Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)

Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THỊ HẢI YẾN

TUYỂN CHỌN CHỦNG

BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG

TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN

ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ SỐ: 62 64 01 02

CẦN THƠ, 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THỊ HẢI YẾN

TUYỂN CHỌN CHỦNG

BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG

TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN

ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ SỐ: 62 64 01 02

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Cần Thơ, 2018

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành các nội dung trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ quý thầy cô, bạn

bè Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS TS Nguyễn Đức Hiền đã động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Quí thầy cô Bộ môn Thú y, khoa Nông nghiêp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Ban lãnh đạo Vemedim Corporation, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình

độ trong thời gian qua

Cty TNHH chăn nuôi một thành viên Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các thí nghiệm

Xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp, các anh, chị,

em phòng Sản phẩm sinh học, Trung Tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã

hỗ trợ, chia sẻ và cung cấp thông tin giúp tôi hoàn thành luận án

Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên, chia sẻ và luôn sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài

iii

TÓM LƢỢC

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh

nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện với mục đích phân lập

chủng vi khuẩn B subtilis có tiềm năng probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất và

phân của trại gà Nghiên cứu này nhằm tìm biện pháp mới thay thế kháng sinh

trong phòng và trị bệnh, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công

nghiệp, giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn kháng kháng sinh trong tự

nhiên

Đề tài đã phân lập được 296 chủng vi khuẩn từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân

gà thu thập tại các trại gà thuộc 7 tỉnh, thành vùng ĐBSCL Các chủng vi khuẩn

này được chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với các chỉ tiêu như: âm tính

với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP

(Voges-Proskauer), và chịu nhiệt cao (phát triển được ở 50 o C); và được định danh bằng

bộ kít API CH50B (Biomerieux-France) kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử

giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen trên

cơ sở dữ liệu NCBI) Kết quả phân tích cho thấy đã chọn ra được 21 chủng vi

khuẩn đạt chỉ tiêu về mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu và về mặt định danh có

mức độ tương đồng của gene 16S rRNA cao (≥ 99%) với B subtilis Nhằm tuyển

chọn chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic, 21 chủng B subtilis tuyển chọn đã

được khảo sát các đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính nhạy cảm

kháng sinh (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin,

colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), tính chịu nhiệt

(phát triển ở nhiệt độ từ 50-60 o C), khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase,

protease, lipase), khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh (E coli, S enterica,

Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), khả năng chịu pH acid dạ dày (pH 2,0),

khả năng chịu muối mật 0,3%, khả năng bám dính (tự bám dính, bám dính với vi

khuẩn gây bệnh, bám dính tế bào biểu mô ruột) và khả năng sống được trong

đường tiêu hóa gà Kết quả cho thấy trong 21 chủng vi khuẩn khảo sát,

B subtilis VL28 thể hiện tốt nhất các đặc tính probiotic, do vậy chủng này được

chọn để sử dụng trong thử nghiệm thức ăn bổ sung probiotic cho gà Vi khuẩn

B subtilis VL28 mật độ 10 7 CFU/g với liều lượng 5 g/kg thức ăn được bổ sung

vào thức ăn cho gà ở độ tuổi 1-56 ngày cho thấy hiệu quả tăng trọng của gà đạt

11,7%, đồng thời lượng thức ăn sử dụng giảm 16,8% so với đối chứng nuôi bằng

thức ăn không bổ sung vi khuẩn Bên cạnh đó, gà 18 ngày tuổi lây nhiễm với

S enterica (liều 7,5x10 4 CFU/mL/gà) và E coli (liều 5,0x10 6 CFU/mL/gà), được

nuôi với thức ăn có bổ sung B subtilis VL28 với liều như trên có khả năng tăng

trọng và tỉ lệ sống tương đương với điều trị bằng kháng sinh enrofloxacin và

From 70 soil samples and 70 fecal samples of chicken farms from 7 provinces in the Mekong Delta, 296 similarly B subtilis bacteria were isolated These isolates were analyzed further for B subtilis characteristics by physio- biological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer), and temperature tolerance (being able to grow at 50 o C); and identified by the API CH50B kit (Biomerieux-France) in combination with the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank) The results showed that there were 21 isolates which satisfied the required physio-biochemical criteria, and the strain identification revealed that the similarity of gene 16S rRNA was high (≥ 99%) with B subtilis In order to select the B subtilis strain with probiotic capabilities,

21 selected B subtilis isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 50-60 o C), extracellular enzyme production (amylase, protease, lipase), bacterial pathogen inhibition properties (E coli,

S enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts, adherence ability (autoaggregation, coaggregation, adherence to epithelial cells) and survival rate in gastro- intestinal environment The results showed that among 21 isolates observed, the strain B subtilis VL28 exposed the best probiotic capabilities Consequently, this strain was chosen to use as a supplement for chicken feed The B subtilis VL28 (the density of 10 7 CFU/g and the dosage at 5 g/kg of feed) was supplemented in feed for the 1-56 day old chicken The results showed that chicken growth increased by 11,7% and feed usage decreased by 16,8%, compared with the control groups without supplementing B subtilis VL28 Furthermore, the 18 day old chicken, infected by S enterica (with the dosage of 7,5x10 4 CFU/mL/chicken) and by E coli (with the dosage of 5,0x10 6 CFU/mL/chicken), then fed with

vi

B subtilis VL28 (supplemented in feed with the above described dosage), had growth ability and mortality rate equivalent to control groups treated with enrofloxacin and oxytetracyclin These results showed that the selected B subtilis VL28 strain in our study has great probiotic potential and could be used to replace antibiotics for prevention and treatment of intestinal diseases in poultry The 16S rRNA partial sequence of the new B subtilis VL28 was registered

in the Genbank of NCBI with the access code KY346980

Key words: B subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic

vii

MỤC LỤC

Lời cam kết kết quả i

Lời cảm ơn ii

Tóm lược iii

Abstract v

Danh sách bảng x

Danh sách hình xii

Danh mục từ viết tắt xv

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới của luận án 2

1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……… 3

2.1 Tổng quan về probiotic 3

2.1.1 Lịch sử probiotic 3

2.1.2 Các định nghĩa về probiotic 3

2.1.3 Xu hướng sử dụng probiotic 4

2.1.4 Vai trò và cơ chế tác động của probiotic 5

2.1.5 Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm 8

2.1.6 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic 12

2.1.7 Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic 13

2.1.8 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic 14

2.2 Tổng quan về Bacillus subtilis 15

2.2.1 Đặc điểm chung của giống Bacillus 15

2.2.2 Đặc điểm loài Bacillus subtilis 16

viii

2.2.3 Dinh dưỡng và tăng trưởng 22

2.2.4 Các chất do B subtilis sinh ra 23

2.2.5 Tính đối kháng của B subtilis 25

2.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B subtilis và vi sinh vật gây bệnh 26

2.3 Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đường ruột 27

2.3.1 Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ 27

2.3.2 Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi 30

2.4 Một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp trên gà 31

2.4.1 Salmonella 31

2.4.2 E coli 36

2.4.3.Clostridium perfringens 39

2.5 Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam 42

2.5.1 Trên thế giới 42

2.5.2 Tại Việt Nam 43

2.6 Một số nghiên cứu ứng dụng B subtilis 44

2.6.1 B subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi 44

2.6.2 B subtilis sử dụng cho gia cầm 45

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 47

3.2 Phương tiện nghiên cứu 47

3.2.1 Vật liệu 47

3.2.2 Dụng cụ 47

3.2.3 Thiết bị 47

3.2.4 Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn 48

3.3 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 49

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 49

3.3.2 Phân lập các chủng Bacillus subtilis 50

ix

3.3.3 Tuyển chọn các chủng B subtilis có đặc tính probiotic 56

3.3.4 Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà 61

3.4 Xử lý số liệu 65

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66

4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis 66

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp 66

4.1.2 Kết quả định danh Bacillus spp 67

4.2 Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic 77

4.2.1 Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao 77

4.2.2 Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh 78

4.2.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 81

4.2.4 Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh 85

4.2.5 Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật 98

4.2.6 Khả năng bám dính 104

4.2.7 Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà 109

4.3 Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà 111

4.3.1 Kết quả thí nghiệm 1… 111

4.3.2 Kết quả thí nghiệm 2 114

4.3.3 Kết quả thí nghiệm 3 123

4.4 Đăng ký trình tự B subtilis trên Genbank……… 131

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 133

5.1 Kết luận 133

5.2 Đề nghị 134

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 135

TÀI LIỆU THAM KHẢO 136

PHỤ LỤC 154

x

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Bậc phân loại của Bacillus subtilis 15

Bảng 2.2 Một số đặc điểm của Bacillus subtilis 22

Bảng 2.3 Một số loại enzyme do B subtilis sinh tổng hợp 23

Bảng 3.1 Phân bố mẫu 50

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 54

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 62

Bảng 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 64

Bảng 3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 65

Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi của 296 chủng vi khuẩn 66

Bảng 4.2 Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa 68

Bảng 4.3 Kết quả định danh 29 chủng vi khuẩn bằng kit API CH50B 70

Bảng 4.4 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA 74

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B subtilis 77

Bảng 4.6 Kết quả kháng sinh đồ của 21 chủng B subtilis chọn lọc 79

Bảng 4.7 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B subtilis 81

Bảng 4.8 Kết quả hoạt lực enzyme amylase, protease, lipase của 10 chủng B subtilis khảo sát 83

Bảng 4.9 Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B subtilis bằng phương pháp kẻ vạch vuông góc 86

Bảng 4.10 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E coli 88

Bảng 4.11 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S enterica 91

Bảng 4.12 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp 93

Bảng 4.13 Kết quả đối kháng trực tiếp của B subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp 96

xi

Bảng 4.14 Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 4 và pH 5 99

Bảng 4.15 Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 3 101

Bảng 4.16 Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 2 103

Bảng 4.17 Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính 105

Bảng 4.18 Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E coli và S enterica 107

Bảng 4.19 Khả năng sống của B subtilis VL28 trong đường ruột gà 109

Bảng 4.20 Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR qua 8 tuần thí nghiệm 112

Bảng 4.21 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 115

Bảng 4.22 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…117

Bảng 4.23 Tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 120

Bảng 4.24 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi

trong thí nghiệm 2 122

Bảng 4.25 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi… 123

Bảng 4.26 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…124

Bảng 4.27 Kết quả test sinh hóa E coli trên bệnh phẩm gan……… 127

Bảng 4.28 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi

ở thí nghiệm 3 129

Bảng 4.29 Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi

ở thí nghiệm 3 130

xii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic 4

Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe 8

Hình 2.3 Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vk probiotic và niêm mạc ruột 9 Hình 2.4 Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc

chất kích thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm 11

Hình 2.5 Mô hình cấu tạo tế bào vi khuẩn Bacillus spp 16

Hình 2.6 Mô hình các vị trí nhiễm sắc thể trên bộ gen B subtilis 17

Hình 2.7 Sơ đồ quá trình hình thành bào tử B subtilis 19

Hình 2.8 Sự biệt hóa tế bào ở B subtilis 21

Hình 2.9 Sơ đồ hệ tiêu hóa gà 28

Hình 3.1 Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B subtilis 55

Hình 3.2 Sơ đồ kiểm tra khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của vi khuẩn B subtilis……… 59

Hình 3.3 Chuồng gà thí nghiệm……… 62

Hình 4.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường TSA và hình thái dưới kính hiển vi 67

Hình 4.2 Kết quả test sinh hóa 69

Hình 4.3 Định danh bằng kit API CH50B 71

Hình 4.4 Sản phẩm PCR của các chủng B subtilis trong nghiên cứu 73

Hình 4.5 Sơ đồ chọn lọc và định danh vi khuẩn B subtilis 76

Hình 4.6 Khả năng chịu nhiệt của các chủng B subtilis phân lập 78

Hình 4.7 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B subtilis…….80

Hình 4.8 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng B subtilis AG27 và VL28 81

Hình 4.9 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng B subtilis AG27 82

Hình 4.10 Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng B subtilis 87

Hình 4.11 Hiệu quả kháng khuẩn của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E coli 90

xiii

Hình 4.12 Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với

S enterica 92

Hình 4.13 Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp 94

Hình 4.14 Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp 97

Hình 4.15 Hoạt tính đối kháng của VL28 với E coli, S enterica,

Staphylococcus spp và Streptococcus spp 98

Hình 4.16 Khả năng chịu pH 4 và 5 của các chủng B subtilis 100

Hình 4.17 Khả năng chịu pH 3 của các chủng B subtilis 102

Hình 4.18 Khả năng chịu pH 2 của các chủng B subtilis 104

Hình 4.19 Khả năng tự bám dính của các chủng B subtilis 105

Hình 4.20 Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh của AG27 và VL28 108

Hình 4.21 Khả năng bám dính của 2 chủng VL28 và AG27 trong biểu mô ruột 108

Hình 4.22 Khả năng tồn tại của B subtilis VL28 ở ruột non, manh tràng,

và ruột già 110

Hình 4.23 Tóm tắt quá trình phân lập và chọn lọc vi khuẩn probiotic……….111

Hình 4.24 Biểu đồ tăng trọng và FCR của gà qua các tuần ở thí nghiệm 1 113

Hình 4.25 FCR và tăng trọng ở giai đoạn 1-14 ngày tuổi của thí nghiệm 2 116

Hình 4.26 Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 15-28 ngày tuổi 118

Hình 4.27 Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm S enterica 119

Hình 4.28 Khuẩn lạc S enterica trên môi trường SS và kết quả test sinh hóa 119 Hình 4.29 Kết quả giải trình tự vi khuẩn S enterica phân lập từ lách gà bệnh 120 Hình 4.30 Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 2 121

Hình 4.31 Tăng trọng và FCR giai đoạn 15-28 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 125

Hình 4.32 Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm E coli 126

Hình 4.33 Khuẩn lạc E coli trên môi trường Mac Conkey và EMB 126

Hình 4.34 Test sinh hóa vi khuẩn E coli 127

xiv

Hình 4.35 Kết quả giải trình tự vi khuẩn E coli phân lập từ gan gà bệnh 128

Hình 4.36 Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 129

Hình 4.37 Kết quả đăng ký trình tự gen B subtilis VL28 trên ngân hàng gen

NCBI……… 131

xv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ (tiếng Anh) Tiếng Việt

ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ

CE Competitive exclusion Loại trừ cạnh tranh

CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CLSI Clinical and Laboratory Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và

Standards Institute Xét nghiệm

HE Hematoxylin- eosin Thuốc nhuộm tiêu bản mô

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét Một trong những vấn đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi Việc này đã làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người Do vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn nuôi Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng cường sức khỏe nói

chung cho người và động vật Bacillus subtilis là một vi khuẩn rất phổ biến trong

tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và

có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người và vật nuôi theo mô hình

công nghiệp Tuy nhiên, B subtilis rất đa dạng về các đặc tính sinh học nên

không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh

nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên

1.2 Mục tiêu

- Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có

các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột

(S enterica, E coli)

- Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong

phòng bệnh đường ruột ở gà do E coli và S enterica gây ra

2

1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

- Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất và

phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu

Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang

1.4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B subtilis

bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng bằng

sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S enterica và E coli gây ra

- Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B subtilis bản địa từ phân

và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B subtilis VL28

có thể sử dụng làm probiotic trên gà

- Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B subtilis VL28

107 CFU/g với liều 5 g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa quá

trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với

S enterica và E coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số

chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng

- Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của

B subtilis VL28 với mã số truy cập KY346980

(có thể truy cập trên trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980)

- Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một

cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế

1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Chọn lọc được chủng B subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic

phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long Kết quả nghiên

cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống

bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho

người chăn nuôi Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm

chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi Góp phần tạo được

nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng

hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh (Schillinger et al., 1996) Sau đó năm

1907, Metchnikoff đã chứng minh việc sử dụng Lactobacillus sẽ hạn chế các nội

độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc (Caucasians) ở Bulgaria là họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men (Metchnikoff E., 1907) Có thể nói Tisser và Metchikoff là những người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic

Năm 1930, Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ em khỏe mạnh (Cartwright, 2003) Cùng năm đó các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng

minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường

xuyên Các nhà khoa học đại học Harvard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất được Khái niệm chung về probiotic xuất hiện ở Châu Âu vào những năm đầu của thập niên 80, ở Châu Á, nhiều năm sau các sản phẩm từ sữa lên men mới được du nhập vào và bắt đầu có khái niệm về probiotic (Cartwright, 2003)

Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, đặc biệt là công nghệ sinh học, các nghiên cứu về probiotic ngày càng được mở rộng Ngày nay probiotic đã được sử dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và chăn nuôi

2.1.2 Các định nghĩa về probiotic

Năm 1965, Lilley và Stillwell lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic để

mô tả những chất tiết ra từ vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển của vi

sinh vật khác (Grover and Luthra, 2011)

Trải qua lịch sử định nghĩa probiotic ngày càng cụ thể hơn, như:

“Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mà chúng tác động có lợi cho sự cân

bằng vi sinh vật đường ruột của động vật” (Marteau et al., 2002)

Luận án đủ ở file: Luận án full