Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm a h5n1 đương nhiễm tại việt nam ( Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN MẠNH KIÊN

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 ĐƯƠNG NHIỄM

TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án của mình, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các Thầy (Cô):

- PGS.TS Lê Thanh Hòa – Viện Công nghệ sinh học,

- PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung – Trường Đại học Y Hà Nội,

đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án này

- Thầy Chủ tịch Hội đồng và các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án, cùng các nhà khoa học trong cả nước, đã có nhiều ý kiến quí báu, giúp tôi hoàn thiện luận án của mình

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình, tôi nhận được sự giúp đỡ quí báu của Nhà trường, đơn vị công tác, tập thể, các nhà khoa học, gia đình và bè bạn Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Ban giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y 7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

- Thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, Trung tâm Gen và Protein – Trường Đại học Y Hà Nội, Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện giúp đỡ chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án

- Cơ quan thú y các vùng trong cả nước hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnh phẩm và thông tin dịch bệnh giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

- Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái

Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc-xin phòng chống”, trong khuôn khổ Nhiệm

vụ “Nghị định thư hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, đã giúp đỡ hỗ trợ tôi kinh phí thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

- Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân, đã hỗ trợ động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày …tháng 8 năm 2014

NGHIÊN CỨU SINH

Nguyễn Mạnh Kiên

LỜI CAM ĐOAN

- Tôi xin cam đoan số liệu trong luận án là một phần số liệu đề tài nghiên cứu Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan có tên: “Nghiên cứu virus cúm

A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc - xin phòng chống” Phần kết quả trong đề tài luận án này là thành quả nghiên cứu của tập thể

mà tôi là một thành viên chính Tôi đã đƣợc sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và toàn

bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu trên vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ

- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là hoàn toàn trung thực Một phần số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án đã đƣợc công bố trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành, với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Phần còn lại chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày ….tháng 08 năm 2014

TÁC GIẢ

Nguyễn Mạnh Kiên

i

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa Lời cảm ơn

Lời cam đoan

PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƯỜI 16 1.2.1 Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử 16 1.2.2 Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch

1 3 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 22 1.3.1 Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 22 1.3.2 Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1 26 1.4 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC

LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 28

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 33

2.1.3 Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 36 2.1.4 Môi trường sử dụng trong dòng hóa 36 2.1.5 Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose 36

ii

2.2.1 Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 38 2.2.2 Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu 38

2.2.4 Tinh sạch DNA sản phẩm PCR 44 2.2.5 Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose 45

2.2.8 Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen

2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 52

3.1 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA

CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 53 3.1.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus 53 3.1.2 Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA 54 3.1.3 Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA 60 3.2 KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID

CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM

A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI 61 3.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61 3.2.1.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61 3.2.1.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB2 65 3.2.2 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67 3.2.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67 3.2.2.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB1 69 3.2.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 69 3.2.2.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 73 3.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73 3.2.3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73 3.2.3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PA 77 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ

PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 79 3.3.1 Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 79

3.3.2 Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 82

3.3.3 Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 85

iii

4.1 VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 88 4.1.1 Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88 4.1.2 Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88 4.2 VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO

ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 89 4.2.1 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 89 4.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93 4.2.2.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93 4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 94 4.2.2.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 96

4.2.3 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA 97 4.3 VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1,

CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC

4.3.1 Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 99 4.3.2 Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 102 4.3.3 Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 103 4.4 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP

CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 105 4.3.1 Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học và

dịch tễ học lây truyền sang người của virus cúm A/H5N1 105 4.3.2 Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase 108

OIE Office International des Epizooties

RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các

1.2 Tóm tắt lịch sử các đại dịch và dịch cúm A ở người 17 1.3 Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2, PB1 và PA, giữa virus

cúm A ở gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 và virus cúm A ở người 19 1.4 Số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến nay 23 1.5 Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA, liên quan đến

độc lực và thích nghi lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người 29 2.1 Danh sách 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng trong nghiên cứu 33 2.2 Danh sách 19 chủng virus cúm A/H5N1 đại diện sử dụng trong so sánh

đặc tính di truyền các gen PB2, PB1 và PA 34 2.3 Danh sách 31 chủng virus cúm A/H5N1 bổ sung xây dựng cây phả hệ

nguồn gốc các gen PB2, PB1 và PA 35 2.4 Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận và giải

trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu 39 2.5 Thành phần và qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm

A/H5N1 từ RNA tổng số trong nghiên cứu 42

2.7 Chu t của kỹ thuật 6 biế

2.8 của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1

và PA từ cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 44 2.9 Chu của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA

từ cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 44 2.10 Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid

amino acid trong protein PB1 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 68 3.5 Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 của

25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 70 3.6 Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự

gen PB1-F2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 71 3.7 Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự

gen PA của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 75 3.8 Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự gen PA của 25 chủng virus

3.9 Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PA của 25

4.1 Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase,

liên quan độc lực gây bệnh, lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người 106 4.2 Nguồn gốc tiến hóa xác định theo genotype của các gen PB2, PB1 và PA

polymerase, trong hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu và

các chủng virus tham chiếu phân lập từ năm 2003 đến nay 109

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình/

1.1 Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A 4 1.2 Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A 5 1.3 Sơ đồ sắp sếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu các

ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A 9 1.4 Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA 12 1.5 Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗi

phân đoạn RNP hệ gen của virus cúm A 12 1.6 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ 13 1.7 Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền của các phân đoạn và hệ gen

1.8 Sơ đồ hình thành các virus cúm A gây đại dịch cúm ở người 21 1.9 ự hình thành và lưu hành xâm nhiễm gây bệnh ở

người củ /H5N1 ở châu Á từ 2003 – 2011 23 1.10 Sơ đồ ổ hợp hình thành các genotype Z, G và V củ

2.1 Sơ đồ qui trình tổng quát nghiên cứu các gen PB2, PB1 và PA

polymerase của virus cúm A/H5N1 37 2.2 Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực hiện kỹ thuật PCR và giải

trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 41 2.3 Sơ đồ nguyên lí của kỹ thuật PCR 41 2.4 Sơ đồ cấu trúc của vector pCR®

2.1TOPO (Invitrogen) 47 3.1 Kết quả điện di kiểm tra DNA một phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1

của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 53 3.2 Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm

A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 54 3.3 Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm

A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 55 3.4 Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cúm

A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 56 3.5 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 57

viii

Hình/

3.6 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 58 3.7 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 59 3.8 Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự protein PB1-F2 của 25

chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 72 3.9 Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

3.10 Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

3.11 Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm nhiều phân type (subtype) lưu

hành ở chim hoang dã, có khả năng biến đổi xâm nhiễm, lây truyền sang người và nhiều loài động vật, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử

đoạn RNA riêng biệt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS, lần lượt mã hóa tổng hợp 12 protein tương ứng được biết cho đến nay, đó là PB2, PB1, PB1-N40, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2 Các protein trên tham gia cấu tạo hạt virus và đảm bảo các chức năng xâm nhiễm, độc lực và thích nghi lây truyền gây bệnh của virus ở các loài vật chủ Đặc biệt, phức hợp enzym polymerase của virus cúm A không có cơ chế “đọc-sửa” bản sao trong quá trình sao chép, tổng hợp các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới Đặc tính cấu trúc hệ gen và enzym polymerase giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao, hình thành chủng virus mới thay đổi độc lực hoặc chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền sang nhiề

và người trong quá trình lưu hành tự nhiên Trong đó, các gen PB2, PB1 và PA mã hóa tổng hợp 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, là các đơn vị cấu tạo phức hợp enzym polymerase, có vai trò quyết định khả năng thích nghi nhân lên và lây truyền của virus ở cơ thể các loài vật chủ Ngoài ra, gen PB1 còn chứa 2 khung đọc mở gen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tương ứng, tham gia biểu hiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm

Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây ra dịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở người (khoảng 60%), lan truyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới Trong đó, Việt Nam là quốc gia có dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiều đợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phương, với hơn 62 người tử vong trong tổng số hơn 124 người được xác định nhiễm loại virus này Các trường hợp người nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, được xác định là do virus xâm nhiễm trực tiếp sang người thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sử dụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh Việt Nam cùng với Indonesia và Hy Lạp, là các quốc gia có tỉ lệ người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất

2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và người nhiễm so với các nhóm virus lưu hành trước đó, làm cho vấn đề phòng chống dịch cho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở người trở nên phức tạp hơn

Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhân lên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dàng giữa người với người và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể người, một trong các vấn đề được quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ở gia cầm và người hiện nay Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và

PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đương nhiễm, là cơ sở khoa học cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứu phát triển vaccine tái tổ hợp và sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho người và gia cầm trong tương lai

Xuất phát từ cơ sở lí luận và thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam”

Nhằm các mục tiêu:

1- Giải trình tự, so sánh biến đổi đặc tính di truyền, tương đồng về nucleotide

và amino acid các gen PB2, PB1, PA, của một số biến chủng virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam từ năm 2007 – 2011 với các chủng A/H5N1 trên thế giới 2- Tìm hiểu nguồn gốc phả hệ các gen nói trên của các biến chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu với các chủng virus A/H5N1 của Việt Nam và thế giới

3

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A

Virus cúm A (influenza A virus) là nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ

Mononegavirales, còn gọi là virus cúm chim (avian influenza virus, AIV) hay virus cúm gia cầm Vị trí phân loại của virus cúm A trong hệ thống phân loại cơ sở (Basic Taxonomy) là:

Viruses; ssRNA negative-stranded viruses; Orthomyxoviridae; Influenzavirus A [1], [2], [3]

Nhóm virus cúm A gồm nhiều phân type (subtype), biểu hiện đặc tính kháng nguyên của hai protein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) gắn trên bề mặt vỏ capsid hạt virus, cho đáp ứng kháng thể khác nhau của cơ thể nhiễm với mỗi kháng nguyên này giữa các phân type virus Cho đến nay, đã phát hiện có 16 phân type HA (kí hiệu từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) của virus cúm

A lưu hành ở chim hoang dã Sự tổ hợp của các phân type HA và NA, có thể dẫn đến sự hình thành hơn 144 phân type virus cúm A khác nhau lưu hành trong tự nhiên Trong đó, 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2, đã có sự biến đổi hình thành các chủng virus thích nghi lây truyền dễ dàng trong quần thể gây ra các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử [1], [2], [3], [4], [5], [6]

Đặc trưng virus cúm A là kí sinh nội bào bắt buộc, cấu tạo hạt virus đơn giản với hệ gen là phân tử RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt có khả năng

tự nhân lên trong nhân của tế bào nhiễm Bên cạnh đó, phức hợp enzym polymerase của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA phụ thuộc RNA type II, không có cơ chế đọc-sửa bản sao, tạo nên khả năng đột biến cao trong hệ gen, qua quá trình lây truyền và lưu hành gây bệnh của virus ở các loài vật chủ [1], [2], [6]

1.1.1 Cấu tạo chung của virus cúm A

Virus cúm A tồn tại ở dạng các hạt virus (virion) hình cầu hoặc hình khối đa diện đôi khi có dạng hình sợi, đường kính 80 – 120 nano mét (nm), khối lượng phân

tử khoảng 250 triệu dalton (Da) Hạt virus cúm A có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏ ngoài (envelope), capsid và lõi là vật chất di truyền (hệ gen) của virus [1], [7] + Vỏ capsid có chức năng bảo vệ vật chất di truyền của virus cúm A, gồm hàng trăm đơn vị cấu trúc gọi là capsomer

4

+ Lớp vỏ ngoài (envelope) có bản chất là lipoprotein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, mặt ngoài gắn các protein bề mặt đặc hiệu của virus và mặt trong được lót bởi một lớp màng đệm là protein M1

- Các protein bề mặt của virus cúm A có bản chất là glycoprotein gồm HA,

NA và M2, được gắn như những gai mấu nhô ra mặt ngoài vỏ capsid của hạt virus

Có khoảng 500 gai mấu phân bố trên mặt ngoài vỏ capsid của một hạt virus, mỗi gai mấu dài khoảng 10 – 14 nm và có đường kính khoảng 4 – 6 nm Tỉ lệ phân bố khoảng 4 – 5 phân tử protein HA trên 1 cụm protein NA (Hình 1.1A) [1], [7]

Hình 1.1 Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A (xem [8])

Ghi chú: (A): Mô hình cấu tạo virus cúm A; (B): Các hạt virus cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử 4.000.000X

- Hai protein HA và NA gắn trên bề mặt vỏ capsid, có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm, giải phóng hạt virus cúm A mới ở tế bào cảm thụ và là hai kháng nguyên chủ yếu cho đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại virus, cơ

sở sản xuất vaccine phòng và chống dịch cúm A hiện nay [1], [2], [3]

- Hệ gen củ m A là ribonucleic acid sợi đơn âm (negative-single stranded RNA, viết tắt là (-)ssRNA) còn gọi là sợi đơn đối mã, nằm bên trong vỏ capsid của hạt virus [1], [2], [7]

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A

Virus cúm A có cấu trúc hệ gen gồm 8 phân đoạn RNA có khả năng tự sao chép độc lập, giúp cho virus dễ dàng nhân lên và tổng hợp các thành phần của hạt virus mới ở tế bào cảm thụ trong cơ thể vật chủ [1], [2], [9]

- Các phân đoạn RNA trong hệ gen của virus cúm A tồn tại ở dạng cấu trúc RNP (ribonucleoprotein) có tổng độ dài từ 10.000 đến 15.000 base pair (bp), chứa

(B): Mô hình cấu trúc một phân đoạn RNP của virus cúm A

- Mỗi phân đoạn RNA sợi đơn âm trong hệ gen của virus cúm A được bao bọc bởi các phân tử nucleoprotein (NP) tạo thành phân đoạn RNP tương ứng, có cấu trúc xoắn đối xứng (α helix) dài 50 – 100 nm, đường kính 9 – 10 nm Các phân tử

NP liên kết với nhau qua cầu nối peptide và tạo thành vòm (loop) ở giới hạn cuối mỗi phân đoạn RNP, đầu tận cùng 3’- và 5’- gắn với phức hợp enzym polymerase, gồm 3 protein dưới đơn vị PB2, PB1 và PA polymerase, tạo thành một phức hệ tự sao chép độc lập trong quá trình nhân lên của virus ở tế bào nhiễm (Hình 1.2B) Các phân đoạn RNP cũng được nối với nhau bởi liên kết peptide ở cuối mỗi phân đoạn, tạo nên hệ gen 1 sợi duy nhất của virus cúm A và được đặt tên theo số thứ tự từ 1 đến 8, hoặc protein mã hóa tổng hợp là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M

và NS, ứng với độ dài phân tử giảm dần (Hình 1.2B)

1.1.3 Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A

Tám phân đoạn RNA gồm PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS trong hệ gen virus cúm A, lần lượt mã hóa tổng hợp 10 đến 12 protein là PB2, PB1 và/hoặc PB1-N40 và PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1 và M2, NS1 và NS2 tùy theo chủng virus

6

Bảng 1.1 Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các

protein của virus cúm A [10]

Gene Độ dài

(bp)

Protein virus

Độ dài

PB2 2.280 PB2 759 - Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase Liên

quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus

PB1 2.274

PB1 757 - Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase Liên

quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus

PB1-F2 87 - 90 - Chỉ có ở một số chủng virus Gây apoptosis tế bào

chủ, liên quan độc lực gây bệnh của virus

PB1-N40 717 - Chưa rõ chức năng, ảnh hưởng đến chu kì nhân

lên của virus ở tế bào nuôi cấy

PA 2.151 PA 716 - Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase Liên

quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus

NP 1.497 NP 498

- Thành phần cấu tạo phức hệ RNP, liên quan đến độc lực, khả năng nhân lên và thích nghi vật chủ của virus cúm A Kháng nguyên nhân phân biệt các nhóm virus cúm A, B, C và Thogovirus

M 1.026

- Vận chuyển các RNP, tham gia quá trình bao gói

và nảy chồi của virus Liên quan đến tốc độ nhân lên của virus ở tế bào cảm thụ

- Kênh ion H+ nội màng, tham gia hòa màng và quá trình nảy chồi của virus Liên quan tốc độ xâm nhiễm, nhân lên và kháng Rimantadin của virus

NS2

- Vận chuyển các RNP của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm Liên quan đến tốc độ nhân lên của virus ở tế bào cảm thụ

Ghi chú: PB2: polymerase basic protein 2; PB1: polymerase basic protein 1; PA: polymerase acidic protein;

PB1-F2: polymerase basic protein 1–frame 2; PB1-N40: polymerase basic protein 1–none 40 amino acid; HA: hemagglutinin; NA: neuraminidase; M: matrix; M1: matrix protein 1; M2: matrix protein 2; NP: nucleoprotein; NS: non structural protein; NS1: non structural protein 1; NS2: non structural protein 2; NEP: nuclear export protein

7

- Hai protein PB1-N40 và PB1-F2 được mã hóa tổng hợp từ 02 khung đọc mở (open reading frame, ORF) lồng trong khung đọc của gen PB1

- Bốn protein M1 và M2 cùng với NS1 và NS2 lần lượt được mã hóa tổng hợp

từ các khung đọc mở, hình thành bởi hiện tượng “cắt-ghép” (splicing) RNA thông tin của 2 gen M và NS tương ứng

- Các protein virus kể trên đảm nhận chức năng khác nhau trong quá trình lưu hành và lây truyền gây bệnh của virus cúm A, được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1 Như vậy, hệ gen virus cúm A gồm 8 phân đoạn RNA được cấu tạo, tổ chức hợp lí, tương tác chặt chẽ và đa dạng về phương thức biểu hiện như: gen lồng trong gen ở gen PB1, cắt-ghép gen ở các gen M và NS, mã hóa tổng hợp 10 – 12 protein đảm bảo các chức năng cấu tạo, xâm nhiễm, lây truyền, độc lực và biểu hiện kháng nguyên, trong quá trình lưu hành của virus ở các loài vật chủ [1], [6], [9], [11]

1.1.4 Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA

* Gen polymerase basic protein 2 (PB2):

Phân đoạn PB2 củ ộ dài tổng số 2.341 nucleotide chứa khung đọc mở ộ dài 2.280 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PB2 polymerase (viết tắt là protein PB2) gồm 759 amino acid [1], [2], [6], [12]

Protein PB2 là một đơn vị cấu tạo trong thành phần phức hợp enzym polymerase, chịu trách nhiệm khởi đầu quá trình tổng hợp và phiên mã RNA của virus ở nhân tế bào nhiễm Bên cạnh đó, protein PB2 còn là một trong các yếu tố quan trọng, liên quan đến khả năng chuyển nhiễm thích nghi lây truyền của virus cúm A từ gia cầm sang động vật có vú và người [1], [2], [6]

Đầu C-tận (carboxy terminal) của protein PB2 chứa các vị trí amino acid quan trọng ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng phức hợp enzym polymerase, liên quan đến khả năng thích nghi vật chủ của virus cúm A Bao gồm:

- Vùng 37 amino acid đầu tiên liên kết với đầu tận cùng N (đầu N-tận, N- terminal) của dưới đơn vị protein PB1, tham gia điều hòa hoạt tính phức hợp enzym polymerase, liên quan đến khả năng nhân lên của virus cúm A trong tế bào cảm thụ

ở cơ thể các loài vật chủ [13], [14], [15]

- Các vùng tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signal domain, NLS) tương tác với thụ thể importin-α (importin-α nuclear import receptors) trên màng

8

nhân, trong quá trình vận chuyển các phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A vào nhân

tế bào nhiễm Có 7 dạng cấu trúc (isoforms) khác nhau của thụ thể importin-α, kí hiệu từ importin-α1 đến importin-α7, phân bố trên màng nhân tế bào cảm thụ với virus cúm A ở các loài vật chủ Ở tế bào cảm thụ gia cầm có thụ thể importin-α1, ở người là các importin-α1, 3, 5 và 7, trong khi ở tế bào cảm thụ của chuột lại có sự thiếu hụt importin-α7 [16], [18] Khả năng tương tác giữa các vùng NLS của protein PB2 với các dạng thụ thể importin-α, liên quan đến đặc tính thích nghi xâm nhiễm, lây truyền của virus cúm A ở loài vật chủ mới [16], [17], [18]

- Bên cạnh đó, các vị trí amino acid đầu C-tận của protein PB2 còn tham gia tương tác với protein NP trong phức hợp RNP của virus cúm A, làm thay đổi khả năng tương tác giữa các vùng NLS của PB2 với thụ thể importin-α1 trên màng nhân

tế bào cảm thụ ở động vật có vú [16], [19], [20]

- Ngoài ra, vùng đầu C-tận của protein PB2 còn tương tác với vùng chuỗi nối giữa 2 tiểu phần HA1 và HA2 của protein HA, liên quan đến biểu hiện độc lực gây bệnh của virus cúm A ở các loài vật chủ [21], [22], [23]

Như vậy, các đột biến về nucleotide xảy ra trong trình tự gen PB2, có thể làm thay đổi amino acid được mã hóa trong protein PB2, dẫn đến thay đổi hoạt tính của phức hợp enzym polymerase liên quan đến độc lực, thích nghi lây truyền của virus cúm A giữa các loài vật chủ

* Gen polymerase basic protein 1 (PB1):

+ Phân đoạn PB1 có độ dài tổng số là 2.341 nucleotide chứa khung đọc mở 2.274 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PB1 polymerase (viết tắt là protein PB1) gồm 757 amino acid, một đơn vị cấu tạo trong thành phần phức hợp enzym polymerase của virus cúm A Bên cạnh đó, khung đọc mở gen PB1 còn chứa 02 khung đọc mở của các gen PB1-N40 và PB1-F2, mã hóa 2 protein tương ứng có chức năng khác nhau, trong quá trình nhân lên và gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ [1], [2], [6], [12]

Trình tự nucleotide vùng đầu 5’- RNA thông tin của gen PB1 chứa đựng nhiều chức năng phức tạp và chồng lấn, bao gồm tín hiệu bao gói RNA hệ gen của virus, thông tin xác định và điều hòa tổng hợp các protein chức năng, được mã hóa từ các khung đọc mở khác nhau lồng trong khung đọc mở gen PB1 Bao gồm 5 vị trí mã

9

khởi đầu (innitiation codon) từ -AUG1- đến -AUG5-, xác định điểm khởi đầu dịch

mã các khung đọc mở khác nhau lồng bên trong khung đọc gen PB1, được nhận diện bởi cơ chế chuyển dịch khung đọc của ribosome Trong đó, các vị trí AUG1, 4

và 5 là mã khởi đầu của 3 khung đọc mở mã hóa cho các protein: PB1, PB1-F2 và PB1-N40 theo thứ tự, các vị trí AUG2 và 3 là mã khởi đầu của 2 khung đọc mở ngắn (short open reading frame, sORF) là sORF1 và sORF2, mã hóa các polypeptid

tương ứng (Hình 1.3) Wise et al., 2009 [11], 2011 [24]

Hình 1.3 Sơ đồ sắp xếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu các

ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A [24]

Ghi chú: (A) Vị trí mã khởi đầu –AUG– các OFR trong vùng đầu 5’- của RNA thông tin gen PB1, tương

ứng với protein được mã hóa; Số thứ tự từ 1 đến 9: các vị trí AUG1 đến AUG9 B Trình tự nucleotide và các

vị trí mã khởi đầu –ATG– trong vùng đầu 3’- xác định trên DNA của gen PB1 virus cúm A

+ Protein PB1 chịu trách nhiệm xúc tác và gắn mũ cho các phân tử RNA thông tin, cũng như các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới được tổng hợp trong nhân của tế bào nhiễm [1], [2]

- Bên cạnh cấu trúc liên kết với đầu C-tận của protein PB2, trình tự đầu N-tận của protein PB1 còn chứa 48 amino acid cấu tạo nên cấu trúc anpha ( ) có vùng trung tâm gồm 12 amino acid đầu tiên, liên kết với protein PA polymerase trong phức hợp enzym polymerase của virus cúm A [14], [25], [26], [27], [28]

10

- Sự thay đổi thành phần amino acid trong vùng N-tận của protein PB1, làm thay đổi liên kết giữa các protein PB2-PB1-PA, dẫn đến thay đổi cấu trúc và hoạt tính enzym phức hợp polymerase, liên quan đến khả năng nhân lên, biểu hiện độc lực và thích nghi của virus cúm A ở các loài vật chủ

+ Protein PB1-F2 có khối lượng phân tử nhỏ, biểu hiện hoạt tính khi chứa đầy

đủ từ 87 – 90 amino acid, được mã hóa bởi khung đọc mở PB1-F2 có độ dài 273 nucleotide, giới hạn từ vị trí nucleotide 95 đến 367 trên khung đọc mở gen PB1 Protein PB1-F2 trực tiếp tham gia và là yếu tố chủ yếu biểu hiện độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể nhiễm [9], [13], [29], [30], [31], [32]

- Protein PB1-F2 gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), do làm thay đổi hình thái và mất điện thế màng ty thể, gây ngưng trệ chuyển hóa nội bào, kích thích sự nhạy cảm với TNFα (α-tumor neucrosis factor) và khởi động quá trình apoptosis của tế Qua đó, protein PB1-F2 tham gia điều biến đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ với virus, gây tổn thương tế bào và mô, chủ yếu là các

tế bào biểu mô đường hô hấp và đại thực bào phế nang (alveolar macrophage) “bắt giữ” virus, rút ngắn thời gian đào thải virus, gia tăng độc lực và mức độ trầm trọng của bệ [9], [33], [34], [35]

- Trong quá trình lưu hành, nhiều chủng virus cúm A có đột biến nucleotide trong trình tự khung đọc mở PB1, làm xuất hiện một hoặc nhiều bộ ba kết thúc (stop codon), thường gặp ở các vị trí sau bộ ba mã hóa amino acid thứ 11 trong trình tự khung đọc PB1-F2 Kết quả đột biến trên dẫn đến protein PB1-F2 được mã hóa không đầy đủ (truncated), làm mất hoạt tính protein này và độc lực của virus trở nên

“ôn hòa” hơn [5], [9], [32], [36], [37] Có khoảng 95% virus cúm A ở chim và gia cầm, 90% ở người, 76% ở lợn và 100% ở các loài động vật có vú khác, chứa protein PB1-F2 chứa đầy đủ 87 – 90 amino acid [9], [37], [38], [39]

- Bên cạnh đó, đột biến nucleotide làm thay đổi amino acid asparagine (N) thành serine (S) tại vị trí 66 (N66S), dẫn đến tăng hoạt tính protein PB1-F2 và gia tăng độc lực của virus cúm A ở cơ thể nhiễm [29], [30], [31], [32]

+ Protein PB1-N40 được Wise và cộng sự (cs.), (2009, 2011) [11], [24] phát

hiện gần đây ở chủng virus A/PuetoRico/8/34(H1N1), thiếu hụt 39 amino acid đầu

11

tiên ở vùng N-tận so với protein PB1, chiếm khoảng 5% so với lượng protein PB1 được tổng hợp trong tế bào nhiễm

- Chức năng của protein PB1-N40 chưa được biết rõ, theo nghiên cứu của

Wise và cs., (2009, 2011) cho thấy protein PB1-N40 không tham gia cấu trúc

enzym polymerase như protein PB1, nhưng sự biểu hiện của protein này có ảnh hưởng đến chu kì phát triển của virus cúm A ở tế bào nuôi cấy [11], [24]

- Hiện chưa có các nghiên cứu về protein PB1-N40 ở các subtype virus cúm A lưu hành trong quần thể các loài chim hoang dã, gia cầm, động vật có vú và người + Đặc biệt, polypeptid ngắn sOFR2 có vai trò như yếu tố điều hòa, tác động đối nghịch trong quá trình tổng hợp 2 protein PB1-F2 và PB1-N40 Trong đó: sOFR2 là tín hiệu thông tin làm tăng tổng hợp protein PB1-F2, nhưng lại điều hòa ngược sự tổng hợp protein PB1-N40, qua cơ chế tái khởi đầu của ribosome bỏ qua

vị trí mã khởi đầu AUG4 (vị trí khởi đầu của khung đọc mở PB1-F2) [24]

* Gen polymerase acidic (PA):

Phân đoạn PA có độ dài tổng số 2.233 nucleotide chứa khung đọc mở 2.151 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PA polymerase (protein PA) gồm 716 amino acid, là một đơn vị cấu tạo phức hợp enzym polymerase của virus cúm A [1], [2] + Protein PA chịu trách nhiệm xúc tác kéo dài sự phiên mã và sao chép RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus ở nhân tế bào cảm thụ Bên cạnh đó, protein PA có hoạt tính enzym endonuclease, phân cắt RNA thông tin của tế bào chủ thành các đoạn oligonucleotide, làm mồi nucleotide cho quá trình tổng hợp RNA virus, tham gia độc lực của virus cúm A ở các loài vật chủ [1], [6], [40] + Protein PA được phân cắt bởi enzym trypsin thành 2 vùng polypeptide có khối lượng và chức năng khác nhau Phần đầu N-tận protein PA chứa 256 amino acid, khối lượng phân tử khoảng 25 kilo Dalton (kDa), có vai trò quan trọng biểu hiện hoạt tính của phức hợp enzym polymerase và phân cắt các RNA thông tin của

tế bào chủ Phần đầu C-tận gồm 560 amino acid, có khối lượng phân tử khoảng 55 kDa, chứa các vị trí amino acid K328, K539, R566 và K574 tạo thành trung tâm, liên kết với trung tâm cấu trúc α đầu N-tận của protein PB1, trong phức hợp enzym polymerase của virus cúm A (Hình 1.4) [14], [28], [40], [41], [42]

Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full