Nghiên cứu một số đặc điểm của vết thương mạn tính và hiệu quả điều trị của ghép tế bào gốc từ mô mỡ tự thân tt

Bệnh lý nền thường là nguyên nhân làm cho quá trìnhliền vết thương không thực hiện được và cũng chính bệnh lý nền làmcho vết thương mạn tính có đặc điểm hết sức phong phú và tạo ranhiều

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

CỦA VẾT THƯƠNG MẠN TÍNH VÀ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA GHÉP TẾ BÀO GỐC TỪ MÔ MỠ TỰ THÂN

Chuyên ngành: NGOẠI BỎNG

Mã số: 62.72.01.28

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018

Cán bộ hướng dẫn:

1 PGS TS Đinh Văn Hân

2 PGS TS Quản Hoàng Lâm

Phản biện 1: GS.TSKH Đỗ Trung Phấn

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Mạnh Khánh

Phản biện 3: GS.TSKH Nguyễn Thế Hoàng

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họptại Học viện Quân y vào hồi giờ ngày tháng năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc Gia

- Thư viện Học viện Quân y

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vết thương mạn tính là thách thức đối với các chuyên giachăm sóc vết thương và đòi hỏi một nguồn lực y tế lớn trong chămsóc và điều trị Bệnh lý nền thường là nguyên nhân làm cho quá trìnhliền vết thương không thực hiện được và cũng chính bệnh lý nền làmcho vết thương mạn tính có đặc điểm hết sức phong phú và tạo ranhiều loại vết thương mạn tính khác nhau Trị liệu tế bào nhằm khắcphục những khiếm khuyết mô tại chỗ vết thương đang được ứngdụng rất rộng rãi, trong đó có trị liệu tế bào gốc từ mô mỡ Tế bàogốc phân lập được từ mô mỡ là tế bào gốc trung mô có hình dángnguyên bào sợi, có khả năng tạo colony và biệt hóa thành nhiều loại

mô khác nhau Hiện nay tế bào gốc mỡ được ứng dụng nhiều trong yhọc tái tạo và sửa chữa trong đó có điều trị các vết thương mạn tính

Tại Viện bỏng Quốc gia, trị liệu tế bào trong điều trị các vếtthương, vết bỏng đã được triển khai khá rộng rãi như ghép tấmnguyên bào sợi nuôi cấy, đắp dịch tiết của nguyên bào sợi điều trị vếtthương Tuy nhiên nghiên cứu hiệu quả của ghép tế bào gốc từ mô

mỡ tự thân điều trị vết thương mạn tính chưa được triển khai

Xuất phát từ những yếu tố trên chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm của vết thương mạn tính và hiệu quả điều trị của ghép tế bào gốc từ mô mỡ tự thân”, nhằm hai mục tiêu: 1 Mô tả một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và hình thái cấu trúc vết thương mạn tính

2 Đánh giá hiệu quả của ghép tế bào gốc từ mô mỡ tự thân trong điều trị vết thương mạn tính.

* Những đóng góp mới của luận án

Vết thương mạn tính (VTMT) có đặc điểm phong phú vàkhó điều trị Bằng việc ứng dụng các phương tiện nghiên cứu hiệnđại, đề tài này đã đặt vấn đề nghiên cứu và đưa ra được một bảng

lâm sàng, cận lâm sàng chi tiết và đầy đủ về đặc điểm VTMT, trong

đó có đặc điểm nhiệt độ vùng cận tổn thương, những hình thái tổnthương trên lâm sàng ở vùng cận tổn thương, nền vết thương, độ pH

và vi khuẩn bề mặt VTMT, hình ảnh cấu trúc và siêu cấu trúcVTMT Bên cạnh đó đề tài cũng nêu lên được hiệu quả của ghéptấm tế bào gốc từ mô mỡ tự thân (TBGM) lên diễn biến lâm sàng vàhình thái cấu trúc và siêu cấu trúc VTMT Khi ghép tấm TBGM lênVTMT, tấm TBGM kích thích tái tạo chất nền ngoại bào, cũng nhưkích thích tăng sinh, di cư tế bào biểu mô và tạo mạch máu mới tạichỗ VTMT

* Bố cục của Luận án

Luận án gồm 136 trang (chưa kể tài liệu tham khảo và phụlục) trong đó: Đặt vấn đề: 02 trang, Chương 1 Tổng quan tài liệu: 31trang, Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 21 trang,Chương 3 Kết quả nghiên cứu: 43 trang, Chương 4 Bàn luận: 36trang, Kết luận: 02 trang, Kiến nghị: 01 trang Luận án có 23 bảng, 7biểu đồ, 53 hình và 148 tài liệu tham khảo (10 tài liệu tiếng Việt và

138 tài liệu tiếng Anh)

(thường do các tế bào này bị rối loạn chức năng) Ở VTCT, các enzyme

phân hủy protein và các chất ức chế chúng là cân bằng nhau Nhưngđối với VTMT thì mất sự cân bằng này Các enzyme phân hủyprotein tăng cao hơn so với các chất ức chế nó Ở VTMT, tình trạngthiếu oxy chiếm ưu thế, điều này gây tổn thương các protein ở môitrường ngoại bào và là nguyên nhân gây tổn thương tế bào Hơn nữa,VTMT với đặc trưng là chứa quần thể các tế bào lão hóa, các tế bàonày suy giảm khả năng tăng sinh và di cư, không đáp ứng với các tínhiệu kích thích của quá trình liền vết thương Bên cạnh nguyên bàosợi bị lão hóa, các VTMT cũng có các tế bào sừng, tế bào nội mô vàcác đại thực bào lão hóa, mất chức năng.

1.2 Tế bào gốc và ghép tế bào gốc từ mô mỡ điều trị vết thương

1.2.1 Một số tế bào gốc sử dụng trong điều trị vết thương

1.2.1.1 Tế bào gốc trung mô điều trị vết thương

Tế bào gốc (TBG) trung mô là một loại tế bào đa tiềm năng,

có nguồn gốc từ trung mô phôi thai, được tìm thấy trong nhiều môkhác nhau của cơ thể như máu, dây rốn, mô mỡ, tủy xương, tủyrăng, cơ và da Đặc tính đa tiềm năng của chúng cho phép chúng dễdàng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau như tế bào sừng, tế bàobiểu mô, tế bào tạo xương, sụn, tế bào mỡ, gân và tế bào cơ tham giavào cả ba giai đoạn của quá trình liền vết thương là giai đoạn viêm,giai đoạn tăng sinh và giai đoạn liền sẹo

1.2.1.2 Tế bào gốc biểu mô điều trị vết thương

TBG biểu mô thường có ở lớp biểu bì da, nang lông và tuyến

bã Ở nang lông có hai quần thể của tế bào gốc biểu mô nằm trongcác mầm tóc, dưới chỗ phình và nằm ngay chỗ phình ra của chânnang lông Các TBG này được kích hoạt khi chu kì tạo sợi lông mớibắt đầu và khi bị chấn thương để cung cấp tế bào giúp tái tạo, sửachữa nang lông và lớp biểu bì da

1.2.1.3 Các tế bào tiền thân nội mô điều trị vết thương

Các tế bào tiền thân nội mô (Endothelia progenitor cells) cóthể phân lập từ máu ngoại vi hoặc tủy xương Yếu tố tăng trưởng tếbào nội mô mạch máu, yếu tố kích thích bạch cầu hạt và yếu tốnguồn gốc mô đệm là những yếu tố quan trọng nhất giúp hình thànhmạch và huy động tế bào tiền thân nội mô tham gia vào quá trình táitạo mạch máu mới trong quá trình liền vết thương

1.2.2 Tế bào gốc từ mô mỡ điều trị vết thương mạn tính

1.2.2.1 Một số đặc điểm của tế bào gốc từ mô mỡ

Năm 2001 tác giả Zuk PA và cs đã phân lập được các tế bào cóđặc tính như TBG trong mô mỡ Các tế bào này có thể biệt hóa thànhnhiều tế bào khác Theo Meliga E và cs (2007), mô mỡ có thể thuđược một số lượng lớn ở nhiều vùng khác nhau của cơ thể, trung bình

cứ 100 ml mô mỡ người có thể phân lập được gần 106 TBGM TBGM có đặc tính nguyên bào sợi, với lưới nội bào phát triển,hạt nhân lớn TBGM có kiểu hình miễn dịch giống như các TBG trung

mô phân lập từ tủy xương, cơ vân Trên 80% kiểu hình miễn dịch củaTBGM giống với TBG trung mô biểu hiện qua các kháng thể bề mặt

1.2.2.2 Ghép tế bào gốc từ mô mỡ điều trị vết thương mạn tính

Hiện nay hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng TBGM thamgia vào quá trình sửa chữa vết thương nhờ khả biệt hóa thành các tếbào của mô tại chỗ vết thương TBGM tiết ra một số yếu tố hòa tan

Đó là các yếu tố tăng trưởng và các cytokine tác động lên quá trìnhliền vết thương như EGF, FGF-β, IGF, PDGF, TGF-β và VEGF.TBGM cũng tham gia điều hòa miễn dịch thông qua khả năng tiết racác yếu tố tăng trưởng, cytokine tiền viêm và kháng viêm như IL-6,IL-8, IL-12, TNF-α, IL-10, HGF và TGF-β Bên cạnh đó TBGMcòn có khả năng thúc đẩy quá trình chuyển đổi các đại thực bào từkiểu hình M0 và M1 (gây nên tình trạng viêm tại chỗ VTMT) thành

kiểu hình M2 (có khả năng kháng viêm) Trong giai đoạn tăng sinh,

TBGM có tác động tích cực nhờ kích thích hình thành tăng sinh

mạch tân tạo TBGM còn kích thích tăng sinh và tăng khả năng di cư

của nguyên bào sợi thông qua việc tiết ra các yếu tố tăng trưởng như

FGF-β, EGF, và PDGF-AA TBGM cũng tham gia thúc đẩy tái tạo

lớp biểu mô, nhờ khả năng tiết ra các cytokine như KGF-1 và

PDGF-BB Ở giai đoạn liền sẹo, TBGM được cho là đã tác động tích cực

làm giảm kích thước sẹo, cải thiện màu sắc của sẹo, giảm tỷ lệ sẹo

lồi, sẹo co kéo Nhờ khả năng kích thích tăng hoạt động của hệ

enzyme phân hủy protein MMPs

Trong điều trị vết thương, TBGM có thể được sử dụng ở

dạng tiêm trực tiếp vào vùng vết thương, phun lên bề mặt vết thương,

hoặc đưa TBGM lên tấm sau đó đắp lên bề mặt vết thương

1.3 Một số nghiên cứu về tế bào gốc từ mô mỡ ở Việt Nam

Nhiều đề tài ứng dụng TBGM trong điều trị ở các chuyên

khoa khác nhau như đề tài: “Nghiên cứu sử dụng tế bào gốc tự thân

từ mô mỡ và tủy xương trong điều trị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”

đang được thực hiện tại bệnh viện Bạch Mai, theo quyết định số

949/QĐ-BKHCN ngày 25 tháng 4 năm 2016 Hay đề tài: “Thử

nghiệm điều trị bệnh thoái hóa khớp gối bằng ghép tự thân hỗn hợp

tế bào gốc từ mô mỡ và huyết tương giàu tiểu cầu được tách chiết

bằng bộ Kit Extracttion và bộ PRP Pro” đang được thực hiện tại

bệnh viện Đại học Y-Dược, thành phố Hồ Chí Minh Năm 2012, tại

Viện bỏng Quốc gia, đề tài: “Nghiên cứu quy trình tách tế bào gốc

mô mỡ và thử nghiệm chế tạo sinh phẩm dùng trong điều trị vết

thương, vết bỏng”, đây là đề tài tiềm năng nằm trong chương trình

KC10 đã được triển khai và nghiệm thu Nhóm nghiên cứu của đề tài

đã phân lập thành công TBGM, xác định được đặc điểm của của

TBGM, chế tạo thành công tấm TBGM với 10 đặc điểm Nối tiếp kết

Sửa chữa và tái tạo

da

quả của đề tài KC10, năm 2017 trong đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo tấm tế bào gốc trung mô từ mô mỡ tự thân trong điều trị vết thương mạn tính” do Viện bỏng Quốc gia chủ trì đã bổ xung

thêm hai đặc điểm của tấm tế bào gốc từ mô mỡ đó là các TBGM ởcác thời điểm nghiên cứu đều có cấu trúc nhiễm sắc thể và nồng độTolemerase bình thường

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Bệnh nhân trên 16 tuổi, có VTMT, điều trị nội trú tại khoaLiền Vết Thương, Viện bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác từ tháng 10 năm

2014 đến tháng 6 năm 2016

- VTMT được định nghĩa theo Markova Alina và cs (2012):VTMT là những vết thương có thời gian tồn tại trên 6 tuần

Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân có vết thương do xạ trị hoặc do ung thư

- Bệnh nhân mắc các bệnh truyền nhiễm: HIV, viêm gan B, C

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:

- Đối với mục tiêu 1: Chúng tôi thực hiện mục tiêu này theophương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang

- Đối với mục tiêu 2: Để xác định hiệu quả của ghép TBGM

tự thân điều trị VTMT, chúng tôi tiến hành phương pháp nghiên cứucan thiệp có so sánh trước sau

2.2.2 Số bệnh nhân nghiên cứu

- Đối với mục tiêu 1: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu ước

lượng một tỷ lệ của nghiên cứu mô tả nhằm mô tả đặc điểm lâm sàngcủa các bệnh nhân có VTMT Chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 56 bệnhnhân đễ thực hiện mục tiêu này

- Đối với mục tiêu 2: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu đánh

giá hiệu quả điều trị của một nghiệm pháp (trong nghiên cứu này,nghiệm pháp là sử dụng TBGM tự thân) Chúng tôi lựa chọn ngẫunhiên 30 bệnh nhân trong 56 bệnh nhân ở mục tiêu 1 để thực hiệnmục tiêu 2

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm lâm sàng

Các mốc thời gian nghiên cứu:

- T0: Trong 72 giờ đầu tiên khi bệnh nhân mới nhập viện

- T1: thời điểm ngay trước khi ghép TBGM

- T2: thời điểm ngày thứ 7 sau ghép TBGM

- T3: là thời điểm ngày thứ 15 sau ghép TBGM

- T4: là thời điểm ngày thứ 20 sau ghép TBGM.

Đối với mục tiêu 1: Tiến hành xác định các đặc điểm lâm

sàng và cận lâm sàng tại thời T0

Đối với mục tiêu 2: Tiến hành xác định các đặc điểm lâm

sàng và cận lâm sàng tại thời điểm T1, T2, T3 và T4

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng

Xác định các chỉ tiêu như: Tuổi, giới tính, tiền sử bệnh, nhữngbệnh lý là nguyên nhân gây nên VTMT hoặc gián tiếp tác động lênvết thương Thời gian tồn tại vết thương , số lượng vết thương và vịtrí từng vết thương

* Đặc điểm da vùng cận tổn thương (periwound skin): Xác

định tình trạng viêm cấp tính, biểu mô hóa, tăng sản mép vết thương,

xơ chai mép vết thương, độ ẩm và nhiệt độ vùng da cận tổn thương

* Đặc điểm nền vết thương mạn tính: Xác định kích thước vết

thương, độ sâu vết thương, tính chất mô, dịch tiết, pH bề mặt VTMT

* Nghiên cứu ghép tấm tế bào gốc từ mô mỡ

Chỉ định ghép:VTMT thỏa mãn các điều kiện sau:

- Vết thương sạch hoại tử, không lộ xương, gân

- Vết thương không có dấu hiệu nhiễm khuẩn trên lâm sàng.

- Vết thương không có đường hầm, hàm ếch

Tiến hành ghép tế bào gốc mỡ tự thân: Tại chỗ VTMT, tiến

hành rửa sạch vết thương và vùng da lành xung quanh vết thươngbằng dung dịch Clohexidine 4% Sau đó rửa lại bằng dung dịchNatriclorid 0,9% vô khuẩn Thấm khô vết thương bằng gạc vô khuẩn.Trải săng vô trùng Cắt tấm TBGM từ transwell, lật úp mặt có TBGMhướng về phía bề mặt vết thương, nhẹ nhàng ghép tấm TBGM tựthân lên bề mặt vết thương, sao cho tấm tế bào che phủ toàn bộ bềmặt vết thương, các tấm TBGM không chồng mép lên nhau Đặt gạcnhàu Vaselin vô khuẩn và 6 lớp gạc khô vô khuẩn lên trên tấmTBGM, sau đó băng ép vết thương bằng băng cuộn hoặc băng dínhUrgocrèpe

2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng

Tại các thời điểm nghiên cứu T0, T1, T2 T3 và T4 tiến hành:

* Xác định các chỉ số huyết học sinh hóa máu ngoại vi: Số

lượng hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, protein, albumin và men gan:SGOT, SGPT

* Cấy khuẩn bề mặt vết thương mạn tính: Định danh và định

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng vết thương mạn tính

3.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu

Bảng 3.1 và Biểu đồ 3.1: 56 bệnh nhân nghiên cứu với 71 vết

thương có độ tuổi trung bình 52,96 ± 18,19 (19-88 tuổi) Nam giới chiếm tỷ lệ 62,5%, nữ giới là 37,5% 94,64% bệnh nhân nghiên cứu có

bệnh kết hợp Trong đó gặp nhiều nhất là chấn thương tủy sống (37,5%).Thứ hai là bệnh tim mạch và đái tháo đường (9,64%) Thứ ba là tai biếnmạch máu não (5,36%).Nguyên nhân gây nên vết thương gặp nhiều nhất

là do tỳ đè (49,30%), thứ hai là nhiễm khuẩn mô mềm (29,58%), thứ ba

là đái tháo đường và chấn thương (7,04%)

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng tại chỗ vết thương mạn tính

Nhận xét: VTMT có bờ mép xơ chai, tăng sản, da khô/ẩm ướt xung

quanh vết thương, nhiệt độ thấp hơn da lành và không có biểu mô hóa

3.1.2.3 Đặc điểm lâm sàng vùng nền vết thương mạn tính

Bảng 3.7+ 3.8: VTMT có diện tích trung bình là 25,71 cm2.56,34% VTMT có diện tích nhỏ hơn 20 cm2, 31% có diện tích [20-50) cm2 90,14% VTMT có tổn thương độ III

Bảng 3.7+ 3.8: Đặc điểm mô và dịch tiết tại chỗ vết thương mạn tính

Nhận xét: VTMT tổn thương sâu biểu hiện có mô hạt viêm

phù nề, hoại tử, lộ mô tổ chức dưới da VTMT tiể dịch nhiều chủ yếumàu trắng đục Bề mặt VTMT phần lớn có pH kiềm

3.1.3 Một số đặc điểm cận lâm sàng ở thời điểm T0

3.1.3.1 Đặc điểm nhiễm khuẩn bề mặt vết thương mạn tính

Bảng 3.11 + 3.12: Đặc điểm nhiễm khuẩn bề mặt VTMT:77,36% VTMT cấy khuẩn dương tính Vi khuẩn chủ yếu gặp P.aeruginosa (33,96%), S.aureus (13,21%), K.pneumonia và Aci.baumanii (5,66%) Số lượng vi khuẩn P.aeruginosa, S.aureus, Aci.baumanii và K.pneumonia đều lớn hơn 105 vi khuẩn /1cm2

3.1.3.2 Đặc điểm cấu trúc vết thương mạn tính trên tiêu bản nhuộm H&E

- Mô liên kết chân bì bị tổn thương Khoảng gian bào hẹp,

không có biểu hiện phù viêm Nhiều nguyên bào sợi nằm sát nhau, cónhiều tế bào sợi và các sợi collagen chạy theo chiều hướng xoắn vặn

- Lớp biểu bì tăng sản dày lên gồm nhiều lớp tế bào gai,nhưng kém biệt hóa thành các lớp tế bào phía trên Lớp chân bìnguyên bào sợi và mạch máu thưa thớt Vết thương mất lớp biểu bì.Biểu bì bò ra nhưng mỏng và không thể che phủ vết thương do bềmặt vết thương còn tổ chức hoại tử Lớp hạ bì xâm nhiễm nhiều tếbào viêm chủ yếu là tế bào Lympho, bạch cầu trung tính Nguyên bàosợi nằm cạnh các bó sợi collagen dày đặc, xoắn vặn Có một vài tiểucầu mồ hô

- Hình ảnh phù viêm với biểu hiện khoảng gian bào giãnrộng Tế bào còn hoại tử Nhiều tế bào viêm chủ yếu là tế bàolympho và đại thực bào Các mạch máu xung huyết Nguyên bào sợi

và collagen tăng sinh, nhưng chỉ tăng sinh ở một số vị trí

- Bề mặt VTMT là đám hoại tử, dưới lớp hoại tử là màngfibrin Mô liên kết phù viêm rõ Lớp hạ bì xâm nhiễm các tế bàoviêm chủ yếu là tế bào lympho Mạch máu, nguyên bào sợi vàcollagen thưa thớt

3.1.3.3 Siêu cấu trúc vết thương mạn tính trên kính hiển vi điện tử truyền qua

Hình ảnh siêu cấu trúc thấy phá hủy chất nền ngoại bào ởđáy vết thương với biểu hiện: Hoại tử tế bào, phù viêm chất nềnngoại bào (biểu hiện các khoảng gian bào dãn rộng) Nguyên bào sợikích thước lớn Các sợi collagen chân bì bị dãn tách, thưa thớt, đứtgãy phá hủy ở các mức độ khác nhau Xuất hiện các tế bào viêm làđại thực bào, bạch cầu đa nhân, tế bào lympho đang hoạt động

3.2 Kết quả ghép tế bào gốc từ mô mỡ tự thân điều trị vết thương mạn tính

38 VTMT của 30 BN có thời gian tồn tại trung bình là 4,2 ±

2,68 tháng Nguyên nhân gây nên VTMT gặp nhiều nhất là do nhiễmkhuẩn (39,47%), thứ hai là tỳ đè (31,58%), thứ ba là đái tháo đường(10,53%) Diện tích VTMT được ghép là 23,73 ± 19,85 cm2 97,37%VTMT được ghép TBGM có tổn thương độ III 60,53% ghép TBGM

ở vùng chi dưới, 31,58% ở vùng cùng cụt

3.2.1 Biến đổi vùng cận tổn thương

Bảng 3.14 + 3.15: Biến đổi da vùng cận tổn thương

Đặc điểm

Thời điểm T1

(n=38)

T2 (n=38)

T3 (n=35)

T4 (n=28)

Nhận xét: Sau ghép TBGM, VTMT có biểu mô hóa rõ, tỷ lệ

VTMT có mép xơ chai, tăng sản, ẩm ướt/ khô giảm rõ rệt Nhiệt độdần trở về với nhiệt độ da bình thường

3.2.2 Biến đổi nền vết thương mạn tính sau ghép tế bào gốc từ mô mỡ

Bảng 3.16+3.17: Biến đổi nền vết thương mạn tính sau ghép

tế bào gốc từ mô mỡ

Đặc điểm

Thời điểm T1

(n=38)

T2 (n=38)

T3 (n=35)

T4 (n=28)