Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương ( Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương ( Luận án tiến sĩ)

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ––––––––––––––––––

PHẠM THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Trang 2

2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ––––––––––––––––––

PHẠM THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƯƠNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS LÊ TRẦN BÌNH

THÁI NGUYÊN - 2014

Trang 3

3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác với các tác giả khác Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc đăng trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành, trong Kỷ yếu hội nghị Công nghệ sinh học và trên GenBank, với sự đồng ý cho phép của các đồng tác giả Phần kết quả còn lại chƣa đƣợc ai công bố

Trang 4

4

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án

Tôi xin được trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ, đặc biệt là PGS.TS Chu Hoàng

Hà, TS Lê Văn Sơn, ThS Hoàng Hà và ThS Lê Hoàng Đức thuộc Phòng Công nghệ

tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất, hướng dẫn kỹ thuật thí nghiệm và góp ý chuyên môn để tôi hoàn thành được đề tài này Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng tác giả

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh- Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên, cùng các cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện, động viên tôi trong học tập và hoàn thiện luận án, đặc biệt là sự giúp đỡ của các Thầy, Cô trong Bộ môn Di truyền- SHHĐ như GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, CN Nguyễn Thị Hồng Chuyên (Phòng thí nghiệm Hóa Sinh), CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền & Công nghệ gen)

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Phòng Quản lý đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo cùng các cán bộ của Viện Nghiên cứu Ngô Đan Phượng- Hà Nội đã tạo điều kiện cung cấp các giống ngô nếp địa phương và những thông tin cơ bản về giống

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã đồng hành, chia sẻ cùng tôi, khuyến khích tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ này

Thái Nguyên, tháng 05 năm 2014

Nghiên cứu sinh

Phạm Thị Thanh Nhàn

Trang 5

5

Trang 6

i

MỤC LỤC

Mục lục i

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Những đóng góp mới của luận án 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cây ngô 5

1.1.1 Sơ lược về cây ngô 5

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô 7

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam …… 8

1.2 Phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn 10

1.2.1 Mối liên quan giữa tác động của hạn và tính chống chịu stress ôxy hóa 10 1.2.1.1 Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa 10

1.2.1.2 Các dạng oxy hoạt hóa 12

1.2.1.3 Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa 13

1.2.2 Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô 14 1.2.2.1 Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn 14

1.2.2.2 Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô 17

1.3 Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa 20

1.3.1 Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn 20

1.3.2 Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô … 27

1.3.2.1 Nhân tố phiên mã và điều hòa biểu hiện gen 27

Trang 7

ii

1.3.2.2 Nhân tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin 30

1.4 Ứng dụng real- time PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện gen tham gia sinh tổng hợp anthocyanin 34

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Vật liệu nghiên cứu 40

2.2 Địa điểm nghiên cứu, hoá chất và thiết bị 40

2.3 Phương pháp nghiên cứu 41

2.3.1 Nhóm phương pháp hoá sinh 41

2.3.2 Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phương 45

2.3.3 Nhóm phương pháp sinh học phân tử ……… 47

2.3.3.1 Phương pháp tách RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen) 47

2.3.3.2 Phương pháp RT- PCR ……… 47

2.3.3.3 Tạo vector tái tổ hơp ……… 49

2.3.3.4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 49

2.3.3.5 Kiểm tra sản phẩm chọn dòng ……… 49

2.3.3.6 Tách plasmid ……… 49

2.3.3.7 Xác định trình tự gen ……… 51

2.3.3.8 Phương pháp real- time PCR 51

2.3.4 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 53

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 54

3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phương 54

3.1.1 Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phương giai đoạn hạt nảy mầm 54

3.1.1.1 Ảnh hưởng của hạn đến hàm lượng đường và hoạt độ - amylase 54

3.1.1.2 Ảnh hưởng của hạn đến sự biến đổi hoạt độ protease 57

3.1.2 Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non 3 lá 59

3.1.2.1 Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn ……… 59

3.1.2.2 Chỉ số chịu hạn tương đối của kiểu gen 10 giống ngô trong điều kiện hạn nhân tạo 61

Trang 8

iii

3.1.3 Phân nhóm 10 giống ngô nếp nghiên cứu theo mức độ chịu hạn 63

3.2 Ảnh hưởng của hạn nhân tạo đến lượng anthocyanin ở cây ngô nếp địa phương 65

3.2.1 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 65

3.2.2 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 67

3.2.3 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 70

3.2.4 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân và bẹ lá cây ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo so với đối chứng 73

3.3 Phân tích trình tự đoạn gen B, Lc ở giống NH và BS1 78

3.3.1 Đặc điểm trình tự đoạn gen B của giống NH và BS1 78

3.3.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc của giống NH và BS1 85

3.3.3 Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHLH ở cây ngô 91

3.4 Định lượng mức độ biểu hiện của gen B và Lc bằng phản ứng real- time PCR 93

3.4.1 Định lượng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con 93

3.4.2 Định lượng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con 97

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 103

Kết luận ……… 103

Đề nghị……… 103

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 105

PHỤ LỤC 1 127

PHỤ LỤC 2 128

PHỤ LỤC 3 131

PHỤ LỤC 4 132

Trang 9

iv

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

anthocyanidin

H2O

mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc

DFR Dihydroflavonol 4 reductase Enzyme chuyển hóa tạo

leucoanthocyanidin

photphodieste của phân tử DNA

element

Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa

Trang 10

v

F3‟5‟H Flavonoid 3‟,5‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin

quá trình hình thành phôi

dinucleotide phosphate

Coenzym đƣợc sử dụng trong phản ứng đồng hóa

dinucleotide phosphate-oxidase

Chất đƣợc tạ

PAL Phenylalanine ammonialyase Enzyme chuyển hóa L-phenylalanine

pelargonidin tạo Aleurone màu đỏ

Trang 11

vi

RT- PCR Reverse transcription-

polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại cDNA từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc

superoxide

polymorphism

Đa hình nucleotit đơn

phiên mã

glucosyltransferase

Enzyme xúc tác phản ứng tạo flavonol 3-O-beta-D-glucoside

3-O-glucosyltransferase

Enzyme xúc tác phản ứng O- glycosyl hóa

Trang 12

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô, lúa mì, lúa nước thế giới

1961-2010/11 8

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1961 đến 2012/13 9

Bảng 1.3 Các nhóm nhân tố phiên mã 29

Bảng 2.1 Các giống ngô nếp địa phương sử dụng trong nghiên cứu 40

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 48

Bảng 2.3 Thành phần dung dịch tách plasmid 51

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng real- time RT- PCR 52

Bảng 3.1 Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô nếp bị xử lý bởi hạn nhân tạo 59

Bảng 3.2 Tổng hợp đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn cây non 3 lá của 10 giống ngô nghiên cứu ……… 62

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng về mức phản ứng của các giống trước hạn … 63

Bảng 3.4 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô 66

Bảng 3.5 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô 69

Bảng 3.6 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô 70

Bảng 3.7 Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá qua các ngưỡng xử lý bởi hạn so với đối chứng 74

Bảng 3.8 Mối tương quan giữa sự biến động hàm lượng anthocyanin và tỷ lệ thiệt hại 76

Bảng 3.9 Chu kỳ ngưỡng của gen Act và B ở giống ngô NH và BS1 qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 94

Bảng 3.10 Chu kỳ ngưỡng của gen Act và Lc ở giống ngô NH và BS1 qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 98

Bảng 1.1 (Phụ lục 1) Hình thái và kích thước hạt của 10 giống ngô nếp địa phương 127

Bảng 1.2 (Phụ lục 1) Chất lượng hạt của 10 giống ngô 127

Trang 13

viii

Bảng 2.1 (Phụ lục 2) Hoạt độ amylase qua các tuổi mầm khi xử lý bởi

sorbitol 5% (ĐVHĐ/mg) ……… 128 Bảng 2.2 (Phụ lục 2) Hàm lượng đường qua các tuổi mầm khi xử lý bởi

sorbitol 5% (% KLT) 129 Bảng 2.3 (Phụ lục 2) Hoạt độ protease qua các tuổi mầm khi xử lý bởi

sorbitol 5% (ĐVHĐ/mg) … 130

Bảng 3.1 (Phụ lục 3) Tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotit của đoạn gen B ở

giống NH và BS1 với một số trình tự trong họ bHLH 131

Bảng 3.2 (Phụ lục 3) Tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotit của đoạn gen Lc ở

giống NH và BS1 với một số trình tự trong họ bHLH 131

Trang 14

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc aglucon của anthocyanin 21

Hình 1.2 Vai trò chất chống oxy hóa của anthocyanin 26

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc chuỗi axit amin của một TFs 28

Hình 1.4 Mô hình hoạt động của các nhân tố phiên mã 30

Hình 1.5 Ba nhóm gen điều hòa tham gia tổng hợp anthocyanin ở ngô theo Hartmann và cộng sự (2005) 31

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của SYBR I 35

Hình 1.7 Biểu đồ chảy (a) và Biểu đồ đỉnh chảy (b) 36

Hình 3.1 Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ - amylase của các giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi sorbitol 5% 55

Hình 3.2 Biểu đồ mô tả sự biến động hàm lượng đường của các giống ngô quaa các ngưỡng xử lý bởi sorbitol 5% 56

Hình 3.3 Biểu đồ mô tả sự biến động hoạt độ protease của các giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi sorbitol 5% 58

Hình 3.4 Đồ thị mô tả tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô trong quá trình xử lý hạn 60

Hình 3.5 Sơ đồ hình cây thể hiện sự giống nhau về khả năng phản ứng với hạn của 10 giống ngô nếp địa phương 64

Hình 3.6 Đường biểu diễn quang phổ hấp thụ của anthocyanin trong các bộ phận cây ngô khi bị hạn 73

Hình 3.7 Màu sắc thân và lá của cây ngô sau 7 ngày hạn ……… 77

Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR của đoạn gen B (A) và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) của giống BS1 và NH 79

Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen B ở giống NH và BS1 82

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa đoạn gen B của hai giống ngô NH và BS1 với các gen thuộc họ bHLH 83

Trang 15

x

Hình 3.11 So sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn protein B ở giống NH

và BS1 84

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR của đoạn gen Lc (A) và kiểm

tra plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) của giống BS1 và NH 85

Hình 3.13 So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen Lc ở giống NH và BS1 88

Hình 3.14 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa đoạn gen Lc của

hai giống ngô NH và BS1 với các gen thuộc họ bHLH 89 Hình 3.15 So sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn protein Lc ở giống NH

và BS1 90 Hình 3.16 Các vùng chức năng của nhân tố bHLH 92

Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen B ở giống

ngô NH và BS1 95

Hình 3.18 Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen B và Act ở hai

giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn 96

Hình 3.19 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen Lc ở giống

ngô NH và BS1 99

Hình 3.20 Biểu đồ chảy (A) và Biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen Act và Lc ở hai

giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn 100

Hình 4.1 (Phụ lục 4) So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen Act của giống NH

với trình tự trên GenBank 132

Trang 16

1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung cấp

lương thực cho loài người và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến lương thực- thực phẩm- dược phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô được chứng minh bằng 670 mặt hàng khác nhau Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung

du và miền núi phía Bắc, và là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao Năm 2012, tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là

48200 ha, ngô là 133700 ha; tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37400

ha, ngô là 52500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 30700 ha, ngô là

39300 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 30600 ha, ngô là 33700 ha [22] Nước ta có 75% diện tích là đồi núi, lượng mưa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra dẫn đến năng suất của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phương nói riêng bị giảm Trong những năm gần đây, hướng sản xuất ngô ở nước ta là tăng cường diện tích ngô lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến Các giống ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt

và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhưng do năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần Vì vậy, việc nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống

Trước đây, công tác chọn giống truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian

và công sức, nhất là đối với những tính trạng đa gen chịu nhiều ảnh hưởng của điều kiện môi trường Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là phương tiện hữu

Trang 17

2

hiệu để khắc phục những vấn đề khó khăn đó Sự hiểu biết về phân tử DNA, RNA, protein, hay các hợp chất thứ cấp có liên quan đến các đặc tính, tính trạng giúp cho người nghiên cứu chủ động lựa chọn kỹ thuật sinh học tác động vào chúng nhằm nhận dạng giống cây trồng theo mong muốn Chọn giống nhờ

sự trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng (Molecular Assisted Selection- MAS) đang ngày càng được quan tâm vì phương pháp này có thể rút ngắn được thời gian chọn lọc, thậm chí có thể chọn lọc sớm ở giai đoạn cây non Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá trình trao đổi chất Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nước khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu Anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó Hiện nay, định hướng nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang được quan tâm, trong đó

có chỉ thị sắc tố anthocyanin

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương”

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được mối tương quan giữa anthocyanin và khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phương

Xác định và phân lập được một số gen điều hòa (gen TF) quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phương

Đánh giá được mức độ phiên mã của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin của ngô nếp địa phương trong điều kiện hạn

Trang 18

3

Những mục tiêu trên nhằm định hướng ứng dụng trong tuyển chọn và bảo tồn giống ngô nếp có chất lượng và khả năng chịu hạn cao

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu giai đoạn hạt nảy mầm và cây con thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh (hàm lượng đường, hoạt độ amylase, chỉ số chịu hạn tương đối ) Phân nhóm các giống ngô theo mức độ chịu hạn

- Xác định mối tương quan giữa sự biến đổi hàm lượng anthocyanin và khả năng chịu hạn của ngô nếp địa phương ở giai đoạn cây con

- Phân lập đoạn gen B và Lc điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu trúc mã

hoá enzyme chuyển hóa tổng hợp sắc tố anthocyanin ở đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn

- Sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR để phân tích, so sánh mức độ biểu

hiện của gen B và Lc ở giai đoạn phiên mã của đại diện thuộc nhóm chịu

hạn tốt và kém trong điều kiện hạn

4 Những đóng góp mới của luận án

- Xác định được mức độ tương quan giữa hàm lượng anthocyanin với khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phương, và hàm lượng anthocyanin được coi là một trong những chỉ thị sinh hóa hóa phục vụ chọn lọc giống ngô chịu hạn

- Phân lập được 02 đoạn gen B và Lc mã hóa cho protein là nhân tố phiên mã

điều hòa quá trình sinh tổng hợp anthocyanin

- Bước đầu xác định được mức độ phiên mã của 02 gen B và Lc là một trong

các chỉ thị ở mức độ phân tử cho khả năng chịu hạn giai đoạn cây ngô non

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp những dẫn liệu khoa học về vai

Trang 19

4

trò của anthocyanin khi cây ngô nếp địa phương bị hạn

- Cung cấp thông tin về hai gen điều hòa (nhân tố phiên mã) B và Lc thuộc

họ bHLH tham gia sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phương bị hạn

- Tìm hiểu được cơ sở sinh học phân tử của khả năng chịu hạn ở cây ngô nếp địa phương thông qua so sánh mức độ biểu hiện của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin

Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phương giai đoạn hạt nảy mầm và cây non được sử dụng làm cơ sở để đánh giá khả năng chịu hạn ở cây trồng Trong đó, anthocyanin được xem là chất chỉ thị phục vụ chọn lọc giống ngô chịu hạn

- Sử dụng gen Lc của ngô như một gen chỉ thị mạnh mẽ để tăng tổng hợp

anthocyanin nhằm tạo ra các loại thực phẩm vừa có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng, vừa có tiềm năng kinh tế cho người sản xuất, và vừa có lợi cho

sự chống chịu hạn cho bản thân cây trồng

Trang 20

5

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây ngô

1.1.1 Sơ lược về cây ngô

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Zea, họ Hoà thảo (Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales) Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội

nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa

Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ Ngoài ra, ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [11]

Cây ngô là một loại cây lương thực được thuần canh tại khu vực Trung Mỹ

và sau đó mở rộng ra khắp châu Mỹ, và trên toàn thế giới vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16 [186] Tuy nhiên dạng ngô dại hiện không còn tồn tại nên có nhiều giả thuyết về nguồn gốc di truyền của cây ngô Song điều quan trọng nhất là hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước [11]

Thân cây ngô trông tương tự như thân cây của các loài hòa thảo Ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm

và rộng 5-10 cm; thân cây thẳng, thông thường cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa

ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn Dưới các lá này và ôm sát thân cây là các bắp Khi còn non chúng dài ra khoảng 3 cm mỗi ngày Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một

số rễ [11] Thân cây ngô non tích lũy một chất kháng sinh mạnh là DIMBOA (2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-on) DIMBOA là thành viên của nhóm các axít hydroxamic (còn gọi là benzoxazinoit) có khả năng phòng chống

tự nhiên đối với một loạt các loài gây hại như côn trùng, nấm và vi khuẩn gây

Trang 21

6

bệnh Giống ngô đột biến (bx) thiếu DIMBOA rất dễ bị các loài rệp và nấm gây bệnh Khi ngô trở nên già hơn thì hàm lượng DIMBOA cũng như khả năng đề kháng sâu bệnh cũng giảm đi [179], [187]

Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông được bao bọc trong một số lớp

lá, và được các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô màu hung vàng từ vòng lá vào cuối của bắp ngô Râu ngô

là các núm nhụy thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục

và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng Các hạt ngô là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu quả thông thường ở họ Hòa thảo Các hạt ngô bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200-

400 hạt Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng Khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [11]

Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10) Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc thể là 1500 cM Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bướu nhiễm sắc thể"- các vùng lặp lại cao với vết màu sẫm Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [185] Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa

Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô Bộ gen ngô có 50000–

60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ base [186]

Ngô nếp (Zea mays L subsp Ceratina Kulesh), là một trong những loài phụ chính của Zea mays L Bề ngoài hạt ngô nếp tương tự với ngô đá, nhưng

bóng hơn Lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ở ngô tẻ,

có tính chất quang học giống như lớp sáp Do vậy, ngô nếp còn có tên gọi khác

là ngô sáp Ngô nếp là dạng ngô tẻ do biến đổi tinh bột mà thành Tinh bột của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong khi ngô thường chỉ chứa 75%

Trang 22

7

amylopectin và 25% amylose [11] Theo Peter Thompson (2005), đặc tính của

ngô nếp được quy định bởi đơn gen lặn đó là gen wx [135]

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp

Ngô nếp được sử dụng làm lương thực và thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, dễ hấp thụ hơn so với tinh bột của ngô tẻ [189] Một trong những nguyên nhân là do trong ngô nếp có hàm lượng các axit amin không thay thế như lyzin và triptophan cao Hàm lượng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên Lipit được tập trung ở phôi và tầng alơron Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic Hàm lượng lipit là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt

Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu là enzyme), protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất Hàm lượng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống Lợi dụng tính chất hoà tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách chiết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá chất lượng, khả năng chịu hạn [187]

Ngô được sử dụng chủ yếu để nuôi gia cầm và gia súc: cỏ khô, cỏ ủ chua hay lấy hạt làm lương thực Hạt ngô có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chuyển hóa thành chất dẻo hay vải sợi; thủy phân hay xử lý bằng enzyme để sản xuất xi rô chứa nhiều fructose, đôi khi được lên men để chưng cất một số dạng rượu Ethanol từ ngô cũng được dùng ở hàm lượng thấp (10% hoặc ít hơn) như

là phụ gia của xăng làm nhiên liệu cho một số động cơ để gia tăng chỉ số octan, giảm ô nhiễm và giảm mức tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là "các nhiên liệu sinh học") Trong nhiều nền văn hóa người ta sử dụng các món cháo ngô, bánh ngô Một vài dạng ngô cũng được trồng làm cây cảnh Đối với mục đích này, các dạng với lá hay bắp nhiều màu, kích thước lớn, bắp dài được sử dụng [187]

Trang 23

8

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô nếp trên thế giới và ở Việt Nam

Ngô là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, có diện tích trồng không ngừng tăng nhanh trong thời gian qua (Bảng 1.1 và 1.2) Ngô nếp được trồng nhiều nhất ở Mỹ, diện tích hàng năm khoảng 290000 ha Hầu hết diện tích này được trồng

là nếp vàng [189] Theo Peter Thompson (2005), năng suất của ngô có hàm lượng amylose cao biến động tuỳ thuộc vào đất trồng, trung bình đạt từ 65- 75% so với ngô tẻ thường Ngô nếp có thể cho năng suất thấp hơn ở điều kiện thời tiết bất thuận [135] Theo thông báo của trường Đại học Illinois, gần đây đã có một số giống nếp lai điển hình cho năng suất cao hơn những giống ngô lai thông thường [190]

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô, lúa mì, lúa nước trên thế giới 1961-2011

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích (triệu ha)

N.suất (tạ/ha)

Diện tích (triệu ha)

N.suất (tạ/ha)

Nguồn Niên giám thống kê Thế giới, 6/2013 [183]

Theo thông tin từ Hội nghị ngô châu Á lần thứ 9 tại Bắc Kinh (2005), Trung Quốc đã tạo ra khá nhiều giống ngô nếp lai cho năng suất cao và chất lượng tốt Ví dụ: giống lai đơn màu trắng JYF 101 cho năng suất trung bình 150 tạ bắp tươi/ha; giống lai đơn màu tím Jingkenou 218 cho năng suất khoảng 120 tạ bắp tươi/ha; giống nếp trắng Jingkenou 2000 năng suất trung bình trên 130 tạ bắp tươi/ha; giống lai đơn tím trắng Jingtianzihuanuo và giống lai đơn Yahejin 2006 cho năng suất tới

200 tạ bắp tươi/ha [188] Ở Hàn Quốc, một số tỉnh trồng ngô nếp bán bắp tươi thu được 7925 USD/ha, sau đó trồng bắp cải, tổng thu nhập trên 16228 USD/ha

Trang 24

9

Ở Việt Nam, ngô nếp được phân bố ở khắp các vùng, miền trong cả nước với nhiều dạng mày hạt khác nhau: Trắng, vàng, tím, nâu, đỏ Hiện nay, Viện nghiên cứu ngô đã thu thập và lưu giữ 148 mẫu ngô nếp địa phương, trong đó có: 111 nguồn nếp trắng, 15 nguồn nếp vàng và 22 nguồn nếp tím, nâu đỏ Theo điều tra của Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống cây trồng Trung ương, trong 2 năm 2003 và

2004, diện tích ngô nếp ở nước ta chiếm gần 10% diện tích trồng ngô [17] Diện tích trồng ngô nếp không ngừng tăng nhanh trong thời gian qua, đặc biệt là ở vùng đồng bằng ven đô thị Nguyên nhân chính trước hết do các giống ngô nếp đáp ứng được nhu cầu luân canh tăng vụ trong cơ cấu nông nghiệp hiện nay, nhưng quan trọng hơn là do nhu cầu của xã hội ngày một tăng đối với sản phẩm này Ở các vùng núi cao và vùng sâu, ngô nếp được người dân sử dụng làm lương thực chính, dưới dạng xôi ngô hoặc dùng tươi dưới dạng nướng, luộc

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1990 đến 2012/13

Diện tích (1000ha) 432,0 730,2 1052,6 1096,1 1089,2 1121,3 1118,3

Sản lượng (1000 tấn) 671,0 2005,9 3787,1 4303,2 4573,1 4835,6 4803,6

Năng suất (tạ/ha) 15,5 27,5 36,0 39,3 40,1 43,1 43,0

Cũng như tình trạng chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào ngô tẻ Đối với các giống ngô nếp địa phương, đến nay chỉ có một số ít công trình được công bố Tác giả Ngô Hữu Tình và Nguyễn Thị Lưu (1990) đã chọn tạo thành công giống ngô nếp trắng từ vốn gen gồm các dòng thuần nếp trắng (làm nền) được bổ sung 12 nguồn gen các giống nếp địa phương [20] Nguyễn Thế Hùng và cộng sự (2010) đã tuyển chọn được 22 nguồn ưu tú trong tổng

số 64 nguồn vật liệu ngô nếp có nguồn gốc từ các vùng địa lý khác nhau (miền Bắc Việt Nam, Lào) Thông qua đánh giá đa dạng di truyền phân nhóm ưu thế lai và các

Trang 25

bị suy giảm quỹ gen vì năng suất thường thấp Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu

và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết cho công tác giống, và bảo tồn nguồn gen quý

1.2 Phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn

1.2.1 Mối liên quan giữa hạn và tính chống chịu stress oxy hóa

1.2.1.1 Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi

là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chịu hạn

Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và hạn sinh lí Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39- 42oC) và độ ẩm thấp

<62% Hạn không khí thường gây nên hiện tượng héo tạm thời vì rễ cây không hút đủ nước mà quá trình thoát hơi nước quá nhanh do nhiệt độ môi trường cao Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi trường vẫn đầy đủ nước nhưng

do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường tế bào và môi trường bên ngoài nên rễ cây không có khả năng hút nước

Trang 26

Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full

Định dạng
Số trang	150
Dung lượng	1,66 MB
File đính kèm	Luận án Full.rar (3 MB)