nghiên cứu tối ưu hóa quy trình và ứng dụng phương pháp fpt xác địnhkháng sinh tồn dư trong thịt trứng sữa

DANH MUC CAC BANG Kháng sinh lựa chọn thí nghiệm trên các nhóm Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các trại chăn nuôi Các loại kháng sinh đang được sử dụng ở các trại chăn nu

BAO CAO NGHIEM THU

TEN DE TAI:

NGHIEN CUU TOI UU HOA QUY TRINH VA UNG DUNG PHƯƠNG PHÁP FPT XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH TÒN DƯ TRONG THỊT, TRƯNG, SỮA

CHU NHIEM DE TAI: TS NGUYEN TH] HOA LY

LỜI CÁM ON

Trân trọng cảm ơn

~ Sở Khoa Học Công Nghệ Tp.HCM đã cấp kinh phí để thực hiện dé tai

—— PGS.TS Trần Đình Từ, PGS.TS Nguyễn Linh Thước dã góp nhiều ý

kiến giúp đỡ hoàn thiện để cương nghiên cứu và báo cáo

— "Th§ Đinh Minh Hiệp Chuyên viên Quản lý khoa học công nghệ Sở KIICN Tp.HCM đã giúp đỡ, động viên chúng tôi trong quá trình thực

hiện đề tài — —

— — Xin cám ơn chỉ cục thú y Tp.HCM, Trung tâm Thú Y Vùng Tp.HCM

— Khoa CNTY trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, đã giúp đỡ chúng tôi

—_ “Trung tâm phân tích thí nghiệm Sở Khoa Học Công Nghệ TP đã nhận xét nghiệm mẫu cho đê tải

Chú nhiệm đề tài

TS NGUYEN THI HOA LY

iii

2.2.1 Các yếu tế ảnh hưởng đến tồn dư kháng sinh

222 Ảnh hưởng của du lượng kháng sinh đôi với sức khỏe cộng đông

2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯƠNG KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM

2.3.1 Sac ky (Chromatography)

2.3.2 Phương pháp mién dich enzyme (ELISA)

2.3.3 Miễn dịch phóng xạ (Radio Immuno Assay)

2.3.4 Phương pháp sử dung vi sinh vat: FPT (Frontier Post tesf) -s+

24 CÁC NGHIÊN CỨU VẺ DƯ LƯỢNG KHẲNG SINH TRONG THIT GIA SÚC, GIÁ CẢM 12

2.4.1 Nghiên cứu trong nước 12

2.4.2 Nghiên cứu ở nước ngoà

CHƯƠNG HI: NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CỨU + seSeererrrirereareeree 15 BAL ĐỊA ĐIỂM ì ì eeeeerenreennrrittrrrieeereeeeerreterrelrttireere110007 15

3.2 THỜI GIAN THÍ NGHIỆM

4.1.1 Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các trại chăn nuôi tại Tp Hồ Chí Minh, Bình

Dương Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu

4.1.2 Phân tích về cơ sở của việc lựa chọn kháng sinh trong các hộ chăn nuôi -erreeerrrrrrr 35

42 TỎLƯU HÓA QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH KHÁNG SINH TÒN DƯ

4.2.1 'Thí nghiệm I Lựa chọn môi trường nhạy cam

4.2.04 Lựa chọn môi trường cho Penicillin

42.12 Lựa chọn môi trường cho Streptomycin

4.2.1.3 Lựa chọn mỗi trưởng cho Tetracyclin

4.2.1.4, Lựa chọn môi trường cho Sulfamethazin

4.2.1.5 Lựa Chọn HÔI t"ƯỜnNG cho Erythromycin

4.2.1.6 Lựa chọn môi trưởng cho Flumequin, Enrofloxacin

4.2.2 Thi nghiém 2 Chon nhiét độ và thời gian thích hợp cho phương pháp - - -„42

43 BẢN ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH TỒN DƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP FPT

443.1 Hân định lượng trên mẫu thịt tÂm kháng sỉnh

4432 Bán định lượng kháng sinh tổn dư trên sữa gẫy

4.3.3 — Bán dịnh lượng kháng sinh tôn dư trên mẫu trừng

4.4, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH HƯỚNG CÁC KHÁNG SINH KHI PHÓI HỢP CÁC MÔI TRƯỜNG50

4.4.1 Định hướng kháng sinh phát hiện 0 4.4.2 Kết quả kiểm tra KSTD mẫu bán định lượng so với HPUC

4.4.3 “T¡ lệ mẫu đương tính trong, kiểm tra thực tế bằng phương pháp ví sinh vat

444, Két qua mau kiém tra thuc tế so với HPLC «-~ ceeeerrrrerrrierr

4.6 CHUYEN GIAO KY THUAT CHO CO so

4.6.1 Tập huấn cho cán bộ Chỉ cục trong vùng về phương pháp kiêm tra tôn dư kháng sinh trong thịt, trứng, sữa

4.6.2

4.7, XÂY DỰNG QUY TRINH KIEM TRA TON DU KHANG SINH

4.7.1 Đối tượng và phạm vỉ áp đdụng àì.ceerrrrrrrrrrrrrm

4.7.2 Quy trình định tính và bản định lượng kháng sinh tồn dự

4.73 Quy trình định hướng sơ bộ nhóm KSTD trước khi phân tích bằng HPLC

Hình 3.4 Vì khuẩn S.aureus ATCC 6538P trên môi trường GTS Hình 3.5 Chủng các vi khuẩn gốc trên môi trường thạch ban cé thé Hinh 3.6 Ching cac vi khuẩn gốc đông khô

Hình 3.7 Ly tâm vi khuẩn nhạy cảm

Hình 3.8 Thao tác trích nước thịt kiểm tra KSTD

Hình 3.9 Thao tác nhỏ nước thịt vào các giếng trên đĩa thạch Hình 3.10 Phản ứng trên môi trường 15787/pH7.2/Bs

Hình 3.11 Mẫu kháng sinh dương tính trên thịt

vii

DANH MUC CAC BANG

Kháng sinh lựa chọn thí nghiệm trên các nhóm

Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các trại chăn

nuôi

Các loại kháng sinh đang được sử dụng ở các trại chăn nuôi gà Các loại kháng sinh dang dược sử dụng ở các trại chăn nuôi heo Các loại kháng sinh đang được sử dụng ở các trại bò

Cơ sở của việc lựa chọn kháng sinh trong điều trị

Kích thước vòng vành khăn của 3 loại kháng sinh nhóm beta lactam trên các môi trường ở 37C / 16 giờ (nỗng độ 10C)

Kích thước vòng vành khăn của streptomycin va gentamycin trén

các môi trường ở 37C / 16 gid (nồng độ 10C)

Kích thước vòng vành khăn của tetracyclin trên các môi trường ở

Kích thước vòng vành khăn của flumequin và enrofloxacin trên

- các môi trường ở 37”C/ l6 giờ (nồng độ 10C)

KTVVK trên 2 mức nhiệt độ 37°C và 30°C

Kết quả bán định lượng trên mẫu thịt

Kết quả bán định lượng KSTĐ trên sữa gay

viii

hiện thấp nhất trên thịt

KTVVK của các kháng sinh ở nồng độ từ thấp đến cao khi phối

hợp trên 5 môi trường đã chọn Định hướng kháng sinh phát hiện khi phối hợp 5 môi trường,

So sánh kết quả bán định lượng KSTD bằng FPT và HPLC

Tï lệ mẫu dương tính kiểm tra thực tế bằng FPT

Kết quả kiểm tra bằng HPLC sau khi định hướng kháng sinh tồn

dư

Kết quả theo dõi độ nhạy của bộ FPT

DANH MUC CAC BIEU DO

Biéu dé 4.1 Tinh str dung khang sinh trong trai ga Biểu đồ 4.2 Tình sử dụng kháng sinh trong trại heo Biển đồ 4.3 Kích thước vòng vành khăn trên các môi trường Biểu đồ 4.4.KTVVK của Sulfamethazine trên các môi trường Biểu đồ 4.5 KTVVK của Erythromycin và Tylosin trên các môi trường Biểu đồ 4.6 KTVVK của Flumequin và Enrofloxacin trên các môi trường

Biểu đỗ 4.7 KTVVK của peniciilin ở 2 mức nhiệt độ

Biểu đồ 4.8 T¡ lệ (%) mẫu dương tính theo thời gian Biểu đồ 4.9 T¡ lệ mẫu dương tính kiểm tra thực tế bằng phương pháp FPT

CAC TU VIET TAT

ELISA:Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay: Mién dich hap thu nối kết

enzym FAO : Food and Argriculture Organisation: Tổ chức nông lương thể giới FPT : Frontier Post Test

MRL :Maximum Residue Limit: gidi han tn dư tối đa HPLC: High Performance Liquid Chromatoghrapphy

Ul: International Unit: đơn vi quéc té KTVVK: kích thước vòng vành khăn

VSV: Vi sinh vat

KSTD: khang sinh ton du KHCN: khoa học công nghệ BS: Bacillus subtilis

BC: Bacillus cereus ML: Micrecoccus luteus EC: E.coli

SA: Staphylococcus aureus

VK: Vi khuan ADI: Acceptable daily intake -lượng ăn vào hàng ngày ( pe/Ke trong lugng )

LOD :Limit of detection.Giới hạn xác định

n: Số lượng mẫu

ND : Not detected PPB: Parts per billion (10° )

PPM: Parts per million (10° )

NA: Nutrient agar

PCA : Plate count agar MHA :Mueller Hinton Agar

MT N° 11: Antibiotic N° 11 medium

MT N° 5: Antibiotic N° 5 medium TSA :Tryptone Sojbean agar AOAC : Association of official Analysis Chemical

CHUONG I: MO DAU

1.0) TINH CAP THIET CUA DE TAI

Vấn đề kháng sinh tồn dư trong thực phẩm đang là mỗi lo ngại cho cơ quan quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm (ANVSTP) và người tiêu dùng bởi vì

nó không chí ảnh hưởng dến chất lượng sản phẩm, sức khỏe cộng dồng mà nó còn là rào cản khắc nghiệt dỗi với các doanh nghiệp xuất khâu sản phẩm dộng vật sang EU và Mỹ Năm 2002, Trung Quốc đã bị cấm xuất khẩu thủy sản sang EU sau cuộc thanh tra của tổ chức an toàn vệ sinh thực phẩm Châu Âu Lượng kháng sinh tồn dữ trong thịt gia súc gia cằm bị ảnh hưởng bởi điều kiện

vệ sinh môi trường, lượng kháng sinh bỗ sung vào khẩu phần thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y phòng trị bệnh, quy trình kỹ thuật chăn nuôi và chế biến

Trong những năm vừa qua, một số nghiên cứu về kháng sinh tồn dư trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được công

bố Đây là phương pháp hiện đại có độ chính xác cao, được cả thế giới công nhận Tuy nhiên ở Việt Nam, do đặc điểm người chăn nuôi sử dụng rất nhiều chủng loại kháng sinh trong thức ăn và điều trị gia súc, nguồn gia súc lại được thu gom từ nhiều nơi khác nhau đưa về lò giết mỗ, do đó việc lựa chọn kháng

sinh để xét nghiệm bằng HPLC khó khăn, đôi khi có sự nhầm lẫn chưa kể giá

xét nghiệm bằng phương pháp này khá cao, không thể thực hiện tại các vùng

xa, thiếu trang thiết bị Song song với phương pháp HPLC, người ta còn dùng phương pháp FPT để xác định kháng sinh tồn dư trong thịt, gan và một số loại sản phẩm động vật khác Ưu điểm của phương pháp này là rẻ tiền, đơn giản,

dễ áp dụng, có thể áp dụng rộng rãi cho các Chỉ cục thú y trong công tác kiểm

soát an toàn vệ sinh thực phẩm

EPT test để định tính và bán định lượng kháng sinh tồn dư trong thịt gia

súc, gia cầm rất thích hợp với các phòng thí nghiệm của các Chỉ cục bởi

những ưu điểm nổi bật: đễ sử dụng, độ chính xác khá cao

FPT test còn có tác dụng như một lưới sàng để định hướng các nhóm kháng sinh cần kiểm tra băng HPLC trong trường hợp không biết chính xác loại kháng sinh nào được sử dung cho gia súc

Không chỉ ở Việt Nam, nhiều nước tiên tiến trên thế giới như Singapore,

Đức, Pháp cũng sứ dụng FPT để sàng lọc trước khi dùng HPLC

Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐÈ TÀI

Đề tài không phải là một phát hiện mới về EPT bởi vì đã có nhiều tác giả

trong và ngoài nước sử dụng phương pháp này để phát hiện tồn dư kháng sinh trong thực phẩm (thịt, trứng, thủy sản)

dược

MỤC TIỂU CỦA ĐÈ TÀI

Xác định nghiệm thức: loại môi trường, vi khuẩn nhạy cảm, nhiệt độ,

thời gian thích hợp cho phương pháp FPT

Tạo ra bộ FPT dùng để định tính và bán định lượng ton du khang sinh

trong thịt, trứng, sữa, đồng thời định hướng loại kháng sinh cần định

lượng bằng phương pháp HPLC

Xây dựng được quy trình xác định kháng sinh tổn dư trong sản phẩm động vật cho các phòng thí nghiệm kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm

1.4

Mỗi tác giả, tùy điều kiện thực tế của nước mình mà lựa chọn một số môi

trường nhất định cho việc xác định những loại kháng sinh quốc gia đó sử dụng Khác với Việt Nam, các nước phát triển sử dụng kháng sinh phải tuân theo những quy định rất nghiêm ngặt về liều lượng, chủng loại

kháng sinh được sử dụng

Từ trước tới nay chưa có tác giả nào nghiên cứu bán định lượng tồn dư kháng sinh bằng FPT, vì vậy chúng tôi tiễn hành nghiên cửu hầu xác định lượng kháng sinh tồn dư thấp nhất mà phương pháp có thể phát hiện

được

MỤC TIỂU CỦA ĐỆ TÀI

Xác định nghiệm thức: loại môi trường, vi khuẩn nhạy cảm, nhiệt độ,

thời gian thích hợp cho phương pháp FPT

Tạo ra bộ FPT dùng để định tính và bán định lượng tồn dư kháng sinh

trong thịt, trứng, sữa, đồng thời định hướng loại kháng sinh cần định lượng bằng phương phap HPLC

Xây dụng được quy trình xác định kháng sinh tồn dư trong sản phẩm động vật cho các phòng thí nghiệm kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm

án tổng hợp hay tổng hợp) có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẫn

bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) bằng cách tac dong shuyén biét trén mot giai doan chuyén hóa cần thiết của vi sinh vật

Theo Puyt (1996), kháng sinh được phân loại thành các nhóm sau:

~ Nhom beta-lactamin: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin

— Nhom aminoglycosid: streptomycin, gentamycin, kanamycin, neomycin

— Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin

— Nhóm tetracycln: tetracyclin, oxytetracycln, chỈotetracyclin, doxycyclin

— Nhom phenicol: chloramphenicol, thiamphenicol

— Nhom macrolid: erythromycin, spiramycin, tylosin

~_ Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolid: lincomycin, virginiamycin

—_ Nhóm sulfamid: sulfaguanidine, sulfacetamide, sulfamethazine

— Nhóm diaminopyrimidin: trimethoprim, diaveridin, pyrimethazine

— Nhom quinolon: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin, enrofloxacin

— Nhóm nitrofuran: nitrofurazol, furazolidon, furaltadon

— Cac nhom khac: glycopeptide (vancomycin), pleuromutilin (tiamulin), poly-ether ionophore (monensin, salinomycin

chuyển hoá và thải trư

e Dugc động học của các chất kháng sinh

Sơ dễ 2.1 Sự phân bố và chuyển hoá kháng sinh trong cơ thể động vật

(Đào Văn Phan, 2003)

sinh

dễ hấp thu hơn dạng dầu, dịch keo hoặc dạng cứng

Dược động học nghiên cứu các quá trình chuyển vận của kháng sinh

từ lúc hấp thu vào cơ thể cho đến khi bị thải trừ hoàn toàn Theo Đào Văn

Phan thì quá trình dược động học gồm các quá trình: hấp thu, phân bố,

Tác

dụng

Hấp thu là sự vận chuyển kháng sinh từ nơi dùng kháng sinh vào máu

để rồi đi khắp cơ thể tới nơi tác dụng Như vậy sự hấp thu phụ thuộc vào:

— D6 hoa tan của kháng sinh: kháng sinh dùng dưới dạng dung dịch nước

—_ Độ pH tại chỗ hấp thu: vì có ảnh hưởng đến độ hoà tan và độ ion hoá

— Néng d6 cha khang sinh: nông độ càng cao hấp thu càng nhanh

—_ Tuần hoàn tại vùng hấp thu: càng nhiều mạch máu thì sự hấp thu càng

Quá trình phân phối kháng sinh phụ thuộc vào tuần hoàn khu vực, tùy

theo sự tưới máu

Hai loại yếu tố có ảnh hưởng đến sự phân bố kháng sinh trong cơ thể:

—_ Về phía cơ thể: tính chất màng tế bio, mang mao mạch, số lượng vị trí gắn thuốc và pH của môi trường

—_ Về phía kháng sinh: trọng lượng phân tử, tỉ lệ tan trong nước và trong lipid, tinh acid hay base, độ ion hóa, ái lực của kháng sinh với thụ thể

(receptor)

e Sự chuyển hoá kháng sinh trong co thể động vậi

Mục đích của sự chuyển hoá kháng sinh là để thải trừ chất lạ (kháng

sinh) ra khỏi cơ thể Kháng sinh là những phân tử tan dược trong chất béo

(lipid), không bị ion hoá, dễ thấm qua màng tế bào, gắn vào protein huyết tương và được giữ lại trong cơ thể Muốn thải trừ, cơ thể phải chuyển hoá những kháng sinh này sao cho chúng trở thành những phân tử có cực, dễ bị ion hoá do đó íL tan trong mỡ, khó gắn vào protein, khó thấm vào tế bào, và

vì thế tan nhiều hơn ở trong nước, dễ bị thải trừ

Nơi chuyển hoá và các cnzyme chính xúc tác cho chuyển hoá

— Niêm mac rudl protease, lipase, decarboxylase

— Huyét thanh: esterase

—_ Phổi: oxydase

—_ Vị khuẩn ruột: reductase, decarboxylase

—_ Hệ thần kinh trung udng: monoamine oxydase, decarboxylase

— Gan là nơi chuyển hoá chính, chứa hầu hết các enzyme tham gia

chuyển hoá chất kháng sinh

e Sự thải trừ kháng sinh

Kháng sinh được thải trừ dưới dạng nguyên chất hoặc đã bị chuyển hoá

— Thải trừ qua thận: là đường thải trừ quan trọng nhất của các thuốc tan

© Sw dung khang sinh

Su dụng kháng sinh hợp lý cần tuân thủ các nguyên tắc của sử dụng kháng sinh trong danh mục cho phép, sử dụng kháng sinh trong trường hợp nhiễm khuẩn hoặc đề phòng nhiễm khuẩn lựa chọn kháng sinh thích hợp với

loại tế bào mầm bệnh Để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu

dùng, người chăn nuôi phải tuân thủ nghiêm ngặt thời gian ngưng thuốc

2.2 GIỚI HẠN TỎN DƯ KHÁNG SINH TRONG THỊT

Giới hạn tồn dư tối đa (MRL) hay mức độ cho phép (tolerance) là nồng

độ mà các chất hóa học hay thuốc trong mô (hoặc trứng, sữa) phải giảm đến

mức này để mô của vật nuôi, trứng hoặc sữa được đánh giả là an toàn cho người tiêu dùng (Riviere, 991) MRL được tính bằng hàm lượng chất tồn dư

so với khôi lượng mô (mg/kg hoặc ng/kg hoặc ppm)

2.2.1 Các yếu tô ảnh hướng đến tồn dư kháng sinh

— Liều kháng sinh cung cấp cho thú: liều dùng càng cao thì thời gian bài thái trong mô của kháng sinh cảng chậm

—_ Loại mô: thông thường mức độ tồn đọng ở thận cao nhất, rồi đến gan, cơ,

mỡ, da

— Khoang thoi gian ngung thuốc trước khi thú được hạ thịt hoặc trước khi

bò cho sữa hay gà đẻ càng ngắn thì mức độ ton đọng càng cao và ngược

lại

—_ Tùy theo loại kháng sinh, đường, cấp, giống loài tuổi gia súc, gia cầm và tình trạng sức khỏe của con vật

2.2.2 Ảnh hưởng của dư lượng kháng sinh đối với sức khúc cộng đẳng

— _ Sự lạm dụng thuốc kháng sinh tất yếu dẫn đến sự tồn du trong thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe con người Việc sử dyng Nitrofuran, quinoxalinedinoxides có khả năng gây ung thư và đột biến gen Sulfamides gây kích ứng tuyến giáp, penicilin thường gây dị ứng

— Ngoài ra kháng sinh nhóm aminoglycoside còn gây ngộ độc mãn tính trên thính gíac và thận Kháng sinh nhóm tetracyline có phản ứng tạo phức hợp với các kim loại hóa trị hai như: Ca`'', Mg””, Zn””, Co” có

trong thành phần các enzyme, vì vậy mà nó cản trở chuyên hóa vật chất

và tăng trưởng của động vật (Nguyễn Đức Trang, 1998)

— Đối với công nghiệp chế biến sữa, sự có mặt của kháng sinh sẽ dẫn đến những thất bại trong quá trình lên men sữa chua và phó mát (Mayra

Makinen, 1995)

2.3 PHUONG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯƠNG KHÁNG SINH TRONG THỰC

PHAM

2.3.1 Sie ky (Chromatography)

— Thuat ngit : “sắc ký” có nghĩa là ghi màu bắt nguồn từ thí nghiệm phân

tích màu thực vật trên cột chứa một chất hấp thu của nhà hóa học Nga,

2.3.3

Nguyên tắc cơ bản của sự chia tách trong sắc ký là một pha động di chuyển qua một pha tĩnh và kéo các chất tan trong hỗn hợp phân tích di chuyển theo với những tốc độ khác nhau Quá trình di chuyển của các chất giữa hai pha là quá trình hấp phụ và phản hấp phụ xảy ra hoặc phân

bố và rửa giải ra liên tục Kết quả là các chất tan trong hỗn hợp được tách

ra Nếu gọi là trạng thái pha động, có sắc ký lỏng và sắc ký khí Nếu gọi tên theo hình dạng của pha tĩnh ta có sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy

Đây là phương pháp phê biến và hiện đại nhất được áp dụng kiểm tra tồn

dư kháng sinh trong thực phẩm Giới hạn mà phương pháp này có thể

xác định được 10°- 1019

Tuy nhiên, chỉ phí xét nghiệm bằng phương pháp HPLC rất cao

Phuong phap mién dich enzyme (ELISA)

Phương pháp này áp dụng cho việc kiểm tra sulfonamide, độ chính xác

của phương pháp thấp hơn phương pháp HPLC

Một vấn đề thường gặp khó khăn của phương pháp là làm sao tạo ra các tác nhân mién dich (immunogen) má không làm hư hỏng cấu trúc của phân tử thuốc

Miễn dịch phong xa (Radio Immuno Assay)

Trong kỹ thuật RIA, sự hình thành phức hợp kháng nguyên, kháng thể có thể được do lường bằng cách sử dụng kháng nguyên không đánh dấu phóng xạ (chất cần tìm) cho tiếp xúc với một số lượng an định của kháng

thể

Sẽ có sự cạnh tranh gắn kết với vị trí hoạt động của kháng thể giữa hai

kháng nguyên này Sau một thời gian, một số kháng nguyên gắn kết với

khang thể, một số còn tự do Ti sé gan két tuong đối của các kháng

nguyên đánh dấu và kháng nguyên không đánh dấu

Hoạt tính phóng xạ của phức hợp kháng nguyên - kháng thê càng thấp, néng độ kháng nguyên không đánh dẫu càng cao Hoạt tỉnh này được xác định bằng máy đếm phóng xạ trong chất lỏng sau khi đã tách phức hợp kháng nguyên - kháng thể ra khỏi phần tự do So sánh với đường cong chuẩn, người ta sẽ tính dược số lượng kháng nguyên cần tìm

(FAO.1990)

2.3.4 Phương pháp sử dung vi sinh vat: FPT (Frontier Post test)

Qui trình này liên quan đến việc nuôi cấy một số chủng vi khuẩn nhạy

cảm trên đĩa thạch có sự hiện diện của mẫu thịt nghỉ ngờ có tồn dư kháng

sinh Nếu mẫu thịt có kháng sinh thì chung quanh nó sẽ có vòng vô

khuẩn do sự khuếch tán của kháng sinh từ mẫu thịt ra môi trường thạch

ức chế sự phát triển của vi khuẩn (Heitzman, 1994) Phương pháp này có ưu điểm là thao tác đơn giản, dễ thực hiện, chỉ phí

thấp, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp Nhiều tác giả đưa ra các quy trình với môi trường, chủng vi khuẩn nhạy

cảm khác nhau đề xác định kháng sinh tồn dư trong thịt, sữa

Hiện nay có 5 loại vỉ khuẩn nhay cam: B subtilis, B cereus, E coli,

M.luteus, S aureus voi 12 loại môi trường nhưng chỉ ở 3 mức pH và 2

mức nhiệt độ

-_ CÁC NGHIÊN CỨU VE DU LUQNG KHANG SINH TRONG THIT GIA

SUC, GIA CAM

Nghiên cứu trong nước Khao sat tinh trạng nhiễm vi sinh vật và kháng sinh tồn sư trong thịt gia

suc, pia cầm tươi khu vực TP.HCM, Đồng Nai, Bình Dương và để xuất biện pháp khắc phục - Báo cáo khoa học năm 2001, Nguyễn Thị Hoa Lý

- Lê Văn Hùng

Thí nghiệm dịnh tinh khang sinh tôn dư trong thịt gia súc, gia cầm bằng phương pháp FPT — Thông báo khoa học năm 2003 Nguyễn Thị Hoa Lý

và Cs

Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại

các cơ sở chăn nuối gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh - Luận

án thạc sĩ nông nghiệp ĐHNL tháng 8/2001, Võ Thị Trà An

Bước đầu khão sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt gà thương phẩm trên địa bàn tỉnh Bình

Dương Định Thiện Thuận, Nguyễn Ngọc Tuân, Võ Thị Trà An, Lê Thanh Hiền, Võ Bá Lâm, Khương Thị Ninh Tạp chí KHKT Thú y, tập

X, số 1/2003, trang 50

Khảo sát kháng sinh tồn dư trên thịt gia súc tại lò mê vùng TPHCM

Nguyễn Thị Hoa Lý — Lê Thị Giang Năm 2002

Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của TP HCM Nguyễn Ngọc Hoài Thi LVTN Khoa Chăn Nuôi Thú y, Trường ĐHNL TP HCM

Sự quen thuốc kháng sinh và cách đối phó Julia Kleenliside — Bacon Bits - Nguyễn Quang Sức dịch Tạp chi KHKT Thú y, tập X, số

1/2003.trang 89

Nghiên cứu ở nước ngoài

A.LL Van Eenennaam, £8 Cullor, Evaluation of milk antibiotic Ressiddue Screening test in Cattle with naturally occurring clinical matitics University of California 1997

Antibiotic residues in Food and Their SignificanceStanley E Katz and Marietta Sue Brady Antimicrobial in food Eds PM Davidson & A.L

Branen, 2" edittion, Marcel Dekker, Inc, 1993

CNEVA Detection Des Residus a Activite antibiotione dans le Muscle

‘BU Ban on Chinese Shirmp to Continue; China Decries Report By

WorldCatch News Network, Apr.12,2002

Simple Continuos and Stimulataneous Determination of tetracycline

Residues.C-E TSA!, F.KONDO, Department of Veterinary Public

health, Faculty of Agriculture, Miyazaki University, Kibanadai-Nishi, Gakuen, Miyazaki-shi 889-21, Japan Reasearch in Veterinary Science,

Có thể nói nghiên cứu về kháng sinh tồn dư trong sản phẩm động vật không phải là điều mới mẻ, đặc biệt là các nước kinh tế phát triển như

Mỹ, Nhật, Đức, Pháp, Anh, Australia Van đề sử dụng kháng sinh trong

chăn nuôi và tồn dư kháng sinh trong thực phẩm rất được chú ý

Trong các phương pháp xác định kháng sinh tồn dư, phương pháp vì sinh vật được sử dụng lâu đời nhất Hiện nay có một số phương pháp kiểm tra

° KSTD bằng phương pháp vi sinh vật: phương pháp của tác giả F Dondo người Nhật xác dịnh Tetracyclin, phương pháp của CNEVA (Đức) xác

định ba loại penicilline, tetracycline, streptomycine

Đây là phương pháp được sử dụng ở nhiều nước và mỗi nơi có một qui trình riêng với loại môi trường và vi khuẩn nhạy cảm đặc trưng phụ

thuộc vào việc cần xác định một số loại kháng sinh nhất định Đây là vấn

để đơn giản ở các nước chăn nuôi phát triển, nhưng ở Việt Nam thực tế cho thấy thuốc thú y được sử dụng rất đa dạng, phong phú Do đó qui trình của các tác giả nước ngoài gặp khiếm khuyết dẫn đến kết quả kém

chính xác

Mẫu thịt, trứng, sữa được thu mua tại các cơ sở giết mổ, chợ, siêu thị

Tp.HCM, Bình Dương, Vũng Tàu, Long An

Kiểm tra, đánh giá, độ chính xác của bộ FPT tại 10 Chỉ cục thú y: Vũng

Tàu, Đồng Nai, Tp.HCM

'THỜI GIAN THÍ NGHIỆM Điều tra tình hình sứ dụng kháng sinh trong trại chăn nuôi từ 12/2003 — 02/2004

Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình và bán định lượng kháng sinh tồn dư

được thực hiện từ 12/2003 — 06/2004

Tập huấn cho Cán bộ Chỉ cục về phương pháp kiểm tra kháng sinh tồn

dư trong thịt, trứng, sữa 07/2004

Triển khai tại Chỉ cục để lấy kết quả 08/2004

3.3 NOLDUNG VA BO TRi THI NGHIEM

Noi dung I Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia súc gia

cầm

Qui mô và địa điểm khảo sát:

`5IHrại và hộ chăn nuôi gia đình thuộc tỉnh Đồng Nai, Long An, Bình

Dương, TP Hồ Chí Minh

- 7 trai heo qui m61000 - 5000 con

- 3 trại heo qui mô T00 - 900 con

- 7 trai heo.qui mé < 100 con

- 5 trại gà thịt qui mô 5000 - 10000 con

- 4 trại gà thịt qui mô 1000 - 4000 con

- 40 trại gả thịt qui mô < 1000 con

Nội dung 2 Tối ưu hoá qui trình định tính kháng sinh tồi dư bằng phương

pháp FPT

Qui mé: Thí nghiệm thực hiện trên

- 11 loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn nhạy cảm

- 5 loại vi khuẩn nhạy cảm

Chỉ tiêu theo dõi

Thí nghiệm 2 Xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho phương phá)?

Chỉ tiêu theo dõi

Nội dung 3 Đán định lượng kháng sinh tồn dư bằng phương pháp FPT

MO tả thi nghiệm

Kích thước vòng vành khăn

Tần suất (+) của các môi trường với pH tương ứng trên II loại kháng sinh thử

Phổ phát hiện của nhóm môi trường lựa chọn

Thí nghiệm dược bố trí ở 2 mức nhiệt dộ 37C và 30ˆC

Thời gian theo dõi sau khi đặt mẫu từ 16-24h

Thí nghiệm được lặp lại trên 11 loại kháng sinh

Tần suất (+)

Kích thước vòng vành khăn

Thí nghiệm thực hiện trên II loại kháng sinh đã lựa chọn

Kháng sinh được sử dụng ở 6 nồng độ: !c, 2c,5c, lÚc, 20c, 50c, (c là

hàm lượng giới hạn kháng sinh tồn dư cho phép trong thịt

Thí nghiệm được thực hiện trên các mẫu có hàm lượng kháng sinh từ

thấp tới cao Các mẫu có hàm lượng kháng sinh tồn dư thấp dã (+) thì

không cần thử trên các mẫu cao

Các mẫu cho phản ứng (+) được định lượng kháng sinh tồn dư bằng

phương pháp HPLC tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Sở KHCN

1?

Chỉ tiêu theo dõi

—_ Kích thước vòng vành khăn và tần suất (+) của từng loại kháng sinh ở các nồng độ khác nhau

~ Theo déi ham lugng khang sinh tồn dư trong các mẫu (+) đã được định

— Chuẩn bị vi khuẩn nhạy cảm, rửa, ÏÏ tâm, tạo dịch vi khuẩn

—_ Chuẩn bị môi trường nuôi cây

—_ Chế thử FPT test hút chân không

— Bảo quản ở 2 mức nhiệt độ: nhiệt độ phòng và 4-10°C/ thoi gian 3 - 4 thang

— Moéot tuần lay 1 b6 ra để kiểm tra độ nhạy của test

Chỉ tiêu theo dõi

— Mat do vi khuẩn trong dịch cây

— Trạng thái tiềm sinh của vi khuẩn nhạy cảm trên đĩa

— Trang thai của môi trường trong quá trình bảo quản

— _ Tần suất (+) của FPT test sau các thời gian nhất định

~_ Rút ra kết luận về điều kiện và thời gian bảo quản thích hợp

khi phân tích bằng HPLC chính xác hơn

Dia diém lay mau

Mo ta thi nghiém

- Các mẫu (+) và đã được định hướng sẽ định lượng kháng sinh tồn dư

Chỉ tiêu theo doi

Mẫu thịt gà, heo, bò dược lấy tại lò mé TP.ICM, Long An, Đồng Nai

Mẫu trứng được thu nhận tại chợ, siêu thị

Mẫu sữa được thu nhận tại các hộ gia đình chăn nuôi bò sữa thuộc huyện

Thú Đức, Củ Chỉ Tp.Hồ Chí Minh

Mẫu được đặt trên môi trường có vi khuẩn nhạy cảm

Ở giữa các đĩa dat | disk khang sinh chuẩn đối chứng

Ủ nhiệt độ thích hợp và thời gian thích hợp

Xung quanh mẫu thịt có hình vành khăn >= 2mm là mẫu có phản ứng

— Hàm lượng kháng sinh tổn dư trong các mẫu được phân tích định lượng bằng HPLC So sánh tý lệ (+) của FPT và HPLC

Nội dung 6 Xây dựng qui trình kiểm tra và triển khai tại cơ sở

Địa điểm thực hiện

PTN Chỉ Cục Thú Y TP Hồ Chí Minh,PTN Chỉ Cục Thú Y Vũng Tàu, PTN Chi Cục Thú Y Long An

PTN Chỉ Cục Thú Y Đồng Nai

Mỏ ta các buốc triên khai

Hoàn thiện qui trình

Chế bộ FPT test

Mỗi Chỉ Cục được cấp 5 bộ FPT ( tương ứng với 30 mẫu)

Tập huấn cho các Chỉ Cục phương pháp kiểm tra, cán bộ kỹ thuật Chỉ Cục trực tiếp lấy mẫu kiểm tra theo qui trình Các mẫu (+) được gửi về phòng thí nghiệm trung tâm dễ định lượng kháng sinh tồn dư

Chỉ tiêu theo dõi:

Cán bộ chỉ cục trực tiếp thực hiện và ghi nhận các chỉ tiêu sau:

Tỉ lệ mẫu (+)/ số mẫu kiểm tra ngẫu nhiên

Tình trạng của môi trường và vi sinh vật nhạy cảm trong quá trình bảo quản

20

3.4 _PHUONG PHAP

3.4.1 Nguyên lý của phương pháp EPT

— Vị sinh vật nhạy cảm được nuôi cấy trên môi trường đặc trưng

— _ Đặt sản phẩm (thịt, trứng, sữa) lên bề mặt môi trường

—_ Giữ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

— Các chất tồn dự kháng sinh có trong sản phẩm động vật sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật tạo ra vòng vành khăn xung quanh vị trí đặt mẫu

—_ Độ nhạy của phương pháp sẽ được tính bằng tần suất (+) và kích thước

vòng vành khăn

3.4.2 Vậtliệu

— Giống vi khuẩn nhạy cảm: gồm 6 giống

® Bacillus subtilis ATCC 6633, Merk Germany

¢ Bacillus cereus ATCC 11778, difco USA

© M luteus ATCC 11778, difco USA

Hình 3.2 Vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 11778 trên môi trường ỐTS

22

Hinh 3.5 Chung vi khuẩn gốc trên môi trường b

Hình 3.6 Ching vi khuẩn gốc đông khô

24 NS

eee

— Moi trudng nudi cy: tht nghiệm trén 18 cap mdi truong

lr—~ -Kháng sinh lựa chọn thí nghiệm trên các nhóm

Bảng 3.1 Kháng sinh lựa chọn thí nghiệm trên các nhóm

Penicilline 58.82 B-lactam Amoxicilline 29.91

Streptomycine 52.94 Aminoglucosid

Gentamycine 52.94 Tetracyline Tetracyline 58.8

Macrocid

Tylosin 47.36 Sulfamid Sulfamethazine 29.41

Flumequin 42.10 Quinolon