Phân lập và định danh một số chỉ tiêu vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm tại viện Pasteur TP. HCM

Tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và định danh một số chỉ tiêu vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm tại Viện Pasteur Tp.. HCM còn là đơn vị y tế dự phòng đầu tiên của cả nước đư

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỈ TIÊU

VI SINH VẬT THƯỜNG GẶP TRONG THỰC PHẨM TẠI VIỆN PASTEUR TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD : ThS Nguyễn Thị Nguyệt SVTH : Hồ Thị Quyên

MSSV : 1453010283 Khóa : 2014-2018

Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2018

tâm, giúp đỡ từ người khác và chính vì điều đó em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đếnThS Nguyễn Thị Nguyệt, người chị, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp

đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực tập tốt nghiệp Em xin chân thành gửilời cảm ơn đến các anh, chị trong phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm đã tạo mọi điềukiện thuận lợi để em có cơ hội học hỏi, trao dồi thêm kiến thức chuyên môn lẫn kinhnghiệm sống

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Trường Đạihọc Mở Tp Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quýbáu trong suốt 4 năm đại học vừa qua để cho chúng em có những hành trang vững chắc

và đủ tự tin khi rời khỏi ghế nhà trường

Cảm ơn những bạn bè đã cùng em thực tập tại phòng thí nghiệm Vi sinh Nước Thực phẩm, Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cùng em trảiqua những lúc khó khăn nhất trong khi thực hiện đề tài

-Cuối cùng con/em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, đặc biệt làcha mẹ, anh chị, cùng những người thân yêu khác đã luôn ủng hộ, khích lệ và tạo cho

em động lực vượt qua những khó khăn, trở ngại

Do thời gian làm đề tài thực tập có hạn, không thể tránh khỏi những thiếu sót vềnội dung và trình bày Kính mong nhận được sự thông cảm và góp ý từ quý thầy cô để

em có thể rút ra được nhiều bài học quý báu cho mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng 01 năm 2018

Hồ Thị Quyên

 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii

 DANH MỤC CÁC BẢNG iii

 DANH MỤC SƠ ĐỒ/BIỂU ĐỒ iv

 DANH MỤC HÌNH ẢNH v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH 3

1.1.1 Lịch sử hình thành 3

1.1.2 Chức năng, nhiệm vụ 4

1.1.3 Thành tựu đạt được 5

1.1.4 Giới thiệu phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm 7

1.2 PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH, KIỂM NGHIỆM VSV 8

2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 8

2.2.2 Phương pháp định danh vi sinh vật 9

2.2.3 Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật 16

1.3 MỘT SỐ VI SINH VẬT THƯỜNG GẶP TRONG THỰC PHẨM 20

1.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí 20

1.3.2 Salmonella 21

1.3.4 Escherichia coli 22

1.3.3 Clostridium perfringens 23

1.3.5 Staphylococcus aureus 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 VẬT LIỆU 26

2.1.1 Địa điểm, thời gian và nguyên liệu thực tập 26

2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ 26

2.2.1 Salmonella (ISO 6579-1:2017) 31

2.2.4 Escherichia coli giả định (ISO 7251: 2005/TCVN 6848: 2007) 34

2.2.3 Clostridium perfringens (ISO 7937:2004/TCVN 4991:2005) 36

2.2.5 Staphylococcus aureus (ISO 6888-1:1999/TCVN 4830-1:2005) 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1.1 Kết quả nhiễm khuẩn đánh giá theo nhóm thực phẩm 40

3.1.2 Kết quả nhiễm khuẩn đánh giá theo chỉ tiêu xét nghiệm 43

3.1.5 Kết quả nhiễm Escherichia coli giả định trong các nhóm thực phẩm 46

3.1.6 Kết quả nhiễm Clostridium perfringens trong các nhóm thực phẩm 47

3.1.7 Kết quả nhiễm Staphylococcus aureus trong các nhóm thực phẩm 49

3.1.8 Kết quả nhiễm Salmonella trong các nhóm thực phẩm 50

3.2 THẢO LUẬN 52

3.2.1 Tỷ lệ nhiễm khuẩn của các nhóm thực phẩm 52

3.2.2 Tỷ lệ nhiễm của các chỉ tiêu VSV 53

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 KẾT LUẬN 54

4.2 KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 58

VSV : Vi sinh vật

CFU : Colony Forming Unit

MPN : Most probable number

ISO : International Orgazation for Standardization

TCVS : Tiêu chuẩn vi sinh

QCVN : Quy chuẩn Việt Nam

PCA : Plate count agar

EP : Nước muối sinh lí (0,9%)

HEK : Hektoen Enteric Agar

XLD : Xylose Lysine Dexycholate Agar

KMTTn : Muller - Kaufman Tetrathionate - Novobiocin Broth

RVS : Rappaport Vasillia

KIA : Kligler Iron Agar

TLS : Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth

EC : Escherichia coli broth

TSC : Tryptone Sulfide Cycloserine Agar

BHI : Brain heart infusion broth

TSVSVHK : Tổng số vi sinh vật hiếu khí

E coli : Escherichia coli

S aureus : Staphylococcus aureus

C perfringens : Clostridium perfringens

Bảng 1.2 Khả năng sử dụng nguồn Cacbon ở vi sinh vật 12

Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết quả API 10S 15

Bảng 1.4 So sánh phương pháp Đếm khuẩn lạc và MPN 17Y Bảng 3.1 Chỉ tiêu xét nghiệm và quy chuẩn đánh giá cho từng nhóm thực phẩm 40

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá tỷ lệ nhiễm các VSV phân tích theo nhóm thực phẩm 41

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá theo các chỉ tiêu vi sinh vật 43

Bảng 3.4 Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trong các nhóm thực phẩm 44

Bảng 3.5 Kết quả kiểm nghiệm E coli giả định trong các nhóm thực phẩm 46

Bảng 3.6 Kết quả kiểm nghiệm C perfringen trong các nhóm thực phẩm 47

Bảng 3.7 Kết quả kiểm nghiệm S aureus trong các nhóm thực phẩm 49

Bảng 3.8 Kết quả kiểm nghiệm Salmonella trong các nhóm thực phẩm 50

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ tổ chức chung của viện Pasteur Tp HCM 6Y

Sơ đồ 2.1 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí ở 30°C 30

Sơ đồ 2.2 Phát hiện Salmonella trên đĩa thạch 33

Sơ đồ 2.3 Định lượng Escherichichia coli giả định 35

Sơ đồ 2.4 Định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch 37

Sơ đồ 2.5 Định lượng Staphylococcus aureus trên đĩa thạch 39

Biểu đồ Biểu đồ 3.1 Mức độ nhiễm vi sinh vật theo nhóm thực phẩm 42

Biểu đồ 3.2 Mức độ nhiễm của từng chỉ tiêu xét nghiệm 43

Biểu đồ 3.3 Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trong các nhóm thực phẩm 45

Biểu đồ 3.4 Kết quả kiểm nghiệm E coli giả định trong các nhóm thực phẩm 46

Biểu đồ 3.5 Kết quả kiểm nghiệm C perfringen trong các nhóm thực phẩm 48

Biểu đồ 3.6 Kết quả kiểm nghiệm S aureus trong các nhóm thực phẩm 49

Biểu đồ 3.7 Kết quả kiểm nghiệm Salmonella trong các nhóm thực phẩm 51

Hình 1.2 Phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm 7

Hình 1.3 Kết quả thử nghiệm Indol 10

Hình 1.4 Kết quả thử nghiệm Coagulase 11

Hình 1.5 Kết quả thử nghiệm Urease 12

Hình 1.6 Kết quả thử nghiệm KIA 13

Hình 1.7 Kết quả thử nghiệm Lysine 14

Hình 1.8 Strip Api- 10S lúc chưa sử dụng 16

Hình 1.9 Máy điếm khuẩn lạc tự động 17

Hình 1.10 Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí trên đĩa thạch PCA 20

Hình 1.11 Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi điện tử 21

Hình 1.12 Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi điện tử 22

Hình 1.13 Vi khuẩn Clostridium perfringens dưới kính hiển vi điện tử 23

Hình 1.14 Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử 24

Hình 1.15 Nhiễm trùng ngoài da gây ra do S aureus 25Y Hình 2.1 Dãy tủ ấm dùng cho nuôi cấy vi sinh vật 26

Hình 2.2 Dãy tủ lạnh dùng cho bảo quản môi trường, hóa chất 27

Hình 2.5 Máy dập mẫu 28

Hình 2.3 Buồng đốt que cấy 28

Hình 2.4 Tủ an toàn sinh học cấp 2 28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhu cầu thực phẩm luôn là thiết yếu nhất đối với con người, thế nhưng khi đờisống ngày một tăng lên thì các vấn đề ăn uống lại không còn được đảm bảo bởi tìnhtrạng ngộ độc thực phẩm và mắc các bệnh có liên quan đến sử dụng thực phẩm

Trên thế giới, theo trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC)ước tính hằng năm có khoảng 48 triệu người mắc bệnh, 128.000 người nhập viện và3.000 người tử vong do các bệnh liên quan đến thực phẩm mỗi năm tại Hoa Kỳ Mộttrong các nguyên nhân được xác định được là do vi sinh vật gây ra [16]

Ở nước ta, theo ghi nhận của Bộ Y tế số vụ ngộ độc thực phẩm trong năm 2017giảm nhưng số trường hợp tử vong lại tăng gấp đôi Cụ thể, trong năm cả nước ghinhận 139 vụ ngộ độc thực phẩm với 3.869 người mắc, giảm 27 vụ và 438 người mắc sovới năm 2016 Số người tử vong do ngộ độc thực phẩm là 24 người, tăng 12 người sovới năm 2016 [15]

Đáng chú ý, trên địa bàn các tỉnh phía Nam của nước ta tình hình ngộ độc thựcphẩm gần đây cũng đang diễn biến hết sức phức tạp Cụ thể vào ngày 17/03/2017,trung tâm Y tế huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang đã tiếp nhận trường hợp nhập viện

do ngộ độc thực phẩm sau khi uống sữa được phát tại trường của 50 học sinh trườngtiểu học Kim Sơn trong tình trạng đau bụng, nôn mửa và sốt cao [13] Vào ngày01/07/2017, xảy ra một vụ ngộ độc thực phẩm tại Công Ty TNHH An Giang Samholàm cho hơn 500 công nhân bị buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy và khó thở phải nhậpviện điều trị khẩn cấp, nguyên nhân xác định là do đặt phải thức ăn tại các cơ sở nấu

Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn tới ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớncác trường hợp là có nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gâybệnh hay độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này [5] Đáng chú ý trong năm 2017, khitiến hành kiểm tra trên gần 10.000 mẫu thực phẩm tại các chợ, các cơ sở giết mổ thì tỷ

lệ vi phạm chỉ tiêu vi sinh chiếm tới 26,7% số mẫu được kiểm tra tăng cao so với mức

9,35% của năm 2016 [15] Bởi vì vậy, kiểm soát vi sinh là một yêu cầu tất yếu đối vớibất cứ một sản phẩm thực phẩm nào, các chỉ tiêu vi sinh được kiểm nghiệm chủ yếu là

tổng số vi sinh vật hiếu khí, Salmonella, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Staphylococcus aureus

Tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và định danh một số chỉ tiêu vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm tại Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh” để đánh giá

mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong một số nhóm thực phẩm, thống kê tỷ lệ nhiễm củatừng loại vi sinh vật, đồng thời so sánh cùng với các nghiên cứu trước đây để từ đó cócái nhìn đúng hơn về tình trạng VSATTP hiện nay, cung cấp thêm những kiến thứcgiúp người tiêu dùng có sự lựa chọn thông thái để bảo vệ sức khỏe cho bản thân, giađình và cộng đồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH

1.1.1 Lịch sử hình thành

Năm 1891,Viện Pasteur Sài Gòn (nay là Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh) đãđược thành lập dựa theo ý tưởng của nhà khoa học vĩ đại Louis Pasteur và đâycũng là chi nhánh nước ngoài đầu tiên trên thế giới của Viện Pasteur Paris

Người được giao cho nhiệm vụ thành lập, tổ chức và điều hành viện đầu tiên

là Albert Calmette, một trong những học trò của Louis Pasteur Ông đã khởi đầu sựnghiệp với đầy rẫy khó khăn về vật chất, kỹ thuật, từ việc tiếp nhận một phòng thínghiệm đơn sơ tại Viện Quân y Grall, đến việc trung chuyển những dụng cụchuyên môn, hóa chất từ Pháp sang Việt Nam và sau đó là đào tạo những nhânviên kỹ thuật đầu tiên để từng bước triển khai công việc Với khối óc và sự chămchỉ của mình, ông đã hoàn thành một khối lượng công việc đồ sộ như xây dựng cơ

sở, cải tiến kỹ thuật, làm một số xét nghiệm chẩn đoán bệnh và sản xuất được vắcxin đậu mùa, vắc xin chống bệnh dại, nghiên cứu về bệnh lý nhiệt đới, làm menrượu, sản xuất huyết thanh chống nọc độc rắn hổ mang Năm 1893, ông bị bệnhnặng phải về nước, nhưng ông đã mở đường và đặt sự nghiệp Pasteur trên một nềntảng vững chắc tại Viện Pasteur Sài Gòn Một thời gian sau, cơ sở đầu tiên ở Grallquá nhỏ hẹp nên Viện đã được đầu tư xây dựng cơ sở mới ở vị trí hiện nay

Từ 1905, Viện được đưa vào hệ thống quản lý chung do viện Pasteur Parisphụ trách Năm 1918, Nol Bernard được giao nhiệm vụ mở rộng hoạt động của cácphòng cơ sở ở Viện và hiện nay viện trưởng đương nhiệm của viện là PGS TS

BS Phan Trọng Lân

Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh cố gắng hoạt động theo quan điểm y học dựphòng thông qua các biện pháp chủ động phòng chống để đem lại hiệu quả cao và

ít tốn kém nhất trong khống chế bệnh tật và bảo vệ sức khỏe cộng đồng [19]

1.1.2 Chức năng, nhiệm vụ

 Chức năng:

Nghiên cứu khoa học, chỉ đạo chuyên môn tuyến trước, phòng chống dịch, đàotạo cán bộ chuyên ngành về vi sinh y học, miễn dịch, dịch tễ học, đề xuất với Bộ Y tếcác biện pháp phòng chống dịch bệnh phù hợp với điều kiện phát triển kinh tế xã hộicủa các tỉnh khu vực Miền Nam

 Nhiệm vụ:

- Nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu vi sinh, miễn dịch, dịch tễ học, sinh học phân

tử, các bệnh nhiễm trùng, nghiên cứu vắc xin

- Chỉ đạo tuyến: Chỉ đạo phòng chống các bệnh dịch nguy hiểm (như tả, thương

hàn, sốt xuất huyết, dịch hạch, viêm não), chỉ đạo thực hiện một số chương trình mụcHình 1.1 Viện Pasteur Tp HCM ngày nay

tiêu quốc gia triển khai ở khu vực phía Nam (như Phòng chống sốt xuất huyết, Giámsát HIV/AIDS, Tiêm chủng mở rộng).

- Ðào tạo: Ðào tạo tiến sĩ chuyên ngành vi sinh y học, đào tạo nâng cao kỹ thuật,

nghiệp vụ chuyên môn cho cán bộ về các chuyên ngành vi sinh, miễn dịch, dịch tễ và yhọc dự phòng

- Giáo dục truyền thông: Phối hợp với các cơ quan truyền thông đại chúng, các

bộ, ban ngành của địa phương để tiến hành công tác truyền thông giáo dục sức khoẻnhân dân về các bệnh truyền nhiễm gây dịch và các biện pháp phòng chống

- Hợp tác quốc tế: Nhằm phục vụ việc phát triển các công tác nghiên cứu khoa

học và đào tạo cán bộ chuyên môn

1.1.3 Thành tựu đạt được

Đây là nơi phát hiện trường hợp nhiễm HIV đầu tiên ở Việt Nam (năm 1990 tạiPhòng thí nghiệm HIV) cùng với các phòng thí nghiệm polio, sởi, dengue xuất huyết,cúm, kháng thuốc đã góp phần thanh toán dịch bại liệt, loại trừ uốn ván sơ sinh,khống chế thành công đại dịch SARS, cúm A/H5N1, phòng chống sốt xuất huyếtdengue, chống bệnh tay-chân-miệng do enterovirus và đẩy lùi dịch hạch

Bước đầu thực hiện thành công nhiệm vụ chỉ đạo giám sát phòng chống dịchbệnh, thực hiện các chương trình mục tiêu quốc gia, các hoạt động về y tế công cộng

và chỉ đạo đẩy lùi, khống chế các bệnh nhiễm trùng, đưa Việt Nam trở thành một điểmsáng về y tế dự phòng ở trong khu vực và trên thế giới Viện đã thực hiện nhiều đề tàicấp nhà nước, cấp bộ, nhiều đề tài hợp tác quốc tế và đã được đưa vào ứng dụng Tronghội chợ Khoa học Công nghệ do Bộ Khoa học Công nghệ và Ủy ban Nhân dân Tp HồChí Minh tổ chức, Viện đã được nhận cúp vàng hội chợ TechMart

Viện Pasteur Tp HCM còn là đơn vị y tế dự phòng đầu tiên của cả nước đưa tưduy kinh tế tri thức vào hoạt động thường xuyên của Viện bằng việc thực hiện các dịch

vụ sinh y học kỹ thuật với gần 300 xét nghiệm các loại cho người, thực phẩm, nước,sản phẩm công nghiệp, một số phòng thí nghiệm dịch vụ tại viện đạt tiêu chuẩn ISO

17025 Hằng năm, viện sản xuất hàng triệu liều vắc xin BCG phục vụ chương trình

“Tiêm chủng mở rộng” ở trẻ em, viện còn sản xuất các loại vắc xin và sinh phẩm chẩnđoán sốt xuất huyết, viêm não, lepto, các bệnh đường ruột, phát hiện a-fetoprotein…

Từ lâu, viện đã là trung tâm huấn luyện, đào tạo thực hành về y tế dự phòng chokhu vực phía Nam Hằng năm, có mấy chục khóa huấn luyện về dịch tễ, vi sinh, miễndịch, sinh học phân tử… cho các cán bộ y tế dự phòng các tuyến Nơi đây còn là cơ sởthực hành làm luận văn, luận án cho sinh viên, cán bộ của các trường Đại học trongkhu vực và cho cả cán bộ ở các viện, trường quốc tế

CÁC PHÒNG CHỨC NĂNG CÁC KHOA CHUYÊN MÔN ĐƠN VỊ TRỰC THUỘC

Khoa kiểm soát phòng ngừa dịch bệnh

Khoa vi sinh miễn dịch

Khoa sản xuất Vacxin và sinh phẩm

Khoa kiểm định vacxin và sinh phẩm y tế

Khoa động vật và côn trùng y học

Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng

Trung tâm đào tạo

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ tổ chức chung của Viện Pasteur Tp HCM

1.1.4 Giới thiệu phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm

Vào tháng 12/1990, phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm thuộc “Khoa Xét nghiệmSinh học Lâm sàng” ra đời nhờ dự án hợp tác giữa Viện Pasteur Paris và Viện Pasteur

Tp Hồ Chí Minh Nội dung dự án là xây dựng một trung tâm xét nghiệm sinh học lâmsàng lấy tên là LAM 91 (Laboratoire’d Analyses Medicales) Nhiều thiết bị, máy móc,dụng cụ chuyên môn, tạp chí, tài liệu khoa học đã được chuyển sang từ Pháp, hàng loạtcán bộ của viện được đào tạo trong và ngoài nước dưới sự giúp đỡ của các chuyên giaPháp Dự án LAM 91 mang lại nhiều kết quả thiết thực, trực tiếp giải quyết được mộtphần nhu cầu khám chữa bệnh của nhân dân và mang lại nguồn thu đáng kể cho Việntrang trải vào các hoạt động nghiên cứu

Khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng nói chung và Phòng vi sinh Nước - Thựcphẩm nói riêng đảm nhiệm công tác kiểm nghiệm: phân lập và định danh vi khuẩn chỉđiểm vệ sinh và vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm, nước và mỹ phẩm Phương phápthử nghiệm áp dụng theo TCVN - Bô Y tế, ISO và AFNOR Phòng cũng đã đưa các kỹthuật sinh học phân tử vào chuẩn đoán phát hiện nhanh một số vi khuẩn có thời giannuôi cấy lâu và vi khuân khó phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống, đápứng được yêu cầu của khách hàng

1.2 PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH, KIỂM NGHIỆM VSV

2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật

Còn gọi là phương pháp tạo khuẩn lạc đơn, đây là quá trình tách riêng các loài visinh vật từ quần xã ban đầu và đưa về dạng thuần khiết để khảo sát và định loại, vi sinh

vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu Hầu hết

các phương pháp phân lập đều được dựa trên một số kỹ thuật như: cấy ria, cấy tranghoặc đổ đĩa kết hợp với nuôi cấy vi sinh vật trên các môi trường chọn lọc nhằm ưutiên sự phát triển của một loại vi sinh vật quan tâm

Kỹ thuật cấy ria là phương pháp phân lập hữu hiệu và dễ thực hiện nhất, hỗn hợp

vi sinh vật được ria trên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri sao cho các tế bào riêngbiệt được tách nhau ra và tạo được khuẩn lạc đơn

Kỹ thuật cấy trang và đổ đĩa là pha loãng dịch chứa vi sinh vật thành các mức độpha loãng khác nhau (bậc 10) và chuyển chúng vào môi trường nuôi cấy nhờ trải đềudịch khuẩn lên bề mặt môi trường rắn (cấy trang) hoặc đổ môi trường đã đun chảy vàođĩa petri đã có sẵn dịch mẫu (đổ đĩa)

Bảng 1.1 So sánh kỹ thuật cấy trang và đổ đĩa

- Dễ làm thuần vi sinh vật

- Cấy được thể tích mẫu lớn

- Phù hợp với các vi sinh vật cần dinhdưỡng tiếp xúc từ nhiều phía

- Đếm được mật độ vi sinh vật cao(150 - 300 khuẩn lạc)

Nhược

điểm

- Cấy được thể tích mẫu nhỏ

- Chỉ cho phép đếm được sốlượng khuẩn lạc thấp

- Không định lượng được những visinh vật nhạy nhiệt

- Khó làm thuần một dòng vi sinh vật

và khó xác định được hình dạngkhuẩn lạc điển hình

L-Tryptophan (Môi trường)+ H2O

Tryptophanase

Vi khuẩn Indole + Pyruvic acid + NH3

2.2.2 Phương pháp định danh vi sinh vật

Sau khi thu được các khuẩn lạc đơn, thuần khiết bằng kỹ thuật phân lập trên các

môi trường chọn lọc, chủng thuần là yêu cầu cần cho việc định danh vi sinh vật Việc

định danh này được thực hiện dựa vào các đặc điểm về kiểu hình, đặc biệt là các phản

ứng sinh hóa được thực hiện do chính vi sinh vật

Có nhiều cách để định danh vi sinh vật như: định danh theo phương pháp truyền

thống (sau bước phân lập chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm gram đánh giá hình thái,

thực hiện các thử nghiệm sinh hóa), sử dụng bộ Kit (giống như phương pháp truyền

thống chỉ khác thử nghiệm sinh hóa được thay thế bằng Kit thương mại) và dùng các

thiết bị định danh hiện đại

2.2.2.1 Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng

 Thử nghiệm Indol

Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật có khả năng oxy hóa Tryptophan trong môi trường

(nhờ có enzyme Tryptophanase) thành các dạng của Indol Nhân pyrol của indol phản

ứng với gốc aldehyde của Para-dimethylamino-benzaldehyd (DMABA) trong thuốc thử

Kovacs qua 2 giai đoạn tạo thành phức chất dạng Quinine có màu đỏ

Môi trường và thuốc thử

Môi trường: canh Tryptone

Thuốc thử: Kovacs

Thực hiện: Cấy sinh khối vi sinh vật vào môi trường canh Tryptone, ủ ở 44ºC/24h-48h,

sau đó nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovac’s vào mỗi ống nghiệm Quan sát sự đổi màu

Indol (+): lớp trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ.

Indol (-): lớp trên bề mặt môi trường có màu vàng chanh của thuốc thử

Hình 1.3 Kết quả thử nghiệm Indol

 Thử nghiệm Coaglase

Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật có sinh Coagulase, coagulase có tác dụng làm ngưng

kết các thành phần của huyết tương tạo thành các khối đông huyết tương

Môi trường và thuốc thử: Bộ thử Staphytect - Plus

Thực hiện: Lần lượt nhỏ một giọt thuốc thử chứa huyết tương và một giọt thuốc thử

không chứa huyết tương (dùng làm chứng âm) lên phiếu phản ứng có sẵn trong bộ thử(có thể thay thế bằng lam kính) Lấy sinh khối vi khuẩn khếch đều lên hai giọt thuốcthử rồi quan sát xem có hay không hiện tượng đông tụ

Kết quả

Nguyên tắc: Phát hiên vi sinh vật có sinh Urease, có khả năng phân giải Urea thành

ammonia (NH3) và CO2 làm kiềm hóa môi trường và có thể theo dõi thông qua sự đổimàu của chất chỉ thị Phenol red

Môi trường và thuốc thử:

Urea Broth và Chiristensen Urea (thạch nghiêng)

Chỉ thị màu Phenol red, pH 7,2

Thực hiện: Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường rồi ủ 37ºC/24h Đọc kết quả.

Kết quả

Urea (+): môi trường trở nên đục, từ màu vàng chuyển sang màu hồng.

Urea (-): môi trường không đổi màu

Hình 1.5 Kết quả thử nghiệm Urease

 Thử nghiệm KIA

Nguyên tắc: Xác định đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau

(glucose và lactose) của vi sinh vật nhận biết nhờ sự thay pH môi trường dẫn đến đổimàu chất chỉ thị phenol red Đồng thời, xác định cả khả năng sinh hydrogen sulfide(H2S) và khả năng sinh hơi

Bảng 1.2 Khả năng sử dụng nguồn Cacbon ở vi sinh vật

Trường hợp Sử dụng Glucose Sử dụng Lactose và Glucose

GĐ1: không

có do không

sử dụng được đường

GĐ2:

Pepton→

NH3 (kiềm)Mặt sâu (kị

khí)

GĐ1: Glucose (lên men kị khí)

→ acid hữu cơ + ATP

GĐ1: Glucose→ acid hữu cơ GĐ2: Không có do không dùng

Không có

VI KHUẨN(Thiosulfate reductase)Sodium thiosulfate (môi trường)

H2S

H2S ↑

Fe 2+

(ferric ammonium citrate)

FeS↓ (màu đen)

+ +

 Khả năng sinh hydrogen sulfide (H 2 S):

 Khả năng sinh hơi:

Nếu sự lên men đường tạo sản phẩm khí thì sẽ kết tụ thành bọt khí trong ống

nghiệm hay làm vỡ thạch

Môi trường và thuốc thử:

Kligler Iron Agar (KIA): chứa 0,1% glucose, 1% lactose

Chất chỉ thị pH: phenol red

Thực hiện: Cấy ria sinh khối vi sinh vật trên môi trường thạch nghiêng sau đó cấy đâm

sâu vào ống nghiệm nhưng tránh chạm vào đáy ống Ủ 37º C trong 18 - 24h

Hình 1.6 Kết quả thử nghiệm KIA

R-CH-NH2-COOH (Amino acid) R-CH2-NH2 (amine)

Lysine decarboxylase

Cadaverine (diamine)+

 Thử nghiệm Lysine

Nguyên tắc:

Phát hiện các vi khuẩn sinh Decarboxylase, xúc tác phản ứng phân cắt nhóm

carboxyl (-COOH) ở một số acide amin, tạo thành amine hoặc diamine và CO2

làm kiềm hóa môi trường và làm chỉ thị màu Bromocresol purple (5,2 vàng -6,8

tím) vẫn giữ màu tím

Trong các enzyme decarboxylase, có Lysine decarboxylase (LDC) giúp vi

khuẩn sử dụng lysine (acide amin) có trong môi trường như một nguồn carbon,

tạo CO2 làm pH tăng, vẫn giữ màu tím ở môi trường

Môi trường thuốc thử:

Môi trường Lysine Decarboxylase Broth

Âm tính: chuyển màu vàng sáng,

trong (chỉ glucose được lên men)

Hình 1.7 Kết quả thử nghiệm Lysine

2.2.2.2 Sử dụng bộ phản ứng sinh hóa

Tập hợp nhiều kiểm tra sinh hóa được nghiên cứu và thu nhỏ giúp cho việc chuẩnđoán nhanh, phương thức đơn giản tiết kiệm thời gian và chi phí Strip Api 10S là một

ví dụ, được dùng trong định danh Enterobacteriaceae và các vi khuẩn Gram (-) hình

que khác, strip gồm các thử nghiệm được trình bày chi tiết ở Bảng 1.3

Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết quả API 10S Thử

nghiệm

Thành phần hoạt tính liên quan Phản ứng/enzyme

Vàng/vàngxám

(ARAbinose) (3)

Xanhdương/lá Vàng

CIT Trisodium citrate Khả năng sử dụng

CITrate

Xanh láxám/Vàng

Xanhdương/lá (2)

thiosulphate Khả năng sinh H2S

Không đổimàu/xámnhạt

Đen/có cặn

oxidase Cytochrome- OXidase

Quan sát màu trên giấy

thử

NO2 GLU tube Khả năng sinh NO2

Nhỏ thuốc thử NIT 1+ NIT2/2-5 phút

Chú thích

(1) Vàng nhạt cũng là dương tính

(2) Đọc ở phần phía trên (phần hiếu khí)

(3) Quá trình lên men quan sát ở phần dưới týp, oxi hóa mặt lõm.

Nhỏ dầu khoáng tạo điều kiện vi hiếu khí trước khi ủ ở các týp: LDC, ODC, CIT, H2S, URE Riêng CIT bơm đầy dịch mẫu trên týp, các thử nghiệm còn lại bơm vừa đủ.

2.2.3 Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật

Kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh vật nhìn chung cũng là dựa trên cơ sở phân lập

và định danh vi sinh, mở rộng hơn là xác định có hay không sự hiện diện vi sinh vật vàđếm số lượng của chúng để trả lời cho câu hỏi “được phép hay không” sự có mặt visinh vật này trong mẫu thực phẩm dựa theo các qui định

2.2.3.1 Phương pháp định tính

Xác định có hay không sự hiện diện của vi sinh vật nào đó trong mẫu thực phẩmGồm các bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, cấy phân lập tạo khuẩn lạc rời, chọnkhuẩn lạc nghi ngờ để đi định danh bằng các phản ứng sinh hóa

 Phương pháp truyền thống

Phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển viPhương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầuPhương pháp màng lọc (ở nước)

Phương pháp đo độ đục ODPhương pháp đếm khuẩn lạcPhương pháp pha loãng tới hạn (MPN)Nhưng trong báo cáo thực tập này, chúng tôi chỉ tập trung phân tích vàtìm hiểu về 2 phương pháp truyền thống phổ biến nhất hiện nay tại các phòngkiểm nghiệm vi sinh vật, đó là phương pháp Đếm khuẩn lạc và phương phápPha loãng tới hạn (MPN)

 Phương pháp hiện đại

Bảng 1.4 So sánh phương pháp Đếm khuẩn lạc và MPN Hình 1.9 Máy đếm khuẩn lạc tự động

(thay thế phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống)

Dựa theo số lượng vi sinh vật có xácsuất lớn nhất hiện diện trong mộtđơn vị thể tích mẫu thu được từ kếtquả định tính của một loạt thínghiệm lặp đi lặp lại từ trước đó ởmột số độ pha loãng khác nhau.

- Ủ nhiệt độ và thời gian thích hợp

- Chuẩn bị dãy các ống nghiệm chứamôi trường nuôi cấy thích hợp

- Cho vào môi trường một thể tíchchính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng

độ pha loãng liên tiếp

- Ủ nhiệt độ và thời gian thích hợp.Kết quả

(n1+0,1n2) d V

N: Số lượng khuẩn lạc trong (CFU/

g hoặc CFU/ml) C: Số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được chọn ở các nồng

- Ghi nhận số ống dương: có hiện

tượng sinh hơi, đổi màu, đục ở

từng độ pha loãng và tra bảng MPN

- Công thức chuyển đổi kết quảMPN:

C S = M F/V 0 V S

vật có trong thể tích V S

M: Chỉ số MPN tra từ bảng đối với

F: Nghịch đảo hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thấp

nồng độ pha loãng thứ nhất V: Thể tích mẫu phân tích (ml)

nhất của dãy

V S : Thể tích chuẩn được chọn để biểu thị mật độ vi sinh vật.

Ưu điểm

- Định lượng được số lượng tế bào

vi sinh vật còn sống hiện diện trongmẫu

- Cho phép định lượng chọn lọc visinh vật tùy theo môi trường vàđiều kiện nuôi cấy

- Độ nhạy cao, cho phép định lượng

vi sinh vật ở mật độ thấp

- Cho phép dịnh lượng được vi sinhvật có mật độ rất thấp

- Cho kết quả khá chính xác

hiên lặp lại trên ít nhất 2 đĩa

- Phức tạp, tốn thời gian, môi trườnghơn phương pháp đếm khuẩn lạc

- Điều kiện ủ: không ủ đủ thời gian

sẽ khiến nhiều tế bào chưa kịp hìnhthành khuẩn lạc

* Điều kiện nuôi cấy cần đảm bảosao cho số khuẩn lạc xuất hiện làtối đa

Thông thường việc định lượng nàyđược thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độpha loãng bậc 10 liên tiếp (9 ốngnghiệm)

* Độ chính xác phụ thuộc vào sốlượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi

độ pha loãng, số lượng ống nghiệmlặp lại càng cao thì độ chính xác củatrị số MPN càng lớn

1.3 MỘT SỐ VI SINH VẬT THƯỜNG GẶP TRONG THỰC PHẨM

1.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí

Vi sinh vật hiếu khí là những VSV tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trongđiều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử TSVSVHK phản ánh mức độ vệ sinh củathực phẩm trong chế biến, bảo quản, độ tươi mới hay nguy cơ hư hỏng thực phẩm [5]

Không thể đánh giá rằng tổng số vi khuẩn ở mức độ thấp có nghĩa là sản phẩm antoàn Trong một số trường hợp, chi tiêu TSVSVHK thấp nhưng chứa độc tố gây ngộđộc của vi khuẩn hay trong thực phẩm lên men thì không thể đánh giá theo tiêu chuẩn

này [1] Đồng thời, các thực phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh về chỉ tiêu TSVSVHK vẫn cóthể nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác

Điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ thay đổi tùy theo yêu cầu phân tích và quy địnhcủa từng quốc gia Theo TCVN 4884:2015 nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi khuẩnhiếu khí trong thực phẩm có thể áp dụng là 30ºC [5,6]

Hình 1.10 Khuẩn lạc VSV hiếu khí trên đĩa thạch PCA

1.3.2 Salmonella

Hình 1.11 Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi điện tử

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, thuộc họ vi khuẩn đường ruột

(Enterobacteriaceae), hiếu khí và kỵ khí tùy tiện, có nhiều lông ở xung quanh thân nên

có khả năng di động, không sinh bào tử Chúng lên men được glucose và mannitol sinhhơi nhưng không lên men được saccharose và lactose, cho phản ứng Oxidase (-),

Dựa vào kỹ thuật nghiên cứu DNA cho thấy Salmonella chỉ có một loại với trên

2500 kiểu huyết thanh khác nhau Hầu hết các kiểu huyết thanh này được định danhdựa vào cấu trúc kháng nguyên (O, H, Vi) [4]

Salmonella có độc tính cao, gây ngộ độc thực phẩm mạnh và có thể gây tử vong.

Triệu chứng nhiễm bệnh bắt đầu từ đau bụng, tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện từ

12 - 36 giờ sau ăn và bệnh kéo dài khoảng một tuần lễ [5] Salmonella typhi gây bệnh cảm thương hàn, Salmonella paratyphi A, B, C gây bệnh phó thương hàn và

Salmonella enteritidis gây ngộ độc thực phẩm, rất nguy hiểm có thể gây biến chứng

xuất huyết đường tiêu hóa, ruột trở nên mỏng và có thể bị thủng

Thực phẩm có nguy cơ nhiễm cao là thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật như:thịt lợn, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm sữa, trứng, hải sản cùng một số rau quả [5].

Salmonella có thể tồn tại ở môi trường bên ngoài khá lâu, nhưng chúng lại mẫn

cảm với thuốc sát trùng và nhiệt độ, phát triển tốt ở 37ºC, ở 60ºC chỉ sống được 60phút, ở 70ºC bị chết sau 10 phút, ở 100ºC thì chết ngay lập tức bởi vậy biện pháp ngăn

ngừa nhiễm Salmonella tốt nhất là tuân thủ vệ sinh trong chế biến thực phẩm, ăn chín

uống sôi [7]

1.3.4 Escherichia coli

Hình 1.12 Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi điện tử

Vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Enterobacteriae, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi,

không sinh bào tử, hầu hết có lông và di động được, ký sinh chủ yếu trong đường ruộtcủa động vật máu nóng Nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 37 ºC, tuy nhiên có thể

tăng trưởng ở 10- 46ºC, pH 7,2- 7,4 E coli có khả năng lên men sinh hơi một số loại

đường thông thường như lactose, gulcose, mannitol Người ta thường dùng thử nghiệm

IMViC để phân biệt E coli với các vi khuẩn đường ruột khác, kết quả IMViC lần lượt

là: Indol (+), Methyl red (+), Vosges Proskauer (-), Citrate (-) [2,4] Ngoài ra, chúng

5 nhóm gây bệnh như sau:

E coli sản xuất ra một số chất độc bền và khó phân hủy ở nhiệt độ cao cũng như

các chất độc nhạy cảm với nhiệt Nguồn lây truyền E coli chủ yếu là từ phân người và

động vật bị nhiễm vi khuẩn này, sự hiện diện của chúng trong mẫu thử chứng tỏ mẫu

có khả năng bị nhiễm phân tươi [5]

1.3.3 Clostridium perfringens

Hình 1.13 Vi khuẩn Clostridium perfringens dưới kính hiển vi điện tử

Clostridium perfringens là các vi khuẩn gram dương, hình que, không có lông vàkhông di động, kỵ khí tuyệt đối và có khả năng sinh bào tử Phát triển dễ dàng trên cácmôi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37ºC, pH 7,6 [2] Lên mensinh hơi các loại đường gulcose, lactose, maltose, sucrose, không lên men đườngmannitol và cho phản ứng Indole (-), Egg yolk (+), Gas (+), Oxidase (-), Urease (-),dung huyết (+), CAMP test (+) [5,9]

C perfringens là loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng, triệu chứng xuất hiện

từ 8- 24h sau khi ăn, kéo dài đến một vài ngày sau đó Có 6 kiểu kháng nguyên được kíhiệu từ A, B, C, D, E, F Trong đó chỉ có kiểu kháng nguyên A gây bệnh cho người,

tố, trong đó có độc tố ruột (Enterotoxin) được sản sinh trong quá trình hình thành nhabào, bản chất là protein gây ra tiêu chảy khi con người ăn phải thức ăn nhiễm độc [11]

C perfringens là một vi khuẩn rất phổ biến, chúng thường nhiễm vào thịt bò và

thịt gà, vịt, nhất là thịt gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa Chúng có thểsống sót ngay khi thực phẩm được nấu ở nhiệt độ (16 - 52)ºC Người bị nhiễm vi khuẩnnày có thể bị tiêu chảy trong vòng 8 đến 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm khuẩn

Ở các nước phương Tây nhiễm C perfringens là nguyên nhân thứ ba về ngộ độc thực

phẩm, phần lớn là do thực phẩm nấu chưa chín [5,17]

Tuy tế bào dinh dưỡng dễ bị tiêu giệt khi được nấu ở trên 60°C nhưng nội bào tửcủa chúng có thể sống sót trong điều kiện khắc nghiệt như bền nhiệt, chịu acid và thậmchí là chất tẩy rửa nên chúng có thể sống sót qua quá trình nấu chín ở nhiệt độ thấp vàthời gian ngắn [5]

1.3.5 Staphylococcus aureus

Hình 1.14 Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử

S aureus là tụ cầu khuẩn có hình chùm nho, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, gram

không chọn lọc, nhiệt độ tối ưu cho phát triển là 37ºC, pH tối thích là 7- 7,5 [2]

Tụ cầu khuẩn được chia thành 2 nhóm: tụ cầu có men coagulase và tụ cầu không

có men coagulase S.aureus là tụ cầu có sinh men coagulase có khả năng làm cho huyết

thanh trở thành dạng đông tụ sợi tơ huyết, coagulase được tạo ra bởi các chủng có độctính cao, tạo rào cản fibrin gây ra tổn thương cấp cục bộ Một trong những lý do

thường dùng thử nghiệm coagulase để xác định S aureus là vì dễ thực hiện và đáng tin

cậy Tế bào vi khuẩn nghi ngờ được trộn với huyết tương thỏ hay người trên ốngnghiệm hoặc trên lam kính, ủ 37ºC và đọc kết quả sau 1giờ đến 3 giờ [10,12]

Hầu hết các dòng S aureus có thể tổng hợp Enterotoxin trong môi trường có

nhiệt độ trên 15ºC, độc tố sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển ở (35 - 37)ºC Tất cả

các dòng S aureus đều có khả năng phát triển trong môi trường lên đến 15% NaCl,

nhạy với Novobiocine và có khả năng gây tan huyết (95%) Có khả năng lên menmannitol, trehalose, sucrose sinh acid, cho phản ứng Catalase (+), Oxidase (-) và cókhả năng đông tụ huyết tương (Coagulase +) [5]

S aureus thường hay thấy trên da và mũi ở khoảng 25% người khỏe mạnh và

động vật, S aureus có thể phát triển trong các loại thực phẩm có muối như chả, kem

tổng hợp, thủy sản Độc tố của chúng có khả năng đề kháng nhiệt và ngay cả nấu chín

cũng rất khó tiêu diệt chúng [5,17] S aureus là một trong năm nguyên nhân chính gây

nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng vế thương sau mổ [12]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Tủ lạnh (4 °C ±3°C): bảo quản môi trường sau khi pha chế, thuốc thử, hóa chất

- Tủ âm (-18°C ±2°C; -70 °C): bảo quản chủng vi sinh vật

Hình 2.2 Dãy tủ lạnh dùng cho bảo quản môi trường, hóa chất

- Tủ An toàn sinh học Cấp 2: tạo khu vực vô trùng cho các thao tác

- Nồi áp suất, bếp đun: đun lỏng môi trường rắn

- Cân, kẹp, muỗng vô trùng

- Máy dập mẫu (stomacher): đồng nhất mẫu ban đầu

- Máy rung (vortex): trộn đều dịch mẫu trong các bước pha loãng

- Túi PE vô trùng: chứa đựng mẫu cho bước đồng nhất

- Đĩa petri vô trùng

- Pipette controller

- Đèn gas: tạo không khí vô trùng và đốt que cấy

- Que cấy vòng, que cấy thẳng và pipette Pasteur

- Buồng tiệt trùng que cấy

Hình 2.5 Máy dập mẫu Hình 2.4 Buồng tiệt trùng que cấy

Hình 2.3 Tủ an toàn sinh học cấp 2

2.2 PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM

2.2.2 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (ISO 4833-1:2013)

 Nguyên tắc :

- Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác địnhtrên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào có mặt trong mẫu vàđược biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc

- Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ thập phân (10-2, 10-3 ) tùy vào tính chất mẫu

- Dùng pipette hút một thể thích mẫu xác định (1 ml) ở mỗi nồng độ pha loãng liên tiếpcho vào các đĩa petri vô trùng, mỗi độ pha loãng ít nhất 2 đĩa

- Đổ khoảng (15 - 20) ml môi trường PCA đã đun nóng chảy và để nguội (44 - 47) ºCvào đĩa petri chứa sẵn dịch khuẩn, xoay đều đĩa cho dàn đều dịch khuẩn trong môitrường Phơi đĩa ở điều kiện phòng cho tới khi thạch đông lại Ủ 30 ± 1°C/72h

n 2 : Số đĩa thực hiện ở nồng độ thứ hai

d: Hệ số pha loãng tương ứng với nồng độ thứ nhất V: Thể tích mẫu phân tích (1ml)

 Sơ đồ quy trình :

Sơ đồ 2.1 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí ở 30°C

1ml 1ml

10-3

Cân 25g mẫu thử + 225 ml dung dịch pha loãng (10-1)

Nghiền 1 phút bằng máy dập mẫu

10-2

Đổ khoảng 12ml - 15ml thạch PCA(Thạch nguội 44°C- 47°C)

Lắc đều, để đông đặc(Nếu cần có thể rót khoảng 4ml Thạch phủ lên bề mặt và để đông đặc)

Đếm tất cả khuẩn lạc trên đĩa thạch(chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 0 < C < 300 khuẩn lạc/đĩa)

30°C ±1°C 72h ± 3h