Báo Cáo Kết Quả Khảo Nghiệm Đánh Giá Rủi Ro Đối Với Môi Trường Và Đa Dạng Sinh Học Của Ngô Kháng Thuốc Trừ Cỏ ROUNDUP

Sự kiện chuyển gen NK603 đã được các quốc gia như Hoa Kỳ, Canada, Argentina, Brazil, Nam Phi, Nhật bản, Philippines… cấp phép an toàn với mục đích phóng thích vào môi trường và trồng trọ

MỤC LỤC

MỤC LỤC HÌNH v

MỤC LỤC BẢNG vi

TÓM TẮT BÁO CÁO KHẢO NGHIỆM ĐÁNH GIÁ RỦI RO ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNGVÀĐA DẠNGSINHHỌCCỦASỰKIỆNNK603 – NGÔKHÁNG THUỐCTRỪCỎROUNDUPGỐCGLYPHOSATE 1

BÁO CÁO KẾT QUẢ KHẢO NGHIỆM SỰ KIỆN NK603 –

NGÔ CHỐNG CHỊUTHUỐCTRỪ CỎROUNDUPGỐC GLYPHOSATE TẠI VIỆTNAM 8

PHẦNI.THÔNGTINCHUNG 8

1 Tổ chức đăng ký khảo nghiệm: 8

2 Giống cây trồng chuyển gen đăng ký khảo nghiệm: 8

3 Đơn vị khảo nghiệm: 8

4 Giấy phép khảo nghiệm: 9

PHẦN II TỔNG QUAN VỀ GIỐNG CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN 10

1 Sinh vật cho gen (mô tả đặc điểm sinh vật cho và nguồn gốc của gen chuyển) 10

2 Quá trình chuyển nạp gen (phương pháp, cấu trúc vector, cấu trúc gen) 11

2.1 Phương pháp chuyển gen 11

2.2 Cấu trúc vector sử dụng trong chuyển gen 12

2.3 Cấu trúc gen đưa vào 15

3 Sinh vật nhận gen 18

4 Giống cây trồng chuyển gen 19

4.1 Tính trạng và đặc điểm nhận dạng của NK603 19

4.2 Sự biểu hiện tính trạng của gen đưa vào 19

4.3 Thông tin về sự khác biệt của sự kiện NK603 so với sinh vật nhận 20

4.4 Phương pháp, công nghệ phát hiện sự kiện NK603 20

4.5 Thông tin về lịch sử cấp phép và sử dụng sự kiện NK603 trên thế giới 21

5 Mô tả các nguy cơ, khả năng xảy ra nguy cơ để xác định rủi ro có thể xảy ra khi phóng thích sự kiện NK603 21

Phần III XÁC ĐỊNH VẤN ĐỀ KHẢO NGHIỆM TẠI VIỆT NAM 23

1 Kết quả đánh giá rủi ro đối với môi trường của sự kiện NK603 trên thế giới 23

1.1 Đánh giá tác động của sự kiện NK603 đối với các loài sinh vật không chủ đích 23

1.2 Đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dai, dịch hại, lan tràn hoặc xâm lấn của sự

kiện NK603 gây ảnh hưởng tới môi trường và đa dạng sinh học thông qua các

đặc tính kiểu hình và nông học trong điều kiện đồng ruộng 26

1.3 Đánh giá nguy cơ trôi gen từ sự kiện MON 89034 sang các sinh vật khác và các hậu quả có thể xảy ra 27

1.4 Đánh giá nguy cơ khác gây ảnh hưởng tới môi trường và các hệ sinh thái ở Việt Nam 30

1.5 Đánh giá về những điều kiện của môi trường làm tăng cường hoặc hạn chế những điểm bất lợi của sự kiện NK603 31

2 Xác định yêu cầu khảo nghiệm tại Việt Nam: 32

PHẦN IV MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO NGHIỆM SỰKIỆNNK603 33

1 Khảo nghiệm hạn chế 33

1.1 Mục tiêu khảo nghiệm 33

1.2 Nội dung khảo nghiệm 33

1.3 Vật liệu sử dụng trong khảo nghiệm 34

1.4 Thời gian và diện tích khảo nghiệm 34

1.5 Địa điểm khảo nghiệm 34

1.6 Phương pháp khảo nghiệm 37

2 Khảo nghiệm diện rộng tại các vùng sinh thái khác nhau 42

2.1 Mục tiêu khảo nghiệm 42

2.2 Nội dung khảo nghiệm 42

2.3 Vật liệu sử dụng trong khảo nghiệm 43

Vật liệu hạt giống chuyển gen sử dụng trong khảo nghiệm diện rộng tại 4 vùng sinh thái bao gồm: 43

2.4 Thời gian và diện tích khảo nghiệm 43

2.5 Địa điểm khảo nghiệm 44

PHẦN V KẾT QUẢ KHẢO NGHIỆM SỰ KIỆN CHUYỂN GEN NK603 TẠI VIỆTNAM 50

1 Khảo nghiệm hạn chế đánh giá rủi ro đối với môi trường 50

1.1 Đánh giá đa dạng quần thể côn trùng không chủ đích trên ruộng khảo nghiệm ngô biến đổi gen so với đối chứng không chuyển gen qua điều tra thực địa 50

1.2 Đánh giá đa dạng thành phần loài sinh vật đất (Collembola) 56

1.3 Đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hại có thể xâm lấn gây ảnh hưởng tới

môi trường và đa dạng sinh học của NK603 trong khảo nghiệm hạn chế tại

Việt Nam 59

1.4 Tóm tắt kết quả khảo nghiệm hạn chế đánh giá rủi ro đối với môi trường và đa dạng sinh học của NK603 tại Việt Nam 66

2 Khảo nghiệm diện rộng đánh giá rủi ro đối với môi trường 67

2.1 Đánh giá ảnh hưởng của NK603 tới các loài sinh vật không chủ đích thuộc nhóm sâu hại, nhóm bắt mồi ăn thịt, nhóm ký sinh 67

2.2 Đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hai, lan tràn hay xâm lấn ảnh hưởng đến môi trường của ngô chuyển gen NK603 77

2.3 Đánh giá hiệu quả kiểm soát cỏ dại của ngô biến đổi gen NK603 so với đối chứng không chuyển gen 82

2.4 Đánh giá hiệu quả kinh tế của sự kiện NK603 85

PHẦN VI.KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ 91

Kết luận 91

Đề nghị 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93

MỘTSỐHÌNHẢNHTRONGQUÁTRÌNHKHẢONGHIỆM 101

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1 Bản đồ Plasmid vector PV-ZMGT32 13

Hình 2 Bản đồ vector PV-ZMGT32L sử dụng trong chuyển gen tạo sự kiện NK603 13

Hình 3 Trình tự axit amin của protein CP4 EPSPS 16

Hình 4 Quy trình tạo sự kiện NK603 17

Hình 5 Diễn biến khí hậu trong khảo nghiệm hạn chế tại Văn Giang – Hưng Yên 36

Hình 6 Diễn biến khí hậu trong khảo nghiệm hạn chế tại Bà Rịa Vũng Tàu 36

Hình 7 Sơ đồ bố tri khảo nghiệm hạn chế 37

Hình 8 Sơ đồ thu thập số liệu trong khảo nghiệm hạn chế tại Việt Nam 41

Hình 9 Sơ đồ bố tri khảo nghiệm hạn chế 47

Hình 10 Sơ đồ thu thập số liệu trong khảo nghiệm diện rộng tại Việt nam 49

Hình 11 Đa dạng thành phần loài côn trùng không chủ đích trong khảo nghiệm hạn chế ngô chuyển gen NK603 tại Việt Nam 55

Hình 12 Đa dạng thành phần loài Collembola trong khảo nghiệm hạn chế ngô chuyển gen MON 89034 tại Việt Nam 58

Hình 13 So sánh một số chỉ tiêu nông sinh học chính trong khảo nghiệm hạn chế ngô chuyển gen MON 89034 tại Việt Nam 63

Hình 14 Đa dạng thành phần loài côn trùng không chủ đích trong khảo nghiệm diện rộng ngô chuyển gen NK603 tại Việt Nam 69

Hình 15 Đa dạng thành phần các loài côn trùng không chủ đích (theo nhóm chức năng) trong khảo nghiệm diện rộng ngô chuyển gen NK603 tại Việt Nam 74

Hình 16 Các chỉ tiêu kiểu hình và nông học chính của các giống ngô khảo nghiệm 80

Hình 17 Năng suất thu hoạch của ngô chuyển gen NK603 trong điều kiện áp lực sâu tự nhiên trong khảo nghiệm diện rộng tại Việt Nam 85

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1 Tổng hợp các nguyên tố di truyền của plasmid vector PV-ZMGT32 14 Bảng 2 Hiện trạng phê chuẩn sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và

trồng trọt của sự kiện NK603 22 Bảng 3 Đặc tính kiểu hình và nông học của sự kiện NK603 so với đối chứng (số liệu thu

thập tại Hoa Kỳ năm 1999) 27 Bảng 4 Diễn biến thời tiết tại Văn Giang-Hưng Yên trong khảo nghiệm hạn chế 36 Bảng 5 Diễn biến thời tiết tại Bà Rịa vũng Tàu trong khảo nghiệm hạn chế 36 Bảng 6 Diễn biến thời tiết trong quá trình khảo nghiệm diện rộng tại 4 vùng sinh thái của

Việt Nam 46 Bảng 7 Công thức thí nghiệm đánh giá rủi ro ngô NK603 46 Bảng 8 Sự đa dạng quần thể côn trùng trong khảo nghiệm hạn chế ngô chuyển gen

NK603 tại Việt Nam 52 Bảng 9 Một số chỉ số đánh giá đa dạng loài côn trùng trong khảo nghiệm hạn chế tại Việt

Bảng 10 Đa dạng thành phần loài và các chỉ số đa dạng Collembola trong khảo nghiệm

hạn chế sự kiện NK603 57 Bảng 11 Đặc tính nông sinh học của ngô NK603 trong khảo nghiệm hạn chế tại Việt

Nam 61 Bảng 12 Một số chỉ tiêu nông sinh học của ngô NK603 trong khảo nghiệm hạn chế tại

Việt Nam (tiếp) 62 Bảng 13 Tính mẫn cảm của ngô NK603 trong khảo nghiệm hạn chế tại Việt Nam 65 Bảng 14 Sự đa dạng quần thể côn trùng trong khảo nghiệm diện rộng sự kiện NK603 tại

Việt Nam 68 Bảng 15 Đa dạng thành phần một số loài sâu hại trong khảo nghiệm diện rộng ngô

chuyển gen NK603 tại Việt Nam 72 Bảng 16 Đa dạng thành phần một số loài bắt mồi ăn thịt và ký sinh trong khảo nghiệm

diện rộng ngô chuyển gen NK603 tại Việt Nam 73 Bảng 17 Cấp hại trung bình của rệp muội trên các giống ngô khảo nghiệm diện rộng ở

Việt Nam năm 2011 76

Bảng 18 Đặc điểm về kiểu hình và nông sinh học chính của NK603 trong khảo nghiệm

diện rộng tại Việt Nam 79 Bảng 19 Tính mẫn cảm với một số bệnh hại chính của NK603 trong khảo nghiệm diện

rộng tại Việt Nam 81 Bảng 20 Kết quả đánh giá hiệu quả kiểm soát cỏ dại của sự kiện NK603 kháng thuốc trừ

cỏ Roundup gốc glyphosate 84 Bảng 21 Năng suất thu hoạch của sự kiện MON 89034 trong khảo nghiệm diện rộng tại

Việt Nam 85

TÓM TẮT BÁO CÁO KHẢO NGHIỆM ĐÁNH GIÁ RỦI RO ĐỐI VỚI MÔI

TRƯỜNG VÀ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA SỰ KIỆN NK603 – NGÔ KHÁNG

TT Nội dung đánh

giá

chú

I Thông tin chung

1 Tên, địa chỉ liên

Công ty TNHH DEKALB Việt Nam

2 Người đứng đầu và đầu mối liên lạc:

Nguyễn Hồng Chính Giám đốc Regulatory Affairs, VN Điện thoại: 0988 026 955 chinh.hong.nguyen@monsanto.com

2 Tên sự kiện chuyển gen:

Sự kiện NK603, Ngô kháng thuốc trừ cỏ Roundup

2 Đánh giá hiệu quả sinh học của giống ngô biến đổi gen NK603 tại các vùng sinh thái của Việt Nam

Trang 33,42

II Thông tin về sinh vật nhận gen

1 Tên cây trồng

nhận gen

1 Tên cây trồng nhận gen: Cây ngô (Zea mays L.)

2 Tên giống nền nhận gen: Giống ngô lai C919 thương hiệu Dekalb

Trang

18

lý khác ảnh hưởng đến khả năng phát tán hạt phấn

Ngô là cây hàng năm với chu kỳ trồng ngắn Cây ngô yêu cầu ánh sáng mạnh, trồng trong điều kiện được chiếu sáng mạnh ngô sẽ cho năng suất cao, chất lượng hạt tốt Nhiệt

độ lý tưởng để ngô sinh trưởng và phát triển là 25-300C

Cây ngô có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, tuy nhiên ngô thích hợp nhất là trên đất có thành phần cơ giới nhẹ, độ màu mỡ cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, độ pH: 6-7

Ngô có thể trồng nhiều vụ trên năm, tùy theo khí hậu của từng vùng mà thời vụ gieo trồng ngô có khác nhau song chủ yếu vẫn là 3 vụ chính: đông xuân, hè thu và thu đông

3 vụ/năm, thích nghi rộng, phù hợp với nhiều loại đất khác nhau, năng suất cao và ổn định từ 10-12 tấn/ha, chi phí thấp, lợi nhuận cao, chống chịu được hạn cục bộ và nhiều bệnh như rỉ sắt, cháy lá , chịu trồng dày, mật độ có thể lên tới 83.000 cây/ha

Phương pháp chuyển gen bằng bắn đạn gia tốc này được sử

dụng rộng rãi

Trang

11

2 Vector sử dụng

trong chuyển gen

Plasmid vector PV-ZMGT32 sử dụng trong chuyển gen

tạo sự kiện NK603 là plasmid nguyên gốc có kích thước

9.3 kb, được thiết kế bởi công ty Monsanto có chứa 2 cấu

Trang

12

Sử dụng enzyme cắt giới hạn MluI cắt giới hạn plasmid

vector PV-ZMGT32, thu nhận được vector PV-ZMGT32L

có kích thước khoảng 6.7 kb Vector này được sử dụng trong phương pháp bắn đạn gia tốc để tạo sự kiện NK603

Sự kiện NK603 này chỉ chứa duy nhất 2 cấu trúc biểu hiện

gen cp4 epsps và không mang gen chọn lọc nptII và gốc tái bản ori

3 Kích thước, trình

tự, chức năng

của gen đưa vào

Sự kiện NK603 mang 02 gen cp4 epsps

Gen cp4epsps được phân lập từ chủng vi khuẩn

Agrobacterium CP4 mã hóa 02 protein CP4 EPSPS và CP4

5-enolpyruvlyshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS)

có trọng lượng 47.6 kDa gồm 455 axit amin Protein CP4 EPSPS là protein thuộc nhóm các protein EPSPS có trong

tự nhiên và có hoạt tính chống chịu cao với glyphosate

Protein CP4 EPSPS L214P có cấu trúc và chức năng tương

tự CP4 EPSPS nhưng chỉ khác nhau bởi 1 axit amin ở vị trí thứ 214 (leucine của CP4 EPSPS bị thay thế bởi proline trong CP4 EPSPS L214P)

Trang

15

4 Phương pháp

xác định, phát

hiện gen đưa vào

1) ELISA để phát hiện protein CP4 EPSPS; 2) PCR để xác định sự có mặt của gen cp4 epsps và 3) Chẩn đoán nhanh

sự có mặt của protein CP4 EPSPS bằng que thử

Có thể nhận ra sự kiện NK603 bằng mắt thường nhờ vào

sự biểu hiện tính kháng thuốc trừ cỏ trên đồng ruộng khi phun Roundup: cỏ chết trong khi sự kiện NK603 sinh

trưởng bình thường hoặc bằng các phương pháp sinh học phân tử sau: 1) ELISA, 2) PCR và 3) lai Southern và 4) Chẩn đoán nhanh bằng que thử

Trang

19

không có sự khác biệt về kiểu hình và các đặc điểm sinh trưởng phát triển giữa sự kiện NK603 so với đối chứng không chuyển gen, bao gồm các đặc điểm về sức sống cây con, số cây ban đầu, số cây thu hoạch, thời gian 50% cây tung phấn, thời gian 50% cây phun râu, chiều cao đóng bắp, bắp rụng, cây gãy thân, cây đổ rễ, dinh dưỡng hạt và trọng lượng hạt

Kết quả phân tích 51 hợp chất trong hạt và trong thân sự kiện NK603 bao gồm thành phần các protein, chất béo, chất xơ, khoáng chất, tinh bột, axit amin, các axit béo,

vitamin, v.v cho thấy sự kiện NK603 có thành phần hợp chất và hàm lượng dinh dưỡng tương đương với ngô đối chứng không chuyển gen;

- Khả năng ảnh hưởng tới các loài sinh vật không chủ đích; sự xuất hiện các loài mới hoặc thay đổi các mắt xích trong chuỗi thức ăn;

- Nguy cơ trôi gen sang các sinh vật khác và các hậu quả

có thể xảy ra;

- Nguy cơ lan tràn hoặc xâm lấn của sinh vật biến đổi gen gây ảnh hưởng tới môi trường và đa dạng sinh học Việt Nam;

- Nguy cơ khác gây ảnh hưởng tới môi trường và các hệ

sinh thái Việt Nam

Sự kiện chuyển gen NK603 đã được các quốc gia như Hoa

Kỳ, Canada, Argentina, Brazil, Nam Phi, Nhật bản, Philippines… cấp phép an toàn với mục đích phóng thích vào môi trường và trồng trọt dựa trên các bằng chứng về tính an toàn của sự kiện ngô này đối với môi trường và đa dạng sinh học sau đây:

- Ngô chuyển gen NK603không gây ảnh hưởng đến các loài sinh vật không chủ đích, bao gồm các loài sinh vật

có ích, loài đang bị đe dọa và loài cần được bảo tồn vì đặc tính an toàn của protein CP4 EPSPS sản sinh trong

sự kiện ngô chuyển gen NK603

- Ngô chuyển gen NK603 không làm thay đổi biện pháp canh tác cũng như không là nguyên nhân làm tăng cường hình thành cỏ dại cũng như không thúc đẩy sự hình thành cỏ dại của các loại ngô khác

- Có sự tương đương cơ bản về đặc tính nông học, sự mẫn cảm đối với sâu bệnh không chủ đích và thành phần hợp chất giữa ngô chuyển gen NK603 và giống sử dụng làm giống nền cho phép kết luận NK603 không là nguy cơ trở thành dịch hại

Trang

23

2 Xác định yêu

cầu khảo nghiệm

tại Việt Nam

Qua phân tích điều kiện cụ thể tại Việt Nam và kế thừa các kết quả đánh giá rủi ro của ngô chuyển gen NK603 trên thế giới, các nội dung khảo nghiệm đánh giá rủi ro ngô chuyển gen NK603 đối với môi trường sẽ tập trung vào các nội dung sau đây:

- Đánh giá ảnh hưởng của NK603 tới các loài sinh vật không chủ đích thuộc nhóm sâu hại, nhóm bắt mồi ăn thịt, nhóm ký sinh;

Trang

32

- Đánh giá hiệu quả kiểm soát cỏ dại của ngô chuyển gen NK603

VI Đánh giá về nguy cơ ảnh hưởng của sự kiện NK603 đối với môi trường và

xuất hiện của

loài mới hoặc

cơ gây lan tràn hoặc xâm lấn đối với môi trường và đa dạng sinh học ở Việt Nam

Trang

66

VI.2 Khảo nghiệm diện rộng

1 Đánh giá nguy cơ

Trang

67

TT Nội dung đánh

giá

chú

2 Đánh giá nguy cơ

lan tràn hoặc xâm

Trang

77

3 Đánh giá hiệu

quả kiểm soát cỏ

dại của sự kiện

NK603

Sự kiện NK603 cho hiệu quả phòng trừ cỏ dại cao khi sử dụng thuốc trừ cỏ Roundup do khả năng kiểm soát cỏ dại cao và mức độ an toàn với cây trồng và môi trường

dạng sinh học được khẳng định thông qua các chỉ tiêu sau:

1 Sự kiện NK603, ngoài đặc tính kháng thuốc trừ cỏ Roundup gốc glyphosate, không tồn tại nguy cơ ảnh hưởng tới các sinh vật không chủ đích (các loài sâu hại, các loài thiên địch và ký sinh và sinh vật đất Collembola) của sự kiện NK603

2 Sự kiện NK603 kháng thuốc trừ cỏ Roundup có các đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sự mẫn cảm với bệnh hại tương tự như giống ngô nền C919 không chuyển gen Điều này một lần nữa khẳng định không tồn tại nguy cơ lan tràn hoặc xâm lấn của sự kiện NK603 đối với môi trường và đa dạng sinh học ở Việt Nam

3 Sự kiện NK603 cho hiệu quả quản lý cỏ dại cao khi sử dụng thuốc trừ cỏ Roundp vì các đặc tính an toàn của loại thuốc trừ cỏ này

BÁO CÁO KẾT QUẢ KHẢO NGHIỆM SỰ KIỆN NK603 –

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

1 Tổ chức đăng ký khảo nghiệm:

Tên, địa chỉ liên lạc của tổ chức đăng ký:

Công ty TNHH Dekalb Việt Nam

2 Giống cây trồng chuyển gen đăng ký khảo nghiệm:

Tên của cây trồng chuyển gen (cây chủ): cây Ngô (Zea mays L.)

Tên của Sự kiện đăng ký khảo nghiệm:

Sự kiện NK603 (Ngô kháng thuốc trừ cỏ Roundup gốc glyphosate)

Tên giống sử dụng làm giống nền: giống ngô lai C919, thương hiệu DeKalb

3 Đơn vị khảo nghiệm:

Tên cơ quan thực hiện khảo nghiệm:

Viện Di truyền Nông nghiệp

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Điện thoại: 84 4 3838 6734 Fax: 84 4 3754 3196

E-mail: vdtkhoahoc@yahoo.com; Website: http://www.agi.gov.vn

Địa chỉ: Đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội, Việt Nam

Họ và tên thủ trưởng cơ quan: PGS.TS Lê Huy Hàm

Chịu trách nhiệm khảo nghiệm: TS Nguyễn Thị Thanh Thủy

4 Giấy phép khảo nghiệm:

- Quyết định cấp phép khảo nghiệm hạn chế: Quyết định số 774/QĐ-BNN-KHCN ngày 29 tháng 3 năm 2010 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

- Quyết định công nhận kết quả khảo nghiệm hạn chế và cấp phép khảo nghiệm diện rộng: Quyết định số 402/QĐ-BNN-KHCN ngày 07 tháng 3 năm 2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

PHẦN II TỔNG QUAN VỀ GIỐNG CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

1 Sinh vật cho gen (mô tả đặc điểm sinh vật cho và nguồn gốc của gen chuyển)

Sinh vật cho gen, chủng vi khuẩn Agrobacterium CP4 được lựa chọn làm sinh

vật cho gen dựa trên tính kháng của chủng vi khuẩn này với glyphosate Tính kháng cao với glyphosate được quy định bởi protein CP4 EPSPS, một protein thuộc nhóm EPSPS phân bố trong tự nhiên (Padgette và cộng sự, 1996) Cho đến nay, chủng vi khuẩn

Agrobacterium CP4 được biết đến là chủng vi khuẩn không gây bệnh, gây dị ứng cho con người hoặc động vật (FAO/WHO, 1991) Hơn nữa, theo FAO/WHO (FAO/WHO, 2001), chưa phát hiện được trường hợp người nào nhạy cảm với các protein của loài vi

khuẩn Agrobacterium nói chung

Enzyme 5-enolpyruvlyshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) thuộc nhóm enzyme có mặt trong cây trồng và các loài vi sinh vật Cho đến nay, các protein thuộc nhóm EPSPS của cả thực vật và vi sinh vật đã được phân lập và xác định chức năng rõ ràng, theo đó cấu trúc và chức năng của các protein này là tương tự nhau (Harrison và cộng sự, 1996; Haslam, 1993; Klee và cộng sự, 1987; Schonbrunn và cộng sự, 2001; Steinrucken và Amrhein, 1980) Các protein EPSPS tham gia vào con đường shikimate, sinh tổng hợp các axit amin thơm trong các loài thực vật và vi sinh vật (Levin và Sprinson, 1964; Harrison và cộng sự, 1996) Các protein EPSPS có mặt trong các loại thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật và vi sinh vật Các loài động vật, cá, chim, bò sát và côn trùng không tồn tại con đường shikimate và có mặt protein EPSPS (Alibhai và Stallings, 2001) Phân tích không gian 3 chiều và phân tích chức năng của protein CP4 EPSPS cho thấy protein CP4 EPSPS thuộc nhóm protein EPSPS,

có cấu trúc và chức năng tương tự các protein EPSPS có nguồn gốc thực vật và vi sinh vật khác, ngoại trừ khả năng chống chịu cao với glyphosate (Levin và Sprinson, 1964; Harrison và cộng sự, 1996)

Gen cp4epsps mã hóa protein CP4 EPSPS có trọng lượng 47.6 kDa gồm 455 axit

amin (Padgette và cộng sự, 1996) Protein CP4 EPSPS có trình tự và chức năng tương

tự EPSPS nội sinh trong các loài thực vật, chỉ khác nhau là ở mức độ chống chịu với glyphosate, thành phần có hoạt tính trong thuốc trử cỏ Roundup (Padgette và cộng sự, 1996) Ở cây ngô không chuyển gen, khi phun thuốc trừ cỏ, chất glyphosate trong thuốc kết hợp với enzyme EPSPS nội sinh tổng hợp dẫn đến kìm hãm quá trình sinh tổng hợp các axit amin thơm (Steinrücken và Amrhein, 1980; Haslam, 1993) Ở sự kiện NK603, quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp các axit amin thơm và các hợp chất cần thiết khác diễn ra bình thường do sự có mặt của protein CP4 EPSPS với khả năng kháng glyphosate cao (Padgette và cộng sự, 1996)

Protein CP4 EPSPS sản sinh trong sự kiện NK603 có trình tự hoàn toàn tương đồng với các protein CP4 EPSPS trong các sản phẩm cây trồng Roundup Ready® và

protein CP4 EPSPS phân lập từ chủng vi khuẩn Agrobacterium CP4 này trước đó đã

được đánh giá an toàn trong các sản phẩm cây trồng của Monsanto đăng ký với Bộ Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) như đậu tương Roundup Ready (40-3-2), đậu tương Roundup Ready 2 Yield (MON 89788), cải dầu Roundup Ready (GT73), củ cải đường Roundup Ready (H7-1) và bông Roundup Ready Flex (MON 88913) Hơn nữa, Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (U.S EPA) cũng đã ban hành quy chế miễn trừ đánh giá tồn dư của CP4 EPSPS và vật liệu di truyền của chúng trong các loại cây trồng (U.S EPA, 1996)

2 Quá trình chuyển nạp gen (phương pháp, cấu trúc vector, cấu trúc gen)

2.1 Phương pháp chuyển gen

Sự kiện NK603 được tạo ra bằng phương pháp bắn đạn gia tốc (particle acceleration) (Klein và cộng sự, 1987; Gordon-Kamm et al., 1990): Sử dụng enzyme

cắt giới hạn MluI cắt giới hạn plasmid vector PV-ZMGT32 (hình 1), phân tách sản

phẩm cắt giới hạn bằng gel agarose và thu nhận được vector PV-ZMGT32L (hình 2) được sử dụng để chuyển gen tạo ra dòng NK603 bằng phương pháp bắn đạn gia tốc (particle acceleration) (Klein và cộng sự, 1987; Gordon-Kamm và cộng sự, 1990)

Đoạn gen chèn vào có chứa 2 cấu trúc biểu hiện gen cp4 epsps có khả năng kháng glyphosate, cho phép chọn lọc được các tế bào mang gen chuyển nạp trong môi trường nuôi cấy có bổ sung glyphosate, một thành phần có hoạt tính trong thuốc trừ cỏ Roundup Quy trình chuyển gen, chọn lọc, tái sinh và và chọn dòng NK603 được mô tả trong hình 3

2.2 Cấu trúc vector sử dụng trong chuyển gen

Plasmid vector biểu hiện gen PV-ZMGT32 là plasmid do công ty Monsanto,

(Hoa Kỳ) thiết kế, mang 2 cấu trúc biểu hiện gen liền kề nhau (2 cassettes) mà mỗi

cassette có chứa 01 bản copy duy nhất của gen cp4 epsps Ngoài 2 cassettes đó, plasmid này cũng mang gen chọn lọc nptII (kháng kanamycine)- cho phép chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid, và gốc tái bản (ori) cần thiết cho sự nhân lên của plasmid trong vi khuẩn Escherichia coli (hình 1)

Sử dụng enzyme cắt giới hạn MluI cắt giới hạn plasmid vector PV-ZMGT32,

phân tách sản phẩm cắt giới hạn bằng gel agarose và thu nhận được vector ZMGT32L có kích thước khoảng 6.7 kb Vector này được sử dụng để chuyển gen bằng phương pháp bắn đạn gia tốc Sự kiện NK603 được tạo ra chỉ chứa duy nhất 2 cassettes

PV-biểu hiện gen cp4 epsps trong hệ gen cây trồng mà không có gen chọn lọc nptII và gốc tái bản ori

Thông tin về vị trí và chức năng của tất cả các nguyên tố di truyền trên plasmid

vector PV-ZMGT32 được xác định rõ ràng Các nguyên tố này bao gồm: 1) promoter

e35S sử dụng trong cấu trúc biểu hiện gen đầu tiên, được thu nhận từ virus gây bệnh khảm ở súp lơ (CaMV), đã được xác định rõ ràng về cấu trúc, đặc tính và mức độ an

toàn; 2) Trình tự mã hoá epsps sử dụng trong cả hai cấu trúc biểu hiện gen được tách từ chủng vi khuẩn Agrobacterium sp CP4; 3) Đầu NOS 3’ kết thúc phiên mã là vùng

3’không dịch mã của gen tạo hợp chất nopaline được tách từ Ti-plasmid của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Không có tác nhân gây bệnh cho người và động vật đã biết

nào có nguồn gốc từ các loài vi khuẩn Agrobacterium, cũng như là từ gen cp4 epsps

hay trình tự NOS 3′ mặc dù đây là các yếu tố quyết định khả năng gây hại cây trồng của

vi khuẩn Agrobacterium 4) Các nguyên tố khác như Promoter P-ract, intron Zmhsp 70

và yếu tố di truyền gắn xen cpt2 được phân lập từ các cây trồng phổ biến gồm có lúa,

ngô và Arabidopsis (bảng 1)

CP4 EPSPS

NOS 3' e35S

ZmHSP70

intron CTP2

CP4 EPSPS NOS 3'

ori

nptII

NcoI 1604 SacI 1098 EcoRI 579 EcoRV 169 MluI 149

SacI 3207 EcoRI 3209

EcoRV 4009 XbaI 4231

MluI 6855 EcoRI 6837 EcoRV 6827 EcoRI 6561 SacI 6559

NcoI 4956 XbaI 4936 ScaI 4703

NcoI 8387

Fragment used in transformation

MluI 0

MluI 6706

EcoRV 3860 ScaI 4554 SacI 6410

Bảng 1 Tổng hợp các nguyên tố di truyền của plasmid vector PV-ZMGT32

Nguyên tố

di truyền Nguồn gốc

Kích thước

ract1 intron Oryza sativa 1.4

Vùng 5’ của gen actin1 ở lúa chứa promoter, điểm bắt đầu phiên mã và intron đầu tiên (McElroy và cộng sự, 1990)

CTP2 Arabidopsis

Trình tự ADN mã hóa cho peptit vận chuyển

qua lục lạp được phân lập từ Arabidopsis thaliana (Klee và Rogers, 1987), có mặt để đẫn đường cho protein CP4 EPSPS đến lục lạp là nơi sinh tổng hợp các axit amin thơm

CP4 EPSPS Agrobacterium

sp strain CP4 1.4

Trình tự ADN mã hoá protein CP4 EPSPS,

phân tách từ chủng vi khuẩn Agrobacterium sp

CP4 (Harrison và cộng sự, 1993; Padgette và cộng sự, 1996), làm tăng khả năng chống chịu glyphosate

NOS 3′ Agrobacterium

tumefaciens 0.3

Vùng 3’ không dịch mã của gen tổng hợp Nopaline trên T-DNA của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens, có vai trò kết thúc

dịch mã và định hướng cho polyA gắn vào mRNA mới tổng hợp (Fraley và cộng sự, 1983)

Cấu trúc biểu hiện gen 2 (cassette 2)

e35S Cauliflower

mosaic virus 0.6

Promoter của virus khảm súp lơ (CaMV) (Odell

và cộng sự, 1985) có chứa vùng tăng cường sao

mã (Kay và cộng sự, 1985)

Zmhsp70 Zea mays L 0.8

Intron từ gen hsp70 của ngô (protein sốc nhiệt),

giúp tăng cường quá trình phiên mã (Rochester

và cộng sự, 1986)

CTP2 Arabidopsis

Trình tự ADN mã hóa cho peptit vận chuyển

qua lục lạp được phân lập từ Arabidopsis thaliana (Klee và Rogers, 1987), có mặt để đẫn đường cho protein CP4 EPSPS đến lục lạp là nơi sinh tổng hợp các axit amin thơm

Nguyên tố

di truyền Nguồn gốc

Kích thước

CP4 EPSPS Agrobacterium

sp chủng CP4 1.4

Trình tự ADN mã hoá protein CP4 EPSPS,

phân tách từ chủng vi khuẩn Agrobacterium sp

CP4 (Harrison và cộng sự, 1993; Padgette và cộng sự, 1996), làm tăng khả năng chống chịu glyphosate

NOS 3′ Agrobacterium

tumefaciens 0.3

Vùng 3’ không dịch mã của gen tạo hợp chất Nopaline trên T-DNA của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens, có vai trò kết thúc

dịch mà và định hướng cho polyA gắn vào

mRNA mới tổng hợp (Fraley và cộng sự, 1983)

2 Các nguyên tố di truyền có mặt trong plasmid vector PV-ZMGT32 nguyên gốc, nhưng không có mặt trong vector PV-ZGMT32L:

Ori Escherichia coli 0.65

Gốc tái bản từ vi khuẩn E.coli có số lượng bản

copy plasmid pUC19 cao (Vieira và Messing, 1987)

nptII Transposon Tn5 0.8

Gen mã hoá cho enzyme neomycin phosphotransferase II Enzyme này làm tăng khả năng kháng kháng sinh aminoglycoside, do đó cho phép chon lọc vi khuẩn chứa plasmid (Beck

và cộng sự, 1982)

2.3 Cấu trúc gen đưa vào

Gen cp4epsps được xác định là có khả năng chống chịu cao với glyphosate khi

được chuyển vào cây trồng (Padgette và cộng sự, 1993; OECD, 1999) CP4 EPSPS) Glyphosate kết hợp và kìm hãm hoạt động của enzyme EPSPS nội sinh tổng hợp tham

gia sinh tổng hợp các axit amin thơm Gen cp4 epsps phân lập từ chủng vi khuẩn Agrobacterium CP4 có trọng lượng 47.6 kDa gồm 455 axit amin (Padgette và cộng sự,

1996) Gen cp4 epsps kết hợp với ctp2 có độ dài 1.6 kb Trình tự protein CP4 EPSPS và

CTP2 được mô tả ở hình 3

Protein CP4 EPSPS là protein thuộc nhóm các protein EPSPS có trong tự nhiên (Schulz và cộng sự, 1985) So sánh với phần lớn các protein ESPSPs khác, protein CP4 EPSPS được xác nhận là protein có tính chống chịu cao với glyphosate (Barry và cộng

sự, 1992; Padgette và cộng sự, 1993; Padgette và cộng sự, 1996)

Sự kiện sản sinh ra 2 protein CP4 EPSPS: CP4 EPSPS và CP4 EPSPS L214P Hai protein này có cấu trúc và chức năng tương tự nhau, chỉ khác nhau bởi 1 axit amin

ở vị trí thứ 214 (axit amin của protein CP4 EPSPS là leucine và của CP4 EPSPS L214P

là proline)

Protein CP4 EPSPS trong sự kiện NK603 chính là các protein đã sử dụng trong tạo dòng các sản phẩm cây trồng kháng thuốc trừ cỏ Roundup Ready như đậu tương, cải dầu, bông và củ cải đường

Cấu trúc biểu hiện gen: Trên cấu trúc biểu hiện gen thứ nhất, gen ctp2-cp4

epsps được điều khiển bởi đầu cuối 5’ của gen actin1 ở lúa (ract1) (có chứa promoter,

điểm bắt đầu phiên mã và intron đầu tiên) (McElroy và cộng sự, 1990) Cấu trúc biểu

hiện gen thứ 2 bao gồm gen ctp2-cp4 epsps l214p dưới sự điều khiển của promoter e35S của virus khảm súp lơ (CaMV) có chứa vùng tăng cường sao mã với độ dài

khoảng 0.6 kb (Kay và cộng sự, 1987; Odell và cộng sự, 1985) Nằm giữa promoter

e35S và gen cp4 epsps l214p là đoạn Intron từ gen hsp70 của ngô (gen mã hóa protein

sốc nhiệt), có độ dài 0.8 kb giúp tăng cường quá trình phiên mã (Rochester và cộng sự,

1986) Trên mỗi cấu trúc biểu hiện gen, gen cp4 epsps nằm liền kề với đoạn đầu cuối 3’

không dịch mã có độ dài 0.3 kb của gen tổng hợp Nopaline trên T-DNA của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens, có vai trò kết thúc dịch mã và định hướng cho polyA gắn

vào mRNA mới tổng hợp (Fraley và cộng sự, 1983)

1 MAQVSRICNG VQNPSLISNL SKSSQRKSPL SVSLKTQQHP RAYPISSSWG

51 LKKSGMTLIG SELRPLKVMS SVSTACMLHG ASSRPATARK SSGLSGTVRI

101 PGDKSISHRS FMFGGLASGE TRITGLLEGE DVINTGKAMQ AMGARIRKEG

151 DTWIIDGVGN GLLAPEAPL DFGNAATGCR LTMGLVGVYD FDSTFIGDAS

201 LTKRPMGRVL NPLREMGVQV KSEDGDRLPV TLRGPKTPTP ITYRVPMASA

251 QVKSAVLLAG LNTPGITTVI EPIMTRDHTE KMLQGFGANL TVETDADGVR

301 TIRLEGRGKL TGQVIDVPGD PSSTAFPLVA ALLVPGSDVT ILNVLMNPTR

351 TGLILTLQEM GADIEVINPR LAGGEDVADL RVRSSTLKGV TVPEDRAPSM

401 IDEYPILAVA AAFAEGATVM NGLEELRVKE SDRLSAVANG LKLNGVDCDE

451 GETSLVVRGR PDGKGLGNAS GAAVATHLDH RIAMSFLVMG LVSENPVTVD

501 DATMIATSFP EFMDLMAGLG AKIELSDTKA A

Hình 3 Trình tự axit amin của protein CP4 EPSPS

Trình t ự protein CTP2 là trình tự gạch chân (từ axit amin 1 – 76) Axit amin đánh dấu

đậm, gạch chân là axit amin Leucin (trong protein CP4 EPSPS) được thay thế bằng

axit amin Proline (trong protein CP4 EPSPS L214P)

Hình 4 Quy trình chuyển gen tạo sự kiện NK603

Nhân dòng plasmid vector PVZMGT32 vào vi khuẩn E.Coli

Sử dụng enzyme MluI cắt và loại bỏ gốc tái bản (ori) và trình tự

marker kháng kháng thể (nptII) để thu nhận đoạn plasmid

PV-Biến nạp đoạn PV-ZMGT32L vào mô ngô nuôi cấy trong điều kiện

in vitro bằng phương pháp bắn đạn gia tốc (particle acceleration)

Chọn lọc các thể biến nạp có mang gen cp4 epsps trên môi trường nuôi

cấy nhân tạo có bổ sung glyphosate

Tái sinh cây ngô mang gen cp4 epsps

Đánh giá khả năng kháng glyphosate

của các cây ngô mang gen cp4 epsps

Tạo dòng thuần và dòng lai bằng phương pháp lai truyền thống

Đánh giá các đặc tính nông-sinh học của cây ngô biến đổi gen

trên đồng ruộng

Sự kiện NK603

3 Sinh vật nhận gen: Cây ngô (Zea mays L.)

Sinh vật nhận gen: Cây ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ 3 trên thế giới (sau lúa mỳ và lúa gạo) và đứng thứ 2 ở Việt Nam (sau lúa) Ngô được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, với tổng sản lượng hàng năm lớn hơn bất kỳ loại ngũ cốc nào khác Hoa Kỳ sản xuất khoảng 40% tổng sản lượng ngô trên thế giới, sau Hoa Kỳ là các nước Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp và Argentina Chỉ tính riêng trong năm 2009, tổng diện tích trồng ngô toàn cầu là hơn 159 triệu ha, đạt sản lượng

817 triệu tấn, nhiều hơn gạo (678 triệu tấn) hoặc lúa mì (682 triệu tấn) (FAO, 2009)

Ngô là loại cây lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới Bên cạnh giá trị lương thực, cây ngô còn là cây thức ăn gia súc quan trọng 70% chất tinh trong thức ăn hỗn hợp là từ ngô Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua rất tốt cho chăn nuôi gia súc lớn, đặc biệt là bò sữa Những năm gần đây cây ngô còn là loại cây thực phẩm được ưa chuộng Người ta dùng bắp ngô bao tử để làm rau cao cấp Đây là loại rau có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và không có dư lượng các chất bảo vệ thực vật Các loại ngô nếp, ngô đường được dùng để luộc, nướng hoặc đóng hộp làm đồ hộp Ngoài

ra, ngô còn là nguyên liệu của nhà máy sản xuất rượu, cồn Ngô đã được dùng để sản xuất ra khoảng 670 mặt hàng khác nhau trong các ngành công nghiệp lương thực, thực phẩm, dược và công nghiệp nhẹ

Cho đến nay, chưa có tài liệu nào công bố về ảnh hưởng của ngô đối với sức khỏe con người, động vật và thực vật: Ngô không mang tính độc hoặc sản sinh ra các chất mang tính độc hoặc các yếu tố chống dinh dưỡng (anti-nutritions) (Watson, 1982; White và Pollak, 1995) Ngô cũng không phải là thực phẩm gây dị ứng đối với con người mặc dù đã có vài báo cáo về dị ứng khi sử dụng ngô làm thức ăn (Pastorello và cộng sự, 2000; OECD, 2002; Pasini và cộng sự, 2002) Đã có hai trường hợp báo cáo

về việc dị ứng ở Hoa Kỳ do việc ăn ngô (Pauls và Cross, 1998; Tanaka và cộng sự, 2001) Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu độc lập trước đó của Jones và cộng sự (1995) kết luận những người bị dị ứng với ngô cũng bị dị ứng với các loại phấn hoa, với hạt ngũ cốc khi sử dụng làm thực phẩm và với loại gia vị Điều này cho thấy nguy cơ gây ngộ độc hoặc gây dị ứng cho con người khi sử dụng ngô làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là không có hoặc là rất thấp (Pasterollo, 2000; Pasini và cộng sự, 2002)

Giống ngô nền được sử dụng để chuyển gen tạo sự kiện MON 89034 là giống ngô lai C919 Giống ngô lai C919, thương hiệu Dekalb đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triên nông thôn công nhận là giống chính thức năm 1999 và hiện đang trồng rộng rãi tại nhiều vùng sinh thái của Việt Nam Giống ngô lai C919 là giống ngắn ngày (thời gian sinh trưởng trung bình từ 90 - 95 ngày trong Vụ Đông), trồng được 3 vụ/năm, thích nghi rộng, phù hợp với nhiều loại đất khác nhau, năng suất cao và ổn định từ 10-

12 tấn/ha, chi phí thấp, lợi nhuận cao, chống chịu được hạn cục bộ và nhiều bệnh như rỉ sắt, cháy lá , chịu trồng dày (mật độ có thể lên tới 83.000 cây/ha)

4 Giống cây trồng chuyển gen (tính trạng, đặc điểm, biểu hiện tính trạng của gen, sự

khác bi ệt của giống chuyển gen, lịch sử cấp phép sử dụng)

4.1 Tính trạng và đặc điểm nhận dạng của NK603

Sự kiện NK603 chứa gen cp4 epsps tổng hợp nên protein CP4 EPSPS làm tăng

khả năng kháng glyphosate (N-phosphonomethyl-glycine) - một thành phần có hoạt tính trong thuốc trừ cỏ Roundup

Ở cây ngô thông thường, khi phun thuốc trừ cỏ Roundup, chất glyphosate gây chết cây ngô thông qua việc ức chế hoạt động của enzyme EPSPS nội sinh Như đã mô

tả ở trên, enzyme EPSPS tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các axít amin thơm như tyrosine, phenylalanine và tryptophan ở các loài thực vật và vi sinh vật (Siehl 1997, Duke 1988) Kết quả là cây ngô không có khả năng tổng hợp những hợp chất thơm cần thiết (Amrhein, 1980; Padgette và cộng sự, 1996) và do đó các quá trình sinh tổng hợp các auxins, các hợp chất kháng bệnh, phytoalexins, axit folic, tiền chất của lignin, flavonoids, plastoquinone, và hàng loạt các hợp chất phenol và alkaloid khác đều bị kìm hãm (Bentley, 1990)

Ngược lại, khi phun thuốc Roundup lên ngô NK603 thì do NK603 mang gen cp4 epsps có đặc tính chống chịu với glyphosate trong thành phần thuốc trừ cỏ nên quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp các axit amin thơm và các hợp chất cần thiết khác diễn ra bình thường (OECD, 1999; Padgette và cộng sự, 1996) Quá trình sinh tổng hợp axit amin thơm không diễn ra ở người và động vật, điều này giải thích đặc tính hoạt động chọn lọc trên thực vật của mà không gây độc đến động vật của CP4 EPSPS

Sự kiện NK603 kháng thuốc trừ cỏ glyphosate có các đặc điểm kiểu hình và đặc tính nông sinh học tương tự giống ngô sử dụng làm giống nền C919 Đặc điểm nhận dạng sự khác nhau của NK603 so với giống ngô nền C919 và các giống thông thường khác là ở tính trạng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate trên đồng ruộng

4.2 Sự biểu hiện tính trạng của gen đưa vào

Hàm l ượng protein CP4 EPSPS

Các mức biểu hiện của các protein CP4 EPSPS được xác định trong các mô của NK603 từ khảo nghiệm đồng ruộng trong năm 2002 ở Mỹ tại Quận Benton (Iowa), Boone County (Missouri), Fayette County (Ohio) và York County (Nebraska) Tại mỗi điểm, thí nghiệm được trồng theo thiết kế khối ngẫu nhiên hoàn toàn với ba lần nhắc lại với NK603 và đối chứng không chuyển gen Các mẫu của mô lá, rễ thu thập trong suốt

mùa vụ, hạt phấn, thân, rễ và hạt được thu thập từ mỗi lần nhắc lại ở tất cả điểm thí nghiệm Trên cơ sở trọng lượng khô (dwt), các mức biểu hiện trung bình của CP4 EPSPS tại 4 điểm trồng đạt 300-430 µg/g dwt trong mẫu mô lá và 76-160 µg/g dwt trong mẫu mô rễ (thu tại bốn thời điểm trong vụ) Các mức biểu hiện trung bình của CP4 EPSPS ở 4 điểm khảo nghiệm đồng ruộng trong các mẫu mô thân, rễ, hạt phấn và hạt đạt tương ứng là 100, 140, 650, và 14 µg/g dwt Các mức biểu hiện trong mẫu mô thân và hạt được báo cáo ở trên là nằm trong đánh giá chung với các mức biểu hiện của EPSPS CP4 được đo trong các mẫu thân và hạt thu thập từ sáu ruộng không lặp lại và

từ hai khảo nghiệm đồng ruộng được lặp lại tiến hành vào năm 1998 tại Mỹ như trong báo cáo trước đây của Monsanto Trong thử nghiệm từ năm 1998, mức độ biểu hiện của CP4 EPSPS đạt từ 18,0 - 31,2 µg/g trọng lượng tươi trong thân và 6,9 - 15,6 µg/g trọng lượng tươi trong hạt

4.3 Thông tin về sự khác biệt của sự kiện NK603 so với sinh vật nhận

Các số liệu quan sát từ các đánh giá so sánh trên đồng ruộng khảo nghiệm đối với dòng ngô NK603 qua nhiều năm ở nhiều địa điểm khác nhau và kinh nghiệm từ

thực tiến trồng trọt tại châu Mỹ xác nhận rằng không có sự khác biệt giữa NK603 và ngô truyền thống về các chỉ tiêu sau :

• Đặc tính sinh trưởng, phát triển và khả năng mẫn cảm với sâu bệnh hại ngô;

• Mức độ ảnh hưởng đến các loài loài chân khớp (bắt mồi ăn thịt, ký sinh, thiên địch) và các loài sinh vật đất (Collembola) cũng như đối với các loài sinh vật không chủ đích khác;

• Ảnh hưởng đến môi trường và đến đa dạng sinh học;

• Nguy cơ hình thành cỏ dại hoặc làm thay đổi phương thức canh tác;

• Thành phần các hợp chất có trong hạt, trong thân và giá trị dinh dưỡng của ngô NK603 so với ngô truyền thống;

Với các chỉ tiêu trên, NK603 được xác nhận là không tiểm ẩn nguy cơ gây tác động bất lợi đối với môi trường và đa dạng sinh học, an toàn và đầy đủ dinh dưỡng tương tự như các giống ngô truyền thống khác

4.4 Phương pháp, công nghệ phát hiện sự kiện NK603

Có thể sử dụng các phương pháp như test thử nhanh (Quickstick), PCR, ELISA, Southern, RT-PCR để phát hiện ra ngô NK603

4.5 Thông tin về lịch sử cấp phép và sử dụng sự kiện NK603 trên thế giới

Từ năm 2000 đến nay, sự kiện NK603 đã được đánh giá là an toàn và được phê chuẩn để sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và trồng trong sản xuất tại 22 quốc gia trên thế giới (bảng 2)

5 Mô tả các nguy cơ, khả năng xảy ra nguy cơ để xác định rủi ro có thể xảy ra khi phóng thích sự kiện NK603

Những mối quan ngại về rủi ro của sự kiện NK603 cũng được xem xét như bất

cứ loại cây trồng chuyển gen khác khi phóng thích vào môi trường sinh thái Việt Nam, bao gồm các yếu tố sau:

- Khả năng ảnh hưởng tới các loài sinh vật không chủ đích; sự xuất hiện các loài mới hoặc thay đổi các mắt xích trong chuỗi thức ăn;

- Nguy cơ lan tràn hoặc xâm lấn của sinh vật biến đổi gen gây ảnh hưởng tới môi trường và đa dạng sinh học Việt Nam;

- Nguy cơ trôi gen sang các sinh vật khác và các hậu quả có thể xảy ra;

Trên cơ sở phân tích logic và cơ sở khoa học về khả năng lai chéo với các loài

họ hàng hoang dại của ngô chuyển gen khảo nghiệm là không có vì không có sự tồn tại của họ hàng hoang dại tại các vùng sinh thái của Việt Nam; khả năng chuyển gen ngang

từ ngô sang vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên là khó có thể xảy ra, kết luận sự kiện NK603 không tiềm ẩn nguy cơ trôi gen sang các loài sinh vật khác hoặc gây ảnh hưởng bất lợi khác đến môi trường và đa dạng sinh học Vì vậy, trong điều kiện khảo nghiệm đánh giá rủi ro đối với môi trường và đa dạng sinh học tại Việt Nam, chúng tôi xem xét đánh giá nguy cơ lan tràn, xâm lấn và nguy cơ ảnh hưởng tới các loài sinh vật không chủ đích liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự kiện NK603 trong chuỗi thức ăn

Bảng 2 Hiện trạng phê chuẩn sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và

Năm cho phép phóng thích vào môi trường

PHẦN III XÁC ĐỊNH VẤN ĐỀ KHẢO NGHIỆM TẠI VIỆT NAM

1 Kết quả đánh giá rủi ro đối với môi trường của sự kiện NK603 trên thế giới

1.1 Đánh giá tác động của sự kiện NK603 đối với các loài sinh vật không chủ đích

Với công thức đánh giá rủi ro: Rủi ro (risk) = mối nguy hại (hazard) x

Ngưỡng phơi nhiễm (exposure), có thể thấy các mối nguy hại và điều kiện phơi

nhiễm với mối nguy hại đó là hai điều kiện cần và đủ để rủi ro có thể xảy ra Điều này

có nghĩa là, nếu có mối nguy hại nhưng không có điều kiện phơi nhiễm với mối nguy

hại đó, hoặc có cơ hội tiếp xúc với đối tượng nào đó không có mối nguy hại thì rủi ro

không thể xảy ra

Tính đến cuối năm 2008, đã có tổng số trên 360 bài báo nghiên cứu về tác

động của cây biến đổi gen đến động vật không xương sống, mà phần lớn là các động

vật chân khớp Kết quả của các nghiên cứu này thu được trong quá trình thực hiện ở

trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài đồng ruộng Các nghiên cứu đã tập trung chủ

yếu vào các sinh vật không chủ đích như các loài sâu hại không chủ đích, các loài

thiên địch, ký sinh, thụ phấm và loài bọ đuôi bật Collembola

Kết quả đánh giá trên đồng ruộng về ảnh hưởng của protein CP4 EPSPS đối với các loài sinh vật không chủ đích đã khẳng định về mức độ an toàn của protein này đối với sự đa dạng quần thể các loài côn trùng (Janski và cộng sự, 2003; Jackson và Pitre, 2004; Yoshimura và cộng sự, 2004; Bitzer và cộng sự, 2002; Buckelew và cộng sự, 2000; Mc Pherson và cộng sự, 2003; Rosca, 2004), đối với quần thể vi sinh vật (Siciliano và Germida, 1999; Dunfield và Germida, 2003, 2004; Kim và cộng sự, 2004) cũng như đối với quần thể bọ đuôi bật (Michigan Farm News, 2002)

Hơn nữa, kết quả phân tích trong phòng thí nghiệm cũng chứng minh rằng protein CP4 EPSPS không gây ảnh hưởng bất lợi nào đến các loài côn trùng thụ phấn (ong mật), bọ đuôi bật Collembola, các loài thiên địch bộ cánh màng và các loài sâu hại (Boogird và cộng sự, 2003; Jamornman và cộng sự, 2003; Goldstein, 2003; Michigan Farm News, 2002; Morjan và Pedigo, 2002; Harvey và cộng sự, 2003)

Việc đánh giá ảnh hưởng đối của ngô chuyển gen NK603 với NTOs được tập trung vào hàm lượng của protein CP4 EPSPS cũng như cơ chế tác động của protein này trong cây

Mức độ an toàn của sinh vật cho gen: Chủng vi khuẩn Agrobacterium CP4

Enzyme 5-enolpyruvlyshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) thuộc nhóm enzyme có mặt trong cây trồng và các loài vi sinh vật Cho đến nay, các protein thuộc nhóm EPSPS của cả thực vật và vi sinh vật đã được phân lập và xác định chức năng rõ ràng, theo đó cấu trúc và chức năng của các protein này là tương tự nhau (Harrison và

cộng sự, 1996; Haslam, 1993; Klee và cộng sự, 1987; Schonbrunn và cộng sự, 2001; Steinrucken và Amrhein, 1980) Các protein EPSPS tham gia vào con đường shikimate, sinh tổng hợp các axit amin thơm trong các loài thực vật và vi sinh vật (Levin và Sprinson, 1964; Harrison và cộng sự, 1996) Các protein EPSPS có mặt trong các loại thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật và vi sinh vật Các loài động vật, cá, chim, bò sát và côn trùng không tồn tại con đường shikimate và có mặt protein EPSPS (Alibhai và Stallings, 2001) Phân tích không gian 3 chiều và phân tích chức năng của protein CP4 EPSPS cho thấy protein CP4 EPSPS thuộc nhóm protein EPSPS,

có cấu trúc và chức năng tương tự các protein EPSPS có nguồn gốc thực vật và vi sinh vật khác, ngoại trừ khả năng chống chịu cao với glyphosate (Levin và Sprinson, 1964; Harrison và cộng sự, 1996)

Gen cp4epsps mã hóa protein CP4 EPSPS có trọng lượng 47.6 kDa gồm 455 axit

amin (Padgette và cộng sự, 1996) Protein CP4 EPSPS có trình tự và chức năng tương

tự EPSPS nội sinh trong các loài thực vật, chỉ khác nhau là ở mức độ chống chịu với glyphosate, thành phần có hoạt tính trong thuốc trử cỏ Roundup (Padgette và cộng sự, 1996) Ở cây ngô không chuyển gen, khi phun thuốc trừ cỏ, chất glyphosate trong thuốc kết hợp với enzyme EPSPS nội sinh tổng hợp dẫn đến kìm hãm quá trình sinh tổng hợp các axit amin thơm (Steinrücken và Amrhein, 1980; Haslam, 1993) Ở sự kiện NK603, quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp các axit amin thơm và các hợp chất cần thiết khác diễn ra bình thường do sự có mặt của protein CP4 EPSPS với khả năng kháng glyphosate cao (Padgette và cộng sự, 1996)

Protein CP4 EPSPS sản sinh trong sự kiện NK603 có trình tự hoàn toàn tương đồng với các protein CP4 EPSPS trong các sản phẩm cây trồng Roundup Ready® và

protein CP4 EPSPS phân lập từ chủng vi khuẩn Agrobacterium CP4 này trước đó đã

được đánh giá an toàn trong các sản phẩm cây trồng của Monsanto đăng ký với Bộ Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) như đậu tương Roundup Ready (40-3-2), đậu tương Roundup Ready 2 Yield (MON 89788), cải dầu Roundup Ready (GT73), củ cải đường Roundup Ready (H7-1) và bông Roundup Ready Flex (MON 88913) Hơn nữa, Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (U.S EPA) cũng đã ban hành quy chế miễn trừ đánh giá tồn dư của CP4 EPSPS và vật liệu di truyền của chúng trong các loại cây trồng (U.S EPA, 1996)

Protein CP4 EPSPS chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong tổng lượng protein trong hạt: Trong số các mô của cây ngô, hạt là nguồn thức ăn được sử dụng nhiều nhất nên về mặt lý thuyết, hạt là nguồn có nguy cơ gây dị ứng lớn nhất Tuy nhiên, kết quả khảo nghiệm cho thấy giá trị trung bình của protein CP4 EPSPS trong hạt là rất thấp, chiếm tỷ lệ

0.01% tổng số protein trong hạt ngô NK603 Vì vậy, có thể kết luận rằng protein CP4 EPSPS chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong tổng lượng protein có trong hạt ngô NK603

Hơn nữa, protein CP4 EPSPS thuộc nhóm protein EPSPS tồn tại trong tự nhiên

và là một enzyme tham gia vào chu trình shikimate nhằm sinh tổng hợp axit amin thơm trong thực vật và vi sinh vật (Levin và Sprinson, 1964; Harrison và cộng sự, 1996), và chúng cũng có mặt trong thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật và vi sinh vật (Schulz và cộng sự, 1985)

Vì vậy, có thể kết luận hầu hết các loại thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc thực vật hay vi sinh vật đều có chứa protein EPSPS Mặc dù vậy, việc đánh giá tương tác giữa ngô biến đổi gen NK603 với các loài sinh vật vẫn được triển khai đánh giá trên điều kiện đồng ruộng ở nhiều nước trên thế giới như Hoa Kỳ, Canada, Úc, Nhật Bản, Brazil và các quốc gia khác đã khẳng định sự kiện NK603 không gây tác động bất lợi tới các sinh vật không chủ đích (US EPA,1997; USDA, 2000; CFIA, 2002; Australia New Zealand Food Authority, 2002; CTNBio, 2004; MoE, Japan, 2001; Philippines Department of Agriculture, 2005)

Kết quả khảo nghiệm hạn chế tại Việt Nam khẳng định lại tính an toàn của sự kiện NK603 đã được công bố trước đó, rằng cây trồng kháng glyphosate không gây ảnh hưởng đến các loài vi sinh vật đất Ví dụ, Gomez và Sagardoy (1985) không tìm thấy ảnh hưởng của glyphosate trên vi sinh vật đất tại Argentina ở liều lượng lớn hơn hai lần mức khuyến cáo sử dụng của thuốc diệt cỏ

Haney và cộng sự (2000, 2002) cho thấy rằng glyphosate có khả năng làm tăng cường hoạt động của vi khuẩn Việc gia tăng tỷ lệ khoáng hoá cacbon xảy ra ngay sau ngày đầu tiên có sự tham gia của glyphosate, và sự gia tăng này kéo dài đến ngày thứ

14 Glyphosate xuất hiện và sau đó nhanh chóng bị phân hủy bởi vi sinh vật đất, bất kể

đó là loại đất gì, với thành phần chất hữu cơ ra sao Liphadzi và cộng sự (2005) thấy không có sự khác biệt về ảnh hưởng của ngô/đậu tượng kháng glyphosate và ngô/đậu tương truyền thống đến mật độ tuyến trùng, sinh khối (biomass) vi sinh vật đất, hoặc thành phần chất tiết ở hệ rễ của 2 loại cây trồng này Sau đó, Dunfield và Germida (2001) cũng kết luận rằng mặc dù ở năm đầu tien có tìm thấy sự khác biệt trong các cộng đồng vi khuẩn vùng rễ của các giống cải dầu kháng glyphosate so với giống truyền thống nhưng sự thay đổi này chỉ mang tính cục bộ và không kéo dài sang mùa

vụ tiếp theo (Dunfield và Germida, 2003)

Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu độc lập từ các nhóm nghiên cứu khác nhau cho thấy cây trồng chuyển gen glyphosate không gây bất kỳ ảnh hưởng bất lợi nào đối với các loài nấm có ích trong đất(Araújo và cộng sự, 2003; Busse và cộng sự, 2001)

Philippot Laurent và cộng sự (2006) đã tiến hành thí nghiệm với 3 giống ngô biến đổi gen là giống ngô kháng glyphosate NK603 xử lý với glyphosate (NK603-Gl), hoặc NK603 xử lý với atrazine (NK603-At), và 2 giống ngô kháng sâu Bt 11 và Bt176 xử lý atrazine (BT11-At và BT176-At) Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá ảnh hưởng của các giống ngô biến đổi gen này tới cấu trúc di truyền và mức độ hoạt động của quần thể vi sinh vật đất có chức năng làm giảm hàm lượng nitơ (nitrate-reducers) Kết quả cho thấy, có sự thay đổi về cấu trúc di truyền và mức độ hoạt động của quần thể vi khuẩn nitrat-reducers trong vùng rễ đều bị thay đổi trong tất cả các giống ngô thí nghiệm so với đối chứng Tuy nhiên, sự thay đổi đó không làm ảnh hưởng đến chức năng của quần thể vi sinh vật này Hơn nữa, các tác giả còn kết luận, yếu tố khí hậu mang tính chất quyết định đến sự thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật chứ không phải

là do bản chất giống (Philippot Laurent và cộng sự, 2006)

Tóm lại, sau hơn 10 năm sử dụng cây trồng mang gen kháng glyphosate ở các mùa vụ canh tác khác nhau, tại các vùng sinh thái khác nhau và trên các loại đất trồng khác nhau, không có một bằng chứng nào cho thấy có sự khác biệt giữa cây trồng mang gen kháng glyphosate so với cây trồng truyển thống về sự thay đổi về cấu trúc di truyền, sự đa dạng và chức năng của các loại vi sinh vật đất (Motavalli và cộng sự, 2004) Dunfield và Germida (2004) cũng khuyến cáo rằng phương pháp canh tác, thời điểm thu thập số liệu, sự luân canh cây trồng, phương thức làm đất, việc sử dụng một

số chất trừ cỏ khác nhau và các phương pháp phân tích có thể ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu

1.2 Đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dai, dịch hại, lan tràn hoặc xâm lấn của sự kiện NK603 gây ảnh hưởng tới môi trường và đa dạng sinh học thông qua các đặc tính kiểu hình và nông học trong điều kiện đồng ruộng

Tại Mỹ cũng như nhiều nước trên thế giới cây ngô không có trong danh mục các loài cỏ chính hoặc loài cỏ độc (Crockett, 1977; Holm và cộng sự, 1979; Muenscher, 1980) Ngô được trồng ở nhiều nơi trên thế giới và chưa có bất kỳ một báo cáo nào về việc ngô có thể trở thành cỏ dại nghiêm trọng Ngô trồng không thể tồn tại như cỏ bởi quá trình chọn lọc trong lịch sử tiến hóa của cây ngô Trong quá trình thuần hoá cây ngô, các tính trạng liên quan đến tính cỏ dại như sự ngủ nghỉ của hạt, cơ chế phát tán, hay khả năng hình thành quần thể sinh sản ngoài canh tác đã không được lựa chọn Ví

dụ, bắp ngô được bao bằng các lớp vỏ dày do đó sự phát tán hạt ra bên ngoài là rất hãn hữu Ngay cả khi các hạt ngô bị phát tán ra ruộng hay trên đường vận chuyển đến kho hay nơi chế biến, cây ngô mọc tự nhiên không tìm thấy tại các khu vực bị phát tán Cây ngô trồng không thể tồn tại nếu thiếu sự hỗ trợ của con người và không có khả năng tồn tại như cỏ (Baker, 1965; Keeler, 1989; Galinat, 1988) Mặc dù hạt ngô có thể tồn tại

qua mùa đông trong cơ cấu luân canh với đậu tương, nhưng ngô vẫn không thể tồn tại như cỏ dại do có thể sử dụng các biện pháp cơ học và hoá học để kiểm soát vấn đề này Kết quả đánh giá từ 17 địa điểm khảo nghiệm ở Hoa Kỳ trong năm 1999 cho thấy không có thay đổi về đặc tính ngủ nghỉ của hạt ngô NK603, không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa p ≤ 0.05 về số cây ban đầu, số cây thu hoạch, thời gian 50% cây tung phấn, thời gian 50% cây phun râu, chiều cao đóng bắp, bắp rụng, dinh dưỡng hạt, trọng lượng hạt và năng suất (bảng 3) (Monsanto, 2000)

Bảng 3 Đặc tính kiểu hình và nông học của sự kiện NK603 so với đối chứng

(số liệu thu thập tại Hoa Kỳ năm 1999)

1.3 Đánh giá nguy cơ trôi gen từ sự kiện MON 89034 sang các sinh vật khác và các hậu quả có thể xảy ra

Phát tán gen, hay còn được gọi theo cách khác là lai cùng giống hay thụ phấn chéo là một quá trình sinh học tự nhiên xảy ra trong hầu hết các loài cây trồng trong đó

có cây ngô Phát tán gen qua yếu tố trung gian - hạt phấn - là khái niệm sử dụng để mô

tả sự di chuyển của gen thực vật từ cây này sang cây khác thông qua hạt phấn Tỷ lệ phát tán gen qua hạt phấn phụ thuộc vào các yếu tố sinh học và phi sinh học như đặc tính sinh học của cây, đặc tính sinh học của hạt phấn, đặc tính hình thái của cây, sự trùng lặp về thời gian ra hoa, nguồn hạt phấn và điều kiện phi sinh học khác như nhiệt

P(<0.05)

Thời gian 50% cây tung phần 12 62.1 61.7 0.4 0.373

Thời gian 50% cây phun râu 12 61.8 60.2 1.6 0.048

Phát tán gen dọc – là sự truyền thông tin di truyền tới các loài mà ngô có thể lai được

Đặc điểm hình thái của ngô tạo điều kiện cho sự thụ phấn chéo, vì vậy khả năng phát tán gen thông qua hạt phấn trong các loài này là rất cao Các nhà nghiên cứu cũng nhận ra rằng: 1) Số lượng gen phát tán có thể xảy ra cao do thụ phấn chéo; 2) Phần trăm gen phát tán giao động bởi quần thể, con lai hay dòng thuần; 3) Mức độ phát tán gen giảm cùng với việc tăng khoảng cách giữa cây tạo ra nguồn phấn và cây nhận hạt phấn; 4) Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến mức độ phát tán gen; 5) Hạt phấn ngô có thể tồn tại trong thời gian ngắn ở điều kiện đồng ruộng; 6) Cây ngô tạo ra nhiều hạt phấn trong một thời gian ngắn; 7) Không có loại côn trùng thụ phấn chuyên tính trên cây ngô

Để phát tán gen xảy ra thông qua giao phấn bình thường, cần phải có các điều kiện sau: 1) Bố mẹ phải tương thích về mặt sinh sản; 2) Phải có sự tương đồng về đặc điểm nông học và 3) Có các yếu tố thuận lợi (như gió hay côn trùng) để đảm bảo khả năng di chuyển hạt phấn giữa hai bố mẹ

Nhiều nghiên cứu về phát tán gen qua hạt phấn ở ngô đã được tiến hành Kết quả thu được khác nhau phụ thuộc vào thiết kế thí nghiệm, điều kiện môi trường và phương pháp xác định Nhìn chung, phần trăm gen phát tán giảm khi khoảng cách từ ruộng nguồn phấn tăng lên Điều này đã được công bố trước đây rằng tỷ lệ thụ phấn chéo ở ngô thấp hơn 1% ở khoảng cách >200m (Jemison và Vayda, 2000; Luna và cộng sự, 2001) Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ thụ phấn chéo ở ngô giảm xuống dưới 0.9% sau 15m (Bannert, 2006)

Như chúng ta đã biết ngô và loại cây chỉ sống một mùa là teosinte (Zea mays subsp mexicana Schrad.) có sự tương thích về mặt di truyền, thụ phấn nhờ gió và được

tìm thấy ở Mexico và Guatemala (Wilkes, 1972), có thể lai tự do trong cự ly gần với nhau Ngô dễ dàng lai với teosinte; tuy nhiên, teosinte không mọc ở các nơi khác và không mọc ở Việt Nam Sự khác nhau về các yếu tố như thời gian ra hoa, sự phân cách

về địa lý và các yếu tố phát triển làm cho sự lai chéo tự nhiên giữa ngô và teosinte không thể xảy ra tại các nơi khác cũng như tại Việt Nam Tương phản với ngô và

teosinte về việc lai dễ dàng thì khả năng ngô lai với Tripsacum là rất khó xảy ra Ngoài

ra, thế hệ con cháu của các cặp lai này có tỷ lệ bất dục rất lớn (Galinat, 1988; Mangelsdorf, 1974; Russell và Hallauer, 1980) Chưa có trường hợp nào về phát tán gen giữa ngô và các loài hoang dại được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới

Khi xem xét vấn đề phát tán gen qua thụ phấn chéo với các loài có quan hệ họ hàng với ngô, ở các nước như Nhật Bản, Úc, Canada nơi không có các loài họ hàng

phân tích logic và cơ sở khoa học về khả năng thụ phấn chéo không xảy ra nên rủi ro tiềm ẩn của việc phát tán gen ngang từ ngô biến đổi gen là không có

Phát tán gen ngang – là sự di chuyển thông tin di truyền đến các loài mà ngô không thể giao phấn được

Những số liệu khoa học hiện nay cho thấy gen chuyển từ cây chuyển gen sang vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên là rất khó Gen từ sự kiện NK603 khó có thể chuyển sang hệ gen của vi khuẩn trong môi trường Khả năng chuyển gen ngang là khó có thể xảy ra, không có tác động nào được tìm thấy đối với sức khoẻ con người và động vật hay môi trường Không có sự xuất hiện của tính trạng mới được biểu hiện trong các quần thể vi sinh vật Tương tự, khả năng chuyển gen từ cây này sang cây khác là rất thấp (EFSA, 2004; EFSA, 2007)

Mặc dù đây là trường hợp hiếm xảy ra, nhưng vấn đề này vẫn được xem xét nghiêm túc trong đánh giá an toàn đối với cây trồng biến đổi gen (OECD, 2000b) Điều đặc biệt quan tâm chính là các vi sinh vật trong đất Có giả thuyết cho rằng ADN tái tổ hợp từ cây biến đổi gen tạo thành một tổ hợp gen ngoài tế bào, cái mà tế bào vi khuẩn

có khả năng thẩm thấu ADN này và gắn kết vào trong hệ gen của chúng (de Vries & cộng sự, 2003) Hiện tượng chuyển gen tự nhiên này cần sự có mặt gần của các tế bào

vi khuẩn trong bầu rễ của cây chuyển gen, cũng như tính tương đồng của ADN tái tổ hợp so với trình tự ADN bên trong vi khuẩn (Smalla và cộng sự, 2000) Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào cho thấy điều này xảy ra trong đất

Trong đường tiêu hoá của người và vật nuôi, ADN có thể tồn tại trong một thời gian, đặc biệt ở ruột kết Tuy nhiên, sự phân huỷ đã bắt đầu trước khi ADN hay các vật liệu có chứa ADN vào đến phần sau của ruột non, ruột tịt, và ruột kết (Van den Eede và cộng sự, 2004) Các nghiên cứu trước đây cho thấy ADN tái tổ hợp phóng thích ra từ các tế bào bị vỡ bị phân huỷ ngay bởi các enzyme nucleaza trong thành phần nước bọt ( Alexander và cộng sự, 2007) Khi ADN tái tổ hợp vào tới đường tiêu hoá thì chúng đã

bị phân huỷ thành các mảnh nhỏ hơn so với chiều dài gen nguyên vẹn Các nghiên cứu cho thấy khả năng ADN tái tổ hợp được chuyển vào vi khuẩn trong ruột của người và động vật là rất thấp, điều này phụ thuộc vào sự tương đồng về trình tự gen (Nordgard

và cộng sự, 2007) Nghiên cứu tương tự trên côn trùng cũng đã khẳng định kết luận trên (Brinkmann và Tebbe 2007; Ray và cộng sự, 2008)

Trên cơ sở phân tích các nghiên cứu và kế thừa các kết quả của các công trình trước, việc triển khai khảo nghiệm hạn chế ngô biến đổi gen MON 89034 về vấn đề phát tán gen dọc ở các nước như Canada, Nhật Bản, Brazil, Úc Philippines sau này sử dụng cách tiếp cận dựa trên phân tích logic và cơ sở khoa học của vấn đề để đưa ra kết

luận về khả năng có xảy ra hay không phát tán gen dọc từ ngô biến đổi gen NK603 tới các loài sinh vật khác mà không có quan hệ họ hàng Vì vậy, trong khảo nghiệm đánh giá rủi ro, hầu hết sau này các nước không triển khai đánh giá vấn đề phát tán gen dọc

từ sự kiện NK603 sang các sinh vật khác không qua thụ phấn

1.4 Đánh giá nguy cơ khác gây ảnh hưởng tới môi trường và các hệ sinh thái ở Việt Nam

Sự tồn tại của protein CP4 EPSPS trong môi trường

Tùy thuộc vào đặc tính của đất, thời gian bán rã của glyphosate trong đất dao động từ 47 ngày đến 174 ngày (Vencill, 2002; Wauchope và cộng sự, 1992) Các nghiên cứu khác lại cho thấy chu kỳ bán rã của glyphosate trong đất thấp hơn rất nhiều,

ít hơn 30 ngày (Smith và Aubin 1993) và từ 11 – 17 ngày (Grunewald và cộng sự, 2001) Mamy và cộng sự (2005) cũng đã kết luận thời gian bán rã của glyphosate ngắn hơn các loại thuốc trừ cỏ khác như trifluralin, sulcotrione, metazachlor và metamitron

Chu kỳ bán rã của glyphosate trong nước dao động 1,5-3,5 ngày (Goldsborough

và Beck, 1989) Tuy nhiên, chu kỳ bán rã của glyphosate có thể sẽ dài hơn do việc sử dụng glyphosate trong thời gian dài

Giảm thiểu xói mòn đất và ô nhiễm môi trường đất

Sử dụng cây trồng chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ cho phép áp dụng hệ thống canh tác không làm đất hoặc làm đất tối thiểu ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là khu vực Nam Mỹ, góp phần quan trọng giảm thiểu xói mòn đất và cải thiện độ ẩm của đất

(Holland, 2004)

Glyphosate nhanh chóng bị hấp thụ và kết hợp chặt với hầu hết các loại đất (Goldsborough và Brown, 1993) Độ pH và hàm lượng chất hữu cơ không gây ảnh hưởng lớn đến sự gắn kết của glyphosate Hoạt tính của glyphosate được tăng cường ở

độ pH cao và hàm lượng cao của gốc phosphate vô cơ Khử hoạt tính của glyphosate thông qua hấp thụ có tầm quan trọng quan trọng Trong hầu hết các loại đất, khả năng thẩm thấu của glyphosate là rất hạn chế so với hầu hết các chất diệt cỏ khác, và glyphosate không dễ bay hơi (Franz và cộng sự, 1997; Getenga và Kengara, 2004)

Glyphosate không là chất gây ô nhiễm đất khi được sử dụng ở liều khuyến cáo

Nó được sử dụng để phun trên lá, do đó không gây ảnh hưởng trực tiếp đến việc ô nhiễm môi trường đất Glyphosate có thể được vận chuyển tới hệ thống rễ cây (thông qua mô lá) và tiết ra bởi các gốc rễ vào đất (Coupland và Caseley, 1979) Tuy nhiên, glyphosate nhanh chóng bị hấp thụ bới các phân tử đất và bị phân hủy bởi các vi sinh vật đất (Duke, 1988; Duke và cộng sự, 2003)

1.5 Đánh giá về những điều kiện của môi trường làm tăng cường hoặc hạn chế những điểm bất lợi của sự kiện NK603

Mối tương tác giữa NK603 – sinh vật khác, NK603 – tác nhân sinh học (sâu hại, bệnh hại), NK603 - tác nhân phi sinh học (khô hạn, gió, thiếu chất dinh dưỡng, độ ẩm v.v) đều được thu thập để đánh giá mối tương tác sinh thái của ngô NK603 so với cây ngô truyền thống

a S ự thay đổi trong mối tương tác NK603-sinh vật khác: Không có sự thay đổi trong

mối tương tác NK603 - sinh vật khác vì NK603 chỉ mang đặc tính kháng thuốc trừ cỏ

* Nguy c ơ ảnh hưởng đến sinh vật khác: Căn cứ vào đặc tính tồn tại trong tự

nhiên và lịch sử sử dụng an toàn của các protein EPSPS có thể kết luận dòng ngô NK603 với sự có mặt của CP4 EPSPS ngoài đặc tính kháng glyphosate không biểu hiện

sự ảnh hưởng nào đối với các loài sinh vật khác Kết luận này càng được khẳng định khi các cây trồng mang gen CP4 EPSPS như như đậu tương Roundup Ready (40-3-2), đậu tương Roundup Ready 2 Yield (MON 89788), cải dầu Roundup Ready (GT73), củ cải đương Roundup Ready (H7-1) và bông Roundup Ready Flex (MON 88913) đã chứng minh tính an toàn của protein này đối với các loài động vật bắt mồi ăn thịt và các loài thiên địch khác (Monsanto - Hồ sơ đăng ký cho EU, 2005)

* S ự thay đổi đến phương thức canh tác, quản lý và thu hoạch: Dòng ngô

NK603 không đòi hỏi kỹ thuật canh tác đặc biệt so với giống truyền thống Phương thức canh tác luân canh truyền thống được áp dụng với NK603 và các giống ngô khác NK603 không đòi hỏi biện pháp quản lý và thu hoạch đặc biệt Tất cả các biện pháp quản lý truyền thống (bón phân, tưới tiêu, quản lý cơ học, phun thuốc hóa học kiểm soát sâu bệnh và cỏ dại…) cũng được áp dụng với NK603, tương tự như với các giống ngô truyền thống khác Dòng NK603 được phát triển tạo điều kiện cho người nông dân

có thể sử dụng thuốc diệt cỏ Roundup với các ưu điểm về phổ tác dụng rộng, khả năng kiểm soát cỏ dại cao và chỉ cần phun thuốc 1 lần/vụ

b Sự thay đổi trong mối tương tác NK603-tác nhân phi sinh học:

NK603 tương tự như ngô truyền thống, ngoại trừ khả năng kháng glyphosate là kết quả biểu hiện của protein CP4 EPSPS trong cấu trúc di truyền của NK603 Protein CP4 EPSPS không có bất kỳ tương tác bất lợi nào với các tác nhân phi sinh học và được biết đến là protein thuộc nhóm EPSPS có lịch sử sử dụng an toàn lâu dài và được tổng hợp trong tất cả các loại tảo, vi sinh vật và thực vật bậc cao

Cục Kiểm dịch Thú y và Bảo vệ Thực vật, Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ đã đánh giá

và cấp giấy chứng nhận an toàn đối với môi trường cho sự kiện ngô chuyển gen NK603 (USDA/APHIS, 2000)

Ngoài Hoa Kỳ, sự kiện chuyển gen NK603 cũng được các quốc gia khác cấp phép

để phóng thích vào môi trường và trồng trọt, như tại Canada, Argentina, Brazil, Nhật Bản, Nam Phi, Philippines, … sau khi được đánh giá về tính an toàn của sự kiện ngô này đối với môi trường và đa dạng sinh học

2 Xác định yêu cầu khảo nghiệm tại Việt Nam:

Theo Nghị định số 69/2010/NĐ-CP của Chính phủ Việt Nam về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền và của sản phẩm của sinh vật biến đổi gen, nội dung khảo nghiệm sinh vật biến đổi gen đối với môi trường và đa dạng sinh học trong điều kiện Việt Nam bao gồm các nội dung chính sau đây:

- Nguy cơ trờ thành cỏ dại, dịch hại;

- Nguy cơ ảnh hưởng xấu đến sinh vật không chủ đích;

- Nguy cơ làm thay đổi bất lợi đến hệ sinh thái xung quanh;

- Các tác động bất lợi khác

Khi xem xét vấn đề phát tán gen trong khảo nghiệm tại Việt Nam cho thấy khả năng lai chéo với các loài họ hàng hoang dại của ngô chuyển gen khảo nghiệm tại Việt Nam là không có vì không có sự tồn tại của họ hàng hoang dại tại các vùng sinh thái của Việt Nam Hơn nữa, khả năng phát tán gen từ ngô chuyển gen NK603 tới các vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên là khó có thể xảy ra Vì vậy, trong khảo nghiệm đánh giá rủi ro, hầu hết sau này các nước không triển khai đánh giá vấn đề phát tán gen dọc

từ sự kiện NK603 sang các sinh vật khác không qua thụ phấn Trên cơ sở phân tích trên, tại Việt Nam chúng tôi không tiến hành các đánh giá các chỉ tiêu liên quan đến nguy cơ phát tán gen

Như vậy, qua phân tích điều kiện cụ thể tại Việt Nam và kế thừa các kết quả đánh giá rủi ro của ngô chuyển gen NK603 trên thế giới, các nội dung khảo nghiệm đánh giá rủi ro ngô chuyển gen NK603 đối với môi trường sẽ tập trung vào các nội dung sau đây:

- Đánh giá ảnh hưởng của NK603 tới các loài sinh vật không chủ đích thuộc nhóm sâu hại, nhóm bắt mồi ăn thịt, nhóm ký sinh;

- Đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hai, lan tràn hay xâm lấn ảnh hưởng đến môi trường của sự kiện ngô chuyển gen NK603;

- Đánh giá hiệu quả quản lý cỏ dại của ngô chuyển gen NK603

PHẦN IV MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO NGHIỆM SỰ KIỆN NK603

1 Khảo nghiệm hạn chế

1.1 Mục tiêu khảo nghiệm

Thu thập số liệu để khẳng định tính an toàn của ngô biến đổi gen NK603 và MON 89034 x NK603 đối với môi trường và đa dạng sinh học của Việt Nam, bao gồm:

- Đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hại hoặc làm thay đổi chế độ quản lý ảnh hưởng đến môi trường thông qua việc đánh giá các đặc tính hình thái, sinh trưởng, phát triển và mức độ mẫn cảm với các loại sâu hại, bệnh hại chủ yếu của ngô biến đổi gen NK603 và MON 89034 x NK603 so với đối chứng không chuyển gen C919

- Đánh giá nguy cơ ảnh hưởng bất lợi tới sinh vật không chủ đích thông qua việc đánh giá sự đa dạng về quần thể côn trùng không chủ đích trên ruộng ngô biến đổi gen NK603 và MON 89034 x NK603 so với đối chứng không chuyển gen C919

- Đánh giá nguy cơ ảnh hưởng tới hệ sinh vật đất thông qua việc đánh giá sự đa dạng của quần thể bọ đuôi bật (Collembola) trên ruộng khảo nghiệm ngô biến đổi gen NK603 và MON 89034xNK603 so với đối chứng không chuyển gen C919

1.2 Nội dung khảo nghiệm

- Đánh giá tính ổn định, tính thích ứng của ngô biến đổi gen NK603 và MON 89034xNK603 so với đối chứng không chuyển gen tại các vùng sinh thái của Việt Nam thông qua các chỉ tiêu sau:

• Thời gian trỗ cờ (ngày)

• Thời gian phun râu (ngày)

• Chiều cao cây (cm)

• Chiều cao đóng bắp (cm)

• Đổ gãy thân (cây)

• Đổ rễ (cây)

• Số bắp rụng (bắp)

• Các loại bệnh hại trên ngô

• Năng suất thu hoạch

- Đánh giá đa dạng quần thể côn trùng không chủ đích trên ruộng khảo nghiệm ngô chuyển gen NK603 và MON 89034xNK603 so với đối chứng không chuyển gen tại các vùng sinh thái của Việt Nam qua điều tra đồng ruộng;