Xây dựng quy trình phát hiện microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và realtime PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------PHẠM QUỲNH TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU

BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ REALTIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU

BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ REALTIME PCR

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Nguyễn Văn Long

Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương quân đội 108

Thái Nguyên - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu cửa tôi dưới sự hưỡng dẫncủa TS Nguyễn Văn long Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng aicông bố trong một công trình nào khác

Thái nguyên, tháng 11 năm 2017

Tác giả

Phạm Quỳnh Trang

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu

sắc tới TS Nguyễn Văn Long đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong

suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Bs Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện để

tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quânđội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quânđội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ,giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017

Học viên

Phạm Quỳnh Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG I 3

TỔNG QUAN 3

1 Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc 3

1.1 Giác mạc 4

1.1.1 Biểu mô 4

1.1.2 Màng đáy và màng Bowmann 5

1.1.3 Nhu mô 5

1.1.4 Màng Descemet 5

1.1.5 Nội mô 5

1.2 Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc 6

1.3 Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc 6

1.3.1 Triệu chứng cơ năng 6

1.3.2 Triệu chứng thực thể 7

2 Microsporidia 8

2.1 Giới thiệu chung 8

2.2 Bệnh học và nguy cơ 11

2.3 Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia 12

2.4 Chẩn đoán viêm loét giác mạc 12

2.5 Các phương pháp phát hiện Microsporidia 13

2.5.1 Chẩn đoán phân biệt 13

2.5.2 Chẩn đoán xác định 14

3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây bệnh

viêm loét giác mạc ở Việt Nam .19

3.1 Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam hiện nay 19

3.2 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam .20

Chương II 22

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 22

1 Đối tượng nghiên cứu 22

2 Hóa chất, thiết bị 22

2.1 Hóa chất 22

2.2 Thiết bị, máy móc 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 24

2.3.2 Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ 25

2.3.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 25

2.3.4 Phương pháp xác định trình tự axit nucleic 26

2.3.5 Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR và Realtime PCR 28

2.3.5.1 Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR 30

CHƯƠNG III 36

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR 36

3.2 Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR 39

3.2.1 Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR 39

3.2.2 Đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR 41

3.3 Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia 43

3.4 Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt 46

KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Biểu đồ thể hiện các tác nhân gây ra tai nạn về mắt trong lao động sản

xuất (theo thống kê hàng năm của BV Mắt TP HCM)(%) 3

Hình 2 Thiết đồ cắt dọc giác mạc 4

Hình 1.3 Hình ảnh minh họa Microsporidia 10

Hình 1.4 Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman 18

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia 36

Hình 3.2 Minh họa kết quả giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia từ bệnh phẩm chất nạo giác mạc của bệnh nhân KHUYEN 37

Hình 3.3 Kết quả so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen thế giới 38

Hình 3.4 Kết quả khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia bằng phản ứng Realtime PCR 39

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR phát hiện Vittaforma corneae 40

Hình 3.6 Kết quả Realtime PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime phát hiện Vittaforma corneae 41

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR phát hiện Microsporidia 42

Hình 3.8 Kết quả Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR phát hiện Microsporidia 42

Hình 3.9a Kết quả điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết quả phản ứng ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida bằng cặp mồi vector M13 43

Hình 3.9b Kết quả điện di sản phẩm plasmid PCR bằng cặp mồi vector M13 trên plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia .

44 Hình 3.10 Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ 45

Hình 3.11 Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia

pha loãng nồng độ 45Hình 3.12 A,B Kết quả điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh việnMắt Trung Ương 47Hình 3.13 A Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh việnMắt Trung Ương 47Hình 3.13 B Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh việnMắt Trung Ương 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen

tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng cặp mồi

MF1&MF2 28

Bảng 2.2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng ADN sau tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R

29 Bảng 2.3 Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng cặp mồi MSRT1&MSRT2 và probe MSRT 30

Bảng 2.4 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy của phương pháp 30

Bảng 2.5 Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ nhạy của phương pháp 31

Bảng 2.6 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 32

Bảng 2.7 Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 32

Bảng 2.8 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid 33

chuẩn dương 33

Bảng 2.9 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid 34

chuẩn dương 34

Bảng 3.1 Bảng pha loãng ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương tính với Vittaforma corneae 40

Bảng 3.2 Bảng tổng hợp số liệu kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng 3 phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR 49

Bảng 3.3 Kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng

50

DANH MỤC VIẾT TẮT

AND Axit deoxyribonucleicRNA Axít ribonucleic SUU Small-subunit

VLGM Viêm loét giác mạc

Giác mạc không chỉ dễ bị viêm loét do những tác nhân từ bên ngoài màcũng có thể là do mắt chưa được chăm sóc và bảo vệ đúng cách từ bên trong Cónhiều tác nhân gây ra vết loét bị nhiễm trùng; thường là do sự tấn công của cácloại vi khuẩn (tụ cầu, liên cầu, phế cầu, lậu cầu, trực khuẩn mủ xanh,

Moraxella,.), do nấm (Aspergillus fumigatus, Fusarium solant, Candida albicans, Histoblasma, ), do virus (Herpes simplex, Herpes zoster) hoặc do ký sinh trùng (Acanthamoeba).

Theo các báo cáo gần đây, tỷ lệ viêm loét giác mạc do Microsporidia ngày

càng tăng, nhất là ở các nước vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm như nước ta,chiếm 0,4% các trường hợp mắc viêm giác mạc do vinh sinh vật gây ra [13].Loài kí sinh này có thể gây bệnh ở mọi lứa tuổi và nguồn nước không đảm bảo

vệ sinh là tác nhân lây truyền bệnh Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử,

kí sinh nội bào, được tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước Bệnh nhân bị

nhiễm Microsporidia biểu hiện các triệu chứng trên lâm sàng như: tiêu chảy cấp,

viêm thành phế nang, viêm loét giác mạc, viêm phế quản, viêm thận, viêm niệuđạo, viêm tuyến tiền liệt, viêm gan, viêm não, viêm cơ và viêm phúc mạc Triệuchứng phổ biến hay gặp nhất ở người liên quan đến bệnh tiêu hóa kết hợp nhiễmHIV

Phát hiện chính xác Microsporidia giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán

nhanh, phát hiện chủng để lựa chọn đúng phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh

cũng như hiểu biết cơ chế bệnh sinh, dịch tễ học phân bố của Microsporidia Tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và phát hiện chủng Microsporidia được thực

hiện qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, transmission electron microscopy) Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chi phí cao, thời gian phân tích lâu, đòi

hỏi người phân tích có trình độ chuyên môn sâu nên không khả thi ứng dụngthường quy kỹ thuật này trong chẩn đoán Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh

quang được phát triển từ những năm 1994 để phát hiện chủng Microsporidia,

tuy nhiên kỹ thuật này cũng không được áp dụng rộng rãi do những hạn chế vềkháng thể, các phản ứng không đặc hiệu và những tín hiệu nhiễu không thể loại

bỏ trong mẫu bệnh phẩm Chính vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã

làm tăng độ nhạy, đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện Microsporidia và các kỹ

thuật này dần được đưa vào sử dụng trong thực hành chẩn đoán lâm sàng Hiệnnay, ở Việt Nam chưa có nhiều công bố về việc sử dụng công nghệ sinh họcphân tử trong việc hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh viêm loét giác mạc do

Microsporida gây ra Do đó, để hỗ trợ giúp đỡ cho khả năng chẩn đoán nhanh

phát hiện Microsporida chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng

kỹ thuật PCR và Realtime PCR.”

1.Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng và tối ưu hóa phản ứng PCR và Realtime PCR để phát hiện ra

Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc.

2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR trên

mẫu bênh phẩm viêm giác mạc

- Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật Realtime

PCR trên mẫu bênh phẩm viêm giác mạc

- Áp dụng kỹ thuật PCR và Realtime PCR vào việc phát hiện Micrisporidia

trên các mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc tại Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1 Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc

Viêm loét giác mạc (VLGM) là bệnh nhiễm trùng nặng ở mắt do vi sinh vậtbao gồm vi khuẩn, nấm, virut, kí sinh trùng.v.v… Bệnh viêm loét giác mạcthường tiến triển nặng, gây nhiều biến chứng và khi khỏi để lại sẹo dày ở giácmạc gây mờ đục giác mạc, làm giảm thị lực nghiêm trọng [1, 8]

Ở các nước phát triển như Mỹ, Tây Âu tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấmchiếm khoảng 3% trong tổng số các nguyên nhân gây viêm loét giác mạc Tỷ lệnày cao hơn ở các nước đang phát triển như: Ấn Độ, Nê-pan, Băng-la-đét (daođộng từ 20% đến 60%) [8, 9, 13, 14] Ở Việt Nam, tại bệnh viện Mắt trung ươngtrong 10 năm (1998 - 2007) trong số 3210 bệnh nhân viêm loét giác mạc đượcđiều trị nội trú thì viêm loét giác mạc chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm tới 50,8% [1]

Có nhiều nguyên nhân gây ra viêm loét giác mạc như: vi khuẩn, vi rút,

nấm, kí sinh trùng, Microsporidia… Tỷ lệ gặp các tác nhân gây bệnh này thay

đổi theo thời gian do có sự thay đổi về môi trường, kinh tế, các yếu tố nguy cơ

và sự hiểu biết của người dân.Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu tại bệnh việnmắt Trung ương những năm 1991- 1996 thì tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm khácao 42,11% nhưng vào năm 2004- 2005 thì tỉ lệ viêm loét giác mạc do nấm lạiđược ghi nhận nhiều hơn 59,8% trong khi vi khuẩn chỉ chiếm 29,4% Điều trịviêm loét giác mạc tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh và mức độ trầm trọng củabệnh Việc điều trị viêm loét giác mạc ở nước ta hiện nay tương đối hiệu quả Song tỉ lệ biến chứng sẹo thủng giác mạc, giảm thị lực thậm chí mù lòa tăng lênrất nhiều nếu việc chẩn đoán và điều trị không kịp thời Nhất là khi điều kiện kĩthuật giúp chẩn đoán ở các cơ sở chưa phát triển và bệnh nhân chưa ý tức được

sự nguy hiểm của bệnh viêm loét giác mạc Điều này không chỉ gây nên gánhnặng cho bản thân người bệnh mà còn làm tăng gánh nặng cho gia đình và toàn

xã hội [2, 6, 7]

Hình 1.1 Thiết đồ cắt dọc giác mạc 1.1.1 Biểu mô

Biểu mô giác mạc là lớp ngoài cùng, liên tiếp với biểu mô

nhãn cầu và dễ tách ra khỏi màng Bowmann ở dưới, dày khoảng 32

1.1 Giác mạc

Giác mạc là một màng xơ trong suốt, không có mạch máu, chiếm 1/5 diệntích phía trước của vỏ nhãn cầu diện tích khoảng 123mm vuông Bán kính độcong giác mạc trung bình ở người Việt Nam trưởng thành là 7,71±0,24mmĐường kính ngang bằng 12mm, đường kính dọc bằng 11mm Độ dày là0,509mm ở trung tâm, 0,74mm ở sát vùng rìa Ranh giới giữa giác mạc và củngmạc là vùng rìa giác mạc bề rộng của vùng rìa chừng 1mm Đây là vùng có cấutạo giải phẫu rất đặc biệt và vai trò sinh lý rất quan trọng của nhãn cầu [1, 8, 19].Giác mạc được cấu tạo gồm 5 lớp từ trước ra sau, bao gồm:

- Lớp biểu mô giác mạc

Biểu mô giác mạc là lớp bảo vệ, ngăn không cho các vi sinh vật xâm nhậpvào nhu mô giác mạc Tuy nhiên, khi biểu mô toàn vẹn, các thuốc cũng rất khóthấm qua biểu mô, nhất là các thuốc không tan trong nước [1, 8]

1.1.2 Màng đáy và màng Bowmann

Màng đáy là một màng rất mỏng nằm sát ngay dưới lớp tế bào đáy của biểu

mô (thực chất do tế bào đáy tạo thành), dày khoảng 40-60 µm [1, 8]

Màng Bowmann là một màng trong suốt, dày khoảng 12µm và khá dai Mặt

trước có giới hạn rõ rệt, mặt sau khó phân tách với nhu mô giác mạc Màng nàykhi bị tổn thương thì không có khả năng hồi phục, ở vùng tổn thương sẽ để lạisẹo mỏng [2, 19]

1.1.3 Nhu mô

Nhu mô chiếm 90% bề dày giác mạc, cơ bản được tạo thành bởi các lá sợi

collagen xếp song song nhau, các giác mạc bào (keratocytes) và các chất ngoại

bào Ngoài ra trong nhu mô giác mạc còn có một số bạch cầu di động giữa các lácollagen và các sợi thần kinh không myelin xuất phat từ thần kinh mi (thuộcnhánh mắt của dây thần kinh số V) đi theo hình nan hoa vào lớp giữa nhu mô ởtrung tâm giác mạc, sau đó chia nhánh theo kiểu phân đôi và đi lên các lớp nông

giác mạc, qua màng Bowmann và tận cùng bằng các đầu tiếp nhận cảm giác ở

giữa các tế bào biểu mô Do đó tổn thương giác mạc càng nông thì các triệuchứng chủ quan của bệnh nhân càng mạnh [1, 8] Khi nhu mô tổn thương sẽ đểlại sẹo dày

1.1.4 Màng Descemet

Màng Descemet được cấu tạo bởi các sợi collagen dạng lưới Màng Descemet chỉ dày 6µm, tách khỏi nhu mô dễ dàng và có thể được tái tạo bởi lớp nội mô Màng Descemet rất dai, có tính đàn hồi cao nên khi bị rách hai mép dễ thun lại và tách rời nhau khỏi chỗ tổn thương [2] Màng Descemet tương đối bền

vững, có thể tồn tại kể cả khi giác mạc bị hoại tử gần hết nhu mô [1, 8]

1.1.5 Nội mô

Nội mô gồm một hàng tế bào hình đa giác, đường kính khoảng 20 µm, dày

4 - 6 µm với một nhân lớn chiếm gần hết tế bào, liên kết với nhau bằng nhữngliên kết chặt và liên kết dạng khe hở [1] Tế bào nội mô không phân chia và số

lượng tế bào nội mô giảm dần theo tuổi tác: lúc sinh mật độ tế bào là 4000 tếbào/mm2, số lượng tế bào giảm xuống còn khoảng 1400 - 2500 tế bào/mm2 ởngười trưởng thành Khi mật độ tế bào chỉ còn 400 - 700 tế bào/mm2 hoặc thấphơn thì các tế bào nội mô còn lại sẽ mất khả năng bù trừ Giác mạc sẽ bị ngấmnước và trở nên phù đục mất đặc tính trong suốt [3, 8].

1.2 Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc

- Chấn thương: làm tổn thương một phần hay toàn bộ giác mạc

+ Chấn thương nông nghiệp: là yếu tố thường gặp nhất, chủ yếu do các tácnhân thực vật (cành cây, gai, mảnh gỗ, hạt thóc, lá lúa,…)

+ Chấn thương công nghiệp: các dị vật bắn vào giác mạc (phoi tiện, mảnhsắt vụn, đá….)

- Các bệnh mãn tính trên bề mặt nhãn cầu (hở mi, lông xiêu, lông quặm,viêm giác mạc do herpes…) làm khô giác mạc và xước giác mạc

- Liệt dây thần kinh số V: làm cho giác mạc mất cảm giác Vì vậy, giácmạc không được bảo vệ bởi phản xạ nhắm mắt

- Các yếu tố nguy cơ khác: sử dụng kính tiếp xúc, phẫu thuật ở giác mạc

và kết mạc, suy giảm miễn dịch, sử dụng thuốc kháng sinh và các thuốccorticosteroid mà không có sự kiểm soát của các bác sĩ chuyên khoa mắt, bệnhnhân có tiền sử mắc bệnh nấm ở da, niêm mạc, nội tạng… [8, 19]

1.3 Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc

Viêm loét giác mạc do kí sinh trùng có biểu hiện lâm sàng rất đa dạng Tuynhiên, bệnh có các triệu chứng đặc trưng Do đó, các triệu chứng có thể giúpđịnh hướng chẩn đoán nguyên nhân trong trường hợp chưa có kết quả cận lâmsàng [1, 3, 19]

1.3.1 Triệu chứng cơ năng

- Dấu hiệu kích thích mắt: sợ ánh sáng, cộm, chói, chảy nước mắt, co quắp mi

- Đau nhức: đau âm ỉ tại mắt, đau có thể lan ra xung quanh hốc mắt hoặclan lên đầu

- Nhìn mờ: thị lực giảm nhiều hay ít phụ thuộc vào mức độ tổn thương trêngiác mạc [19].

1.3.2 Triệu chứng thực thể

Các dấu hiệu thường gặp:

- Kết mạc cương tụ rìa hoặc toàn bộ

- Đặc điểm của ổ loét giác mạc:

+ Vị trí: có thể ở vùng rìa, cạnh trung tâm,

trung tâm hoặc toàn bộ giác mạc

+ Màu sắc: thường có màu trắng xám và giác mạc xung quanh mờ đục dophù nề

+ Kích thước: từ những chấm nhỏ đến toàn bộ giác mạc

+ Hình thái:

* Bờ ổ loét: thâm nhiễm như lông hoặc dạng sợi, trong nhu mô giác mạc cónhững đường phân nhánh tỏa theo hình nan hoa từ bờ của ổ loét ra nhu mô xungquanh được gọi là thẩm lậu dạng ngón tay hay dấu hiệu chân giả

* Bề mặt ổ loét: bề mặt gồ cao, toàn bộ hoặc phần lớn đáy ổ loét cao hơngiác mạc xung quanh, không có hoại tử mềm mà thô ráp khô như một miếngmàng cứng, dạng vảy

* Áp xe giác mạc: ổ áp xe đặc chiếm hết bề dày nhu mô và tiến triển vàotiền phòng

* Mảng nội mô: là mảng xuất tiết trắng, dày bám mặt sau nội mô, có thểxuất hiện trong trường hợp viêm loét giác mạc không phải do nấm Một số

trường hợp biểu mô đã hàn gắn hoàn toàn nhưng mảng này vẫn còn tồn tại thìnghĩ nhiều đến nấm

* Vòng thâm nhiễm: hay còn gọi là vòng miễn dịch, là vòng trắng baoquanh ổ loét, thường có một khoảng giác mạc lành ngăn cách với ổ loét, có thểđây là đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh

* Tổn thương vệ tinh: ở cạnh ổ loét và có vẻ như tách rời ổ loét

+ Phản ứng tiền phòng: biểu hiện của một phản ứng viêm nặng ở mắt,thường xuất hiện dấu hiệu Tyndall kèm theo nếp gấp ở màng Descemet.

* Mủ tiền phòng: là dấu hiệu thường gặp trong viêm loét giác mạc Kí sinhtrùng có thể xuyên qua màng Descemet vào tiền phòng ngay cả khi ổ loét giácmạc nhỏ Có thể đó là mủ vô trùng do lắng đọng các tế bào viêm Mủ có thể táiphát, tái xuất hiện nhanh sau khi rửa mủ tiền phòng [16, 19]

2 Microsporidia

2.1 Giới thiệu chung

Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử, kí sinh nội bào bắt buộc, được tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước Microsporidia” không phải là một

từ thuộc phân loại học, có liên hệ đến một vi sinh vật thuộc bộ Microsporida, ngành Microspora Thuật ngữ về phân loại học của Microsporidia phức tạp và

thay đổi Có 14 loài thuộc 07 họ được báo cáo gây bệnh trực tiếp cho người

(Enterocytozoon, Encephalitozoon, Nosema, Pleistophora, Vittaforma, Trachipleistophora và Brachiola).Trong đó chỉ có hai loài được công nhận gây bệnh trên mắt là Nosema, Vittaforma Microsporidia ngày càng được công nhận

là tác nhân truyền nhiễm gây bệnh đường ruột, mắt, viêm xoang, phổi và tiết

niệu Microsporidia là kí sinh trùng đơn bào nhỏ (dài 3,5-5µm và rộng 2-3µm),

hình oval, kí sinh bắt buộc nội tế bào sinh dưỡng Theo cây phả hệ,

Microsporidia là sinh vật sinh dưỡng, bởi vì chúng có nhân thực, ribosome giống sinh vật nhân sơ và thiếu ti thể Có 7 chi và cả các loài Microsporidia

chưa được phân loại gây bệnh trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch và bệnh nhân

có hệ miễn dịch khỏe mạnh [5, 20]

Phần lớn chu kỳ phát triển của Microsporidia ở dạng bào tử, là trạng thái

dễ phát hiện hơn so với ở giai đoạn tăng sinh nội bào Bào tử kháng lại các yếu

tố bên ngoài, chúng có thể sống sót trong môi trường khắc nghiệt trong thời gian

dài Sự hình thành ống phân cực ở hầu hết cấu trúc bào tử Microsporidia đánh

dấu sự xâm nhiễm đầu tiên vào tế bào vật chủ, với sự xâm nhiễm trực tiếp thông

qua ống phân cực của bào tử được lộn ra phía bên ngoài, tiếp đó chất nguyên

sinh bào tử (sporoplasm) được chuyển vào bên trong tế bào lây nhiễm Có hai giai đoạn trong chu kỳ phát triển của Microsporidia: pha bắt đầu tăng sinh (merogony) tiếp đến là pha tạo bào tử (sporogony) [7, 11, 12].

Chỉ có 2 loài được công nhận gây viêm nhiễm ở mắt Hai biểu hiện lâm

sàng của bệnh vi bào tử mắt là Viêm giác mạc nhu mô gây bởi Nosema corneum

trên bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh và Viêm kết giác mạc chấm nông do

dòng Encephalitozoon ở bệnh nhân AIDS hoặc người đeo kính áp tròng Tuy

nhiên, các báo cáo hiện nay chỉ ra rằng viêm dính giác mạc cũng có thể xảy ra ởbệnh nhân không bị suy giảm miễn dịch Năm 2015, Phạm Ngọc Đông và cs đãnghiên cứu hồi cứu 12 mắt (11 bệnh nhân) viêm giác mạc nhu mô do

Microsporidia Tất cả bệnh nhân đều có HIV (-) Thời gian mắc bệnh trung

bình 5,25 ± 6,56 tháng, đã dùng nhiều loại kháng sinh, corticosteroid Tổnthương nhu mô kèm theo loét giác mạc gặp ở 10/12 mắt; 2 mắt chỉ có áp xe sâutrong nhu mô, không có loét giác mạc; 7/12 mắt có mủ tiền phòng; 3/12 mắttăng nhãn áp Điều trị nội khoa gồm kháng sinh fluoquinolon, chống nấm,albendazol Chỉ 1 mắt điều trị khỏi bằng thuốc, 2 mắt (của 1 bệnh nhân) bỏ điềutrị Số còn lại đều phải ghép giác mạc điều trị [2] Kết luận: viêm giác mạc nhu

mô do Microsporidia lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam, với các tổn

thương nhu mô không đặc hiệu, chủ yếu gặp ở nữ, người lao động chân tay, cóHIV (-) Việc điều trị nội khoa khó khăn, hầu hết phải ghép giác mạc điều trị.Bệnh vi bào tử ở mắt của bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh có thể bị

lẫn với viêm giác mạc do vi rút herpes gây ra Bệnh nhân thường có biểu hiện

đau kéo dài, đỏ mắt, chảy nước mắt, mờ mắt và giảm tầm nhìn [5, 6, 19]

Một số bệnh nhân bị chẩn đoán nhầm sang trường hợp viêm giác mạc nhu

mô do Herpes vi-rút và được điều trị bằng thuốc kháng vi-rút và steroids Trong

thăm khám, bệnh nhân có thể có biểu hiện sưng phù mí mắt, xung huyết kếtmạc Tổn thương ở giác mạc thường thâm nhiễm nhu mô từ nông đến sâu cùng

inh họa Microsporidia Hình 1.2 Hình ảnh

với sưng phù nhu mô xung quanh Lớp biểu mô phủ trên cùng có thể phù hoặctrong một số trường hợp có thể có khuyết biểu mô Có thể có dịch trong nội mô[19]

Trong số 14 loài Microsporidia có 7 họ lây nhiễm vào con người Nhận

dạng chúng là một công việc khó khăn bởi chúng không thể tồn tại ngoài tế bàovật chủ bị nhiễm, chúng có số lượng gen rất nhỏ nhưng lại phát triển rất nhanh.Các nhà khoa học thuộc đại học Duke đã ứng dụng hai nghiêm cứu di truyền để

chứng minh rằng Microsporidia phát triển rõ rệt từ nấm sinh sản hữu tính, và

đặc biệt là có mối liên hệ chặt chẽ với nấm tiếp hợp [11, 12]

Tín hiệu di truyền này cũng cho thấy rằng Microsporidia và nấm tiếp hợp

dường như có chung tổ tiên, và có quan hệ gần gũi hơn các dòng nấm khác đượcbiết đến

Ngoài ra, Microsporidia và nấm tiếp hợp này có cùng gen quy định giới

tính, cùng trình tự trên ADN Các gen khác có liên quan đến sinh sản hữu tính

cũng có mặt Điều này cho thấy Microsporidia có thể có chu trình sinh sản quy

định bởi đặc điểm di truyền, có thể nó phải trải qua sinh sản hữu tính khi lâynhiễm vào cơ thể vật chủ [8]

Ảnh quét điện tử giao tử Microsporidia với một cái ống nhô ra ngoài dùng

để đưa vào tế bào nhân chuẩn Giao tử sẽ bơm dịch lây nhiễm qua cái ống này

(Ảnh: CDC/NCID/DPD Parasite Image Library)

m

Phát hiện chính xác Microsporidia giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán

nhanh, phát hiện chủng để lựa chọn đúng phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh

cũng như hiểu biết cơ chế bệnh sinh, dịch tễ học phân bố của Microsporidia Tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và phát hiện chủng Microsporidia được thực

hiện qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, transmission electronmicroscopy) Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chi phí cao, thời gian phân tích lâu, đòihỏi người phân tích có trình độ chuyên môn sâu nên không khả thi ứng dụngthường quy kỹ thuật này trong chẩn đoán Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh

quang được phát triển từ những năm 1994 để phát hiện chủng Microsporidia,

tuy nhiên kỹ thuật này cũng không được áp dụng rộng rãi do những hạn chế vềkháng thể, các phản ứng không đặc hiệu và những tín hiệu nhiễu không thể loại

bỏ trong mẫu bệnh phẩm Chính vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã

làm tăng độ nhạy, đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện Microsporidia và các kỹ

thuật này dần được đưa vào sử dụng trong thực hành chẩn đoán lâm sàng Mộtvài cặp primer và cặp primer lồng đã được mô tả sử dụng để khuếch đại trình tự

gen chủng Encephalitozoon và Enterocytozoon bieneusi Phần lớn các nghiên

cứu ứng dụng kỹ thuật PCR được thiết kế khuếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ

small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia Trong nghiên cứu này, bước đầu xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia dựa trên việc áp dụng kỹ thuật PCR

sử dụng cặp mồi có khả năng khuếch đại vùng gen bảo thủ (SSU) rRNA đã được

mô tả phát hiện các chủng gây viêm giác mạc: Nosema và Vittaforma corneae

[2]

2.2 Bệnh học và nguy cơ

Microsporidia được coi là tác nhân nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân suy

giảm miễn dịch Nguồn lây nhiễm cho người và con đường truyền bệnh vẫn còn

là bí ẩn, tuy nhiên chúng có thể lây qua đường phân-miệng do phơi nhiễm trựctiếp hoặc sau tổn thương Phơi nhiễm trực tiếp có thể do tiếp xúc gần với vậtnuôi như mèo và chim hoặc phát tán từ người mang bệnh Vòng đời thông

thường của Microsporidia bao gồm bao tử xâm nhập vào cơ thể người sau đó

đưa các thành phần cấu tạo của loài này vào tế bào chất.Trong tế bào, bào tử

phân chia để tạo thành thể phân liệt (scizont) có 2-6 nhân, sau đó thể này phân

thành thể đơn bào meront Tiếp đó, thể này sẽ tiết ra vỏ capsule cứng và trởthành bào tử hoàn chỉnh có kích thước 2,5x1,5 micron Tế bào sau cùng vỡ ra đểtiếp tục vòng đời tiếp theo và sau đó phá hủy vật chủ đồng thời phát tán trongmôi trường qua các chất thải của ký chủ như phân, nước tiểu, chất tiết hô hấp [1]

2.3 Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia

Nhiễm Microsporidia ở người gặp ở khắp nơi trên thế giới Ký sinh trùng

này là nguyên nhân gây bệnh đáng kể ở bệnh nhân bị AIDS, bệnh nhân bị ức chếmiễn dịch sau ghép cơ quan, và ở nhóm người cạnh tranh miễn dịch Loại nhiễm

ở người thường gặp nhất là Enterocytozoo bieneusi Tỷ lệ nhiễm toàn bộ Enterocytozoon bieneusi được báo cáo ở những quần thể chọn lọc như những người nhiễm HIV có tiêu chảy thay đổi từ 7% - 50% Nhiễm Encephalitozoon (trước đây là Septata) intestinalis, Encephalitozoon hellem và Encephalitozoon

cuniculi cũng được ghi nhận với tần số tăng dần, trong khi nhiễm những giốngkhác ít hơn [2]

Cách lây nhiễm và những yếu tố nguy cơ lây nhiễm chưa được biết nhiều

sự có mặt của bào tử Microsporidia trong nước tiểu, phân, dịch hút tá tràng và

chất tiết đường hô hấp cho thấy khả năng lây lan là từ người qua người Nhiễm ởmắt có thể do từ bên ngoài do tay bẩn dụi vào mắt Nhiễm ở đường niệu dục cóthể do lây lan qua đường tình dục Nước cũng là nguồn nhiễm chủ yếu

Microsporidia Bệnh do Microsporidia ở người có thể là bệnh động vật, nguồn

nhiễm chủ yếu có liên hệ đến các động vật như chim, chó, heo và thỏ [11, 12]

2.4 Chẩn đoán viêm loét giác mạc

Microsporidia là kí sinh trùng nhỏ, kí sinh nội bào bắt buộc, sản sinh bào

tử gây nhiễm Chúng là loại vi sinh vật khó nuôi cấy Ta có thể thu được sinh vậtnày bằng cách sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô đặc biệt hiện đang được sử dụng

trong một số ít phòng thí nghiệm, do đó việc chẩn đoán vi sinh thường quy khákhó Các mẫu tế bào (cố định trong cồn) từ mảnh cạo từ kết mạc, biểu mô mắthoặc cả hai hoặc mảnh sinh thiết được chứng minh là rất hữu dụng cho việc biểu

hiện dạng bào tử của Microsporidia Thường thì mảnh cạo từ kết mạc cũng đủ

cung cấp mẫu đạt tiêu chuẩn cho chẩn đoán tế bào học trong trường hợp viêmkết giác mạc chấm nông Kết quả tế bào học cho thấy sinh vật nhỏ hình oval tồntại trong tế bào biểu mô, tế bào sừng, mô bào và cấu trúc ngoại bào Các bào tửnày có dạng oval giống nhau và không có mầm, giúp phân biệt chúng với vi

khuẩn và nấm khác Chất nhuộm Giemsa được dùng để hiển thị bào tử của Microsporidia Trong một số trường hợp bất kì, bào tử bắt màu kém hoặc không

bắt màu chất nhuộm định kì [20]

Hinh 2.1 Hình ảnh nhuộm soi Microsporidia

Bệnh vi bào tử ở mắt, mặc dù không phổ biến, có thể tách là một phần củanhiễm khuẩn hệ thống Bệnh này chủ yếu có 2 dạng: viêm dính giác mạc,thường thấy ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch; viêm giác mạc nhu mô thấy ởbệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh Bệnh này được coi là bệnh cơ hội ở bệnhnhân suy giảm miễn dịch

2.5 Các phương pháp phát hiện Microsporidia

2.5.1 Chẩn đoán phân biệt

Cần phân biệt với những bệnh lý do các nguyên nhân khác khi biểu hiệnlâm sàng gặp ở đường ruột, gan, mật, hô hấp, niệu dục, mắt, xương cơ, thần kinh

trung ương Bệnh lý đường ruột nên nghĩ dến nguyên nhân do Microsporidia ở

những cá thể suy giảm miễn dịch có tiêu chảy kéo dài hay bệnh gan mật không

rõ nguyên nhân

Cần chẩn đoán phân biệt với nhiễm những đơn bào đường ruột khác cũnggây tiêu chảy kéo dài như Cryptosporidium, Cyclospora, Giardia và Isospora Ở

những cá thể miễn dịch bình thường, bệnh do Microsporidia được nghĩ đến ở

những khách du lịch bị tiêu chảy, trong đó những nguyên nhân bệnh lý thườngqui không thể xác định

Chẩn đoán nguyên nhân do Microsporidia cũng nên được nghĩ đến ở bệnh

nhân viêm kết giác mạc hay loét giác mạc không giải thích được nguyên do,bệnh viêm xoang hay bệnh đường hô hấp dưới lan tỏa, suy thận không rõnguyên nhân hay có những ca lắng bất thường trong nước tiểu, viêm cơ Bệnh cókhuynh hướng lan tỏa Kí sinh trùng này có thể xâm nhập bất kỳ cơ quan nào, kể

cả xương và hệ thần kinh trung ương Cần xác định được mầm bệnh ở nhiều loạibệnh phẩm nếu có thể như phân, đàm, nước tiểu, phết mũi, kết mạc, dịch não tủybằng tất cả những phương pháp có thể làm được [1, 11]

2.5.2 Chẩn đoán xác định

Chẩn đoán xác định dựa vào tìm thấy bào tử Microsporidia trong phân

sau khi nhuộm bằng các phương pháp đặc biệt như Weber chromotrope, hóahuỳnh quang, Gram – chromotrope

Các bệnh phẩm khác như nước tiểu, đờm, dịch rửa phế quản, dịch tátràng, phết từ màng nhày mũi, giác mạc, kết mạc Ly tâm lấy cặn nhuộm bằngcác phương pháp như Gram, Weber chromotrope, Giemsa,Steiner bạc,trichorome blue cải biến PAS, kháng thể huỳnh quang đặc hiệu Nhuộm grambào tử ăn màu gram dương rất rõ, nhưng đôi khi ăn màu gram âm hay gramdương yếu

Nhuộm mô giải phẫu bệnh từ mẫu sinh thiết hay giải phẫu thì từ các mô bệnhnhư giác mạc, kết mạc, xương cơ, ruột non, ruột già, gan, túi mật, mạc treo,thận, bọng đái, khí quản, phế quản xương, não Ở bệnh nhân nhiễm trùng ở mặt

– ruột, hỗng tràng và hồi tràng có mật độ nhiễm kí sinh trùng này cao nhất,phương pháp nhuộm thường là Giemasa, PAS, methenamine bạc, Ziehl –Neelsen, Kinyoun.

Các phương pháp khác như kháng thể huỳnh quang, sinh học phân tửPCR, cấy mô, kính hiển vi điện tử ngoài việc chẩn đoán còn giúp định danh loài

Microsporidia [2, 11].

2.5.2.1 Phương pháp nhuộm soi

Trong điều trị viêm loét giác mạc do Microsporidia, việc chẩn đoán sớm có

ý nghĩa vô cùng quan trọng giúp cho việc điều trị đúng hướng ngay từ đầu

Có nhiều phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng như soi tươi, soi trực tiếp,ELISA, PCR…nhưng kỹ thuật thường được áp dụng là soi trực tiếp Nguồnbệnh phẩm được lấy từ chất nạo ổ loét giác mạc bằng thìa nạo chắp nhỏ hoặc

Spatula Kimura hay đầu của kim tiêm trong da.

Mặc dù nhiều đánh giá so sánh về hiệu quả của các phương pháp nhuộm

trong việc xác định Microsporidia trong các mẫu phân, mật, nước tiểu và tiêu bản phổi, đánh giá về hiệu quả trong xác định Microsporidia trên mẫu tiêu bản

của mắt vẫn còn hạn chế Mẫu giác mạc được lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán

mà mắc Microsporidia sau đó đem đi dàn trên lam kính.

Cho đến nay ở nước ta, chẩn đoán vẫn chủ yếu dựa vào hình ảnh tổn

thương trên lâm sàng và kết quả nhuộm soi Tổn thương do Microsporidia

mặc dù có những đặc điểm đặc trưng nhưng không phải lúc nào cũng rõ ràng và

dễ dàng cho chẩn đoán

Đây là một xét nghiệm không thể thiếu, giúp chẩn đoán chính xác tácnhân gây bệnh Tuy nhiên, kỹ thuật nhuộm soi có độ đặc hiệu thấp chỉ áp dụngđối với những ca nhiễm điển hình có hình thái rõ ràng, dễ nhận định nên đã bỏsót một tỷ lệ khá lớn các trường hợp bị bệnh [1]

2.5.2.2 Phương pháp PCR và Realtime PCR

Mặc dù phương pháp nhuộm vi sinh hiệu quả và đặc hiệu trong việc chẩn

đoán, xác định Microsporidia ở mắt, nó yêu cầu phải có sự tham gia của các

chuyên gia, đặc biệt vẫn chưa có phương pháp chẩn đoán từ mẫu lam kính.Thêm vào đó, phương pháp nhuộm này không xác định được loài khác nhau của

Microsporidia Do đó, hiện nay trên thế giới đã tập trung nghiên cứu phát triển

kỹ thuật PCR và Realtime PCR hỗ trợ cho chẩn đoán Microsporidia [10, 15].

A Phương pháp PCR (Theo Kary Mullis và cộng sự năm 1985)

Nguyên tắc

Sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp các đoạn ADN mới từmạch khuôn trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu Các đoạn ADNmới được tạo thành lại được sử dụng làm khuôn Sau nhiều chu kỳ, đoạn ADNquan tâm được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lượng phục vụ chonhững nghiên cứu tiếp theo

Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:

- Giai đoạn biến tính: ADN mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt

độ cao (940C-960C)

- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đầu của

đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ sung

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng

lên khoảng 70-800C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq ADN polymerase kéo dài

chuỗi Trong việc xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật

khuếch đại trình tự gen( PCR) Để khuyếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ SSU

rRNA( đặc hiệu cho loài) của Microsporidia, sử dụng cặp mồi MF1 và MF2 đã

đc Polly công bố năm 2011 Cặp mồi này đc tác giả khuyến cáo đc dùng để

phát hiện chủng Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm Để khẳng định bộ mồi này có thể phát hiện được chủng Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm mắt của

các bệnh nhân viêm loét giác mạc thì tiến hành tách chiết nhuộm soi 1 mẫu dương tính sau đó tiến hành khuyếch đại trình tự gen Sau khi tiến hành khuyếchđại gen, để khẳng định lại tính

chính xác thì tiến hành giải trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ SSU rRNA xác địnhlại kích thước Đồng thời, so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen với ngân hàng genthế giới (http : / /bl a st n c bi nl m nih go v / )

Để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR, ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh

phẩm chứa Microsporidia được khẳng định bằng kỹ thuật nhuộm soi và xác định

trình tự axít nucleic theo thang pha loãng 1000 lần (ngµ/L - fg/µL) Sau đó tiếnhành phản ứng PCR như thành phần và điều kiện phản ứng mô tả như trên

Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR được đánh giá trên chủng nấm: Aspergillus sp, Fusarium sp; chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

và mẫu bệnh phẩm dương tính với HSV, CMV

B Phương pháp Realtime PCR

Trong phản ứng PCR kinh điển, sản phẩm khuếch đại được phát hiện quaphân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di ADN trên gel agarose khi phản ứngkết thúc Ngược lại, RealTime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũyADN khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Khả năng này được thực hiệnnhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tănglượng ADN tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang Những hóa chấtphát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết ADN và những trình tự gắnhuỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe Những máy luân nhiệtđặc biệt trang bị bộ phận phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát tínhiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra Tín hiệu huỳnh quang được

đo lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ

Ưu điểm chính của Real-Time PCR so với PCR truyền thống là nó chophép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạycao trong một phạm vi biến thiên rộng Kết quả Real-Time PCR có thể là kếtquả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự ADN) hay định lượng (sốlượng bản sao ADN) Real-Time PCR sử dụng để định lượng ADN được gọi làPCR định lượng

Đoạn dò TaqMan Probe là đoạn oligonucleotide có trình tự bổ sung vớitrình tự của đoạn ADN trên mạch khuôn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung vớitrình tự của hai 2 đoạn mồi trong phản ứng PCR Hai đầu của đoạn dò được gắn

hai chất gọi là chất phát quang (reporter) và chất ức chế (quencher), khi reporter

và quencher ở gần nhau thì quencher làm mất màu của reporter Ngược lại, khireporter và quencher ở xa nhau thì reporter phát huỳnh quang Trong mỗi chu kỳcủa phản ứng khuếch đại gene (PCR), đoạn dò và hai đoạn mồi sẽ được gắn vàosợi khuôn DNA đích cần phát hiện Tiếp đó, Taq DNA polymerase sẽ tổng hợpmạch DNA mới dựa trên trình tự nucleotide của sợi khuôn và đoạn mồi, đồngthời nó cũng phân cắt đoạn dò ra khỏi mạch khuôn khi nó tiến đến vị trí củađoạn dò, trong quá trình này quencher sẽ tách ra khỏi reporter nên làm reporterphát quang Do đó, lượng phát quang sẽ tỉ lệ thuận với lượng DNA khuếch đạilên Kỹ thuật Real time PCR dùng đoạn dò TaqMan cho kết quả chính xác

Hình 1.4 Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman

Để thuận lợi cho những nghiên cứu tiếp theo, tiến hành tạo nguồn plasmit

chuẩn dương Microsporidia sử dụng các kit tinh sạch Sản phẩm PCR khuyếch

đại đoạn gen tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA sẽ được gắn vào trong vectorPTZ57/RT Tiến hành đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu của phản ứng Realtime

PCR, kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi MSRT1 và MSRT2 với probeMSRT chỉ phát hiện đặc hiệu trình tự tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA của

Microsporidia mà không bắt cặp không đặc hiệu với các mầm bệnh vi sinh vật

khác

Để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime PCR, ADN tổng số tách chiết

từ mẫu bệnh phẩm chứa Microsporidia được khẳng định bằng kỹ thuật nhuộm

soi và xác định trình tự axít nucleic theo thang pha loãng 1000 lần (ngµ/L fg/µL) Sau đó tiến hành phản ứng Realtime PCR như thành phần và điều kiệnphản ứng mô tả như trên

-Độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR được đánh giá trên chủng nấm:

Aspergillus sp, Fusarium sp; chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và mẫu bệnh phẩm dương tính với HSV, CMV.

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về việc ứng dụng kỹ

thuật PCR vào việc phát hiện Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm giác

mạc Năm 2015, đã có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện

Microsporidia trên cỡ mẫu nhỏ [1] Đề tài chúng tôi thực hiện là tiếp nối từ kết

quả của nghiên cứu trước đó và phát triển nghiên cứu thêm ứng dụng kỹ thuật

realtime PCR phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm mảnh giác mạc 2.5.2.3 Phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh viện trung ương Mắt kết hợp với bệnh viện TW Quân đội 108 từ 2016-2017

Tiến hành trên 30 mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh viện trung ươngMắt kết hợp với bệnh viện TW Quân đội 108 từ 2016- 2017

3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây

bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam.

3.1 Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt

Nam hiện nay.

Năm 2015, TS Phạm Ngọc Đông và cs đưa ra trong số 134 mắt viêm kết

giác mạc do Microsporidia, có tới 99% được điều trị khỏi bằng nhỏ mắt

fluoroquinolone đơn thuần; 4 mắt viêm tái phát, được điều trị khỏi bằng nhỏ

fluoroquinolone và phối hợp với albendazole Tuy nhiên, điều trị viêm giác mạc

nhu mô do Microsporidia thì khó khăn và kết quả kém hơn nhiều Mặc dù được

điều trị tích cực, kết quả điều trị nội khoa cũng hết sức thất vọng Chỉ có 1/12mắt được điều trị khỏi bằng nội khoa, số còn lại đều phải ghép giác mạc điều trị.Kết quả thị lực sau ghép ở mức thấp, chủ yếu là từ BBT đến 20/400 Thị lựcthấp là do tổn thương nặng ở mắt (đục thể thủy tinh, màng xuất tiết diện đồngtử…) và cả do chất lượng mảnh giác mạc ghép không tốt, nhưng vẫn phải dùng

để ghép, nhằm bảo tồn nhãn cầu cho bệnh nhân [2]

Theo Garg P và sc., trong 19 ca điều trị bằng nhỏ mắt polyhexamethylenebiguanide và chlorhexidine, kèm theo uống albendazole hoặc itraconazole thìhầu hết các bệnh nhân đều không đáo ứng với thuốc, phải ghép giác mạc mớiloại trừ được tác nhân gây bệnh [11]

Theo các báo cáo y khoa đã được công bố về các trường hợp viêm giác

mạc nhu mô do Microsporidia, hầu hết các trường hợp đều thất bại khi điều trị

nội khoa, phải bỏ nhãn cầu hoặc ghép giác mạc điều trị Tuy cũng có một vàitrường hợp điều trị nội khoa thành công nhưng đây cũng là một thách thức rấtlớn đối với các bác sỹ nhãn khoa trong điều trị nhiễm trùng giác mạc do

Microsporidia.

Vấn đề đặt ra là nếu bệnh nhân không được phát hiện sớm tác nhân gây

bệnh là do kí sinh trùng Microsporidia, và khi điều trị bằng thuốc nhỏ mắt

không có tác dụng hay trong nhiều trường hợp bị viêm nặng sẽ phải chỉ địnhphương pháp phẫu thuật dành cho viêm giác mạc Do đó, vấn đề phát hiện sớm

tác nhân gây bệnh viêm giác mạc nói chung và đặc biệt là do Microsporidia nói

riêng đóng vai trò rất quan trọng trong việc đưa ra phác đồ điều trị sớm

3.2 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và

Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt

Nam.

Quả đúng như vậy, khi áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử, sử dụng phươngpháp PCR và Realtime PCR trong điều trị bệnh viêm loét giác mạc do

Microsporidia nói riêng có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng Phương pháp này

giúp phát hiện sớm nguyên nhân gây viêm loét giác mạc có phải do

Microsporidia hay không, và về hiệu quả thì tối ưu hơn hẳn các phương pháp

thông thường hiện đang được sử dụng ở các Bệnh viện lớn tại Việt Nam hiệnnay như phương pháp nhuộm soi hay nuôi cấy về độ đặc hiệu cũng như độ nhạy

và thời gian làm xét nghiệm Từ đó góp phần phát hiện sớm, đúng tác nhân vàtác động tích cực đến việc điều trị bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam Giúpđiều trị sớm, bác sỹ đưa ra được phác đồ điều trị hơp lý và nhằm giảm thiểu chiphí điều trị cho bệnh nhân cũng như hậu quả của việc phát hiện nguyên nhângây bệnh quá muộn gây ra

Hiện nay, phương pháp PCR đã và đang từng bước được áp dụng để chẩn

đoán và phát hiện Microsporidia là tác nhân gây viêm loét giác mạc tại Bệnh

viện TW Quân đội 108 kết hợp với Bệnh viện Mắt TW Vậy nên sau kết quả của

đề tài này, nhóm nghiên cứu của chúng tôi hi vọng ứng dụng thực tiễn của kỹthuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime PCR trong việc

phát hiện Microsporidia trong việc điều trị viêm loét giác mạc sẽ được áp dụng

rộng rãi hơn nữa tại các bệnh viện lớn tại Việt Nam và được đưa vào quy trìnhthường quy để xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh này

Chương II VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng nghiên cứu

- 01 Mẫu chứng dương Microsporidia được phân lập từ mẫu bệnh phẩm

viêm giác mạc được xác định bằng phương pháp nhuộm soi tại khoa Xét nghiệmtổng hợp, Bệnh viện mắt Trung ương

- Mẫu bệnh phẩm như: mô, dịch giác mạc… của bệnh nhân được chẩn đoán

viêm loét giác mạc bằng phương pháp nhuộm soi do Microsporidia được cung

cấp bởi khoa Kết giác mạc, bệnh viện Mắt Trung ương Mẫu bệnh phẩm đượclấy theo quy trình thường qui tại bệnh viện Hồ sơ bệnh án của các bệnh nhân bị

viêm giác mạc nhu mô do Microsporidia được chẩn đoán và điều trị tại Khoa

Kết Giác mạc đến ngày 1 tháng 5 năm 2017

- Các chủng nấm: Aspergillus sp, Fusarium sp…; Các chủng vi khuẩn:

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureu…và các mẫu bệnh phẩm dương

tính với Herpes Simplex Virus (HSV), Cytomegalovirus (CMV), được sử dụng để

đánh giá tính đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR

2 Hóa chất, thiết bị

2.1 Hóa chất

- GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo)

- GenJET PCR Purification Kit (Thermo)

- Các hóa chất, vật tư tiêu hao thông dụng trong sinh học phân tử của cáchãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad, Corning

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB gồm 1% trypton, 0,5% cao nấm men,0,5% NaCl

Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu được đặt tổng hợp tại hãng IDT (Mỹ)