chẩn đoán nhanh bệnh dịch tả heo bệnh phù đầu do ecoli trên heo và chuyển giao kỹ thuật cho cơ sở

Hiện nay, ở nước ta chân đoán bệnh DTH thường dựa vào các phương pháp sau: dựa vào triệu chứng lâm sàng, mô tả bệnh tích, phản ứng ELISA gián tiếp để xét nghiệm Protein P125, phản ứng m

TEN DE TAI:

CHAN DOAN NHANH BENH DICH TA HEO, BENH PHU

DAU DO E COLI TREN HEO VA CHUYEN GIAO KY

THUAT CHO CO SO

Chủ nhiệm đề tài PGS.TS LỄ VĂN HÙNG

CƠ QUAN QUẢN LÝ ĐỀ TÀI CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

TP HCM THANG 10/2004

LOI CAM ON

Tran trong cam on

Sở Khoa Học Công Nghệ Tp.HCM đã cấp kinh phí để thực hiện đề tài PGS.TS Trần Đình Từ đã góp nhiều ý kiến giúp đỡ hoàn thiện đề

cương nghiên cứu và báo cáo nghiệm thu

ThS Đinh Minh Hiệp , Chuyên viên Sở KHCN TP.HCM và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Ban Giám Hiệu, Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại học

Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Viện thú Y Quốc Gia, Công Ty NAVETCO

Chi cục thú y Tp.HCM, Chi Cục Thú y Cần Thơ, Trung tâm Thú Y

Vùng Tp.HCM, Chi Cục Thú y Long An, Chi cục Thú Y Đồng Nai đã

giúp đỡ chúng tôi trong việc thu nhận mẫu vật nghiên cứu

Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y, bộ môn bệnh Lý Truyền Nhiễm

trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM

CAC CHU VIET TAT

ELISA enzym links immuno sorbent assay

số tt

II

4.1 4.2

443 4.4 4.5 4.6

Kết quả PCR trên nhóm heo đã chết và heo còn sống

So sánh kết quả giữa 2 phương pháp ELISA và RT-PCR

So sánh kết quả RT-PCR giữa các loại mẫu

Kết qua phân lập E.coli từ các bệnh phẩm khác nhau Kết quả định type kháng nguyên của các chủng E.coli

DANH SÁCH CAC BIEU DO

MUC LUC

(CETUS ONG TVD DAU c6 62c 0x 666x000600 HA Ga geebdevlyotrsobvioesosi 1

1 _ Tính cấp thiết của đề tài -c ccscccxeesressrersetrrrekriirkrerkee 1

CHUONG II: MOT SO NET VE BENH DICH TA HEO VA PHU DAU

ID H.ÁCG0)10100/ 001109100000 00011 /4/91.097900).0970170/0172729/91/).7927339/74904/0/77/79209709290/0949991 20973 3

Derll Letchies Weve! eT in DIVE lpeeeeeeeet eee rere eee eee eee eee 3

L QU CANBENN wits asteme eer eee tcc miele ae NSE+.-111 78 7901 :5 4

1.3 Các biểu hiện đặc trưng của bệnh - ¿:2c¿222++vccvxcrvsersrrvee 5

1.4 Cac phurong phap chan dodn bénh DTH .ccccssssssssscssseesesssessesssseeseess 6

1.4.1 Chẳn đoán vì rúi NOC cscccccsssescsssssssscsssessccsssvsssssssssescstsseesssnsccesvasesesnssecesnsseconsesees 6

1.4.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Ñeactiof) -cc sec 8 1.4.4 Phần ứng ngưng kết hồng cầu gián HIẾp 22211 111cc 8

2 _ Bệnh phù đầu do E coli trên heO -c-sccccceesccccesssvcrvessserrree 2

2.5 Chân đoán

CHUONG III: NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

1 Địa điểm ae et tester ge aN Nt 13

3 Vậtliệu và hoá Chất cacsscceccsssssssecscacevsnsnsssesseccenscsszavseiesscseenseessssseeseeensesoss 14

37I1567H1dIctrtiileco ẽẻẽẽ 14

3 1.2: HƯƠNG: DHID HỘ THỆH, GHI: (cv 0151550 211381111811 0103 100131186 15011316115 130011n311801 6 độ)

3:2 bBenhpnu đau cmrE coi cố 18

2H SPAUONE Pidp NENICNI CU «pace nye ere aN) ene ecru 18

CHƯƠNG IV KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

2'1998itcon mm di ẻ arsenite erate ent ne eyn arama 33

CHUONG L MO DAU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh dịch tả heo (DTH) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút DTH

gây ra trên heo Cho đến nay, bệnh vẫn là một trong những bệnh gây thiệt

hại nghiêm trọng nhất cho ngành chăn nuôi heo không những ở Việt nam

mà cả trên thế giới Ở Việt nam, bệnh xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1923

và đến nay đã lan rộng khắp toàn quốc Việc chân đoán chính xác bệnh DĨTH có một ý nghĩa quan trọng trong việc thanh toán bệnh Hiện nay, ở nước ta chân đoán bệnh DTH thường dựa vào các phương pháp sau: dựa

vào triệu chứng lâm sàng, mô tả bệnh tích, phản ứng ELISA gián tiếp để xét

nghiệm Protein P125, phản ứng miễn dịch huỳnh quang Tuy nhiên, các phương pháp trên thường có những nhược điểm là độ chính xác thấp, có thê có những phản ứng giả và không cho phép xác định được thú mang trùng, vi rút trong tính dịch Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) diing chan đoán bệnh dịch tả heo đã được áp dụng khá phổ biến ở các phòng thí nghiệm sinh học trên thế giới Kỹ thuật này với những ưu điểm

nhanh, nhạy, độ chính xác cao, nếu được áp dụng thành công ở Việt nam sẽ

góp phần rất lớn trong việc kiểm soát và tiến tới thanh toán bệnh dịch tả heo

ở Việt nam

Khác với bệnh DTH, có thể gây chết heo ở mọi lứa tuổi; bệnh phù đầu

do E coii trên heo thường tập trung trên đối tượng heo sau cai sữa Từ những năm 1990 trở lại đây, bệnh phù dau do E coli trên heo đã gây lên

những thiệt hại kinh tế to lớn cho những nhà chăn nuôi heo Bệnh có đặc

điểm gây chết nhanh, cùng những triệu chứng khó phân biệt với các bệnh

truyền nhiễm khác như dịch tả heo, bệnh do Streptococcus, Actinobacillus

gây nên Việc tìm hiểu nguyên nhân và đặc điểm của tác nhân gây bệnh đã

được nhiều nhà khoa học quan tâm: Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự (1999 -

2000) đã thành công trong việc phân lập tác nhân gây bệnh từ hạch mảng

treo ruột của những heo bệnh Những dòng # ¿oi thuộc nhóm VTEC là

nguyên nhân của bệnh phù đầu trên heo sau cai sữa Phần lớn những dòng

E coli gây bệnh này thuộc các nhóm kháng nguyên O138, O139 va O141, mang những gen quy định tính gây bệnh đặc trưng như độc tố vero (VT2e)

và yếu tố lông bám F18 Việc chẩn đoán bệnh dựa vào phương pháp cổ điển: phân lập vi khuẩn và định type kháng nguyên được xem là quy trình

tương đối chuẩn xác và đơn giản Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu hơn với

kỹ thuật hiện đại, kỹ thuật PCR cho thấy khá nhiều ching E coli thudc cac nhóm kháng nguyên trên không có những gen này Việc ứng dụng kỹ thuật PCR sẽ cho phép xác định và chân đoán chính xác căn bệnh gây phù đầu

trên heo sau cai sữa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu về dịch tễ

học, phòng và trị bệnh này đạt kết quả

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Chẩn

đoán nhanh bệnh dịch tả heo, bệnh phù dau do E coli trên heo và chuyển

giao kỹ thuật PCR chẩn đoán bệnh dịch tả vịt, bệnh tụ huyết trùng gia cam

cho cơ sở”

2 Mục tiêu của đề tài

= Chân đoán được bệnh dịch tả heo, phù dau do E coli trén heo

bằng kỹ thuật PCR

câm, dịch tả vịt cho cơ sở

và tỷ lện chết rất cao Quá trình bệnh diễn ra rất đa dạng: cấp tính, á cấp,

mãn tính, không điển hình hoặc không thể hiện lâm sàng phụ thuộc vào

độc lực của chủng vi rút và trạng thái miễn địch của đàn heo Bệnh cấp tính

gây ra bởi chủng vi rút độc lực cao với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao;

trong khi nhiễm các chủng vi rút độc lực yếu chỉ gây được bệnh ở trạng thái

nhẹ hoặc không gây được bệnh cho con thú

Bệnh được mô tả đầu tiên ở bang Tennesse năm 1810, sau đó tiếp tục

tìm thấy ở bang Ohio (Hoa Kỳ) năm 1830 Tiếp đến, bệnh được ghi nhận ở Pháp năm 1822, Đức 1833, Anh 1862 và lan ra nhiều quốc gia khác ở châu

Âu Tuy nhiên, mãi đến năm 1903, Dorset và Schneinitz mới khảng định

căn bệnh là vi rút Hiện nay, bệnh DTH đang hiện diện khắp nơi trên thế

giới và đã được phát hiện ở 54 quốc gia Tuy nhiên, một số nước đã xây

dựng được chương trình thanh toán bệnh DTH và có những nước được coi

là an toàn đối với bệnh DTH như : Canada, Pháp, Mỹ, Úc, Newzeland, Nhật Bản

Ở Việt Nam, bệnh DTH được phát hiện vào năm 1923; 1924 bởi

Houdemer (Đào Trọng Đạt, 1989) Đến nay, bệnh vẫn tồn tại phổ biến và là

mối đe doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi heo ở nước ta (Lê Minh

Chí, 1998) Năm 1960, bệnh DTH xây ra ở Nghệ An Năm 1968, có 481 é

dịch xẩy ra ở miền Bắc (Lê Độ, 1981) Năm 1972 - 1973, dịch phát ra ở I1 trại xung quanh khu vực Sài Gòn (nay là Thành phố Hồ Chí Minh) Năm

1974, dịch xây ra ở 17 tỉnh phía Bắc giết chết trên 40.000 con heo Năm

1981, nhiều ỗ dịch lớn xây ra ở 15 tỉnh miền Tây Nam Bộ đã giết chết trên

150.000 con heo (Đào Trọng Đạt, 1989) Năm 1990, dịch xây ra trên 1.800

- con heo tại lò mê Huỳnh Thúc Kháng tỉnh Thừa Thiên - Huế (Báo cáo dịch

Vi rút DTH thuộc chỉ Pes/ivirus của họ FÏavividae Hai thành viên khác

của chỉ này là vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV - Bovine viral Diarrhoea virus) và vi rút gây bệnh Border trên cừu (Border virus disease- BDV) déu cé tinh kháng nguyên chéo với vi rút DTH Vi rút BVD cũng có thể nhiễm trên heo, làm cho việc phòng ngừa bệnh DTH ngày càng khó

khăn

Vị rút DTH thuộc loại ARN vi rút có vỏ bọc là lipoprotein Dưới kính hiển vi điện tử, vi rút có cấu trức hình cầu với nucleocapside đối xứng khối,

bao bọc bởi một màng ngoài Virion có đường kính 40 - 50nm, đường kính

của khối nueleocapside là 29 nm Bộ gen của vi rút là một chuỗi đơn ARN,

có độ dài là 12,3 kilobase Những thí nghiệm trung hoà chéo giữa 1 số chủng vi rút DTH cho thấy chúng chỉ tạo thành 1 nhóm kháng nguyên tương đối đồng nhất và không có các type huyết thanh riêng cho từng chủng

Các chủng vi rút có độc lực cao khi nhiễm sẽ gây ra bệnh cấp tính, tỷ lệ

chết cao cùng với sự bùng nỗ của các ô dịch Heo nhiễm vi rút cường độc sẽ

thải vi rút với số lượng lớn trong suốt quá trình bệnh Các chủng có độc lực

thấp sẽ gây bệnh ở thể bán cấp tính, thể mãn tính và chỉ gây tỷ lệ chết cao

ở heo nhỏ hoặc bào thai Người ra đã sử dụng phương pháp làm giảm độc

_ lực của vị rút bằng cách cấy truyền qua động vật không mẫn cảm hoặc môi

trường tế bào ít mẫn cảm để tạo ra chủng nhược độc để sử dụng làm vacxin

như vi rút DTH chủng C, chủng GPE

1.3 Các biểu hiện đặc trưng của bệnh

1.3.1 Thể quá cấp

Heo sốt cao đột ngột, phần da mỏng đỏ ửng, chưa kịp xuất hiện xuất

huyết trên da nên được gọi là "dịch tả trắng" Heo chết nhanh sau 24 - 48

giờ

1.3.2 Thể cấp tính

Thời gian ủ bệnh 3 - 7 ngày; sau đó có thể thấy xuất hiện các triệu

chứng đầu tiên như sốt cao trên 41°C, biếng ăn, phản ứng chậm chạp, phân

táo, sau đó tiêu chảy, viêm kết mạc mắt, chảy nước mỗi, run cơ bắp Giai

đoạn cuối có thể thấy các biểu hiện như đa nhợt nhạt ở tai, mii va mom,

xuất huyết toàn thân, đặc biệt ở đa phía trong đùi và da bụng Heo bệnh có

hiện tượng yếu chân sau, sau đó có thể liệt chân sau Hiện tượng giảm bạch

cầu là biểu hiện chung trorig suốt quá trình của bệnh Mỗ khám bệnh tích

thấy đặc trưng nhất là xuất huyết điểm hoặc xuất huyết tập trung thành từng

mảng ở nhiều cơ quan và phủ tạng, hach lympho sung va xuất huyết Mức

độ tốn thương của bệnh lý phụ thuộc vào mức độ trầm trọng của bệnh

1.3.3 Thể mãn tính

Thể mãn tính có thể diễn biến theo 3 giai đoạn : giai đoạn đầu kéo dài từ

10 - 15 ngày, toàn bộ đàn heo phát bệnh với các triệu chứng giống như dạng

cấp tính nhưng ở mức nhẹ hơn như biếng ăn, suy sụp, nhiệt độ tăng và có

hiện tượng giảm bạch cầu Giai đoạn hai là giai đoạn thuyên giảm hầu hết

các triệu chứng và kéo dài vài tuần, heo có vẻ bình thường và đã có biểu

hiện thèm ăn và ăn, nhiệt độ trở về bình thường hoặc hơi cao hơn một ít

Giai đoạn ba xuất hiện kèm theo với các mầm bệnh bội nhiễm và sự phát bệnh toàn thân kèm theo các triệu chứng cục bộ về hô hấp hoặc tiêu hoá

Heo gầy còm dần, sau đó chết trong thời gian từ 1 đến 3 tháng Nói chung,

triệu chứng thường thấy của thể mãn tính là bỏ ăn, tiêu chảy, sốt nhẹ cách quãng, ốm yếu, viêm da, chậm lớn và tỷ lệ loại thải cao Bệnh tích thường

thấy là teo tuyến thymus và sưng các khớp xương sườn heo con Đôi khi

thấy loét hình cúc áo ở van hồi manh trùng

1.4 Các phương pháp chân đoán bệnh DTH

Trước kia việc chấn đoán bệnh DTH thường chỉ dựa trên các triệu

chứng lâm sàng và biến đối bệnh tích, nhưng do diễn biến phức tạp của

bệnh đã làm cho phương pháp chân đoán này không đáng tin cậy và người

ta thường dùng ee phuong phap sau day :

- Phương pháp làm tăng cường độc lực của vi rút Newcasstle (END):

Dùng môi trường tế bào dịch hoàn heo một lớp, cấy dịch mẫu bệnh

phẩm nghỉ nhiễm vi rút DTH, sau 5 ngày cấy vi rút Newcastle chủng Miyadela thì thấy vi rút Newcastle nhân lên mạnh và gây bệnh tích tế bào

Nếu môi trường tế bào dịch hoàn heo chỉ cấy vi rút Newcastle thì vi rút không gây được bệnh tích tế bào Điều này chứng tỏ có sự hiện diện của vi

rat DTH đã làm tăng độc lực của vi rút Newcastle (Nguyễn Như Thanh,

1996)

- Tiêm truyền động vật thí nghiệm:

Theo Pearson (1998), đây là phương pháp phát hiện vi rút DTH chính xác nhất, tuy cần nhiều thời gian và tốn kém nhưng có độ chính xác cao hơn phương pháp nuôi cấy tế bào 10 lần Lấy bệnh phẩm máu, lách của heo trong ổ dịch có triệu chứng, bệnh tích không rõ ràng đề tiêm cho heo con Dùng heo 3 - 4 tháng tuổi khoẻ mạnh, không ở nơi có dịch và chưa tiêm

vacxin DTH lần nào Tiêm dưới da 1ml máu hay 0,5 gam mẫu lách của heo

nghỉ bệnh DTH Ba ngày sau heo kém ăn, sốt 40 - 41°C có khi đến 42°C, nhiệt độ này giữ vững trong 4 - 5 ngày liền, con vật bỏ ăn, phân táo, mắt có

dử đặc, viêm kết mạc mắt có nước nhờn chảy ra Sau một tuần lễ con vật di

tháo, phân lẫn máu hôi thối, nếu bệnh kéo dài có thể thấy triệu chứng thần kinh như bại hai chân sau Cuối cùng nhiệt độ hạ thấp dưới 37 - 36°C, con vật mệt lả và chết Mô khám thây bệnh tích đặc trưng: dạ dày và ruột bị loét

và tụ máu, thận xuất huyết từng chấm đỏ ngoài mặt, lá lách nhồi huyết quanh rìa, ở ngoài da nhất là vùng đùi bụng có nốt đỏ xuất huyết

1.4.2 Phương pháp đánh dấu :

Phương pháp ELISA trực tiếp : là một trong những phương pháp ELISA đơn giản nhất thường dùng phát hiện kháng nguyên chưa biết Hiện nay, phương pháp ELISA bắt kháng nguyên (Antigen capture) được phát

triển để kiểm tra số lượng lớn mẫu, Phương pháp này có độ đặc hiệu cao và thực hiện nhanh hơn so với phương pháp phân lập Tuy nhiên, độ nhạy của

phương pháp thấp so với phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phân lập Phương pháp cho kết quả tin cậy đối với những mẫu bệnh phẩm từ những

heo có dấu hiệu lâm sàng như sốt, tiêu chảy Do đó sử dụng phương pháp ELISA này phải kết hợp với chân đoán lâm sàng trên thú bệnh

Hiện nay bộ kit ELISA phát hiện kháng nguyên P125 của Synbiotics

đang được sử dụng để phát hiện kháng nguyên thuộc nhóm Pøs/ivirws trong

điều tra tình hình heo nái mang trùng ở Việt nam (Nguyễn Lương Hiền, 1999)

Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể

1.4.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Việc phát triển sinh học phân từ đã góp phần đưa ra những phương pháp

chân đoán có độ nhạy cao Phương pháp Reverse Transcriptase Polymerase

Chain Reaction (RT-PCR) là một phương pháp chẩn đoán DTH chuẩn có

độ nhạy và độ đặc hiệu có thể sánh bằng phương pháp phân lập hay thậm

chí cao hơn Tuy nhiên RT-PCR hiện nay chưa thích hợp với các khảo sát

một số lượng lớn mẫu vì giá thành cao

RT-PCR được sử dụng phổ biến để nghiên cứu đặc tính di truyền của vi

rút DTH, điều tra tình hình bệnh, chân đoán DTH ở đàn thú được tiêm

vacxin DTH đánh dấu (Koene, 1999)

Ở Việt Nam, RT-PCR đang được sử dụng tại một số phòng thí nghiệm

để chân đoán bệnh cũng như điều tra sự lưu hành một số phân lập vi rút

Hiện nay, tai Trung tâm Thú y vùng thành phố Hồ Chí Minh sử dụng bộ

kit ELISA (Ceditest) phát hiện kháng thể kháng Protein E2 do Viện Nghiên

cứu Thú y Hà Lan sản xuất

1.4.4, Phan ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp

Bình thường vi rút DTH không hấp phụ được lên hồng cầu, do đó phải

và một chức gắn với vi rút DTH, nhờ đĩ vi rút DTH dễ dàng hấp phụ lên

hồng cầu thỏ, cừu hoặc chuột lang nhưng khơng gây ngưng kết hồng cầu

Khi gặp kháng thể tương ứng, vi rit DTH sé kết hợp với kháng thể, do đĩ

hồng cầu dính lại qua cầu nối kháng thể gây hiện tượng ngưng kết hồng

cầu

Hiện nay, phản ứng này được sử dụng để đánh giá mức độ hiệu giá

kháng thể hình thành trên heo sau khi tiêm vacxin (Shanyi va cs, 2000)

hoặc sự biến động kháng thể thụ động trong huyết thanh của heo con sinh

từ heo mẹ cĩ tiêm vacxin (Jin, 2000)

Bệnh phù dau do E coli trén heo

2.1 Giới thiệu về bệnh

Bệnh phù đầu trên heo sau cai sữa được Shanks ghi nhận lần đầu tiên

vào năm 1938 tại Ireland Sau đĩ, bệnh được phát hiện ở khắp các châu lục

Ở Việt nam, bệnh xuất hiện khá phổ biến và đã gây thiệt hại khá nghiêm

trọng cho ngành chăn nuơi heo trong thập niên 90 Đặc điểm của bệnh là

gây phù đầu, chết nhanh trên heo sau cai sữa năm 1957, Sojka, Erskine và

Lloyd đã xét nghiệm vi khuẩn học và thực hiện các thí nghiệm trên thú, cho

rang vi khuan Escherichia coli chính là tác nhân gây bệnh Các chủng vi

khuẩn E coii gây lên bệnh này được xếp vào nhĩm VTEC (Verotoxin

Escherichia coli)

2.2 Vi khuẩn E eoli gây phù trên heo sau cai sữa

Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy những dịng # cọi gây bệnh

phù trên heo sau cai sữa được xếp vào nhĩm VTEC, chủ yếu thuộc các

nhém khang nguyén 0138, 0139, O141 (Linggoot M.A va Thomspon

J.M., 1987; Imberechts H va ctv., 1992; Parma va ctv., 2000) Ở Việt nam,

trong thập niên 90, bệnh phù trên heo sau cai sữa do # coi¡ đã gây ra những

tổn thất to lớn cho người chăn nuơi heo Những dịng E coli thuộc các

nhóm kháng nguyên 0138, 0139 va O141 lần đầu tiên đã được phân lập

vào năm 1999 từ những mẫu hạch màng treo ruột của những heo bệnh

(Nguyễn Ngọc Hải, 1999) Những dòng E coli nay cé kha nang san xuất ra một loại độc tố đặc trưng cho những dòng Z coji gây phù trên heo, đó là

độc tố vero VT2e Độc tố vero tiết ra bởi những dòng Z coi gây phù là

Bguyện nhân gây nên những triệu chứng và bệnh tích trên heo bệnh Bằng thực nghiệm, với việc tiêm độc tổ vero VT2e vào bắp thịt heo sau cai sữa,

đã gây nên những triệu chứng và bệnh tích trên heo bị tiêm giống như ở trên

heo mắc bệnh tự nhiên (Macleod và ctv., 1991a)

Ngoài việc tiết ra độc tố vero đặc trưng, những dòng Z cøi¡ gây phù còn

mang một yếu tố đặc trưng khác, đó là lông bám F18 (tên cũ là F107) Yếu

tố kết bám này hoàn toàn khác với các yếu tế kết bám trước đây (F4 (K88),

F5 (K99), F6 (K987P), F41 ) đã được tìm thấy trên các dòng E coli gay

tiêu chảy trên heo, bò (Bertschinger và ctv., 1990; Imberechts và ctv.,

1992) Người ta đã chứng tỏ được là những dòng £ coli cé mang yếu tổ

bám dính F18 có khả năng kết bám lên các tế bào biểu mô ruột của những

heo sau cai sữa, nhưng lại không thể kết bám lên tế bào biểu mô ruột của những heo sơ sinh (Nagy B và ctv., 1997) Đây là một trong những lý do giải thích tại sau bệnh phù do # coli lai thuong chi thấy ở trên heo sau cai sữa Trong đa số trường hợp, gen quy định yếu tố lông bám F18 thường di

kèm với gen quy định việc sản xuất độc tố vero VT2e, và đôi khi còn kết hợp với cả những gen quy định việc sản xuất độc tố đường ruột ST và LT

(MacLeod va ctv., 1991a; Nagy B va ctv., 1990) Nhitng dong £ coli gay phủ trên heo có thể được phân lập được từ những heo bệnh cũng như những heo khoẻ Điều này cho phép nghỉ ngờ rằng những heo khoẻ luôn có thể là những nguồn mang mầm bénh (Gannon va ctv., 1988; Osek 1999; 2000) Đặc biệt, những dòng # coi gây phù trên heo không phải là những dòng #

coli xâm nhập, nhưng chúng có thê được phân lập từ hạch màng treo ruột

của những heo bệnh (Sojka và ctv., 1957; Nguyễn Ngọc Hải và ctv., 1999;

2000)

Những dong # coi gây phù trên heo không có những đặc tính sinh hoá

riêng biệt cho nhóm, kể cả đặc tính dung huyết, mặc dù một phần khá lớn

các dòng # cojj thuộc các nhóm kháng nguyên gây bệnh phù trên heo sau

cai sữa có khả năng gây dung huyết Vì thế, không thể xác định được chúng

nếu chỉ đơn thuần dựa vào các xét nghiệm sinh hoá (Gannon và ctv., 1988;

Nguyễn Ngọc Hải, 1999)

Tuy nhiên, với những kỹ thuật của sinh học phân tử như: kỹ thuật PCR

(Polymerase Chain Reaction), kỹ thuật lai (Hybridation) người ta có thể chân đoán phân biệt chúng một cách dễ dàng (Gyles, 1988; Karch, 1989;

Brown, 1989; Pollard, 1990; Woodward, 1992; Piérard, 1998)

2.3 Triệu chứng bệnh

Triệu chứng bệnh rất thay đổi Bệnh thường xãy ra một cách đột ngột,

bắt đầu trên 1 hay vài heo con, khoảng 1 tuần đến 10 ngày sau khi cai sữa

mà không có biểu hiện gì trước đó Ö dịch bắt đầu với 1 hay vài con chết và một số con có triệu chứng thần kinh

Heo bệnh có vẻ lờ do, mat sưng húp, mat phối hợp, đi xiéu vẹo, co giật,

hôn mê và thường chết 4— 36 giờ sau khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng

Triêu chứng thần kinh thường liên hệ với thủy thủng ngoại vi, có thể thấy phù ở trán, mí mắt, âm hộ thủy thủng ở hầu sẽ làm biến đổi tiếng kêu

của heo

Thân nhiệt có thể đến 40°C tron giai đoạn sớm của bệnh, nhưng nhiệt

độ trực tràng vẫn bình thường ngay cả khi triêu chứng bệnh xuất hiện (trần

Thanh Phong, 1996)

2.4 Bénh tich

Thường thấy thủy thủng ở mắt và mặt Thủ thủng đường cong lớn của

đạ dày, ở khoảng giữa lớp niêm mạc và lớp cơ Dịch thủy thủng màu vàng

có thể bị đông lại, có thể thấy ở màng treo ruột, thanh quản, mỡ quanh tim,

vỏ thận (Trần Thanh Phong, 1996)

2.5 Chan doan

Những chân đoán lâm sang có thể dựa trên sự chết đột ngột của heo sau

khi cai sữa Tuy nhiên những triệu chứng lâm sang đặc trưng cho bệnh thường không hiện diện ở tất cả heo bệnh (Depeche Technique, 1994;

Taylor, 1991) Do vậy, việc chân đoán vi sinh vật học là hết sức cần thiết Chân đoán vi sinh vật học dựa trên việc nuôi cấy phân lập vi khuan E coli

từ dịch nạo trên niêm mạc ruột, dịch hạch bạch huyết màng treo ruột Chân đoán huyết thanh học bằng phản ứng ngưng kết hoặc bằng phản ứng miễn

dịch huỳnh quang để định type kháng nguyên của vi khuẩn E coli Viéc tìm

kháng nguyên lông F107, kháng nguyên O 138, O 139, O141 là hết sức cần thiết trong việc kết luận bệnh Ngoài ra có thể xác định độc tố verotoxin

trên môi trường tế bào vero Phương pháp PCR có thể được sử dụng nhằm phát hiện gien quy định yếu tố F18 và VT2e của những đòng vi khuẩn Z coi¡ gây bệnh phù trên heo

CHUONG III NOI DUNG VA PHUONG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Dia diém

Đề tài được thực hiên tại trung tâm phân tích thí nghiệm trường Đại Học

Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Trung tâm Thú Y vùng TP Hồ Chí Minh

Mẫu bệnh phẩm được thu nhận tại các tỉnh Cần thơ, TP Hồ Chí Minh,

Long an, Tiền Giang, Đồng Nai

Chuyển gia kỹ thuật được thực hiện tại Trường Đại Học Nông Lâm TP

Hồ Chí minh cho Các cán bộ kỹ thuật chỉ Cục tỉnh Cần thơ, TP Hồ Chí

Minh, Long an, Tiền Giang , Đồng Nai

2 Nội dung

Xây dựng quy trình ly trích RNA và quy trình chạy PCR, RT-PCR trong chân đoán bệnh DTH và bệnh phù đầu do Z coi trên heo

Phân lập vi khuẩn E coi từ mẫu bệnh theo quy trình cổ điển, định typ vi

khuẩn E coli phan lập được bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với các kháng huyết thanh chuẩn của các type kháng nguyên O138,

0139, O141

Kiểm tra bệnh phẩm thu thập được trên các quy trình chạy RT-PCR và

PCR, xác định sự hiện diện của gen VT2e và F18

Khảo sát đặc tính gây bệnh của vi khuẩn # coi gây phù trên chuột bạch

So sánh kết quả trên kỹ thuật RT-PCR, PCR với vi khuẩn học, phương

pháp ELISA

Chuyển giao kỹ thuật cho cơ sở

3 Vật liệu và hoá chất

3.1 Bệnh dịch tả heo

3.1.1 Vật liệu và hoá chất trong bệnh dịch tả heo

— Mẫu đối chứng dương: mẫu dich tả heo đương tính chuân do Viện Thú y

Quốc gia cung cấp

— Bệnh phẩm nghi ngờ bệnh DTH và phù đầu do Z eofi trên heo được thu

thập tại các tỉnh Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Cần Thơ, Bến Tre, Thành phố Hồ Chí Minh

Thang trọng lượng chuẩn (ladder) (ABgene)

Đoạn mỗi (Genset Oligos, Singapore)

ˆ Cặp môi 1 (đặc hiệu cho giống pestivirus) đoạn mỗi và quy trình theo

S

©

S

Wirz B, Tratschin J.D, Muller H.K va Mitchell D.B, 1993

Doan méi 324 : ATG CCC (T/A) TA GTA GGA CTA GCA

Doan moi 326 : TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC Kích thước đoạn gen được khuếch đại : 288bp

— Cặp mỗi 2 (đặc hiệu cho vi rút dịch tả heo) :