Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm ngoại nhập

Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm ngoại nhập

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học nông nghiệp i

-

đào yến khanh

Kiểm nghiệm và khảo nghiệm

vaccine Cúm gia cầm ngoại nhập

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: TS tô long thành

PGS.TS.Trương Quang

Hà nội - 2005

Lời cam đoan

- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn

là trung thực và ch−a từng đ−ợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đ−ợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã đ−ợc chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả

Đào Yến Khanh

Lời cảm ơn

Tác giả luận văn xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- TS Tô Long Thành, PGS TS Trương Quang, những người hướng dẫn khoa học trực tiếp đã đóng góp nhiều ý kiến quan trọng từ những bước nghiên cứu ban đầu đến quá trình thực hiện viết luận văn

-PGS TS Hoàng Đạo Phấn, giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I và các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

-PGS TS Trương Văn Dung, Viện Trưởng Viện Thú y Quốc gia và ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm đề tài

- Ban lãnh đạo Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập

- Tập thể các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, đặc biệt các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Bệnh lý – Trường Đại học Nông nghiệp I – Hà Nội đã trực tiếp đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tác giả hoàn thành luận văn này

- Cảm ơn các nhà khoa học trong ngành, các đồng nghiệp, bạn bè và người thân đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình công tác và học tập

Tác giả

Đào Yến Khanh

Mục lục

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng vi

Danh mục hình viii

1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Giới thiệu chung về bệnh Cúm gà 4

2.1.1 Lịch sử bệnh Cúm gia cầm 4

2.1.2 Bệnh Cúm gia cầm ở thế giới và châu á 5

2.1.3 Tóm tắt tình hình bệnh Cúm gia cầm ở Việt Nam 6

2.2 Virus học Bệnh Cúm gia cầm 9

2.1.1 Cấu trúc chung của virus 9

2.2.2 Tính đa dạng kháng nguyên 10

2.2.3 Sức đề kháng của virus 11

2.2.4 Độc lực của virus 11

2.2.5 Nuôi cấy và lưu giữ virus Cúm gà 13

2.3 Dịch tễ học bệnh Cúm ở loài chim 13

2.3.1 Động vật cảm nhiễm 13

2.3.2 Động vật mang virus 14

2.3.3 Sự truyền lây 15

2.4 Miễn dịch chống bệnh của gia cầm 16

2.4.1 Miễn dịch tự nhiên: 16

2.4.2 Miễn dịch đặc hiệu 17

2.5 Tình hình sử dụng vaccine trên thế giới và khuyến cáo của tổ chức dịch tễ thế giới 20

2.5.1 Các loại vaccine phòng bệnh hiện nay 20

2.5.2 Yêu cầu cần đạt được đối với vaccine phòng bệnh Cúm gà 23

2.5.3 Tình hình sử dụng vaccine Cúm gia cầm trên thế giới 24

2.5.4 Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vaccine phòng chống Cúm gia cầm 25

2.6 Các phương pháp xét nghiệm 27

2.6.1 Chẩn đoán huyết thanh học 27

2.6.2 Chẩn đoán vi- rút học 28

3 Nội dung - nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 30

3.1 Nội dung 30

3.1.1 Kiểm nghiệm vaccine Cúm gia cầm ngoại nhập 30

3.1.2 Khảo nghiệm vaccine Cúm gia cầm H5N2 ngoại nhập 30

3.2 Nguyên liệu 30

3.2.1 Động vật thí nghiệm 30

3.2.2 Vaccine 31

3.2.3 Các trang thiết bị và cơ sở vật chất 31

3.3 Phương pháp nghiên cứu 31

3.3.1 Kiểm nghiệm vaccine 31

3.3.2 Thử nghiệm vaccine 33

3.3.3 Phản ứng HI 35

3.3.4 Lấy và bảo quản mẫu bệnh phẩm 38

3.3.5 Phân lập virus trên phôi gà 38

3.3.6 Phản ứng RT - PCR 39

3.3.7 Xác định ảnh hưởng của vaccine đến thể trọng gà bằng phương pháp

cân trọng lượng gà 43

3.3.8 Tính tỷ lệ chết- Tỷ lệ chết bệnh 43

3.3.9 Tính tỷ lệ đẻ 43

2.3.10 Xử lý số liệu 43

4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 44

4.1 Kết quả kiểm nghiệm vaccine 44

4.1.1 Chỉ tiêu thuần khiết 44

4.1.2 Chỉ tiêu an toàn 46

4.1.3 Chỉ tiêu hiệu lực 47

4.2 Kết quả khảo nghiệm vaccine 56

4.2.1 ảnh hưởng của vaccine Cúm gà tới một số chỉ tiêu sinh lý của gà đẻ trứng thương phẩm 57

4.3.2 Giám sát sự cảm nhiễm và sự lưu hành của virus Cúm gà chủng H5N1 trên đàn gà khảo nghiệm vaccine Cúm gà H5N2 50

4.3.3 Biến đổi hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) kháng kháng nguyên H5 ở gà được tiêm vaccine Cúm gà H5N2 55

4.3.3.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) kháng kháng nguyên H5 ở gà được tiêm vaccine H5N2 của Trung Quốc 55

4.3.3.2 Biến đổi hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) kháng kháng nguyên H5 ở gà được tiêm vaccine Cúm H5N2 của Hà Lan Error! Bookmark not defined 4.3.4 Đáp ứng miễn dịch ở đàn gà được tiêm vaccine Cúm H5N2 tại các thời điểm 3, 4, 6, 8, 14, 16 tuần sau khi tiêm vaccine lần 1 59

5 Kết luận 73

B¶ng c¸c ch÷ viÕt t¾t trong luËn v¨n

FAO Food and Agriculture Organization of the United

HI Haemgglutination Inhibition Assay

HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza

OIE Office International des Epizooties

Danh mục bảng

Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vaccine cúm gà Hà Lan và vaccine cúm gà Trung Quốc 45 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vaccine 46 Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vaccine cúm gà của Trung Quốc và vaccine cúm gà của Hà Lan 55 Bảng 4.4: Kết quả theo dõi gà khảo nghiệm vaccine cúm gà của Hà Lan và vaccine cúm gà của Trung Quốc 58 Bảng 4.5: Trọng lượng trung bình của gà khảo nghiệm vaccine cúm gà của Hà Lan và vaccine cúm gà của Trung Quốc 59 Bảng 4.6: Tỷ lệ đẻ của gà khảo nghiệm vaccine cúm gà của Hà Lan và vaccine cúm gà của Trung Quốc 60 Bảng 4.7: Giám sát sự cảm nhiễm và sự lưu hành của virus Cúm H5N1 trên

đàn gà khảo nghiệm vaccine vô hoạt H5N2 54 Bảng 4.8: Biến đổi hiệu giá HI trung bình ở gà được tiêm vaccine cúm H5N2 của Trung Quốc 56 Bảng 4.9: Biến đổi hiệu giá HI trung bình ở gà được tiêm vaccine cúm H5N2

cuả Hà Lan Error! Bookmark not defined

Bảng 4.10: Hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 ở gà thời điểm 3 tuần sau tiêm vaccine lần thứ nhất 60 Bảng 4.13: Hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 ở gà thời điểm 8 tuần sau tiêm vaccine lần thứ nhất 67 Bảng 4.14: Hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 ở gà thời điểm 14 tuần sau tiêm vaccine lần thứ nhất 69

Danh mục hình

Hình 4.1: Diễn biến tỷ lệ đẻ của đàn gà thí nghiệm Error! Bookmark not defined

Hình 4.2: Biến đổi hiệu giá kháng thể trung bình kháng kháng nguyên H5 ở

gà đ−ợc tiêm vaccine Trung Quốc Error! Bookmark not defined

Hình 4.3: Biến đổi hiệu giá kháng thể trung bình kháng kháng nguyên H5 ở

gà đ−ợc tiêm vaccine Cúm gà Hà Lan 57 Hình 4.4: Biến đổi hàm l−ợng kháng thể trung bình kháng kháng nguyên H5

ở hai đàn gà đ−ợc tiêm vaccine Cúm Hà Lan và vaccine Cúm Trung Quốc 58 Hình 4.5: Hiẹu giá kháng thể ở gà đ−ợc tiêm vaccine tại thời điểm 3 tuần sau tiêm lần thứ nhất 61 Hình 4.6: Hiệu giá kháng thể ở gà tại thời điểm 4 tuần sau khi tiêm lần thứ nhất 63 Hình 4.7: Hiệu giá kháng thể của đàn gà- Thời điểm 6 tuần sau tiêm chủng lần 1 66 Hình 4.8: Hiệu giá kháng thể của gà tại thời điểm 8 tuần sau khi tiêm vaccine lần thứ nhất 68 Hình 4.9: Hiệu giá kháng thể của gà tại thời điểm 14 tuần sau lần tiêm vaccine thứ nhất 70 Hình 4.10: Hiệu giá kháng thể của gà đ−ợc tiêm vaccine tại thời điểm 16 tuần sau lần tiêm thứ 1 72

1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI) được phát hiện lần đầu tiên ở Italy vào năm 1878 Bệnh còn gọi là bệnh dịch hạch (Fowl plague) Đây là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan rất mạnh ở gia cầm Với tính chất nguy hiểm của nó, bệnh cúm gia cầm được tổ chức dịch tễ thế giới OIE xếp vào Bảng A – Bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất của động vật [28] Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới và gây thiệt hại kinh tế rất lớn Căn bệnh do virus cúm gia cầm, là một virus thuộc họ Orthomyxoviridae, là virus ARN phân mảnh có khả năng đột biến rất mạnh Hai kháng nguyên bề mặt H (từ H1 đến H15) và N (từ N1 đến N9) có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học

và miễn dịch học cũng như phân loại virus

Bệnh cúm gia cầm xảy ra ở Việt Nam vào cuối năm 2003 trong bối cảnh chăn nuôi gia cầm là một nghề truyền thống của Việt Nam, là nguồn thu nhập chính cho nhiều nông hộ và là một trong những nghề có tác dụng xoá

đói giảm nghèo nhanh, có hiệu quả Trước khi xảy ra dịch cúm gia cầm, tổng

đàn gia cầm của cả nước là 261 triệu con, trong đó có 192 triệu gà và khoảng 68,8 triệu gia cầm khác mà chủ yếu là vịt, ngan và ngỗng [3]

Đây là lần đầu tiên bệnh xuất hiện tại Việt Nam và vì thế nó có thể

được coi là một bệnh mới ở gia cầm Làn sóng dịch cúm gia cầm thứ nhất kéo dài từ 27 tháng 12 năm 2003 tới 30 tháng 4 năm 2004 đã làm cho gia cầm của

2574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 57 tỉnh/thành phố của Việt Nam

bị mắc bệnh Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và bị tiêu hủy là hơn 43,9 triệu con chiếm 16,8% tổng số gia cầm của cả nước, trong đó gà là 30,4 triệu con

và thủy cầm là 13,5 triệu con [3]

Dịch cúm gia cầm xảy ra đã gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi gia cầm của nước ta, nhiều cơ sở chăn nuôi công nghiệp qui mô lớn, nhiều trang trại và hộ gia đình lâm vào cảnh mất trắng Nguy cơ lây lan bệnh

đe doạ các trung tâm giống gia cầm của quốc gia và các cơ sở giống của các tỉnh và thành phố là không thể tránh khỏi

Dịch cúm gia cầm đã bùng phát trở lại Việt nam vào tháng 7 và 8 năm

2004 và tiếp tục nổ ra mạnh mẽ tại vùng đồng bằng sông Cửu Long với tổng

số gia cầm bị chết và tiêu hủy là 1,5 triệu con Đặc điểm của các ổ dịch chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và những vùng có chăn nuôi nhiều thủy cầm, từ giữa tháng 4 năm 2004 đến 15 tháng 2 năm 2005, bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao đã được ghi nhận ở 35 tỉnh và thành phố

Như vậy, sau 1 năm chống dịch, do điều kiện kinh tế, xã hội và khoa học kỹ thuật; chúng ta chưa khống chế được dịch một cách có hiệu quả Việc

áp dụng các biện pháp mạnh mẽ nhất như tiêu hủy gia cầm cấm lưu thông và tiêu thụ gia cầm và sản phẩm gia cầm chưa đạt được hiệu quả khống chế bệnh như mong muốn và điều đó dẫn tới việc phải xem xét khả năng áp dụng biện pháp tiêm phòng Việc phối hợp tốt các biện pháp an toàn sinh học, thực hiện

vệ sinh mặt bằng, sát trùng tiêu độc chuồng trại tốt, kết hợp với chủng ngừa bằng vaccine có thể làm tăng ngưỡng nhiễm bệnh và hạn chế sự lây lan của virus từ gia cầm sang gia cầm và từ gia cầm sang người, từ đó có tác động tốt

đến vấn đề bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

Nhằm đánh giá khả năng phòng bệnh của các vaccine phòng chống cúm gia cầm hiện có dùng cho gà và ảnh hưởng của việc tiêm phòng vaccine cúm gia cầm trên đàn gà, được sự đồng ý của Cục Thú y, Trung tâm Chẩn

đoán Thú y Trung ương và Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc thú y Nhà nước;

Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm – Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp I, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm ngoại nhập”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định chất lượng của một số vaccine cúm gia cầm ngoại nhập

- Xác định ảnh hưởng của việc tiêm phòng trên đàn gà được tiêm vaccine cúm gia cầm ngoại nhập

- Giám sát sự cảm nhiễm và lưu hành virus H5N1 trên đàn gà đã được tiêm phòng

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn gà được tiêm vaccine

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đánh giá được chất lượng của vaccine cúm gia cầm ngoại nhập thông qua việc kiểm nghiệm và khảo nghiệm vaccine

- Là cơ sở để đánh giá tính khả thi của biện pháp tiêm phòng vaccine cúm gia cầm đại trà áp dụng đồng thời với các biện pháp khác

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Giới thiệu chung về bệnh Cúm gà

2.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gà (Avian Influenza) còn gọi là bệnh dịch hạch (Fowl

Plague) đã đ−ợc Porroncito mô tả lần đầu tiên ở Italy vào năm 1878 và đ−ợc

nhìn nhận là một bệnh quan trọng và nguy hiểm Đến năm 1901, Centanni và Savunozzi mới xác định đ−ợc căn nguyên là một tác nhân qua lọc (filterable agent) Nh−ng phải đến năm 1955, virus gây bệnh mới đ−ợc Schafer xác định thuộc type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 gây chết nhiều

gà, gà tây và các loài chim khác (Trính dẫn theo Tô Long Thành, 2004) [11]

Bệnh đ−ợc Beard [17] mô tả khá kỹ ở Mỹ vào năm 1971 qua đợt dịch cúm khá lớn trên gà tây Các năm tiếp theo bệnh đ−ợc phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ rồi Nam Phi, Trung Cận Đông, Châu Âu, Liên hiệp Anh và Liên Xô

có độc lực cao thuộc phân type H5 và H7, nh− ở Scotland năm 1959 là H5N1,

ở Mỹ năm 1983-1984 là H5N2

Năm 1963, virus cúm type A được phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập virus vào đàn gà Cuối thập kỷ 60, phân type H1N1 thấy ở lợn và có liên quan tới sự tái tổ hợp gen của virus Cúm gia cầm

Dịch Cúm gia cầm liên tục bùng nổ khắp các Châu lục trên thế giới, đã thúc đẩy các hiệp hội chăn nuôi gia cầm và các nhà khoa học tổ chức hội thảo chuyên đề về bệnh cúm gà (hội thảo lần đầu tiên vào năm 1981, lần thứ 2 tại Athen năm 1987, lần 3 cũng tại Athen vào 1992) Từ đó đến nay, trong các hội thảo về dịch tễ, bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung được coi trọng Từ đó có thể thấy, bệnh cúm gia cầm ngày càng trở nên nguy hiểm, gây nhiều thiệt hại về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm trên phạm vi toàn cầu

2.1.2 Bệnh cúm gia cầm ở thế giới và châu á

Năm 2004, bệnh cúm gia cầm đã xảy ra với qui mô lớn và với tốc độ bùng phát rất nhanh ở các nước châu á với tổng số 11 quốc gia và vùng lãnh thổ Dịch xuất hiện đầu tiên ở Hàn Quốc từ đầu tháng 12/2003, sau đó dịch xảy ra ở nhiều nước khác với những diễn biến phức tạp [10] Đến cuối tháng 2/2004 đã có 11 nước và vùng lãnh thổ công bố dịch là Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Indonexia, Trung Quốc, Hồng Kông,

Đài Loan và Pakistan Chủng virus độc lực cao gây bệnh đã được phân lập và

định type là H5N1 là chủ yếu, ngoài ra còn là H5N2 ở Đài Loan và H7N3, H9N2 ở Pakistan, H7 ở Cộng hoà Dân chủ Nhân dân Triều Tiên Tại một số nước khác như Nam Phi phân lập được H6, H5N2, Ai Cập H10N7, Canada H7N3, Hoa Kỳ H7N2 Trong đợt dịch cúm này khoảng 120 triệu gia cầm gồm: gà, gà tây, gà sao, gà lôi, vịt, ngan, ngỗng, cút, bồ câu, và một số loài chim hoang dã đã bị nhiễm bệnh và nằm trong vùng dịch phải tiêu hủy Hàng trăm người cũng đã bị lây nhiễm bệnh, trong đó có trên 20 người bị chết (Hội

nghị cúm gia cầm tại thành phố Hồ Chí Minh)[3]

- Tại Hàn Quốc: Dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra từ 12/12/2003 đến 24/3/2003

- Tại Nhật Bản: Dịch cúm H5N1 phát ra từ ngày 27/1/2004, ổ dịch sau cùng xảy ra ngày 5/03/2004

- Tại Thái Lan: ổ dịch H5N1 đầu tiên được xác định vào ngày 23/01/2004 Tính đến giữa tháng 3/2003 Thái Lan đã phát hiện 11 tỉnh có dịch cúm gia cầm với tổng số gia cầm bị tiêu huỷ đợt 1 khoảng 30 triệu con Đợt dịch thứ 2 phát lại từ 3/7/2004 đến 14/2/2005

- Tại Indonesia: Dịch cúm gia cầm xuất hiện vào tháng 1/2004 Dịch xuất hiện lần thứ hai vào 23/3/2005

- Tại Trung Quốc: ổ dịch H5N1 đầu tiên phát ra ngày 27/1/2004 ở tỉnh Quảng Tây, sau đó lan ra 15 tỉnh khác, đặc biệt các tỉnh có biên giới với Việt Nam đều có dịch Từ ngày 28/7/2004 Trung Quốc không phát hiện thêm ổ dịch mới

- Tại Campuchia: Dịch H5N1 xảy ra từ ngày 24/01/2004

- Tại Lào : Dịch H5N1 xảy ra từ ngày 27/01/2004 đến 13/02/2004

- Tại Malaysia: ổ dịch H5N1 đầu tiên phát ra ngày 19/8/2004, ổ dịch sau cùng xảy ra ngày 22/11/2004

- Tại Hồng Kông : Dịch xảy ra ngày 26/01/2004

Trong tháng 2/2004, một số nước đã tuyên bố khống chế được dịch, song cũng có một số nước lại tái phát lần thứ 2, thứ 3 như Thái Lan, Campuchia, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam Đây là lần đầu tiên trong lịch

sử bệnh cúm gia cầm xảy ra nhanh, trên diện rộng và diễn biến phức tạp ở các nước Châu á [12]

2.1.3 Tóm tắt tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm ở nước ta xuất hiện lần đầu tiên vào cuối tháng

12/2003 và đến nay xảy ra thành 3 đợt chính như sau:

* Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/3/2003: Khoảng cuối

tháng 12 năm 2003, dịch cúm gia cầm thể độc lực cao với tác nhân gây bệnh

là vi-rút cúm gia cầm H5N1 xảy ra ở Việt nam Đây là lần đầu tiên bệnh xuất hiện tại Việt Nam và vì thế nó có thể được coi là một bệnh mới ở gia cầm Đặc

điểm của đợt dịch thứ nhất này là dịch lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc ở nhiều địa phương khác nhau đã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi gia cầm Ngay cả các trại gia cầm nằm ở những vùng không có dịch cũng gặp phải những khó khăn trong việc duy trì

đàn gia cầm dẫn đến việc phải tiêu hủy Đợt dịch này đã làm cho gia cầm của

2574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 57 tỉnh/thành phố của Việt Nam

bị mắc bệnh Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và bị tiêu hủy là hơn 43,9 triệu con, chiếm 16,8% tổng số gia cầm của cả nước Trong đó, gà là 30,4 triệu con

và thủy cầm là 13,5 triệu con Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và bị tiêu huỷ

Ca bệnh đầu tiên được báo cáo xảy ra vào cuối tháng 12 năm 2003 ở một xã thuộc tỉnh Hà Tây, miền Bắc Việt Nam Hầu như là đồng thời với thời điểm

đó, các ổ bệnh Cúm gia cầm cũng xảy ra ở tỉnh Tiền Giang và Long An ở phía Nam Sau thời điểm này, bệnh lây lan rất nhanh từ tỉnh này sang tỉnh khác, bao gồm cả các tỉnh thuộc miền Trung và Tây Nguyên

Đến đầu tháng 2 năm 2004, bệnh cúm gia cầm đã lan ra hầu như khắp cả nước với diễn biến rất phức tạp Bình quân 1 ngày có khoảng 13- 230 xã, 15-

20 huyện phát sinh ổ dịch mới trong cả nước Số gia cầm phải tiêu huỷ lên tới 2- 3 triệu con/ ngày, ngày cao điểm nhất lên tới 4 triệu con Số lượng các ổ dịch cao nhất vào ngày mùng 6 tháng 2 năm 2004

Sau ngày 29 tháng 2 năm 2004 không có thông báo về các ổ dịch mới

và không còn gia cầm bị tiêu huỷ

Như vậy trong đợt dịch thứ nhất có 57 tỉnh có dịch trên tổng số 61 tỉnh trong cả nước, số lượng xã có dịch cũng rất khác nhau, dao động từ 1% đến 99% số xã Có 4 tỉnh là Tuyên Quang, Phú Yên, Khánh Hòa và Bình Thuận không bị dịch Hầu hết ở các tỉnh có dịch đều có trên 10% số xã có dịch Theo thống kê cho đến cuối đợt dịch, đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long là những khu vực có tỷ lệ số xã có gia cầm bị mắc bệnh cao nhất [3]

* Đợt dịch thứ hai từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2004: Các ổ dịch cúm

gia cầm thể độc lực cao đã tái xuất hiện vào giữa tháng 4 năm 2004 ở một số

tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long Trong đợt dịch tái lại này, các ổ bệnh

chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi qui mô lớn bị nhiễm bệnh Dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng có chăn nuôi nhiều thủy cầm Bệnh xuất hiện ở 46 xã phường tại 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh Thời gian cao điểm nhất là tháng 7 sau đó giảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ có 1 điểm phát dịch Tổng số gia cầm bị tiêu huỷ trong thời gian này là 84.000 con, trong đó có 56.000 gà, hơn 8000 vịt

* Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 đến nay: Bệnh cúm gia cầm thể độc

lực cao đã xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam) Thời điểm xuất hiện các ổ dịch nhiều nhất là vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên 31 tỉnh thành Trong đợt dịch này,

460320 con gà, hơn 825.000 vịt ngan và 551.000 chim cút đã chết và bị tiêu hủy (Báo cáo về dịch cúm gia cầm – Hội nghị dịch Cúm gia cầm )[3]

Cho đến nay, nguồn gốc của dịch cũng chưa được xác định chính xác nhưng có giả thuyết cho rằng việc vận chuyển lậu gà bị nhiễm từ nước ngoài vào nước ta là một trong các nguyên nhân gây ra dịch Ngoài ra, với đặc điểm khí hậu ấm áp và có nhiều sông ngòi, các loài chim và thủy cầm di cư thường xuyên ra vào Việt Nam và chúng cũng có thể là tác nhân truyền bệnh cơ giới

2.2 Virus học Bệnh Cúm gia cầm

2.1.1 Cấu trúc chung của virus

Virus cúm gia cầm là một thành viên của họ Orthomyxoviridae, có vỏ với

bộ gen là ARN cực âm một sợi Sợi ARN chia làm 8 mảnh và nối với nhau nhờ các protein có vỏ bọc Virus được bọc bên ngoài bằng các Protein và có màng Lipit ở ngoài cùng Bề mặt ngoài màng phủ bằng 2 hệ thống Protein có các phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hoà được kết hợp với nhau một cách riêng biệt [15]

- Hình thái và cấu trúc: RNA của virus là một sợi đơn chia thành 8

đoạn kế tiếp nhau mang 10 mật mã cho 10 loại Virion protein khác nhau: HA,

NA, NP, M1, M2, PB1, PB2 và PA Đoạn ARN có trọng lượng nhỏ nhất mang mật mã cho 2 loại không có cấu trúc protein là NS1 và NS2, chúng dễ dàng tách được ở các tế bào bị nhiễm Tất cả 8 đoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt dễ dàng qua phương pháp điện di

Qua kính hiển vi điện tử tương phản âm, các virus họ Orthomyxoviridae

có dạng gần như hình cầu hoặc các hạt mỏng, đường kính chung của hạt virus

từ 80 - 100 nm

Hiện nay họ Orthomyxoviridae gồm có 1 giống được tạo thành từ các virus Cúm type A, B, C Chỉ có virus cúm type A đã được phân lập từ gia cầm còn virus cúm type B, C gây cúm điển hình ở người và động vật

Dựa trên cơ sở xác định đặc tính glycoprotein bề mặt, yếu tố ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin viết tắt là H) và trung hoà (Neuraminidase viết tắt

là N) là những kháng nguyên có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ và

có tính đa dạng cao mà virus cúm type A được định phân type (WHO Expert committee, 1980) [31] Đến nay virus cúm type A chia thành 15 phân type trên cơ sở kháng nguyên ngưng kết H (H1- H15) và 9 kháng nguyên N (N1-N9) Trong mỗi một phân typ, lại có nhiều chủng virus khác nhau trong đó các

virus cúm lưu hành ở người đã được biết gồm 3 subtype HA (H1, H2 và H3)

và 2 phân typ NA (N1và N2) Đối với gia cầm chỉ có phân typ H5 và H7 của virus cúm là có độc lực cao, mặc dầu có rất nhiều chủng cũng thuộc hai phân type này phân lập từ chim có độc lực thấp [15] Các chủng virus gây bệnh trầm trọng trên gà được gọi là các chủng gây bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI) với tỷ lệ chết có thể lên tới 100%

- Thành phần hoá học của virus:

RNA của virus chiếm 0,8 - 1,1% ; protein: 70 - 75%; lipit: 20 - 24% và

5 - 8% hidratcacbon Lipit tập trung ở màng virus và chủ yếu là lipit có gốc phốt pho, số còn lại là cholesterol, glucolipit và hidratcacbon Thành phần protein chính của virus chủ yếu là glycoprotein

- Quá trình nhân lên: Quá trình sinh sản của virus được mô tả tóm tắt

như sau: Virus được hấp thụ vào bề mặt tế bào nhờ có receptor mà bản chất là glycoprotein chứa axit sialic, từ đấy virus chui qua màng tế bào nhờ 1 loại men đặc biệt để vào trong nguyên sinh chất và nhân tế bào Tại đây virus sinh trưởng nhanh chóng và phát triển theo phương thức nhân đôi

2.2.2 Tính đa dạng kháng nguyên

Virus cúm type A có đặc điểm đặc trưng là chúng thường có đột biến gen, dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên Hai khả năng đột biến của virus Cúm là:

* Đột biến điểm (còn gọi là đột biến ngẫu nhiên hoặc hiện tượng trôi trượt hoặc lệch lạc về kháng nguyên – antigenic drift) là kiểu đột biến xảy ra thường xuyên, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N tạo ra những sự thay đổi nhỏ về trình tự nuclêotit của gen mã hóa Kết quả là tạo ra các phân type cúm hoàn toàn mới Ví như quá trình dập dịch không triệt để, virus vẫn tồn tại trong đàn gia cầm và biến đổi Gia cầm và các động vật khác (kể cả người) có thể mắc các virus cúm biến dị này với hậu quả khó lường

* Đột biến do tái tổ hợp di truyền (còn gọi là đột biến thay đổi bản chất

kháng nguyên- antigenic shift) Đột biến này là sự tái tổ hợp di truyền xảy ra

định kỳ trong đó có sự sắp xếp lại các nuclêotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau Điều đó đã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus đời con so với virus bố mẹ Khi nhiều virus khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, các thế hệ virus được sinh ra sau đó có thể được sinh ra từ

sự tái tổ hợp của các gen bố mẹ xuất phát từ nhiều virus khác nhau Vì vậy do kiểu gen của virus cúm type A gồm 8 đoạn gen nên từ 2 virus bố mẹ có thể xuất hiện 256 tổ hợp của các virus thế hệ sau

2.2.3 Sức đề kháng của virus

Virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu và bị “chết” dễ dàng ở môi trường bên ngoài nếu như không được bảo vệ bằng các chất hữu cơ có trong nước bọt hoặc phân

Virus rất nhạy cảm với nhiệt độ và một số chất sát trùng thông thường:

ở nhiệt độ 56-60 độ chỉ trong vài phút là virus mất độc tính

ở 4oC, virus có thể “sống” ít nhất là 35 ngày trong các chất hữu cơ và khoảng 23 ngày trong thân thịt đông lạnh Người ta đã phân lập được virus từ nước ao, hồ là nơi các loài thủy cầm sinh sống Nếu nguồn nước không được

xử lý, nó sẽ là nguyên nhân lây nhiễm cho gia cầm khi gia cầm uống phải nước từ nguồn nước đó

Trong phủ tạng gà, virus tồn tại 24-39 ngày, ánh nắng chiếu trực tiếp sống được 40 giờ còn chiếu thường thì sống 15 ngày [8]

2.2.4 Độc lực của virus

Để đánh giá độc lực của virus cúm sử dụng phương pháp gây bệnh cho

gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng đã được gây nhiễm virus với tỷ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm (chỉ số IVPI) Điểm tối đa là 3 điểm và đó là virus có độ độc lực cao

nhất Theo qui định của tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) [27], bất cứ virus cúm nào có chỉ số IVPI > 1,2 trên gà 6 tuần tuổi, hoặc bất kỳ virus cúm nào thuộc subtype H5 hoặc H7 có trình tự acid amin trùng với trình tự acid amin của chủng độc lực cao là thuộc loại HPAI- độc lực cao Căn cứ vào độc lực, các nhà khoa học đã thống nhất chia virus cúm gồm 3 loại:

Virus có độc lực cao: Sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà, virus phải

làm chết 75 – 100% gà thực nghiệm Sau khi phân lập từ gà bệnh, virus phát triển tốt và gây bệnh tích tế bào trong môi trường nuôi cấy tế bào không có Trypsin Đối với chủng H5 và H7độc lực thấp, nếu mọc tốt trên môi trường tế bào không có trypsin, trình tự acid amin trùng với trình tự acid amin của đoạn

H chủng độc lực cao thì được xác định là chủng độc lực cao

Loại virus có độc lực trung bình : là những chủng virus gây dịch cúm

gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm

Loại virus có độc lực thấp (nhược độc) : là những virus phát triển tốt

trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch cúm nhưng không có triệu chứng lâm sàng

rõ rệt và không tạo ra bệnh tích đại thể, không làm chết gà

Trong thực tế người ta chia virus cúm gia cầm làm 2 loại: Loại virus có

độc lực thấp – LPAI và loại virus có độc lực cao – HPAI Các vụ dịch lớn đều

do virus HPAI gây ra thường là virus có kháng nguyên H5, H7, và H9 Riêng H5 và H7 thông thường bắt nguồn từ virus độc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút thì độc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn

Nghiên cứu ở mức độ phân tử cho thấy, khả năng lây nhiễm virus phụ thuộc vào tác động của men proteaza vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hoá học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết Tính thụ cảm của ngưng kết tố và

sự phá vỡ liên kết của men proteaza lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại điểm bắt đầu vỡ liên kết Các enzym giống Trypsin có khả năng phá

vỡ liên kết khi chỉ có 1 phần tử arginin, trong khi đó các men proteaza khác lại cần nhiều amino axit cơ bản, vì thế một số nước đánh giá độc lực của virus trên cơ sở gây nhiễm cho gia cầm và sau đó phân tích sự sắp xếp các amino axit của các virus

2.2.5 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gà

Virus cúm gà phát triển tốt trong phôi gà 9 – 11 ngày tuổi Trong nước phôi đó người ta thấy tập trung khá nhiều virus và có thể lưu giữ chúng sống

được trong nước phôi vài tuần ở điều kiện 40C Khả năng tồn tại của virus rất cao nếu bảo quản nước phôi đó ở - 700C hoặc cho đông khô

Virus cúm gà cũng phát triển tốt trong môi trường tế bào xơ phôi gà CEF (Chicken Embryo Fibroblast) và tế bào dòng có nguồn gốc thận chó MDCK (Madin-Darby-Canine -Kidney cells) với điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chứa Trypsin

2.3 Dịch tễ học bệnh Cúm ở loài chim

Vật chủ tự nhiên của virus cúm gia cầm là các loài gia cầm như gà, vịt, ngỗng, gà tây, gà Nhật, chim cút và chim trĩ Hiện nay vẫn chưa rõ nguồn bệnh tàng trữ chính xác ở đâu và người ta giả thiết do gia cầm tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với thủy cầm di cư Virus lây lan rất nhanh từ đàn gia cầm này sang gia cầm khác qua tiếp xúc trực tiếp Virus được bài thải theo phân và các dịch tiết từ mũi và mắt Hiện nay, vai trò của vịt như một vật tàng trữ mầm bệnh tự nhiên ở một số vùng châu á đã được xác nhận và đây là trở ngại rất lớn trong công cuộc phòng chống và tiêu diệt bệnh cúm gia cầm [13]

2.3.1 Động vật cảm nhiễm

Tất cả các loài chim thuần dưỡng (gia cầm) hoặc hoang dã (đặc biệt các loài thuỷ cầm di cư) đều mẫn cảm virus Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút) Phần lớn các loài gia cầm non đều mẫn

cảm với virus Cúm type A

Virus cúm của loài chim có thể gây bệnh cho các loài động vật có vú (lợn, ngựa ) và cả con người

Virus cúm type A phân bố trong hầu như tất cả các loài chim và động vật có vú từ loài sống trên cạn đến loài sống dưới nước (cá voi, hải cẩu ) Lợn mắc bệnh cúm thường do phân type H1N1, H3N3 Vịt nuôi cũng bị nhiễm virus cúm nhưng ít phát hiện do vịt có sức đề kháng với virus gây bệnh kể cả chủng có độc cao gây bệnh nặng cho gà, gà tây Tuy nhiên năm 1961 ở Nam Phi đã phân lập được virus cúm type A H5N1 gây bệnh cho cả gà và vịt

2.3.2 Động vật mang virus

Virus cúm đã phân lập được ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt, thiên nga, hải cẩu, vẹt, mòng biển, diều hâu, chim sẻ Tuy nhiên tần suất và

số lượng virus phân lập ở loài thủy cầm đều cao hơn ở các loài khác Kết quả

điều tra thuỷ cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non mang virus do tập hợp đàn trước khi di trú

Trong các loài thuỷ cầm di trú thì vịt trời có tỷ lệ bị nhiễm virus cao hơn các nhóm khác

Những kết quả điều tra về sự phân bố rộng của virus cúm typ A ở chim hoang dã và đặc biệt là vịt trời đã cho thấy: Sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và N của các phân typ virus cúm typ A diễn ra ở chim hoang dã Những virus này không gây độc đối với vật chủ, chúng được nhân lên ở đường ruột khiến cho các loài này mang virus và là nguồn gieo rắc virus cho các loài khác, đặc biệt là gia cầm

Cuối tháng 10/2004 FAO, OIE và WHO đã lưu ý các nước đã trải qua dịch cúm gia cầm H5N1 rằng vịt nuôi có thể đóng một vai trò quan trọng

trong việc làm lây lan chủng virus cúm gia cầm H5N1 thể độc lực cao cho các gia cầm khoẻ và rất có thể lây truyền virus trực tiếp cho người vì vật nuôi nhiễm virus, gà bệnh và gà có biểu hiện ốm bài thải một lượng virus xấp xỉ nhau nhưng vịt nuôi không thể hiện các triệu chứng lâm sàng bệnh lý Vịt có thể là con vật tàng trữ “thầm lặng” đối với virus cúm H5N1 gây bệnh thể độc lực cao cho gà Hiện tại, FAO và OIE đang phối hợp với nhau đánh giá vai trò của vịt nuôi nhằm đưa ra các chiến lược lâu dài với mục đích khống chế các ổ dịch cúm gia cầm ở châu Á

Virus H5N1 lưu hành ở một số khu vực châu á có độc lực đối với gà và chuột đã được tăng lên và virus này đã mở rộng phổ gây bệnh của nó trên cả loài mèo [13]

2.3.3 Sự truyền lây

Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêu hoá Sự truyền lây bệnh được thực hiện theo hai phương thức là trực tiếp và gián tiếp

Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nước uống bị nhiễm

Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim, thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển Đây là phương thức lây truyền chủ yếu [5]

Như vậy virus cúm dễ dàng lây truyền tới những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi Đối với các virus gây bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm thì sự truyền lây chủ yếu qua phân,

đường miệng

2.4 Miễn dịch chống bệnh của gia cầm

Hệ thống miễn dịch đóng vai trò quyết định trong phòng chống bệnh của loài chim Tổ chức và hoạt động của hệ miễn dịch của loài chim nói chung

và gia cầm nói riêng hoàn toàn tương tự như ở động vật có vú

Nhũng tế bào miễn dịch hiện diện ở các cơ quan lympho sơ cấp hoặc các cơ quan lympho thứ cấp Tuyến ức và túi fabricius là cơ quan sơ cấp, tại

đó tiền tế bào T và tiền tế bào B biệt hoá và trải qua quá trình chín Tuyến ức

là một cấu trúc phân thuỳ, mỗi tiểu thuỳ có 1 vùng vỏ ngoại vi là nơi các lympho bào tập trung dày đặc và 1 phần lõi trung tâm là nơi các lympho bào tập trung thưa hơn Túi Fabricius nằm ở trên lỗ huyệt và được tổ chức thành các nang, mỗi nang chứa đầy lympho bào Giống như trong tuyến ức, các lympho bào được tập trung ở vùng vỏ ngoại vi và ở phần tuỷ trung tâm

Những tế bào lympho chức năng rời cơ quan lympho sơ cấp và cư trú ở cơ quan lympho thứ cấp, những khu vực diễn ra các phản ứng miễn dịch do kích thích của kháng nguyên Cơ quan lympho thứ cấp, được xác định bởi sự

tụ hợp của các lympho bào và các tế bào trình diện kháng nguyên, phân tán rải rác khắp cơ thể Cơ quan lympho thứ cấp bao gồm lách, tuỷ xương, tuyến harder, hạch phổi, mô lympho ruột (hạch ruột) Túi Fabricius cũng hoạt động như một cơ quan lympho thứ cấp Gia cầm thiếu một số hạch bạch huyết tương đương của động vật có vú nhưng có một số hạch nhỏ dạng bạch huyết dọc theo mạch bạch huyết

2.4.1 Miễn dịch tự nhiên:

Gia cầm có cơ chế phòng chống tự nhiên rất phát triển Những hàng rào vật lý như da hoặc hệ lông nhầy bình thường ngăn cản tác nhân gây bệnh vào cơ thể Đối với mầm bệnh đầu tiên vào cơ thể, sự phòng thủ đầu tiên được cung cấp bởi cơ chế miễn dịch tự nhiên như các tế bào thực bào bao gồm các

đại thực bào, bổ thể và các tế bào giết tự nhiên (NK)

Các bổ thể là những thành phần không bền bởi nhiệt, hiện diện trong

huyết tương của gia cầm, là phần quan trọng và nhạy cảm của hệ phòng thủ của gia cầm chống lại mầm bệnh vi khuẩn Hệ bổ thể có thể hoạt động theo nhiều cách: bằng sự kết hợp kháng thể trên bề mặt của mầm bệnh hoặc protein

bổ thể tự hoạt hoá phân huỷ vi khuẩn

Những tế bào diệt tự nhiên của gia cầm là tế bào lympho hạt lớn và gây nên sự phá huỷ của tế bào đích gắn kháng thể ở gia cầm, tế bào diệt tự nhiên

có thể tái tạo ở nhiều nơi như lách, máu và ruột… là một phần của hệ thống phòng vệ ở gà, những biểu hiện của tế bào diệt tự nhiên biến đổi theo tuổi, hệ gen, độ phơi nhiễm với tác nhân nhiễm trùng hoặc sự hiện diện của các khối u

2.4.2 Miễn dịch đặc hiệu

Những mầm bệnh vượt qua hàng rào vật lý hoặc cơ chế phòng vệ miễn dịch tự nhiên sẽ kích thích một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đặc hiệu có tính đặc hiệu cao đối với tác nhân kích thích đặc hiệu Những tế bào

đặc hiệu trung gian giữ một hồi ức với những lần gặp gỡ sau với mầm bệnh thậm chí cả khi mầm bệnh không còn trong cơ thể và đáp ứng miễn dịch tương ứng đã tạm thời lắng xuống [1] Những tế bào nhớ có đáp ứng đối với lần phơi nhiễm sau đối với cùng mầm bệnh bằng cách kích thích một đáp ứng miễn dịch có tính đặc hiệu cao và rất nhanh chóng Chủng vaccine nhắc lại, sử dụng thường xuyên đối với gia cầm, đưa dến những ưu điểm của đáp ứng hồi

ức này

Tính hiệu quả chống bệnh của một vaccine phụ thuộc vào các phản ứng mạnh của hệ miễn dịch với vaccine

Trong miễn dịch qua trung gian tế bào , quan trọng nhất là các tế bào T,

tế bào B và các đại thực bào Tế bào T, các tế bào chính của miễn dịch trung gian tế bào, nhận biết kháng nguyên lạ sau khi kháng nguyên (như vi sinh vật)

đã được xử lý bởi các tế bào trình diện kháng nguyên

Sự nhận diện kháng nguyên của tế bào B không phụ thuộc vào quá trình

xử lý kháng nguyên Tế bào B có thể nhận dạng kháng nguyên khi nó tương tác với globulin miễn dịch nhô ra trên bề mặt tế bào Tế bào B có đáp ứng miễn dịch dịch thể và sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên

Hầu hết các vi sinh vật kích thích miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào, mặc dù kiểu miễn dịch tối ưu nhất cho phòng vệ có thể khác nhau

đối với từng loại

Miễn dịch dịch thể

Globulin miễn dịch ( Ig) hay kháng thể tiết bởi tế bào B cấu thành thành phần chính của miễn dịch dịch thể Kháng thể có thể hiện diện trong các loại dịch trong cơ thể nhưng được xác định (định lượng) trong huyết thanh hoặc huyết tương Gà có 3 lớp Ig chính: IgM, IgY, IgA

IgG của gia cầm lớn hơn của động vật có vú thường được gọi là IgY IgY có thể là tiền chất tổ tiên của IgE và IgG của động vật có vú

IgA là Ig quan trọng nhất trong miễn dịch thuộc màng nhày và tập trung nhiều nhất ở các bề mặt nhày IgA bảo vệ màng nhầy chồng lại các mầm bệnh đặc biệt là virus bằng cách trung hoà và ngăn cản sự liên kết của chúng với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào đích

IgM được tìm thấy trên bề mặt của hầu hết các tế bào B và là kháng thể

được sản xuất ra đầu tiên trong miễn dịch sơ cấp Sau đó các tế bào chuyển sang sản xuất IgG hoặc IgA (sự chuyển lớp) Khả năng gắn kết kháng nguyên của các kháng thể không thay đổi trong hoặc sau khi chuyển lớp Các cytokine IL-4, TGF-β và IFN-γ kích thích tế bào B trải qua sự chuyển lớp

Một đáp ứng miễn dịch điển hình của gia cầm bắt đầu bằng sự sản xuất

ra IgM Sau vài lần đáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgG IgG là kháng thể chính sinh ra trong miễn dịch thứ phát và chiếm ưu thế trong máu gia cầm

Có một số ý kiến cho rằng tế bào B sử dụng Ig bề mặt để gắn với kháng nguyên Mỗi tế bào B chỉ sản xuất ra chỉ 1 kiểu chuỗi nặng hay chuỗi nhẹ và

tương hợp với 1 loại kháng nguyên xác định Như thế, đối với kháng nguyên

để bắt đầu sản xuất kháng thể và mở rộng việc nhân lên, kháng nguyên phải phản ứng với tế bào B có thể hiện điểm tiếp nhận Ig tương đồng

Cơ chế phòng vệ của kháng thể chống lại mầm bệnh

- Trung hoà: Kháng thể liên kết và trung hoà với mầm bệnh đặc hiệu,

đặc biệt là các virus Những virus bị trung hoà không thể bám vào điểm tiếp nhận bề mặt của tế bào đích và bởi vậy bị ngăn cản tái tổ hợp

- Opsonin: Đối với mầm bệnh là vi khuẩn, có thể nhân lên ngoài tế bào, mầm bệnh có thể bị nuốt vào trong và phá huỷ bởi thể thực bào nếu mầm bệnh

bị bao bởi kháng thể

- Hoạt động bổ thể: Kháng thể bao quanh bề mặt mầm bệnh có thể hoạt hoá bổ thể và sản xuất protein bổ thể mới Protein bổ thể gắn với receptor của thể thực bào, kích thích cho sự thực bào và phân huỷ mầm bệnh

Các kháng thể dịch thể tồn tại trong cơ thể trong 1 thời gian nhất định Tuy vậy phải sau 1 thời gian nhất định sau khi kháng nguyên kích thích, thường là 5-7 ngày thì kháng thể mới xuất hiện Hàm lượng kháng thể sẽ đạt tới đỉnh cao nhất và sẽ được duy trì trong 1 thời gian rồi lại giảm dần

Những yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành kháng thể:

Sự hình thành kháng thể và quá trình đáp ứng miễn dịch phụ thuộc rất nhiều yếu tố như trạng thái sức khoẻ của cơ thể, điều kiện ngoại cảnh , sự chăm sóc nuôi dưỡng …Nhưng quan trọng hơn cả là phụ thuộc bản chất kháng nguyên [24] Có thể kể ra 1 số yếu tố ảnh hưởng chính đến sự hình thành kháng thể như sau:

+ Bản chất kháng nguyên: kháng nguyên có bản chất là protein và có tính kháng nguyên cao sẽ kích thích sinh kháng thể tốt

+ Đường xâm nhập của kháng nguyên: thường đường xâm nhập tốt nhất

là dưới da và trong bắp thịt

+ Liều lượng kháng nguyên: Lượng kháng nguyên đưa vào vừa đủ sẽ

kích thích cơ thể sản sinh miễn dịch ở mức tối đa mà không gây ức chế và tê liệt miễn dịch

+ Số lần đưa kháng nguyên vào cơ thể: Tiêm nhắc lại vắc- xin có tác dụng tốt, kháng thể sinh ra nhiều hơn và được duy trì trong thời gian lâu hơn

+ Chất bổ trợ: Chất bổ trợ cho vào khi chế vaccine với mục đích giữ và duy trì lượng kháng nguyên lâu trong cơ thể nhờ đó tạo kích thích liên tục,

đều đặn các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể ở mức cao và duy trì được lâu hơn Những chất bổ trợ thường dùng là keo phèn, nhũ tương, dầu khoáng, dầu thực vật, saponin…[28]

2.5 Tình hình sử dụng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới và khuyến cáo của tổ chức dịch tễ thế giới 2.5.1 Các loại vaccine phòng bệnh cúm gia cầm hiện nay

Một trong những khó khăn trong sản xuất vacxin cúm gia cầm là việc chọn virus, vì kháng nguyên H có tầm quan trọng về miễn dịch nhưng do có nhiều các phân type với tính đa dạng khi phân lập trong cùng 1 phân type và

sự xuất hiện của các phân type khác nhau khi đã trải qua nhiều năm

2.5.1.1 Vaccine truyền thống

Vaccine cúm gia cầm được nuôi cấy trong phôi gà, sau đấy được vô hoạt bằng hoá chất Kháng nguyên virus sau khi vô hoạt được bổ sung chất bổ trợ nhũ dầu để tăng khả năng đáp ứng miễn dịch Sự tương đồng giữa kháng nguyên trong vaccine và kháng nguyên của virus môi trường có cùng subtype

H (heamaglutinin tương đồng) sẽ quyết định hiệu lực của vaccine [30]

Việc sử dụng các vacxin vô hoạt đã đạt được những hiệu quả về phương diện sinh học và kinh tế ở một số nước

Những loại vaccine này ban đầu được sản xuất như các vaccine tự phát sinh, có nghĩa là vaccine chứa cùng những virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa Các loại vaccine này được sử dụng rộng rãi ở Mehico và Pakistan trong những trận dịch cúm gà [23]

Hiệu lực của những vaccine này trong việc ngăn ngừa bệnh và giảm lượng virus thải ra môi trường đã được chứng minh thông qua các nghiên cứu trên thực địa và các thử nghiệm

Nhược điểm của loại vaccine này là không thể phân biệt gia cầm được tiêm chủng với gia cầm tiếp xúc với mầm bệnh trên thực địa trừ khi có những con chưa được tiêm chủng được nhốt ở trong chuồng

* Vaccine vô hoạt dị chủng: Ví dụ như vaccine vô hoạt H5N2 của Intervet

(Hà Lan) và của Weike (Trung Quốc)

Những vaccine này được sản xuất tương tự như vaccine vô hoạt đồng chủng Điểm khác biệt là các chủng virus sử dụng trong vaccine có kháng nguyên H giống chủng virus trên thực địa, nhưng có Neuraminidase (kháng nguyên N) dị chủng

Sau khi tiếp xúc với virus trên thực địa, bảo hộ lâm sàng và giảm thải trừ virus ra ngoài môi trường được đảm bảo bằng phản ứng miễn dịch sản sinh bởi kháng nguyên nhóm H đồng chủng, trong khi kháng thể chống Neuraminidase sản sinh bởi virus thực địa có thể sử dụng như chất đánh dấu

sự lây nhiễm trên thực địa [25]

Khi so sánh hai loại vaccine đồng chủng và dị chủng như trên sẽ thấy mức độ bảo hộ lâm sàng và việc giảm thải trừ virus ra môi trường bên ngoài của vaccine đồng chủng được cải thiện hơn do khối lượng kháng nguyên trong vaccine cao hơn Đối với vaccine dị chủng, mức độ bảo hộ không chặt chẽ với mức độ đồng chủng giữa gen ngưng kết tố hồng cầu trong vaccine và chủng trên thực địa Đây là một ưu điểm lớn cho phép thành lập ngân hàng vaccine bởi giống gốc có thể chứa một chủng phân lập cùng dòng sẵn có trước khi có

dịch mà không chứa virus có mặt trên thực địa

2.5.1.2 Vacxin tái tổ hợp : Ví dụ như vaccine sống virus tái tổ hợp H5 Trovac

của Merial (Liên doanh Pháp-Mỹ) và H5N1 của Weike (Trung Quốc)

Một vài loại vaccine tái tổ hợp phối hợp virus đậu gà chứa kháng nguyên H5 đã và đang được nghiên cứu và phát triển và một vaccine gần đây

đã được cấp phép ở Mêxicô [23]

Một số thí nghiệm cho thấy có thể phối hợp virus đậu gà với kháng nguyên H7 [30] Một số virus khác có thể phối hợp với kháng nguyên H5 hoặc H7 như vaccine sử dụng virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILTV) Một ưu diểm của vaccine tái tổ hợp hoặc của vaccine chứa kháng nguyên H là sẽ không xảy ra phản ứng đối với phản ứng miễn dịch ngưng kết kép trên thạch Chính vì vậy các điều tra huyết thanh học khó có thể thực hiện

được đối với loại vaccine này

Vaccine tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa động vật nhiễm bệnh và

động vật tiêm chủng vaccine bởi vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên Nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gà Chỉ những

động vật nhiễm bệnh trên thực địa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotein) và phát hiện ra kháng thể này qua phản ứng kêt tủa ngưng kết trên thạch hoặc phản ứng ELISA

Việc sử dụng các văc xin này cũng được giới hạn với những loài mà virus đích sẽ nhân lên hoặc sẽ chỉ được giới hạn trong đàn gà có huyết thanh

âm tính với virus đích Ví dụ, ILTV sẽ không nhân lên ở gà tây và gà tây đặc biệt quan trọng trong vấn đề dịch tễ của bệnh cúm gà, việc sử dụng vaccine

được hạn chế ở vùng không có gà tây

2.5.1.3 Chiến lược DIVA

Lựa chọn vaccine tương đồng không hoàn toàn cho phép áp dụng chiến lược “DIVA” (Phân biệt con vật nhiễm bệnh và con vật được tiêm phòng) để cho thấy không có virus môi trường đang lưu hành trong đàn gia cầm dùng

vaccine Nhóm H tương đồng đảm bảo tính bảo hộ, còn khả năng phân biệt gà chủng ngừa và gà nhiễm bệnh dựa vào đáp ứng huyết thanh nhóm N bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Gà chủng ngừa chỉ dương tính với nhóm N dùng trong vaccine, còn nếu dương tính với nhóm N của virus môi trường cho thấy đã nhiễm bệnh Sự phát triển của các vaccine mới và các xét nghiệm khác cho phép phát hiện được sự lây nhiễm trên thực địa ở đàn đã tiêm chủng vaccine là 1 việc làm ưu tiên đối với công nghiệp dược và đối với các viện nghiên cứu bởi tiêm chủng vaccine đã là 1 giải pháp để khống chế bệnh cúm gà [7]

Nếu việc tiêm chủng vaccine được xem xét thì kế hoạch dự phòng phải

dự đoán trước được ngân hàng vaccine đã được cấp phép, cho phép bắt buộc thực hiện được chiến lược “Phân biệt con vật bị nhiễm bệnh với con vật tiêm chủng vaccine”, như vậy đảm bảo được sức khoẻ động vật, đối xử nhân đạo với động vật và thương mại quốc tế [9]

2.5.2 Yêu cầu cần đạt được đối với vaccine phòng bệnh cúm gia cầm

Mỗi loại vaccine phòng bệnh cúm gia cầm cần đạt được những yêu cầu cơ bản sau:

2.5.2.1 An toàn: Trong chế tạo vaccine, chỉ tiêu an toàn là chỉ tiêu cần được

coi trọng hàng đầu cần phải quan tâm An toàn của vaccine là khi dùng trên vật chủ không gây bệnh cho chúng và bệnh tích cho các cơ quan trong cơ thể gia cầm Tuy nhiên những biểu hiện phản ứng cục bộ hoắc toàn thân nhẹ trong một thời gian ngắn ( triệu chứng không đặc trưng) có thể được chấp nhận ở một số loại vaccine nếu sau đó con vật trở lại khoẻ mạnh và có miễn dịch Tính an toàn của một vaccine còn phụ thuộc vào thời điểm đưa vaccine vào cơ thể con vật [22]

Theo tiêu chuẩn của Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE), vaccine cúm gia cầm vô hoạt đạt tiêu chuẩn an toàn khi sử dụng 2 liều sử dụng trên 10 gà 3 tuần tuổi, theo dõi 2 tuần không có biểu hiện của bệnh cũng như bệnh lý cục

bộ [16]

2.5.2.2 Hiệu lực: Hiệu lực của vaccine còn có thể hiểu là khả năng kích thích

tạo miễn dịch đặc hiệu đủ sức chống bệnh của một vaccine ít nhất là trong giai

đoạn mẫn cảm với bệnh

Hiệu lực của vaccine phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó tính kháng nguyên của virus vaccine và tính đặc hiệu giữa kháng thể sinh ra và kháng nguyên là quan trọng nhất Những virus có tính kháng nguyên cao và giữ được tính kháng nguyên cao sau khi được chế làm vaccine thì khả năng kích thích miễn dịch càng cao [28]

2.5.3 Tình hình sử dụng vaccine cúm gia cầm trên thế giới

Mặc dù có một số loại vaccine đã được nghiên cứu và thử nghiệm trong phòng thí nghiệm về khả năng ứng dụng ngoài thực địa nhưng chỉ có hai loại vaccine được cấp giấy phép và được sử dụng đối với gia cầm: các vaccine virus cúm gia cầm toàn thân, vô hoạt và một vaccine vector virus đậu gà tái tổ hợp với gene AI H5 nhận từ virus AI của gà tây A/turkey/Ireland/83 Công nghệ sản xuất hai loại vaccine này đảm bảo vaccine đạt độ an toàn, tinh khiết

và hiệu lực theo yêu cầu Cả hai loại vaccine này đều đòi hỏi bắt và tiêm từng con vật [21]

Số lượng vaccine đã được sử dụng trên thực địa chưa được từng nước thông báo cụ thể, nhưng các nguồn tin đáng tin cậy cho rằng Mexico đã sử dụng 1 tỷ 300 triệu liều vaccine vô hoạt và 850 triệu liều vaccine tái tổ hợp

đậu gà trong chương trình sử dụng vaccine chống bệnh cúm gia cầm từ tháng

1 năm 1995 và đã thanh toán được bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao do virus H5N2 vào tháng 6 năm 1995 mặc dù virus H5N2 thể độc lực thấp vẫn lưu hành In đô nê xia cũng sử dụng vaccine AI H5 vô hoạt Từ 1995 Pakistan bắt

đầu sử dụng vaccine phòng chống cúm gia cầm ở các ổ dịch H7N3 thể độc lực cao (1995, 2001 và 2004) Các vaccine vô hoạt chế tạo từ chủng virus H9N2

độc lực thấp đã và đang được sử dụng ở một số nước châu á, vùng Cận Đông

và Đông Âu Gần đây, vaccine vô hoạt nhũ dầu H7 đã được dùng cho các vùng có nguy cơ cao ở phía Bắc Italy và tại một công ty nuôi gà con một ngày tuổi ở Mỹ

*Trung Quốc: là nước sử dụng vaccine nhiều nhất với số lượng 2 tỷ

830 triệu liều (tính từ tháng 12 năm 2003 đến tháng 4 năm 2005) Trung Quốc

đã có bản tường trình về kết quả của 3 vaccine đang được sử dụng tại Trung Quốc, được tóm tắt như sau:

+ Vaccine vô hoạt AI (chủng H5, N-28) Bộ Nông nghiệp Trung Quốc

đã phê chuẩn vaccine này là một sản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 12 năm 2003 Vaccine này đã được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao vào đầu năm 2004

+ Vaccine vô hoạt virus cúm gia cầm tái tổ hợp (sub-typ H5N1,

chủng Re-1) Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đã phê chuẩn vaccine này là sản

phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 1 năm 2005 Vaccine rất có hiệu quả đối với bệnh cúm gia cầm, kích thích gia cầm sản xuất kháng thể với hiệu giá cao hơn và thời gian bảo hộ dài hơn Các thực nghiệm đã chứng minh rằng thủy cầm được tiêm chủng vaccine này không bị nhiễm và không bài thải virus cúm gia cầm Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật này để chế tạo chủng virus vaccine nhưng chỉ có Trung Quốc là thành công và đã thương mại hóa được vaccine

+ Vaccine sống virus đậu tái tổ hợp phòng cúm gia cầm (H5) Bộ

Nông nghiệp Trung Quốc đã phê chuẩn vaccine này là một sản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 1 năm 2005 Sử dụng vaccine này có thể phân biệt

được miễn dịch do vaccine hay bị nhiễm tự nhiên

2.5.4 Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vaccine phòng chống cúm gia cầm

Đối với bệnh cúm gia cầm, việc sử dụng, tiêm chủng vacxin như một giải pháp, một công cụ hỗ trợ tích cực để ngăn chặn, khống chế và tiến đến

thanh toán bệnh cúm gia cầm ở vùng nhiễm bệnh [20] Theo quan điểm của OIE [27], WHO [31], FAO [26], vaccine nên được sử dụng như là một biện pháp trong chiến lược toàn diện phòng chống bệnh cúm gia cầm mà chiến lược đó bao gồm:

Lưu ý trước khi sử dụng vaccine:

- Vaccine phải cùng subtyp hemagglutinin và phải được chứng minh trên bản động vật là có đủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập của virus thực địa

- Vaccine phải được sản xuất theo công nghệ đã tiêu chuẩn hóa để đảm bảo có một vaccine hiệu quả và phù hợp về chủng virus

- Cần có các hoạch định trước về bảo quản tốt vaccine, phân phối và sử dụng vaccine

- Đảm bảo được việc giám sát huyết thanh học và virus học để xác định virus cường độc có lưu hành trong đàn gia cầm được dùng vaccine hay không

- Phải có một kế hoạch loại trừ (exit strategy) để phòng tránh việc sử dụng vĩnh viễn vaccine

Lưu ý khi dùng vaccine virus toàn thân vô hoạt:

- Cần một lượng kháng nguyên đủ để kích thích một đáp ứng miễn dịch phòng hộ

- Cần đảm bảo an toàn sinh học cho nhân viên tiêm phòng vaccine ngoài thực địa để ngăn ngừa sự lây lan của virus cường độc

Ưu điểm của tiêm chủng:

- Giảm đáng kể virus bài xuất trong đàn gà nhiễm bệnh

- Giảm thiểu nhu cầu loại thải những đàn gia cầm khoẻ mạnh

- Là phương án thay thế khả thi đối với những đàn gà có giá trị cao và

gà chăn nôi gia đình, gà cảnh

- Giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm công nghiệp

Nhược điểm của việc tiêm chủng:

- Không phù hợp với qui định thương mại quốc tế Tiêm chủng được chấp nhận như một biện pháp khống chế dịch Cúm gà của OIE

- Những đàn gà tiêm chủng không biểu hiện triệu chứng lâm sàng bệnh Cúm

- Giám định virus bằng kỹ thuật PCR

2.6.1 Chẩn đoán huyết thanh học

Phản ứng huyết thanh học dùng để nhận biết các kháng thể có từ 7 - 10

ngày sau khi chủng vaccine Chúng ta có thể sử dụng các phương pháp chẩn

đoán như phản ứng ngưng kết hồng cầu -HA (Hemagglutination test), phản

ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - HI (Hemagglutination inhibition test) Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu- HI:

Phản ứng này được ứng dụng để:

- Chẩn đoán bệnh cúm gia cầm: xác định type hoặc subtype của chủng virus Cúm phân lập với các kháng thể đặc hiệu đã biết (mẫu kiểm tra là nước

trứng hoặc môi trường tế bào thu hoạch sau khi tiêm truyền bệnh phẩm)

- Phát hiện kháng thể cúm gia cầm với subtype của chủng virus Cúm bị nhiễm hoặc sau khi sử dụng vaccine phòng bệnh (mẫu kiểm tra là huyết thanh)

2.6.2 Chẩn đoán virus học

Phân lập virus và xác định virus cúm gia cầm typ A là hết sức cần thiết

và bắt buộc trong chẩn đoán bệnh [14]

* Phân lập virus bằng tiêm truyền trên phôi trứng

Phương pháp phân lập virus thích hợp là tiêm truyền qua phôi trứng gà hoặc tế bào nuôi cấy

Tiêm 0,1 - 0,3ml nước bệnh phẩm vào túi niệu của phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, hàn kín và tiếp tục cho ấp ở nhiệt độ 370C trong 2 - 3 ngày

Một số ít chủng virus có độc lực cao có thể gây chết phôi khoảng 18-24 giờ, trứng thu hoạch để ở nhiệt độ 40C qua một đêm Virus nhân lên trong nước trứng có hiện tượng ngưng kết hồng cầu gà Nếu không gây ngưng kết hồng cầu thì có thể lấy nước trứng thu được tiêm lần 2 cho phôi gà.Phần lớn các phôi bị tạp khuẩn sẽ chết trước 24 giờ phải bỏ đi Những phôi sống sau 24h tiếp tục được theo dõi đến 72h

Lấy nước phôi từ những phôi chết trong khoảng 48h và sau 48h hoặc từ phôi chưa chết đến 72h vào việc giám định virus Đây là khoảng thời gian mà

được dùng để tổng hợp nên cDNA như vậy Do đó quá trình nhân hệ gen RNA của virus Cúm được gọi là RT- PCR Phản ứng RT-PCR cần có một cặp oligonucleotides, hoặc còn gọi là primer (cặp mồi); 4 deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs); RNA khuôn mẫu, men Rt và Taq DNA polymerase Hỗn hợp phản ứng trước tiên được làm nóng tới 600C, sau đó làm mát tới nhiệt

độ 420C để primer forward (tiến về trước) gắn vào chuỗi RNA đích Primer đã gắn sau đó được kéo dài ra với RT để tổng hợp cDNA có độ dài đầy đủ ở nhiệt

độ 500C Hỗn hợp DNA/RNA sẽ trải qua 25 - 30 vòng gồm các giai đoạn tách sợi, gắn vào và kéo dài Men Taq DNA là một loại men polymerase bền nhiệt không bị phá huỷ bởi nhiệt độ nóng và không cần phải thay thế ở mỗi vòng của chu trình nhân lên Do sản phẩm của mỗi 1 vòng nhân lên sẽ làm khuôn mẫu cho vòng tiếp theo, nên mỗi vòng sẽ nhân đôi số sản phẩm DNA mong muốn

Cặp primer được sử dụng trong phản ứng PCR được thiết kế dựa trên cơ

sở của chuỗi gen đã biết Do các chuỗi HA của các type/ subtype của các rút Cúm khác nhau cũng khác nhau nên có thể thiết kế các primer PCR để nhân lên một cách đặc hiệu của RNA của một type hoặc subtype

Mẫu bệnh phẩm : là dịch ổ nhớp, phân, hoặc mẫu bệnh phẩm phân lập

từ trứng hoặc môi trường tế bào

3 Nội dung - nguyên liệu

và phương pháp nghiên cứu

3.1 Nội dung

3.1.1 Kiểm nghiệm vaccine cúm gia cầm ngoại nhập

- Đánh giá chỉ tiêu thuần khiết của vaccine cúm gia cầm H5N2 nhập từ

Hà Lan và vaccine cúm gia cầm H5N2 nhập từ Trung Quốc

- Đánh giá chỉ tiêu an toàn của vaccine cúm gia cầm H5N2 ngoại nhập trên gà

- Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực của vaccine cúm gia cầm H5N2 trên gà

3.1.2 Khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm H5N2 ngoại nhập

- Khảo sát ảnh hưởng của vaccine cúm gia cầm H5N2 ngoại nhập ở đàn

gà đẻ trứng thương phẩm qua các chỉ tiêu: trọng lượng gà, tỷ lệ đẻ, tỷ lệ chết của đàn gà được tiêm vaccine

- Giám sát sự lưu hành của virus cúm H5N1 trên đàn gà khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm vô hoạt H5N2

- Khảo sát diễn biến của hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên cúm H5 của đàn gà được tiêm vaccine

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng kháng nguyên cúm H5 của đàn gà tại các thời điểm 0, 3, 4, 6, 8, 14, 16 tuần sau khi tiêm vaccine lần thứ nhất

3.2.2 Vaccine

Vaccine vô hoạt chống bệnh cúm gia cầm chủng H5N2 của Hà Lan và của Trung Quốc

- Vaccine của Hà Lan: Vaccine Nobilis Influenza H5N2 dạng nhũ dầu

Đây là vaccine chứa kháng nguyên vô hoạt virus cúm gia cầm độc lực thấp chủng Mexico, subtype H5N2

- Vaccine của Trung quốc: Vaccine H5N2 dạng nhũ dầu màu trắng sữa

Đây là vaccine chứa kháng nguyên vô hoạt cúm gia cầm subtype H5N2 (theo

ký hiệu của nhà sản xuất: H5N28): A/ gà tây/ Anh/N28/73

3.2.3 Các trang thiết bị và cơ sở vật chất

Các trang thiết bị và cơ sở vật chất của các phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Kiểm nghiệm vaccine

Vaccine được kiểm nghiệm để đánh giá các chỉ tiêu thuần khiết, an toàn

và hiệu lực tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I [4], so sánh với hồ sơ kỹ thuật của các nhà sản xuất [25]

3.3.1.1 Chỉ tiêu thuần khiết

Vaccine cúm gia cầm của Trung Quốc và vaccine cúm gia cầm của Hà Lan được kiểm tra trên các môi trường cơ bản: nước thịt, nước thịt gan yếm khí, thạch thường và thạch nấm, mỗi loại 2 ống Sau khi cấy, các môi trường

được bồi dưỡng ở nhiệt độ 370C, riêng thạch nấm để ở nhiệt độ phòng

(25-300C) Môi trường đã cấy kiểm tra được theo dõi trong 7 ngày, sau đó đọc kết quả

3.3.1.2 Chỉ tiêu an toàn

+ Vaccine cúm gia cầm Trung Quốc: Trong thí nghiệm này, chúng