HPLC (cột Cosmosil 5C18-Ms-II) với
hệ dung môi MeOH : H2O (1:1, v/v) thu được 16 phân đoạn (F3.3A-P)
• Lycoflexine N-oxide (7) (6.5mg) thu được từ phân đoạn F3.3G.
• Phlegmariurine B (8) (4.0mg) thu được từ phân đoạn F3.3K
Phân đoạn 3.4 được tinh chế bằng HPLC (cột Cosmosil 5C18-Ms-II) sử dụng hệdung môi MeOH : H2O (3:2, v/v) thu được 20 phân đoạn (F3.4.A-Z)
• Lycoposerramine U N-oxide (9) (4,3 mg) thu được từ phân đoạn F3.4E.
• 12-epilycodine N-oxide (10) (8,4mg) thu được từ phân đoạn F3.4F.
• Lycoflexine N-oxide (7) (4.4mg) thu được từ phân đoạn F3.4I.
• Và HuperzineA (3) (1,2 mg) thu được từ phân đoạn F3.4 P.
2.1.3. Thành phần
Các chất phân lập được:
Bảng 2 Cấu trúc của các alkaloids phân lập được
Trang 142.2. Phương pháp 2 [10]
2.2.1. Sơ đồ khối
Trang 15Sắc ký cột Silicagel (2x20 cm, Hexane:EtOAc:MeOH, 3:7:0-0:7:3)
Trang 162.2.2. Thuyết minh
Mẫu cây H.squarrrosa khô (750g) được nghiền nhỏ và ngâm trong MeOH (3Lx4)
ở nhiệt độ phòng Cặn chiết thô được hoà với dung dịch gồm axit tartaric 5% (200ml)
và CH2Cl2 Pha nước được kiềm hóa bằng dung dịch Na2CO3 tới pH=10 và sau đóđược chiết với CH2Cl2 Phần chiết giàu alkaloid (1,39 g) được tiến hành sắc ký cộtSephadex LH-20 (3×91 cm, CH2Cl2:MeOH, 1:1, 700 mL) và thu được 6 phân đoạn(P1-P6)
Phân đoạn P5 (686,4mg) được tiến hành sắc ký cột lần 2 trên Sephadex LH-20(3×70 cm, CH2Cl2:MeOH, 1: 1, 2000 mL) thu được 7 phân đoạn (P5.1-P5.7)
Phân đoạn P5.5 (543,3mg) được tiến hành sắc kí cột silicagel (3×30 cm,
CH2Cl2:MeOH: NH3-MeOH, 1:0:0–0:9:1) thu được 7 phân đoạn (P5.5.1-P5.5.7)
• Phân đoạn P5.5.1 (44,3 mg) được tiến hành sắc kí cột silicagel (2x20 cm, Hexane:
EtOAc:MeOH, 3:7:0-0:7:3) thu được hợp chất Pyrrolhuperzine A (11) (6,7 mg) là chất
Trang 172.3. Phương pháp 3 [3]
2.3.1. Sơ đồ khối
Trang 18Hợp chất 2 Hợp chất 1