Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà

CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 . Tính cấp thiết của đề tài Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét. Một trong những vấn đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Việc này đã làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người. Do vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn nuôi. Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng cường sức khỏe nói chung cho người và động vật. Bacillus subtilis là một vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học. Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người và vật nuôi theo mô hình công nghiệp. Tuy nhiên, B. subtilis rất đa dạng về các đặc tính sinh học nên không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định. Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên. 1.2. Mục tiêu - Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột (S. enterica, E. coli). - Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong phòng bệnh đường ruột ở gà do E. coli và S. enterica gây ra.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THỊ HẢI YẾN

TUYỂN CHỌN CHỦNG

BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG

TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN

ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ SỐ: 62 64 01 02

CẦN THƠ, 2018

MỤC LỤC

Lời cam kết kết quả i

Lời cảm ơn ii

Tóm lược iii

Abstract v

Danh sách bảng x

Danh sách hình xii

Danh mục từ viết tắt xv

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới của luận án 2

1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……… 3

2.1 Tổng quan về probiotic 3

2.1.1 Lịch sử probiotic 3

2.1.2 Các định nghĩa về probiotic 3

2.1.3 Xu hướng sử dụng probiotic 4

2.1.4 Vai trò và cơ chế tác động của probiotic 5

2.1.5 Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm 8

2.1.6 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic 12

2.1.7 Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic 13

2.1.8 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic 14

2.2 Tổng quan về Bacillus subtilis 15

2.2.1 Đặc điểm chung của giống Bacillus 15

2.2.2 Đặc điểm loài Bacillus subtilis 16

2.2.3 Dinh dưỡng và tăng trưởng 22

2.2.4 Các chất do B subtilis sinh ra 23

2.2.5 Tính đối kháng của B subtilis 25

2.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B subtilis và vi sinh vật gây bệnh 26

2.3 Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đường ruột 27

2.3.1 Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ 27

2.3.2 Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi 30

2.4 Một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp trên gà 31

2.4.1 Salmonella 31

2.4.2 E coli 36

2.4.3.Clostridium perfringens 39

2.5 Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam 42

2.5.1 Trên thế giới 42

2.5.2 Tại Việt Nam 43

2.6 Một số nghiên cứu ứng dụng B subtilis 44

2.6.1 B subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi 44

2.6.2 B subtilis sử dụng cho gia cầm 45

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 47

3.2 Phương tiện nghiên cứu 47

3.2.1 Vật liệu 47

3.2.2 Dụng cụ 47

3.2.3 Thiết bị 47

3.2.4 Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn 48

3.3 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 49

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 49

3.3.2 Phân lập các chủng Bacillus subtilis 50

3.3.3 Tuyển chọn các chủng B subtilis có đặc tính probiotic 56

3.3.4 Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà 61

3.4 Xử lý số liệu 65

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66

4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis 66

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp 66

4.1.2 Kết quả định danh Bacillus spp 67

4.2 Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic 77

4.2.1 Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao 77

4.2.2 Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh 78

4.2.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 81

4.2.4 Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh 85

4.2.5 Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật 98

4.2.6 Khả năng bám dính 104

4.2.7 Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà 109

4.3 Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà 111

4.3.1 Kết quả thí nghiệm 1… 111

4.3.2 Kết quả thí nghiệm 2 114

4.3.3 Kết quả thí nghiệm 3 123

4.4 Đăng ký trình tự B subtilis trên Genbank……… 131

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 133

5.1 Kết luận 133

5.2 Đề nghị 134

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 135

TÀI LIỆU THAM KHẢO 136

PHỤ LỤC 154

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Bậc phân loại của Bacillus subtilis 15

Bảng 2.2 Một số đặc điểm của Bacillus subtilis 22

Bảng 2.3 Một số loại enzyme do B subtilis sinh tổng hợp 23

Bảng 3.1 Phân bố mẫu 50

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 54

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 62

Bảng 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 64

Bảng 3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 65

Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi của 296 chủng vi khuẩn 66

Bảng 4.2 Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa 68

Bảng 4.3 Kết quả định danh 29 chủng vi khuẩn bằng kit API CH50B 70

Bảng 4.4 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA 74

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B subtilis 77

Bảng 4.6 Kết quả kháng sinh đồ của 21 chủng B subtilis chọn lọc 79

Bảng 4.7 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B subtilis 81

Bảng 4.8 Kết quả hoạt lực enzyme amylase, protease, lipase của 10 chủng B subtilis khảo sát 83

Bảng 4.9 Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B subtilis bằng phương pháp kẻ vạch vuông góc 86

Bảng 4.10 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E coli 88

Bảng 4.11 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S enterica 91

Bảng 4.12 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp 93

Bảng 4.13 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp 96

Bảng 4.14 Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 4 và pH 5 99

Bảng 4.15 Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 3 101

Bảng 4.16 Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 2 103

Bảng 4.17 Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính 105

Bảng 4.18 Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E coli và S enterica 107

Bảng 4.19 Khả năng sống của B subtilis VL28 trong đường ruột gà 109

Bảng 4.20 Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR qua 8 tuần thí nghiệm 112

Bảng 4.21 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 115

Bảng 4.22 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…117

Bảng 4.23 Tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 120

Bảng 4.24 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi

trong thí nghiệm 2 122

Bảng 4.25 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi… 123

Bảng 4.26 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…124

Bảng 4.27 Kết quả test sinh hóa E coli trên bệnh phẩm gan……… 127

Bảng 4.28 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi

ở thí nghiệm 3 129

Bảng 4.29 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi

ở thí nghiệm 3 130

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic 4

Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe 8

Hình 2.3 Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vk probiotic và niêm mạc ruột 9 Hình 2.4 Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc

chất kích thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm 11

Hình 2.5 Mô hình cấu tạo tế bào vi khuẩn Bacillus spp 16

Hình 2.6 Mô hình các vị trí nhiễm sắc thể trên bộ gen B subtilis 17

Hình 2.7 Sơ đồ quá trình hình thành bào tử B subtilis 19

Hình 2.8 Sự biệt hóa tế bào ở B subtilis 21

Hình 2.9 Sơ đồ hệ tiêu hóa gà 28

Hình 3.1 Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B subtilis 55

Hình 3.2 Sơ đồ kiểm tra khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của vi khuẩn B subtilis……… 59

Hình 3.3 Chuồng gà thí nghiệm……… 62

Hình 4.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường TSA và hình thái dưới kính hiển vi 67

Hình 4.2 Kết quả test sinh hóa 69

Hình 4.3 Định danh bằng kit API CH50B 71

Hình 4.4 Sản phẩm PCR của các chủng B subtilis trong nghiên cứu 73

Hình 4.5 Sơ đồ chọn lọc và định danh vi khuẩn B subtilis 76

Hình 4.6 Khả năng chịu nhiệt của các chủng B subtilis phân lập 78

Hình 4.7 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B subtilis…….80

Hình 4.8 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng B subtilis AG27 và VL28 81

Hình 4.9 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng B subtilis AG27 82

Hình 4.10 Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng B subtilis 87

Hình 4.11 Hiệu quả kháng khuẩn của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E coli 90

Hình 4.12 Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với

S enterica 92

Hình 4.13 Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp 94

Hình 4.14 Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp 97

Hình 4.15 Hoạt tính đối kháng của VL28 với E coli, S enterica,

Staphylococcus spp và Streptococcus spp 98

Hình 4.16 Khả năng chịu pH 4 và 5 của các chủng B subtilis 100

Hình 4.17 Khả năng chịu pH 3 của các chủng B subtilis 102

Hình 4.18 Khả năng chịu pH 2 của các chủng B subtilis 104

Hình 4.19 Khả năng tự bám dính của các chủng B subtilis 105

Hình 4.20 Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh của AG27 và VL28 108

Hình 4.21 Khả năng bám dính của 2 chủng VL28 và AG27 trong biểu mô ruột 108

Hình 4.22 Khả năng tồn tại của B subtilis VL28 ở ruột non, manh tràng,

và ruột già 110

Hình 4.23 Tóm tắt quá trình phân lập và chọn lọc vi khuẩn probiotic……….111

Hình 4.24 Biểu đồ tăng trọng và FCR của gà qua các tuần ở thí nghiệm 1 113

Hình 4.25 FCR và tăng trọng ở giai đoạn 1-14 ngày tuổi của thí nghiệm 2 116

Hình 4.26 Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 15-28 ngày tuổi 118

Hình 4.27 Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm S enterica 119

Hình 4.28 Khuẩn lạc S enterica trên môi trường SS và kết quả test sinh hóa 119 Hình 4.29 Kết quả giải trình tự vi khuẩn S enterica phân lập từ lách gà bệnh 120 Hình 4.30 Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 2 121

Hình 4.31 Tăng trọng và FCR giai đoạn 15-28 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 125

Hình 4.32 Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm E coli 126

Hình 4.33 Khuẩn lạc E coli trên môi trường Mac Conkey và EMB 126

Hình 4.34 Test sinh hóa vi khuẩn E coli 127

Hình 4.35 Kết quả giải trình tự vi khuẩn E coli phân lập từ gan gà bệnh 128

Hình 4.36 Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 129

Hình 4.37 Kết quả đăng ký trình tự gen B subtilis VL28 trên ngân hàng gen

NCBI……… 131

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ (tiếng Anh) Tiếng Việt

APC Antigen presenting cells Tế bào trình diện kháng nguyên

ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ

BAU Bacterial Amylase Units Đơn vị hoạt lực amylase của vi khuẩn

CE Competitive exclusion Loại trừ cạnh tranh

CLSI Clinical and Laboratory Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và

Standards Institute Xét nghiệm DSM Difco sporulation Medium Môi trường bào tử hóa

HE Hematoxylin- eosin Thuốc nhuộm tiêu bản mô

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

PBS Phosphate buffered saline Muối đệm phosphate

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét Một trong những vấn đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi Việc này đã làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người Do vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn nuôi Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng cường sức khỏe nói

chung cho người và động vật Bacillus subtilis là một vi khuẩn rất phổ biến trong

tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và

có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người và vật nuôi theo mô hình

công nghiệp Tuy nhiên, B subtilis rất đa dạng về các đặc tính sinh học nên

không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh

nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên

1.2 Mục tiêu

- Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có

các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột

(S enterica, E coli)

- Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong

phòng bệnh đường ruột ở gà do E coli và S enterica gây ra

1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

- Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất và

phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu

Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang

1.4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B subtilis

bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng bằng

sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S enterica và E coli gây ra

- Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B subtilis bản địa từ phân

và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B subtilis VL28

có thể sử dụng làm probiotic trên gà

- Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B subtilis VL28

107 CFU/g với liều 5 g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa quá

trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với

S enterica và E coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số

chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng

- Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của

B subtilis VL28 với mã số truy cập KY346980

(có thể truy cập trên trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980)

- Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một

cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế

1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Chọn lọc được chủng B subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic

phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long Kết quả nghiên

cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống

bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho

người chăn nuôi Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm

chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi Góp phần tạo được

nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về probiotic

2.1.1 Lịch sử probiotic

Nghiên cứu về probiotic bắt đầu được chú ý vào năm 1900 khi Tisser quan sát và thấy phân của những đứa trẻ tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc

hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh (Schillinger et al., 1996) Sau đó năm

1907, Metchnikoff đã chứng minh việc sử dụng Lactobacillus sẽ hạn chế các nội

độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc (Caucasians) ở Bulgaria là họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men (Metchnikoff E., 1907) Có thể nói Tisser và Metchikoff là những người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic

Năm 1930, Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ em khỏe mạnh (Cartwright, 2003) Cùng năm đó các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng

minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường

xuyên Các nhà khoa học đại học Harvard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất được Khái niệm chung về probiotic xuất hiện ở Châu Âu vào những năm đầu của thập niên 80, ở Châu Á, nhiều năm sau các sản phẩm từ sữa lên men mới được du nhập vào và bắt đầu có khái niệm về probiotic (Cartwright, 2003)

Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, đặc biệt là công nghệ sinh học, các nghiên cứu về probiotic ngày càng được mở rộng Ngày nay probiotic đã được sử dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và chăn nuôi

2.1.2 Các định nghĩa về probiotic

Năm 1965, Lilley và Stillwell lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic để

mô tả những chất tiết ra từ vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển của vi

sinh vật khác (Grover and Luthra, 2011)

Trải qua lịch sử định nghĩa probiotic ngày càng cụ thể hơn, như:

“Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mà chúng tác động có lợi cho sự cân

bằng vi sinh vật đường ruột của động vật” (Marteau et al., 2002)

“Probiotic là các chủng vi sinh vật sống bổ sung tạo ảnh hưởng có lợi lên vật chủ bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hay quần thể vi sinh vật bao quanh, tăng cường việc sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường khả năng phản ứng của vật chủ với bệnh, tăng cường chất lượng môi

trường xung quanh vật chủ” (Verschuere et al., 2000).

“Probiotic là lượng vi sinh vật sống xác định với số lượng thích hợp được chuẩn bị trong các sản phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật ruột và

có tác dụng tốt đến sức khỏe vật chủ." (Schrezenmeir and de Vrese, 2001)

"Probiotic, đó là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ" (FAO/WHO, 2002) Đây là định nghĩa được chấp nhận nhiều hơn cả, nó được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học

2.1.3 Xu hướng sử dụng probiotic

Theo khảo sát của hiệp hội lương thực và thực phẩm (International Food Information Council - IFIC), số người biết đến và sử dụng probiotic ngày càng tăng qua các năm Mức tăng trưởng về thị trường probiotic từ năm 2009 đến 2014

là 12,6% Năm 2004, số người biết đến probiotic ít hơn 10%, nhưng năm 2011 thì hơn 81% người tiêu dùng biết và sử dụng probiotic (Hình 2.1) Theo dự báo của IFIC, sản lượng probiotic toàn cầu dự báo đạt 31,1 tỉ USD vào năm 2015, nhưng thực tế đạt 41 tỉ USD (Monica Feldman, 2016), cho thấy thị trường probiotic rất tiềm năng, luôn phát triển ngoài mong đợi

Hình 2.1 Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic (IFIC, 2011)

2.1.4 Vai trò và cơ chế tác động của probiotic

Probiotic khi được đưa vào cơ thể sẽ có nhiều tác động tích cực không chỉ

với hệ tiêu hóa mà còn trên nhiều hệ cơ quan khác (Patterson and Burkholder, 2003) Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả Kabir (2009); Otutumi

et al (2012) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với động vật thể

hiện ở các khía cạnh sau:

2.1.4.1 Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

- Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn: bao gồm bacteriocin, acid hữu

cơ, và hydrogen peroxide

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein, được ribosome tổng hợp nên các peptide hoặc protein Chất này có ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương nhằm ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác Cơ chế tác động của bacteriocin rất đa dạng, nó có thể làm biến đổi các enzyme, ức chế sự sản sinh bào tử, xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ

Acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acid acetic, lactic, propionic, … làm pH môi trường hạ thấp, ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh, do đó có tác dụng ức chế sự phát triển của chúng

Tính chất kháng khuẩn của hydrogen peroxide chủ yếu thông qua việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc superoxide và các gốc hydroxyl tự do

- Cạnh tranh vị trí gắn kết

Khả năng gắn kết trên biểu mô ruột là một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật

cư trú trong ruột Các vi khuẩn probiotic có mặt trong hệ tiêu hóa có khả năng ngăn chặn khả năng bám dính của vi khuẩn gây bệnh, do đó làm giảm lượng chất độc của chúng tiết ra trên biểu mô ruột Một số trường hợp, vi khuẩn probiotic có thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi khuẩn gây bệnh ngay cả khi những vi khuẩn này

đã bám chặt trên tế bào biểu mô (Czerucka and Rampal, 2002)

- Cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng

Probiotic còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dưỡng để phát triển Chẳng hạn sự phát triển của probiotic sử dụng đường đơn (glucose, fructose) sẽ

làm giảm sự phát triển của Clostridium difficile (cũng sử dụng đường đơn) (Peter,

2006) Các sinh vật probiotic còn tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến

sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh (Otutumi et al., 2012)

2.1.4.2 Tác động trên mô biểu bì ruột

Một số chủng probiotic có khả năng tiết ra một số chất giúp đẩy mạnh sự liên kết giữa những tế bào biểu mô, hoặc có khả năng làm giảm độ thẩm thấu vào màng nhầy, hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật Một số chủng có khả năng sinh tổng hợp chất nhầy, đây cũng là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân gây bệnh do chất nhầy sẽ cô lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh

2.1.4.3 Tăng cường khả năng miễn dịch

Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật, giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương quan đặc thù Probiotic tác động đồng thời lên cả

hệ miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu của cơ thể Với hệ miễn dịch không đặc hiệu, probiotic giúp giảm thiểu sự di chuyển của các vi khuẩn và chất lạ (kháng

nguyên) từ ruột xâm nhập vào mạch máu (Dugas et al., 1999) Nhờ đó giúp giảm

nhiễm khuẩn và dị ứng đối với các kháng nguyên trong thực phẩm Đối với hệ miễn dịch đặc hiệu, tác động của probiotic tương đối phức tạp hơn Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành, và một số cơ chế tác động của probiotic lên hệ miễn dịch

đã được phát hiện (Lee and Salminen, 2009) Tuy nhiên cơ chế tác động của

probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ

2.1.4.4 Tác động đến vi khuẩn đường ruột

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pH trong hệ tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi khuẩn gây bệnh và thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi, giảm vi

khuẩn gây hại (Soccol et al., 2010)

2.1.4.5 Tổng hợp vitamin

Các vi khuẩn probiotic có khả năng sinh các loại vitamin nhóm B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K (Chaucheyras-

Durand and Durand, 2010) Theo các nghiên cứu, Lactobacillus brevis có khả

năng tổng hợp vitamin D và vitamin K; Bacillus longum tổng hợp vitamin B; Bacillus bifidum và Lactobacillus acidophillus tổng hợp được các vitamin B như

niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K

2.1.4.6 Một số tác động khác

- Tác động chống ung thư: Probiotic giúp gắn kết và phân hủy các chất gây

ung thư, sản xuất ra những hợp chất kháng ung thư, điều hòa những enzyme tiền

chất gây ung thư (Holm, 2003)

- Tác động chống dị ứng: Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn

là điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn

vi sinh vật chính kích thích hệ thống miễn dịch Qua các nghiên cứu, người ta

thấy rằng ở những người ít bị dị ứng số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và

Clostridia ít hơn so với ở những người thường bị dị ứng (Soccol et al., 2010)

- Làm tăng khả năng dung nạp của cơ thể với lactose, giúp tránh khỏi tình

trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose

(Soccol et al., 2010)

- Làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh Vi khuẩn đường ruột

chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn (coprostanol) do đó làm cản trở

việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột

SCFA: short chain fatty acids: acid béo mạch ngắn: có tác dụng hạ pH trong đường tiêu

hóa, ức chế vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn lên men thối.

Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe

2.1.5 Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm

Cơ chế tác động của probiotic lên hệ thống miễn dịch ở niêm mạc gia cầm

chưa được biết đến một cách rõ ràng Tuy nhiên, tác dụng điều hòa miễn dịch của

Probiotic

Hiệu quả chuyển hóa

Thủy phân Lactose

Cải thiện khả năng dung nạp lactose

Khử và tiết muối mật cholesterol Giảm

Điều hòa miễn dịch

Giảm triệu chứng dị ứng thức ăn

Kiểm soát các bệnh viêm nhiễm đường ruột

probiotic là điều không thể phủ nhận (Erickson and Hubbard, 2000; Everlon,

miễn dịch (Hong et al., 2005)

Hình 2.3 Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vi khuẩn probiotic

và niêm mạc ruột (Everlon, 2012)

Vi khuẩn probiotic ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột, và tăng cường chức năng làm rào cản Theo Hình 2.3, hoạt động kháng khuẩn của probiotic bao gồm:

(1) Sản xuất các kháng khuẩn sinh học (bacteriocins và defencins).

(2) Ức chế cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh

(3) Ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh hoặc chuyển vị

(4) Giảm pH trong lòng ruột

(5) Tăng cường sản xuất chất nhầy

Cơ chế điều hòa miễn dịch xảy ra theo hai cách: (a) Từ vi sinh vật, các vi khuẩn probiotic cư trú nơi thành ruột và số lượng các vi khuẩn được nhân lên (b) Từ kháng nguyên, tạo bởi các sinh vật chết được hấp thụ, từ đó kích thích hệ

thống miễn dịch (Havenaar and Spanhaak, 1994) Theo Loddi (2003), các kháng

nguyên (lipopolysaccharides và peptidoglycans) được tạo ra liên tục trong lòng ruột Quá trình này tăng lên khi xảy ra viêm nhiễm, các thành phần này mang tính thiết yếu trong sự phát triển và duy trì các phản ứng miễn dịch (Loddi, 2003) Probiotic tạo ra những thay đổi ở biểu mô ruột bằng cách: làm giảm pH của ruột, tiết ra các peptide kháng khuẩn ức chế vi khuẩn xâm nhập và ngăn chặn sự bám dính vào tế bào biểu mô Điều này có nghĩa là chúng cải thiện chức năng rào

cản ở ruột, gia tăng tổng hợp cytokine (TNF-α, IFN-γ, IL-10 và IL-12) (Arvola et al., 1999), kích thích IgA tiết ra trong niêm mạc ruột, giải phóng mucin (Gupta and Garg, 2009) Mucin là lớp glycoprotein khi tiếp xúc với nước sẽ tạo thành

một màng bôi trơn và bảo vệ các tế bào biểu mô ruột chống lại tác nhân gây bệnh, chúng thành lập một rào cản vật lý giữa các tế bào biểu mô và các thành phần

trong lòng ruột, giúp giữ vi khuẩn an toàn trong ruột (Mattar et al., 2002) Trong

ruột, probiotic tương tác với các tế bào hấp thu ở nhung mao, tế bào hình ly, tế bào M (Microfold cells) từ các lympho bào Những tương tác này dẫn đến tăng số lượng IgA, thêm vào đó là việc tiết IgM và IgA, đặc biệt quan trọng đối với khả năng miễn dịch của niêm mạc ruột, góp phần tạo rào cản chống lại mầm bệnh

(Szajewska et al., 2001) Khả năng lấn át mầm bệnh trong cơ chế điều hòa đáp

ứng miễn dịch đã được quan sát thông qua sự gia tăng của nhu động ruột (Gupta

and Garg, 2009), gia tăng quần thể tế bào lympho trong biểu mô ruột (Dalloul et al., 2003), loại bỏ các tác nhân gây bệnh (Patterson and Burkholder, 2003), ổn định hệ vi sinh vật đường ruột và gia tăng chiều cao vi nhung ruột (Salzman et al., 2003) Thêm vào đó, các nhóm vi khuẩn phát triển một mạng lưới để khóa các

vị trí liên kết của các tác nhân gây bệnh đường ruột

Vi khuẩn probiotic có khả năng sản xuất ra một loại chất có khả năng “loại trừ” các vi sinh vật cạnh tranh khác, cơ chế này được biết đến như là cơ chế loại trừ cạnh tranh, chúng cạnh tranh vị trí bám dính vào màng tế bào hình ly, các tế bào nội tiết và các tế bào hấp thu ở nhung mao trong niêm mạc ruột, cơ chế này tạo nên hệ thống hàng rào vật lý toàn vẹn, giúp ngăn ngừa tác nhân gây bệnh

đường ruột Cơ chế đã được mô tả bởi Revolledo et al (2006) (Hình 2.4) Cũng

theo cơ chế này, tác dụng đối kháng thông qua một số chất được tiết ra nhằm ức chế sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như bacteriocin, acid hữu cơ và hydrogen peroxide (Patterson and Burkholder, 2003;

Mazmanian et al., 2008) Những lợi ích khác từ việc sử dụng các vi khuẩn

probiotic đó là: tăng hoạt động enzyme thúc đẩy quá trình hấp thu và dinh dưỡng;

ức chế các enzyme gây bệnh ung thư (Gill, 2003)

Hình 2.4 Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc chất kích thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm (Revolledo et al., 2006)

SIgA = IgA phân tiết (secretory IgA) ; CE = loại trừ cạnh tranh (competitive exclusion) ; IEC =

tế bào biểu mô ruột (intestinal epithelial cells); IEL = lympho bào trong biểu mô ruột (intestinal intraepithelial lymphocyte) ; LPL = lympho bào đệm niêm mạc (hoạt hóa lympho bào T) (lamina propria lymphocytes); tế bào đuôi gai hay đại thực bào = tế bào trình diện kháng nguyên (APC- antigen-presenting cells); LB = lympho bào B; LT = lympho bào T; Tế bào M = tế bào cần cho việc vận chuyển các kháng nguyên từ lumen ruột đi vào các mô bạch huyết ruột; SC = thành phần kích thích tiết IgA (secretory component); endocytosis = nhập bào (xâm nhập tế bào bằng cách hình thành túi trên màng tế bào, sau đó túi này lộn ngược vào trong tế bào phóng thích chất xâm nhập vào bên trong tế bào); transcytosis = chất trung gian trên màng tế bào

Theo Revolledo et al (2006), cơ chế được đề xuất như sau (Hình 2.4):

gai b) Kháng nguyên kích hoạt các tế bào B, quá trình này hoạt hóa lympho T trong đệm niêm mạc

- Các tế bào trong biểu mô (IEC) sử dụng quá trình nhập bào (endocytosis)

để hấp thu kháng nguyên IEC có thể hoạt động như một tế bào đại diện kháng nguyên (APC) và xử lý kháng nguyên, kháng nguyên đại diện cho lympho T trong đệm niêm mạc

Sự sản xuất SIgA: Lympho bào T (LT - LPL) được kích hoạt sản xuất cytokin (chất trung gian điều hòa các tế bào trong cơ thể), kích thích lympho B hoạt động, và cuối cùng là các tương bào, sản xuất IgA Các IgA được gắn thành phần kích thích tiết tế bào trong biểu mô (IEC) và tự biến đổi chúng thành IEC; cuối cùng SIgA được hình thành và phát huy hiệu quả bảo vệ bề mặt

2.1.6 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ

yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và Streptococcus cũng được sử dụng nhưng ít hơn Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus,

L casei, L rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii, S cerevisiae cũng được xem là probiotic (Vuyst et al., 2004) Tuy nhiên, các nghiên cứu cho

thấy vi khuẩn lactic bị diệt khi gặp nhiệt độ cao và tác động của muối mật

(Fernandes et al., 1988) Bên cạnh đó, các vi khuẩn này không chịu được các điều

kiện khắc nghiệt của quá trình sản xuất như sấy khô, tạo hạt, … làm cho tuổi thọ của sản phẩm ngắn Để bảo đảm hiệu quả của sản phẩm, một số nhà sản xuất tiên tiến đã sử dụng công nghệ vi bao (Cell Biotech) trong quá trình sản xuất, đưa đến

giá thành sản phẩm cao Trong khi đó, các vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus có thể

chịu đựng được nhiệt độ đến 100oC trong vài phút (Teo et al., 2003), tồn tại trong muối mật 0,5% (Teo et al., 2006), bền vững trong điều kiện bảo quản thông

thường và trong quá trình sản xuất sấy khô, tạo hạt, … nên rất phù hợp để tạo sản phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn vật nuôi

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy B subtilis có khả năng cạnh tranh mạnh với các vi khuẩn gây bệnh (La Ragione and Woodward, 2003), thân thiện với

nhóm vi khuẩn lên men lactic, là nhóm được xem là có lợi cho sức khỏe động vật

(Knarreborg et al., 2008) Ngoài ra do B subtilis có khả năng hình thành bào tử,

tồn tại lâu dài trong điều kiện tự nhiên mà không mất hoạt tính nên sản phẩm

probiotic sẽ rất thuận lợi khi lưu hành và bảo quản (La Ragione et al., 2008) Chính vì lẽ đó B subtilis đã được ưu tiên sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi ở

nhiều quốc gia

2.1.7 Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic

2.1.7.1 Về mặt sản xuất

- Có thể nhân lên nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men đơn giản và giá thành thấp

- Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc vi hiếu khí

- Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà không mất số lượng đáng kể

- Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng

- Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến thực phẩm bao gồm các quá trình nhiệt độ cao trên 45oC cũng như chịu đựng được nồng độ cồn và muối cao

- Có thể tồn tại được trong quá trình lưu trữ trong khoảng thời gian dài mà không bị giảm mật số

2.1.7.2 Về mặt sử dụng cho vật nuôi

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật, tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh trong đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí

nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn

probiotic (FAO/WHO, 2002)

Theo FAO (2002) các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:

- Có tính định danh chính xác thuộc loài nào

- Không mang các gen kháng kháng sinh

- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ

- Có khả năng cạnh tranh thức ăn với các vi sinh vật có hại

- Không sinh chất độc và không gây bệnh cho vật chủ

- Có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài

- Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà cơ thể vật chủ có thể sử dụng

- Chịu được pH thấp ở dạ dày và nồng độ muối mật cao ở ruột non

- Khả năng chịu được các dịch tiêu hóa

- Khả năng cư trú trong ruột

2.1.8 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic

Đánh giá độ an toàn phải tính đến bản chất của vi khuẩn được sử dụng, phương pháp điều trị, mức độ phơi nhiễm, trạng thái sức khoẻ của động vật sử dụng và các chức năng sinh lý mà probiotic được hướng tới

Đối với nghiên cứu phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôi cần bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia

súc, gia cầm (Arturo et al., 2006) Điều này cho thấy yêu cầu an toàn đối với

chủng vi sinh vật được tuyển chọn làm probiotic dù dùng trong chăn nuôi cũng cần xem xét các yếu tố tác động đến vật nuôi, con người và môi trường

- Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hóa, bệnh nhiễm

khuẩn và các phản ứng phụ (Arturo et al., 2006)

- Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người

và động vật, không mang gen lạ Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi, đất) là các chủng được khuyến cáo sử dụng

- Tổ chức FAO (2002) hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải được cụ thể hóa các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Ủy ban khoa học về dinh dưỡng động vật (Scientific committee for animal nutrition, SCAN) đưa ra những qui định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn

đề này qua các điều luật và kỹ thuật online (SCAN, 2000)

Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng

vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices)

2.2 Tổng quan về Bacillus subtilis

2.2.1 Đặc điểm chung của giống Bacillus

Theo Online Textbook of Bacteriology (Todar, 2015), Wikipedia và

Microbewiki Bacillus được phân loại như sau:

Bảng 2.1: Bậc phân loại của Bacillus subtilis

Hiện nay đã xác định được 226 loài Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên

(Euzéby, 1997) đặc biệt trong đất, không khí, nước, trên cơ thể thực vật và động

vật, bụi cỏ khô và rơm rạ Hầu hết là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu

khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính nhau thành chuỗi ngắn Nội

bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohen (1872) khi nghiên cứu về B subtilis và sau

đó là Robert Koch trong các nghiên cứu về các loài vi khuẩn gây bệnh như

B anthracis vào năm 1876 Sự tạo thành nội bào tử sau đó được chấp nhận như là

một đặc tính căn bản để phân loại và xác định các thành viên của chi Tuy nhiên,

cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B thermoamylovorans,

B halodenitrificans, một số khác bắt màu Gram âm hay Gram dương yếu như

B thermosphaericus, B horti, B oleronius, B azotoformans (Yumoto et al.,

1998) Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải trình tự rRNA/DNA, dạng vi

khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus như

B infernus (Boone et al., 1995)

Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước từ 0,5-1,2 x 2,5-10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài Đối với Bacillus có

nội bào tử thì bào tử hình trụ, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục Tùy theo loài,

bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không

phồng Trong một số điều kiện đặc biệt (có HCO3- trong bình kỵ khí hoặc môi

trường CO2), B subtilis, B licheniformis B megaterium và B anthracis, tạo ra

một vỏ polypeptide (poly-γ-D-glutamic acid) nhìn thấy được khi nhuộm tế bào

với polychrome methylene blue Trừ B anthracis và B mycoides, hầu hết các loài

Bacillus đều di động, mặc dù có sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong

mỗi loài Đa số các loài có catalase dương tính

Hình 2.5 Mô hình cấu tạo tế bào vi khuẩn Bacillus spp

2.2.2 Đặc điểm loài B subtilis

Vi khuẩn lần đầu tiên được Ehrenberg phát hiện năm 1835 và được đặt với

tên Vibrio subtilis Sau đó, năm 1872 được Cohen đổi tên thành B subtilis và

được sử dụng cho đến ngày nay B subtilis là một trong những vi khuẩn đầu tiên

được nghiên cứu, và được sử dụng như mô hình nghiên cứu quá trình phát triển

và biệt hóa của tế bào (Entrez Genome Project, NCBI)

B subtilis là vi khuẩn Gram dương, hình que được tìm thấy tự nhiên trong

đất, cát, thực vật, hệ tiêu hóa người và động vật (Raghavendra et al., 2006)

B subtilis có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 5-15oC đến 40-50oC,

nhiệt độ tối ưu để phát triển là 25-35oC (Entrez Genome Project, NCBI) Khi gặp

điều kiện môi trường không thuận lợi, khắc nghiệt, thiếu thức ăn, B subtilis có

khả năng hình thành bào tử Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng hấp thu DNA

bên ngoài, cho phép các vi khuẩn thích nghi bằng cách tái tổ hợp Tuy nhiên, điều

này cần nhiều thời gian Nhờ sự hình thành bào tử, B subtilis cũng có thể gia tăng

sự chống chịu nhanh trước môi trường khắc nghiệt như acid, kiềm, oxy hóa, nhiệt

hoặc ethanol bằng cách kích hoạt yếu tố B (sigma factor B) (Bandow, 2002)

2.2.2.1 Tính an toàn của B subtilis

B subtilis được xem là sinh vật không gây bệnh và được Cục Quản lý

dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA) công nhận là sinh vật an toàn (Generally

Regarded As Safe - GRAS, No 562) (Peter, 2009) B subtilis có độc tính rất thấp

đối với người vì enzyme ngoại bào và các tác nhân gây độc do vi sinh vật này sản

xuất ra không đủ liều lượng và hoạt độ gây nguy hại cho người, ngoại trừ các

trường hợp đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ miễn dịch của người quá suy

yếu Các nghiên cứu cho thấy B subtilis sử dụng ở người với liều uống lên đến

1×1011 CFU/ngày/người vẫn an toàn và không hề có tác dụng phụ (Hong et al.,

2008)

2.2.2.2 Cấu trúc gen

Trình tự bộ gen của vi khuẩn B subtilis đã được Kunst giải mã thành công

và được công bố vào tháng 11 năm 1997 (Kunst et al., 1997)

Bộ gen B subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể

vòng tròn Kích thước tổng thể của DNA là 4.214.814 cặp bp (4215 kbp) (Hình

2.6) Có 4.100 gen là gen mã hóa protein 192 gen trong số này được xem là

không thể thiếu và 79 gen được xem là cần thiết cho các quá trình sống của

B subtilis (Kunst et al., 1997) Phần lớn các gen trong vi khuẩn này là gen đơn

bản Khoảng 220 yếu tố điều hòa phiên mã đã được xác định trong hệ gen Cho

đến nay, chỉ khoảng 58% số gen đã được biết chức năng 42% số gen còn lại vẫn

đang được nghiên cứu

Hình 2.6 Mô hình các vị trí nhiễm sắc thể trên bộ gen B subtilis được khảo sát ở

một số quốc gia (Kyoto University Bioinformatics Center, 2006)

(http://bacillus.genome.ad.jp/bsorf.html)

Hầu hết các gen cần thiết là các gen tham gia vào các hoạt động sống của tế bào, 50% trong số các gen thiết yếu có trách nhiệm xử lý thông tin, 20% trong số chúng có trách nhiệm tổng hợp thành tế bào, phân chia tế bào, cấu thành tế bào và khoảng 10% trong số chúng chịu trách nhiệm về việc tổng hợp năng lượng tế bào Ngoài ra, còn khoảng 4% gen cần thiết khác chức năng chưa được biết rõ

(Kobayashi, 2003) B subtilis có khả năng tiết ra một số lượng lớn kháng sinh ra

ngoài vỏ tế bào (Ara, 2007) Được biết có 5 gen mã hóa peptidase giữ vai trò quan trọng trong việc tiết kháng sinh và nhiều gen của tế bào chịu trách nhiệm

trong việc tổng hợp kháng sinh (Kunst et al., 1997)

2.2.2.3 Nhiễm sắc thể

B subtilis nhân đôi nhiễm sắc thể bắt đầu từ một sợi đơn DNA, bản gốc

(oriC) Tiến trình sao chép theo hai hướng: theo chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim đồng hồ Sự sao chép nhiễm sắc thể hoàn tất khi sợi DNA mẫu đến điểm cuối, tại vị trí đối diện với đoạn gốc trên bản đồ nhiễm sắc thể và nó chứa một đoạn ngắn DNA Protein cụ thể điều hòa tất cả các bước trong sao chép DNA Mặc dù các thành phần cơ bản thúc đẩy bắt đầu, kéo dài, và chấm dứt sự sao chép được bảo tồn tốt, một số khác biệt quan trọng có thể được tìm thấy (như một số loại vi khuẩn thiếu protein thiết yếu) Những khác biệt này nhấn mạnh sự

đa dạng trong các cơ chế và chiến lược mà các loài vi khuẩn khác nhau đã áp dụng để thực hiện việc sao chép bộ gen của chúng (Graumann, 2012)

2.2.2.4 Cấu trúc tế bào và chuyển hóa

B subtilis là vi khuẩn hình que, Gram dương (Perez, 2000) Thành tế

bào được cấu tạo từ các đơn phân murein (còn gọi là peptidoglycan hay glycopeptide) Mỗi đơn phân murein bao gồm: N- acetyl glucozamin (G), N- acetyl muramic (M), alanin, D- glutamic, Di - aninoacid Mối liên kết giữa các chất trong đơn phân: G và M liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 β glucoside Các acid amin liên kết với nhau và liên kết với M bởi liên kết peptid Các đơn phân liên kết với nhau để tạo lớp thành vững chắc Thành tế bào có nhiều lớp murein nên dày, hình thành lớp bảo vệ giữa môi trường và tế bào vi khuẩn, ngoài ra nó còn giữ vai trò duy trì hình dạng của tế bào và giữ áp lực của sức trương nội bào (Schaechter, 2006)

B subtilis là vi sinh vật mẫu để nghiên cứu sự hình thành nội bào tử của vi khuẩn Trong điều kiện môi trường không thuận lợi, vi khuẩn B subtilis hình

thành nội bào tử Tuy nhiên quá trình này cần bắt đầu trước khi chất dinh dưỡng

cạn kiệt toàn bộ; nếu không, sự hình thành bào tử không được hoàn tất (Perez, 2000) Sự hình thành bào tử xảy ra trong nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất Đầu tiên, nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn thực hiện sao chép và chuyển về một phía của tế bào Sau đó, tế bào hình thành một vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ(mother cell) (Perez, 2000) Tế bào mẹ nuôi dưỡng tiền bào tử Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể nằm bên trong tế bào mẹ 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một loại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE (Schaechter, 2006) Sau đó,

tế bào mẹ nuốt tiền bào tử vào trong theo kiểu thực bào, lúc này tiền bào tử có hai lớp màng peptidoglycan dày, gọi là vỏ bao, một là lớp áo protein của bào tử và một lớp màng bảo vệ bên ngoài Tại thời điểm này, tiền bào tử bắt đầu có những thay đổi bên trong, và cuối cùng nó tách rời ra khỏi tế bào mẹ (Perez, 2000) Một nội bào tử trưởng thành không có hoạt động trao đổi chất, nó là trơ Phần lõi của nội bào tử rất khô và có khả năng đề kháng với ẩm độ (Schaechter, 2006)

Hình 2.7 Sơ đồ quá trình hình thành bào tử B subtilis

B subtilis sử dụng lông của nó để kết lại thành từng đám Hiện tượng này thường thấy trên đĩa thạch hơn là trong môi trường dịch lỏng Vi khuẩn B subtilis

có thể ở dạng đơn hoặc kết thành chuỗi Các tế bào ở cạnh nhau có khuynh hướng

kết lại thành mảng, nhờ vào chất nhày mỏng gọi là surfactin, là một lipopeptide

có khả năng làm giảm sức căng bề mặt (Schaechter, 2006)

Trước đây, B subtilis được xem là hiếu khí bắt buộc, nghĩa là chúng cần

được cung cấp oxy để phát triển Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy chúng có thể phát triển trong điều kiện yếm khí Nó có thể tạo ra ATP thông qua quá trình lên men đường, peptides và một số cơ chất khác trong điều kiện yếm khí Sản phẩm của quá trình lên men tạo ra butanediol và nitơ thu được từ quá trình khử nitrate (Marino, 2001)

Trong điều kiện yếm khí B subtilis có thể sử dụng nitrite hoặc nitrate cho việc hô hấp Tế bào B subtilis có chứa hai men khử nitrate (nitrate reductases)

Một sử dụng cho việc đồng hóa nitơ trong nitrate và một được sử dụng cho việc

hô hấp nitrate Tuy nhiên, chỉ có men khử nitrite (nitrite reductase) là thực hiện nhiệm vụ hô hấp Men khử nitrate sẽ khử nitrate thành nitrite để sử dụng hô hấp, sau đó dưới tác dụng của nitrite reductase sẽ khử nitrite thành ammonia (NH3) (Marino, 2001)

B subtilis chứa men catalase KatA và MrgA, một loại enzyme giữ nhiệm vụ

xúc tác thủy phân hydrogen peroxide thành nước và oxy, và superoxide dismutase, một loại enzyme xúc tác sự phân hủy của superoxide thành oxy và hydro peroxide (Bandow, 2002)

2.2 2.5 Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa

B subtilis có khả năng biệt hóa rất lớn biểu hiện ở nhiều dạng tế bào khác

nhau Nghiên cứu chuyên sâu đã cho kết quả chi tiết đặc tính phân tử về sinh lý của một số loại tế bào khác nhau trong các môi trường phân tán

Ví dụ, vào giai đoạn bắt đầu pha tĩnh, B subtilis có thể biệt hóa thành các

tế bào khả biến (competent cells) - có khả năng thu nhận DNA từ môi trường

(Dubnau, 1991; Dubnau and Provvedi, 2000), hay nó có thể biệt hóa thành các

bào tử miên trạng (dormant spore) có khả năng chống lại các điều kiện khắc

nghiệt bên ngoài (Rudner and Losick, 2001; Piggot and Hilbert, 2004) Ngoài ra,

một tập hợp con của các tế bào có thể sản xuất một “tác nhân hủy diệt” ngoại bào (killing factor) và độc tố có chức năng tiêu diệt (hoặc thực bào) các tế bào chưa bắt đầu hình thành bào tử, do đó cho phép các tế bào có thể thực bào lẫn nhau để trì hoãn tham gia vào lộ trình hình thành bào tử (Gonzalez - Pastor, 2003)

Một loại tế bào thứ tư được quan sát trong quá trình thành lập màng sinh học (biofilm), khi một phần của quần thể tế bào sản xuất ra chất nền ngoại bào (extracellular matrix) giúp kết dính các tế bào với nhau (Vlamakis, 2008)

Sự biệt hóa cũng đã được quan sát trong các tế bào đang ở pha tăng

trưởng Chỉ một phần nhỏ của các tế bào thể hiện sigD, nhân tố sig cần thiết cho

quá trình sản xuất tiên mao, kết quả là không có sự đồng nhất về tính di động

(Kearns et al., 2005) Một số loại tế bào này có thể được phân biệt với những tế

bào chị em của chúng do quá trình biểu hiện gen bị biến đổi dẫn đến thay đổi hình thái quan sát được dưới kính hiển vi Một số khác chỉ có thể phân biệt bằng cách

đo lường sự biểu hiện gen chuyên biệt cho từng loại tế bào bằng cách sử dụng các phân tử chỉ thị (Hình 2.8)

Hình 2.8 Sự biệt hóa tế bào ở B subtilis được quan sát trong các tế bào chứa tổ hợp chỉ thị

phiên mã cho mỗi loại tế bào Hình ảnh được phủ 1 lớp nền (màu xám) là do ánh sáng truyền qua với chất chỉ thị huỳnh quang Màu xanh là các tế bào di động (Motile cells) (Phag-CFP), màu đỏ là các tế bào sản xuất chất nền (Matrix – producing cells) (PyqxM-yfp), màu xanh lá cây

là các tế bào thành lập bào tử (sporulating cells) (PsspB-yfp) và các tế bào khả biến (competent cells) có màu vàng (PcomG-yfp) Mỗi loại tế bào thể hiện một kiểu hình đặc trưng để phân biệt

nó với các loại còn lại (Lopez et al., 2009)

2.2.3 Dinh dưỡng và tăng trưởng

2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy

Phần lớn chi Bacillus phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương

mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khoáng, … mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh pH hoặc nồng độ muối (pH từ 2-11, và nồng độ muối từ dưới 2-25%) Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ

của Bacillus khoảng 25 phút

Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo váng trên bề mặt Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề mặt khuẩn lạc sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt

thạch (Gibson et al., 2000)

Hình dạng khuẩn lạc thay đổi tùy theo thời gian nuôi cấy, và các đĩa nuôi cấy riêng lẻ có thể tạo ra các dạng khuẩn lạc khác nhau

Bảng 2.2: Một số đặc điểm của vi khuẩn B subtilis

Phản ứng sinh hóa Kết quả Phản ứng sinh hóa Kết quả

(Manual for the identification of medical bacteria, 2004)

D : có hoặc không (khác nhau giữa các thứ trong cùng một loài)

V : bào tử ở trung tâm

X : bào tử hình oval

ONPG : ortho-nitrophenyl glucuronide

2.2.3.2 Môi trường tạo bào tử

Hầu hết các loài Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể tạo bào tử

Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng

bị cạn kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn carbon, nitrogen, hoặc phospho Có thể sử dụng môi trường nhân tạo như Difico Sporulation Medium (DSM), 2xSG

Chemically Defined Sporulation Medium (CDSM) để tạo bào tử (Monteiro et al., 2014)

2.2.4 Các chất do B subtilis sinh ra

2.2.4.1 Các enzyme

Enzyme nội bào

Trong tế bào B subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có những

enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa Enzyme nội bào là những enzyme được vi sinh vật tổng hợp trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ hay sinh tổng hợp các vật chất trong tế bào của

chúng Các enzyme nội bào của B subtilis gồm các enzyme thủy phân, protease

nội bào, penicillin amidase, catalase, amylase nội bào

Enzyme ngoại bào

B subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình

sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như α-amylase,

protease, lipase, β-glucanase, xylanase (Oyeleke et al., 2012)

Bảng 2.3: Một số loại enzyme do B subtilis sinh tổng hợp, đặc tính và phản ứng thủy phân (Oyeleke et al., 2012)

Enzyme Nhiệt độ tối

ưu (oC)

Protease 40 6,2-7,4 Thủy phân liên kết peptide, protein và

các polypeptide, tạo ra các peptide có phân tử lượng thấp hơn và các amino acid

β-glucanase 35-55 6,0-7,0 Thủy phân liên kết β-1,6-glucoside của

β-glucan tạo ra những chất có phân tử lượng thấp

Xylanase 25 5,0 Thủy phân liên kết xylan- một thành

phần của hemicellulose

2.2.4.2 Các kháng sinh do B subtilis tổng hợp

B subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau: subtilin,

subtilosin A, TasA, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin (Stein, 2005), … với những đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm hữu ích Các chất kháng sinh do vi khuẩn tiết ra thường được gọi với tên chung Bacteriocin Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được ribosome tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương

Bacteriocin được chia thành 4 nhóm: Nhóm I là nhóm lantibiotic, là các peptide có khối lượng phân tử < 5 KDa Nhóm II gồm các bacteriocin không phải

là lantibiotic, có khối lượng < 10 KDa, nhóm này lại chia ra thành 3 nhóm nhỏ khác Nhóm III là bacteriocin có khối lượng phân tử > 30 KDa, nhóm IV là các bacteriocin phức tạp, ngoài thành phần chính là protein chúng còn chứa lipid và carbohydrate

Subtilin

Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm I lantibiotic, những kháng sinh thuộc nhóm lantibiotic có tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dương như

Propionibacterium acnes, Staphylococci, Streptococci và Clostridia (Klein et al.,

1994) Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự khử hydro các nhóm sulfhydyl (nhóm chứa Hydro và sulfur trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton (Stein, 2005)

Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria

monocytogenes và Bacillus cereus (Kawulka et al., 2004)

Sublancin không tác động với vi khuẩn gram âm nhưng có khả năng đối

kháng mạnh với vi khuẩn gram dương kể cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở nhiệt độ thường trong thời gian 2 năm không mất hoạt tính (Stein, 2005)

TasA có phổ kháng khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30

phút sau khi quá trình tạo bào tử được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử, sau đó định vị trong lớp petidoglycan

vách của lõi bào tử, TasA giúp cho B subtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (Stöver and Driks, 1999)

Surfactin là một kháng sinh có tính đối kháng mạnh với Mycoplasma và

Pseudomonas syringae, virus và kháng lại các tế bào ung thư nhưng ít tác động

đối với nấm (Bais et al., 2004) Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên lớp màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của 1 số enzyme (Stein, 2005)

Bacilysocin là một kháng sinh có bản chất phospholipid có tính kháng

khuẩn mạnh với nấm được phát hiện lần đầu tiên trên B subtilis vào năm 2002 (Tamehiro et al., 2002)

Mycosubtilin là một lipopeptide có tính kháng khuẩn thuộc họ iturin

Mycosubtilin có tính đối kháng mạnh với nấm nhưng có tác động hạn chế với vi

khuẩn (Sieber and Marahiel, 2003)

2.2.5 Tính đối kháng của B subtilis

Với vi sinh vật gây bệnh

Hình thức đối kháng chủ yếu của B subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh (Yonggang et al., 2013) Tác dụng chủ

yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ yếu sau:

- Làm ngừng tổng hợp màng tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn và do

đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg++, Na+, Ca++ thoát ra ngoài làm tế bào chết

- Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn Chất kháng sinh có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi polypeptide hay đưa đến tổng hợp protein bất thường

- Phá hủy sự trao đổi của DNA và RNA của vi khuẩn cạnh tranh bằng cách

ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn chuỗi xoắn kép

DNA Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của B subtilis với một số

lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa

vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng

sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Yueju et al., 2014)

Với các vi khuẩn khác

Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, B subtilis đã tạo ra chất kháng

sinh giết chết những tế bào vi khuẩn lân cận nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải

phóng từ các tế bào này, để duy trì sự sống trước khi tạo bào tử (Gonzalez et al.,

Phương pháp cấy theo đường thẳng góc: Trên môi trường dinh dưỡng

thạch đĩa, cấy 1 đường vi sinh vật đối kháng dọc theo đường kính của đĩa Đặt vào tủ ấm ủ ở nhiệt độ thích hợp khoảng 1 ngày đối với vi khuẩn, 4-5 ngày đối với nấm mốc Sau khi các vi sinh vật đối kháng đã mọc và sinh chất kháng sinh, dùng que cấy, cấy vi sinh vật kiểm định thành những đường thẳng góc và sát với đường vi sinh vật đối kháng Sau 24 giờ ủ trong tủ ấm, quan sát vùng ức chế vi khuẩn Hoạt tính kháng sinh được đánh giá sơ bộ bằng cách đo khoảng cách từ vết cấy vi sinh vật đối kháng đến nơi vi sinh vật kiểm định ban đầu mọc

Phương pháp thỏi thạch

Sử dụng trong xác định hoạt tính kháng sinh trong trường hợp vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật sinh chất kháng sinh không mọc được trên cùng một môi trường

Nuôi vi sinh vật đối kháng trên đĩa thạch dinh dưỡng cho mọc tốt Sau đó, dùng ống thép không gỉ (đường kính 10-20 mm) ấn nhẹ lên bề mặt thạch để lấy ra những thỏi thạch hình trụ Dùng kẹp vô trùng gắp những thỏi thạch này đặt lên môi trường đã cấy sẵn vi sinh vật kiểm định Sau 18-20 giờ nuôi cấy trong tủ ấm

và quan sát vòng vô khuẩn xung quanh thỏi thạch Có thể dùng phương pháp này

để xem thời gian nào vi sinh vật sinh chất kháng sinh nhiều nhất

Phương pháp phủ lớp thạch vi sinh vật kiểm định lên khuẩn lạc vi sinh vật đối kháng

Phương pháp này dùng để lựa chọn trong số các chủng nghiên cứu những

chủng có hoạt tính cao nhất Trên môi trường dinh dưỡng thạch đĩa petri, cấy vi sinh vật đối kháng sao cho các khuẩn lạc mọc cách nhau một khoảng khá xa Sau khi các khuẩn lạc đã mọc và sinh chất kháng sinh người ta đổ lên trên các khuẩn

lạc 1 lớp mỏng môi trường đã trộn vi sinh vật kiểm định Nồng độ vi khuẩn trong môi trường thạch thường là 100 triệu CFU/mL, lắc đều, cẩn thận đổ lên trên khuẩn lạc thành 1 lớp mỏng rồi đặt đĩa vào tủ ấm Quan sát vòng vô khuẩn

Phương pháp đục lỗ thạch

Dùng ống thép không gỉ (đường kính 10-20 mm) ấn nhẹ lên bề mặt thạch

để lấy ra những thỏi thạch hình trụ bỏ đi để tạo được những lỗ hình trụ trên môi trường thạch đĩa Phết vi khuẩn kiểm định lên bề mặt thạch bằng cách dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào môi trường tăng sinh lỏng Sau đó, dùng pipette hút dịch chiết ly tâm từ vi sinh vật đối kháng bơm vào các lỗ trên (lượng dịch này khoảng 50 μL/lỗ) Ủ các đĩa này trong tủ ấm và quan sát vòng vô khuẩn sau 1 thời gian thích hợp đối với từng loài vi sinh vật

Phương pháp này được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu các hợp chất

kháng sinh của B subtilis vì loại trừ được trường hợp vòng vô khuẩn tạo ra do

cạnh tranh dinh dưỡng giữa 2 loại vi sinh vật

2.3 Hệ tiêu hóa và vi sinh đường ruột

2.3.1 Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ

Gia cầm có tốc độ trao đổi chất và năng lượng cao hơn so với động vật có

vú Cường độ tiêu hóa mạnh ở gia cầm được xác định bằng tốc độ di chuyển của thức ăn qua ống tiêu hóa Ở gà còn non, tốc độ này là 30-39 cm trong 1 giờ; ở gà lớn hơn là 32-40 cm và ở gà trưởng thành là 40-42 cm (Sklan, 2001) Chiều dài của ống tiêu hóa gia cầm không lớn, thời gian mà khối thức ăn được giữ lại trong

đó không vượt quá 2-4 giờ, ngắn hơn rất nhiều so với động vật khác Trong quá trình phát triển của phôi, ban đầu hệ tiêu hóa chỉ là một ống thẳng, về sau nó hình thành xoang miệng, thực quản, diều, dạ dày tuyến, dạ dày cơ, ruột (ruột non, ruột già) tận cùng là hậu môn

Hình 2.9 Sơ đồ hệ tiêu hóa gà

(http://www.geauga4h.org/poultry/chicken_digestion.htm)

Tiêu hóa ở miệng

Gia cầm lấy thức ăn bằng mỏ Hình dáng và độ lớn của mỏ ở các loài gia cầm rất khác nhau Lưỡi gia cầm nằm ở đáy khoang miệng, có hình dạng và kích thước tương ứng với mỏ Bề mặt phía trên của lưỡi có những gai rất nhỏ hóa sừng hướng về cổ họng, có tác dụng giữ khối thức ăn trong miệng và đẩy chúng về phía thực quản Khi thức ăn đi trong khoang miệng, nó được thấm ướt nước bọt

để dễ nuốt Các tuyến nước bọt của gia cầm phát triển kém Viên thức ăn thu nhận được ở cuống lưỡi được đẩy vào lỗ thực quản và sau đó, do những co bóp nhu động của thành thực quản, nó được đẩy vào diều Ở gia cầm đói, thức ăn được đẩy thẳng vào dạ dày, không qua diều Trong thành thực quản có các tuyến nhầy hình ống, tiết ra chất nhầy, cũng có tác dụng làm ướt và trơn thức ăn khi nuốt

Tiêu hóa ở diều

Ở gà, diều là một chỗ phình rộng hơn, hình túi Mặt ngoài của diều được tiếp xúc trực tiếp với cơ da, nó có thể giãn nở rộng khi thức ăn rơi vào Các lỗ dẫn vào và dẫn ra của diều rất gần nhau và có các cơ thắt Giữa các cơ thắt lại có ống diều - là một phần của diều Khi gia cầm đói, thức ăn theo ống này đi thẳng vào

dạ dày, không qua túi diều Thức ăn ở diều được làm mềm ra, quấy trộn và được tiêu hóa từng phần bởi các men của thức ăn và các vi khuẩn có trong thức ăn

Tiêu hóa ở dạ dày

Dạ dày gia cầm gồm dạ dày tuyến và dạ dày cơ Thức ăn từ diều được chuyển vào dạ dày tuyến Dịch dạ dày được tiết vào trong khoang của dạ dày

tuyến, có acid chlorhydric, enzyme và mucin Cũng như ở động vật có vú, pepsin được tiết ra ở dạng không hoạt động (pepsinogen) và được hoạt hóa bởi acid chlorhydric Các tế bào hình ống của biểu mô màng nhầy bài tiết ra một chất nhầy đặc rất giàu mucin, chất này phủ lên bề mặt niêm mạc của dạ dày Sự tiết dịch dạ dày ở gia cầm là liên tục, sau khi ăn thì tốc độ tiết tăng lên

Dịch dạ dày tinh khiết là một chất lỏng không màu hoặc hơi trắng đục, có

pH acid Độ pH của dịch dạ dày ở gia cầm trung bình là 3,0; thường là 2,6 Độ pH

sẽ giảm xuống sau khi tiếp nhận thức ăn giàu chất kiềm

Ở gà, số lượng dịch dạ dày và độ acid tăng dần lên cùng với độ tuổi Gà con vài ngày tuổi, dịch dạ dày có tính acid (pH = 4,2-4,4) Ở gà 31-40 ngày, độ acid đạt mức tối đa (pH = 1,15-1,55) và giữ ở mức độ đó với sự dao động không lớn trong các thời kỳ tiếp theo

Trong dạ dày cơ, ngoài việc nghiền thức ăn cơ học, còn xảy ra quá trình hoạt động của các men Dưới tác động của acid chlorhydric, các phân tử protein trở nên căng phồng và dễ bị phân giải

Tiêu hóa ở ruột

Quá trình tiêu hóa các chất dinh dưỡng đều xảy ra ở ruột non gia cầm Nguồn các men tiêu hóa quan trọng nhất là từ dịch dạ dày, cùng với mật đi vào manh tràng, chất tiết của các tuyến ruột có ý nghĩa kém hơn

Dịch ruột gà là một chất lỏng đục, có phản ứng kiềm yếu (pH 7,42) với tỉ trọng 1.0076 Trong thành phần dịch ruột có các men proteolytic, aminolytic và lypolytic và cả men enterokinase Dịch tụy của gia cầm trưởng thành có chứa các men trypsin, carbocipeptidase, amylase, maltase, invertase và lipase Các men amylase và maltase phân giải các polysaccharide đến các monosaccharide như glucose, lipase được dịch mật hoạt hóa, phân giải lipid thành glycerin và axit béo Các quá trình tiêu hóa và hấp thu ở ruột non xảy ra đặc biệt tích cực Sự phân giải các chất dinh dưỡng không chỉ có trong khoang ruột (tiêu hóa ở khoang), mà cả ở trên bề mặt các lông mao của các tế bào biểu bì (sự tiêu hóa ở màng) Tiêu hóa ở khoang là sự thủy phân thức ăn, còn tiêu hóa ở màng là các giai đoạn tiếp theo, tạo ra các sản phẩm cuối cùng của sự tiêu hóa để hấp thu (Sklan, 2001) Các cấu trúc phân tử và trên phân tử của thức ăn có kích thước lớn được phân giải dưới tác động của các men trong khoang ruột, tạo ra các sản phẩm trung gian nhỏ hơn, chúng đi vào vùng có nhiều nhung mao của các tế bào biểu

mô Tại đây, diễn ra giai đoạn cuối cùng của sự thủy phân để tạo ra sản phẩm

cuối cùng như acid amin, monosaccharide chuẩn bị cho việc hấp thu Quan hệ qua lại của quá trình tiêu hóa ở khoang, ở màng và vai trò của tiêu hóa màng ruột của gia cầm hiện nay còn chưa được nghiên cứu đầy đủ

Sự tiêu hóa trong manh tràng của gia cầm nhờ có các men đã đi vào cùng với chymus từ phần ruột non và từ hệ vi khuẩn Các vi sinh vật bắt đầu thâm nhập vào manh tràng gia cầm non ngay từ lần tiếp nhận thức ăn đầu tiên Ở đây, các vi

khuẩn Streptococcus, trực khuẩn ruột, Lactobacicoli, sinh sản rất nhanh Trong

manh tràng cũng xảy ra quá trình tiêu hóa protein, glucid và lipid Ngoài ra, các

vi khuẩn còn tổng hợp các vitamin nhóm B

Khả năng tiêu hóa chất xơ của gia cầm rất hạn chế Cũng như ở động vật có

vú, các tuyến tiêu hóa của gia cầm không tiết ra một men đặc hiệu nào để tiêu hóa

xơ Một lượng nhỏ chất xơ được phân giải trong manh tràng bằng các men do vi khuẩn tiết ra Những gia cầm nào có manh tràng phát triển hơn như đà điểu, ngan, ngỗng, thì các chất xơ được tiêu hóa nhiều hơn Ở các loại gia cầm khác nhau thì chỉ có trung bình từ 10-30% chất xơ được phân giải (Gauthier, 2002)

2.3.2 Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi

Mối quan hệ giữa vi khuẩn và vật nuôi đã được công nhận là yếu tố quyết định đến sức khỏe của vật nuôi Vi khuẩn trong hệ đường ruột của động vật đóng vai trò quan trọng đối với khả năng tiêu hóa của vật nuôi Vì vậy, hệ vi sinh đường ruột sẽ ảnh hưởng đến vật nuôi về mặt dinh dưỡng, sự đáp ứng miễn dịch

và khả năng đề kháng bệnh của vật nuôi (Arturo, 2006; Soccol et al., 2010) Bên cạnh sự hấp thu các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể, là hệ thống bảo vệ và

là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm (Jans, 2005) Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh (Jans, 2005)

Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hóa của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và sinh sống trong đường tiêu hóa (WHO, 2001) Theo thời gian do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên Số lượng tế bào vi sinh vật

cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp 10 lần số lượng tế bào cấu