PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ CHỨA CELLULOSE VÀ LIGNIN TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA, HUYỆN LAI VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN “PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ CHỨA CELLULO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

“PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ CHỨA CELLULOSE VÀ LIGNIN TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA, HUYỆN LAI

VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP”

TSV2014-54

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh học môi trường

Cần Thơ, 12/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

“PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ CHỨA CELLULOSE VÀ LIGNIN TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA, HUYỆN LAI

VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP”

TSV2014-54

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh học môi trường

Sinh viên thực hiện: Võ Thị Ngọc Cẩm

Giới tính: Nữ

Dân tộc: Kinh

Khoa: Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng

Năm thứ: 3 trong tổng số 4 năm đào tạo

Ngành học: Khoa Học Cây Trồng, chuyên ngành: Nông Nghiệp Sạch

Khóa: 38 (2012-2016)

Người hướng dẫn: Ts Nguyễn Khởi Nghĩa, Bộ Môn Khoa Học Đất

Cần Thơ, 12/2014

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG BIỂU iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT vi

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI vii

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN ix

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở trong và ngoài nước 1 1.1.1 Trong nước 1 1.1.2 Ngoài nước 2 1.2 Tính cấp thiết của đề tài 4 1.3 Mục tiêu đề tài 5 1.4 Phương pháp nghiên cứu 5 1.4.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 5 1.4.2 Phương tiện 5 1.4.2.1 Thiết bị thí nghiệm 5 1.4.2.2 Các hóa chất thí nghiệm 5 1.4.3 Phương pháp 6 1.4.3.1 Nội dung nghiên cứu 1: Phân lập một số dòng nấm có tiềm năng phân hủy cellulose và lignin 6 1.4.3.2 Nội dung nghiên cứu 2: Đánh giá khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin trong điều kiện tiệt trùng của 17 dòng nấm phân lập 8 1.4.3.3 Nội dung nghiên cứu 3: Đánh giá khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin trong điều kiện không tiệt trùng của 4 dòng nấm tuyển chọn 10 1.4.3.4 Nội dung nghiên cứu 4: Giải mã trình tự một đoạn gene ITS của 4 dòng nấm tuyển chọn 11 1.5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 13 1.5.1 Đối tượng nghiên cứu 13 1.5.2 Phạm vi nghiên cứu 14 2 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 15 2.1 Đặc tính hóa học của mẫu đất và một số vật liệu hữu cơ thí nghiệm 15

2.2 Kết quả nội dung nghiên cứu 1: Phân lập một số dòng nấm có tiềm năng phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin 16

2.3 Kết quả nội dung nghiên cứu 2: Đánh giá khả năng phân hủy đối với một số vậtliệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin trong điều kiện tiệttrùng của 17 dòng nấm phân lập 19

2.6 Kết quả giải mã trình tự một đoạn gene ITS và xác định ở mức độ loài của bốndòng nấm phân lập thể hiện khả năng phân hủy cao vật liệu hữu cơ chứa cellulose

và lignin 31

3 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 363.1 Kết luận 36

3.2 Kiến nghị36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Một số đặc tính lý và hóa học của mẫu đất thí nghiệm (Phòng phân tích Bộ

Môn Khoa Học Đất, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại HọcCần Thơ) 15

Bảng 2.2 Một số đặc tính hóa học của vật liệu hữu cơ thí nghiệm (Phòng phân tích Bộ

Môn Khoa Học Đất, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại HọcCần Thơ) 16

Bảng 2.3 Một số đặc tính hình thái khuẩn lạc của 17 dòng nấm phân lập từ mẫu đất

thâm canh lúa 16

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sáu vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin dùng trong thí nghiệm 8 Hình 1.2 Sự phát triển sinh khối hai dòng nấm phân lập PH-L5 và PH-L3 trong môi

trường BHM bổ sung 0,5% Malt Extract lỏng sau 3 ngày nuôi cấy 12

Hình 2.1 Hai dạng cuống bào tử nấm điển hình cho 17 dòng nấm phân lập: (A) cuống

bào tử giống Aspergillus sp và (B) cuống bào tử giống Penicillium sp được quan sát

trên kính viển vi ở vật kính 100 17

Hình 2.2 Hai dạng bào tử nấm điển hình cho 17 dòng nấm phân lập: (A) bào tử dạng

hình cầu và (B) bào tử dạng hình hạt lúa được quan sát trên kính viển vi ở vậtkính 100 18

Hình 2.3 Hai dạng sợi nấm điển hình cho 17 dòng nấm phân lập gồm: (A) Sợi nấm có

vách ngăn và (B) Sợi nấm không có vách ngăn được quan sát trên kính hiển vi ở vậtkính 100 18

Hình 2.4 Khả năng phân hủy xác mía trong điều kiện tiệt trùng của 18 dòng nấm thử

nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn) 20

Hình 2.5 Khả năng phân hủy mụn dừa trong điều kiện tiệt trùng của 18 dòng nấm thử

nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn) 21

Hình 2.6 Khả năng phân hủy rơm trong điều kiện tiệt trùng của 18 dòng nấm thử

nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn) 22

Hình 2.7 Khả năng phân hủy đối với vỏ trấu trong điều kiện tiệt trùng của 18 dòng

nấm thử nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn) 23

Hình 2.8 Khả năng phân hủy mùn cưa trong điều kiện tiệt trùng của 18 dòng nấm thử

nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (n=3, độ lệch chuẩn) 24

Hình 2.9 Khả năng phân hủy đối với bã cà phê trong điều kiện tiệt trùng của 18 dòng

nấm thử nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn) 25

Hình 2.10 Khả năng phân hủy mụn dừa và xác mía trong điều kiện không tiệt trùng

của dòng nấm PH-L3 và Trichoderma sp sau 30 ngày nuôi cấy (n=4 và độ lệch

chuẩn) 26

Hình 2.11 Khả năng phân hủy rơm và bã cà phê trong điều kiện không tiệt trùng của

dòng nấm PH-C5 và dòng Trichoderma sp sau 30 ngày nuôi cấy (n=4 và độ lệch

chuẩn) 27

Hình 2.12 Khả năng phân hủy đối với vỏ trấu trong điều kiện không thiệt trùng của

dòng nấm PH-L6 và Trichoderma sp sau 30 ngày nuôi cấy (n=4 và độ lệch chuẩn).

28

Hình 2.13 Khả năng phân hủy đối với mùn cưa trong điều kiện không tiệt trùng của

dòng nấm PH-L4 và Trichoderma sp sau 30 ngày nuôi cấy (n=4 và độ lệch chuẩn)

………29

Hình 2.14 Khả năng phân hủy đối với sáu vật liệu hữu cơ giữa hai điều kiện thí

nghiệm: tiệt trùng và không tiệt trùng sau 30 ngày nuôi cấy của bốn dòng nấm tuyểnchọn 30

Hình 2.15 Một số vật liệu hữu cơ thí nghiệm ở nghiệm thức đối chứng sau 30 ngày

nuôi cấy 31

Hình 2.16 Một số vật liệu hữu cơ thí nghiệm chủng một số dòng nấm tuyển chọn sau

30 ngày nuôi cấy 31

Hình 2.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 4 dòng nấm PH-C5, PH-L6, PH-L3 và

PH-L4 32

Hình 2.18 Kết quả định danh tên loài của dòng nấm PH-C5 theo độ tương đồng của

đoạn gene 18S rRNA 33

Hình 2.19 Kết quả định danh tên loài của dòng nấm PH-L3 theo độ tương đồng của

đoạn gene 18S rRNA 34

Hình 2.20 Kết quả định danh tên loài của dòng nấm PH-L4 theo độ tương đồng của

đoạn gene 18S rRNA 34

Hình 2.21 Kết quả định danh tên loài của dòng nấm PH-L6 theo độ tương đồng của

đoạn gene 18S rRNA 35

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: “Phân lập một số dòng nấm bản địa có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ chứa

cellulose và lignin từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh ĐồngTháp”

- Sinh viên thực hiện: Võ Thị Ngọc Cẩm

- Lớp: Nông Nghiệp Sạch, Khóa 38, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng

- Năm thứ: 3 trong tổng số 4 năm đào tạo

- Người hướng dẫn: Ts Nguyễn Khởi Nghĩa, Bộ Môn Khoa Học Đất

2 Mục tiêu đề tài:

Phân lập một số dòng nấm có khả năng phân hủy một số vật liệu hữu cơ từ phụ phếphẩm nông nghiệp chứa cellulose và lingin từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyệnLai Vung, tỉnh Đồng Tháp

Tuyển chọn và định danh ở mức độ tên loài một số dòng nấm thể hiện khả năng phânhủy cao một số vật liệu hữu cơ từ phụ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin từ các

4 Kết quả nghiên cứu:

Tổng cộng 17 dòng nấm có tiềm năng phân hủy vật liệu hữu cơ từ phụ phế phẩm nôngnghiệp chứa cellulose và lignin được phân lập từ mẫu đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa,huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Kết quả khảo sát và đánh giá khả năng phân hủy của 17dòng nấm phân lập cho thấy như sau: Dòng nấm ký hiệu PH-C5 có khả năng phân hủy caohơn so với các dòng thử nghiệm khác đối với vật liệu rơm lần lượt 47,6% và 38,6% trong điềukiện tiệt trùng và không tiệt trùng, đồng thời, dòng nấm này còn có khả năng phân hủy caohơn so với các dòng khác đối với vật liệu bã cà phê, lần lượt phân hủy 48,1% và 41,1% trongđiều kiện tiệt trùng và không tiệt trùng Trong khi đó, dòng nấm ký hiệu PH-L3 có khả năngphân hủy cao hơn so với các dòng khác đối với xác mía với tỷ lệ lần lượt 46,9% và 32,8%trong điều kiện tiệt trùng và không tiệt trùng, ngoài ra dòng nấm này còn có khả năng phânhủy 37,2% và 30,8%, cao hơn các dòng khác đối với vật liệu mụn dừa lần lượt trong điều kiệntiệt trùng và không tiệt trùng Riêng dòng nấm ký hiệu PH-L4 có khả năng phân hủy cao hơncác dòng khác và lần lượt chiếm 32,9% và 27,6% trọng lượng khô đối với mùn cưa trong điềukiện tiệt trùng và không tiệt trùng Cuối cùng, dòng nấm ký hiệu PH-L6 có khả năng phân hủy

cao hơn các dòng khác với vật liệu vỏ trấu, lần lượt chiếm 50,9% và 32,1% trong điều kiệntiệt trùng và không tiệt trùng Kết quả giải mã trình tự một đoạn gen ITS cho thấy 4 dòng nấm

này lần lượt được định danh tên loài theo thứ tự như sau: Aspergillus fumigatus (PH-C5), Penicillium janthinellum (PH-L3), Aspergillus fumigatus (PH-L4) và Rhizomucor variabilis (PH-L6).

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

Kết quả của nghiên cứu này đóng góp về mặt kinh tế xã hội giúp nông dân xử lý nhanhcác vật liệu hữu cơ có nguồn gốc từ nông nghiệp giúp giảm ô nhiễm môi trường, đồng thờigiúp nông dân giảm chi phí trong sản suất do tận dụng nguồn hữu cơ có sẵn, ngoài ra, giúpnông dân tăng thu nhập thông qua việc sản xuất phân hữu cơ từ phế phẩn nông nghiệp giúpcải thiện dinh dưỡng đất dẫn đến năng suất cây trồng được cải thiện

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài: Bài báo đang chờ xét

duyệt để đăng trên tạp chí Khoa Học Trường Đại Học Cần Thơ

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện đề

tài: Đề tài nghiên cứu khoa học của sinh viên Võ Thị Ngọc Cẩm đóng góp một phần không

nhỏ trong việc tìm ra dòng nấm có khả năng phân hủy cao các vật liệu hữu cơ có nguồn gốc

từ nông nghiệp nhằm xử lý chúng thành phân bón hữu cơ giúp giảm thiểu ô nhiễm môitrường, đồng thời cải thiện dinh dưỡng đất, chất lượng và năng suất cây trồng theo hướngsạch và bền vững cho vùng Đồng bằng sông Cửu Long

Xác nhận của Trường Đại học Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Võ Thị Ngọc Cẩm

Sinh ngày: 10 tháng 02 năm 1993

Nơi sinh: Xã Hòa An, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang

Lớp: Khoa Học Cây Trồng, chuyên ngành: Nông Nghiệp Sạch

Khóa: 38

Khoa: Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng

Địa chỉ liên hệ: Ấp 5, xã Hòa An, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang

Điện thoại: 01627 465 269 Email: camB1205889@student.ctu.edu.vn

1 MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở trong và ngoài nước 1.1.1 Trong nước

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích Glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thểnằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thựcvật Trong gỗ lá kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích Tương tự cellulose, lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ởthực vật bậc cao Ở cây gỗ, lignin chiếm tới 20-30% Trong thành phần của lignin,carbon chiếm tới 69%, hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24% Lignin có cấu trúc vô địnhhình, không tan trong nước và trong acid vô cơ Theo các nghiên cứu trước đây thìtrong vỏ trấu lignin chiếm 26-30% và cellulose chiếm 35-40% Trong khi mùn cưathành phần lignin khoảng 25% và cellulose chiếm tới 55% và đối với bã cà phê thìthành phần lignin và cellulose chiếm lần lượt là 33,6% và 13,8%.Trong mụn dừa thànhphần lignin chiếm 46% và cellulose chiếm 20% (Vũ Thị Bách, 2010) Đối với vật liệuxác mía lignin chiếm 19,95% và cellulose chiếm 46% (Isaias, 1980) Đối với rơm, hàmlượng lignin chiếm 6,48% và cellulose chiếm 7,08% (Đặng Tuyết Phương, 2010).Trong tự nhiên có rất nhiều nhóm vi sinh vật tham gia phân hủy vật liệu hữu cơchứa lignin và cellulose, tuy nhiên, nấm được xem là vi sinh vật chủ yếu tham giaphân giải lignin và cellulose Chúng bao gồm các loài sau: 1) Các dòng nấm thuộc

β-D-nhóm nấm bất toàn: Clasdosporium sp., Heminthosporium sp., Humicola sp.,

Dematium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp., Metarrhizum sp và Gliocladium sp, ; 2)

Các dòng nấm thuộc lớp nấm Đảm: Agaricus sp., Marasmius sp., Pleurotus sp.,

Polyporus sp., Trametes sp., Ustulina sp 3) Một số nấm ăn được trồng trên mùn cưa: Pleurotus sp (nấm bào ngư), Auricularia sp., Polytricha sp (nấm mèo), nấm Trametes

sp Các nấm làm mục gỗ được xếp thành hai nhóm: a) Nhóm nấm làm thối gỗ có màunâu: Là nhóm nấm phân giải cellulose mà không phân giải được lignin và b) Nhómnấm làm thối gỗ có màu trắng: Có thể phân giải cả cellulose lẫn lignin gồm:

Polystictus sp., Armillaaria sp., Polyporus sp., Stereum sp., Ganoderma sp., Pleurotus

sp., Trametes sp., Fomes sp., Ustulina sp (Phạm Văn Kim, 2000) Những vi sinh vật

phát triển trên hợp chất chứa cellulose thường tiết ra các loại enzyme này để phân hủychuyển hóa cellulose (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2003)

Ở Việt Nam một số công trình nghiên cứu về vi sinh vật tham gia vào tiến trìnhphân hủy cellulose và lignin đã được công bố và mang lại giá trị ứng dụng rất đáng kể

Bùi Minh Trí (2014) thực hiện phân lập, đánh giá và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy một

số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy đồng thời lignin và cellulose Kiều NgọcBích (2012) đã phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm hình thái của một sốchủng nấm mốc có khả năng sinh cellulose cao Lê Thị Hồng Mai (1989) nghiên cứu

về khả năng sinh tổng hợp và một số đặc tính của cellulase ở Aspergilus niger trong

môi trường loãng Trong khi đó, Nguyễn Đức Lượng (1996) nghiên cứu tính chất củamột số vi sinh vật có khả năng phân giải cellulase cao và ứng dụng trong công nghệ xử

lý chất thải hữu cơ Theo Nguyễn Đường (1990) thì một số loại nấm sau đây có khả

năng phân hủy tốt lignin như: Polysitctus versicolor, Stereum hisutum, Pholiota sp.,

Clytocye sp

1.1.2 Ngoài nước

Trichoderma là một trong những chi nấm được nghiên cứu nhiều nhất và đặc

biệt là Trichoderma reesei Ưu điểm của dòng nấm này là có hệ enzyme hoạt động rất

mạnh và có khả năng phân giải hoàn toàn cellulose tự nhiên (Markku Saloheimo và

ctv., 2012) Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy nấm Trichoderma sp tổng hợp một

lượng lớn endo-glucanase và exo-glucanase, nhưng chỉ một lượng ít β-glucosidase,

trong khi đó các chủng thuộc giống Aspergillus sp thường sinh ra một lượng lớn

endo-glucanase và β-glucosidase nhưng một lượng ít exo-endo-glucanase (Bothast và Saha,

1997) Exo-glucanase được tạo ra từ Trichoderma sp., Aspergillus sp và Penicillium

sp nhưng nhiều nhất từ Aspergillus sp đặc biệt là Aspergillus niger (Shen và ctv., 2003), trong khi ezyme β-glucosidase được tiết ra nhiều từ Trichoderma sp và

Aspergillus oryzae (Fareeha và ctv., 2011) Enzyme cellulase tiết ra từ Trichoderma reesei thích hợp với khoảng pH = 6 ở nhiệt độ là 40oC (Han và ctv., 2010) Cellulase

thu được từ Aspergillus sp hoạt động tốt ở khoảng pH =7 và ở 30oC (Chandra và ctv.,2012) Deschams và ctv (1985) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của

Trichoderma haianum trên môi trường gồm hỗn hợp rơm lúa mì (80%) và cám (20%)

với ẩm độ 74% và pH 5,8 Trichoderma virde có khả năng phân hủy cellulose khá cao:

80% trong vòng 3 ngày (Lars và ctv., 2005) Một số loài nấm có khả năng sinh ra một

lượng lớn cellulase để phân giải cellulose, phần lớn chúng thuộc giống Alternaria,

Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium… Trong đó hai giống Trichoderma và Aspergillus được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase

(Bothast và Saha, 1997) Theo Mandels và Reese (1964) thì nhiều loài nấm có khảnăng tổng hợp enzyme Cx (exoglucanza), nhưng rất ít loài có khả năng sản sinhenzyme C1 (endogluanase) Trong khi đó, Teho Reese (1984) thì cho rằng C1 là "tiền

nhân tố thủy phân", là enzyme không đặc hiệu, nó làm trương cellulose tự nhiên thànhcác chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn và bị enzyme Cx tiếp tục phân cắt tạothành các đường tan và cuối cùng thành glucose.

Hầu hết nấm phân hủy lignin thuộc chi Basidiomycetes gồm: Phanerochaete

chrysoporium, Phlebia radiata, Trametes versicolor, Bjerkandera adusta, Chrysonilia sitophila, Streptomyces badius và Streptomyces flavovirens (Kirk và Farrell, 1987;

Blanchette, 1991) Ngoài ra, còn một số dòng nấm phân hủy lignin thuộc nhóm

Ascomycetes sp (Duranvà ctv., 1987) và Actiomyces sp (Crawford ctv., 1983;

Ramachandra và ctv., 1987) Ngoài ra, một vài loài nấm sống trong đất và gỗ có khả

năng phân hủy lignin cao như: Paraconiothyrium sp có khả năng sử dụng một số dạng

hợp chất tiêu biểu của lignin sau 40 ngày nuôi cấy với tỷ lệ lignin được phân hủy là

22,99 % (Nilsson và ctv., 2011) Bên cạnh đó, nấm Chrysonilia sitophila làm giảm

59,6% trọng lượng lignin của cây thông trong môi trường lỏng sau 12 ngày, trong khi

đó trên môi trường agar có bổ sung glucose thì tỷ lệ này là 25% trong 3 tháng (Ferraz

và Duran, 1994 và 1995)

Từ các tài liệu tham khảo ở trong và ngoài nước nghiên cứu về phân hủycellulose và lignin bởi các dòng nấm cho thấy ở nước ngoài đã có rất nhiều nghiên cứusâu về phân lập và đánh giá hiệu quả của các dòng nấm lên phân hủy cellulose vàlignin Tuy nhiên, các dòng nấm họ nghiên cứu và phân lập được là những dòng nấm ở

xứ ôn đới có nhiệt độ thấp Do đó, khó có thể áp dụng cho điều kiện của Việt Nam.Thêm vào đó, ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu về phân hủy cellulose và lignin bởi cácdòng nấm Mặc dù ở Việt Nam và đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long có rấtnhiều hệ sinh thái khác nhau, rất đa dạng và phong phú Do đó, sự đa dạng về các dòngnấm bản địa có tiềm năng phân hủy cao cellulose và lignin trên các hệ sinh thái khácnhau là điều tất yếu Tuy nhiên, chúng ta chưa khai thác và nghiên cứu về các dòngnấm bản địa từ các hệ sinh thái khác nhau nhằm ứng dụng vào sự phân hủy chuyênbiệt cellulose và lignin

1.2 Tính cấp thiết của đề tài

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng trọng điểm cho sản xuất nôngnghiệp, đặc biệt là cây lúa Hàng năm sản lượng nông nghiệp và sản lượng nông sảnxuất khẩu gia tăng đáng kể Tuy nhiên, ĐBSCL đang phải đối mặt với vấn đề xử lý vàgiải quyết phế phẩm nông nghiệp trong và sau thu hoạch Chỉ riêng lượng rơm và vỏtrấu hàng năm có khoảng gần chục triệu tấn thải ra trong quá trình thu hoạch và chếbiến gạo, bên cạnh đó, các phế phẩm nông nghiệp khác như: mùn cưa, mụn dừa, xác

mía,…cũng chiếm một lượng rất lớn trong tổng lượng phế phẩm nông nghiệp và cũngđang được tập trung quan tâm để xử lý Với phế phẩm giàu cellulose và lignin này,một lượng rất ít được sử dụng để đun nấu, dùng làm giá thể trồng nấm, làm thức ăncho gia súc, tuy nhiên hiệu quả mang lại chưa cao do chi phí thu gom vận chuyển phếphẩm nông nghiệp tương đối cao so với giá trị sử dụng của chúng nên phần lớn được

xử lý theo phương pháp truyền thống là đốt bỏ hoặc thải trực tiếp ra môi trường bênngoài Điều này không chỉ làm tăng thêm gánh nặng môi trường mà còn làm lãng phí

về các nguồn sinh khối, do đó cần phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối vớiviệc thải các chất thải vào môi trường Việc phân hủy cellulose và lignin bằng phươngpháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường Trong khi

đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose và lignin bằng công nghệ vi sinh làmột biện pháp xử lý chất thải và phế phẩm nông nghiệp hiệu quả, đồng thời còn thânthiện với môi trường sinh thái và sức khỏe người dân Trong công nghệ vi sinh, các visinh vật gồm: nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn…được sử dụng để phân hủy nhanh phế phẩmnông nghiệp và kết quả thu được cuối cùng là compost hoai mục, một dạng phân hữu

cơ vi sinh giúp cải tạo chất lượng đất và trả lại dinh dưỡng cho đất một cách nhanhchóng và tăng năng suất cây trồng Điều này có nghĩa là các chất dinh dưỡng trong phếphẩm nông nghiệp được tái sử dụng đồng thời giúp giảm được lượng rác hữu cơ thải ramôi trường bên ngoài Vì vậy, việc phân lập các dòng nấm có khả năng phân hủynhanh vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin nhằm xử lý phế thải nông nghiệp vùng

ĐBSCL là thật sự cần thiết và cấp bách Do đó, đề tài: “Phân lập một số dòng nấm

bản địa có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp“ được thực

hiện nhằm phân lập và đánh giá hiệu quả phân hủy cellulose và lignin của một số dòng

nấm đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp trong điều kiện tiệt trùng

và không tiệt trùng nhằm chuyển hóa phế thải nông nghiệp thành phân bón hữu cơcung cấp dinh dưỡng cho đất và cây trồng vùng ĐBSCL

1.4 Phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Đề tài được thực hiện từ tháng 06 đến tháng 12 năm 2014.

Công việc khảo sát và thu mẫu đất được thực hiện tại xã Phong Hòa, huyện LaiVung, tỉnh Đồng Tháp

Quy trình phân lập cộng đồng nấm, đánh giá khả năng phân hủy vật liệu hữu cơchứa cellulose và lignin bởi các dòng nấm và quy trình trích DNA thực hiện tại phòngthí nghiệm Sinh Học Đất, Bộ môn Khoa Học Đất, Khoa Nông Nghiệp & Sinh HọcỨng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

1.4.2.2 Các hóa chất thí nghiệm

Hóa chất trích DNA của nấm: CTAB 3%, Chloroform, Isopropanol và Ethanol;hóa chất thực hiện phản ứng PCR: sử dụng các hóa chất trong bộ kit PCR bao gồm:Hỗn hợp Go Taq Green Master Mix (Promega), Primer reverse 27F (5' AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG 3'), Primer forward 907R (5' CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT 3') và nước (không có chứa DNA); hóa chất điện di trên gel Agarose kiểm trasản phẩm PCR gồm: Agarose 1% - 1,5% (Merck), TAE buffer 0,5X, Loading buffer(chất chỉ thị màu-LB), Ethidium bromide (chất chỉ thị huỳnh quang - EtBr), thangchuẩn DNA 100 bp plus và 100 bp (Fermentas)

Các loại hóa chất để nuôi cấy vi sinh vật gồm: Môi trường Bushnell HaasMedium (BHM), Carboxymethyl cellulose (CMC), CaCl2, K2HPO4, KH2PO4,

Na2HPO4, NH4NO3, MgSO4.7H2O, Bacto Agar và Malt Extract

Công thức môi trường BHM trong 1 lít như sau: 5g CMC hoặc lignin, 0,2gMgSO4 x7H2O, 1g K2HPO4, 1g KH2PO4, 1g NH4NO3, 0,05g FeCl3x6H2O và 0,02gCaCl2

thâm canh lúa có tiềm năng phân hủy cellulose và lignin.

a Quy trình thu mẫu đất

Mẫu đất dùng cho phân lập một số dòng nấm có tiềm năng phân hủy cellulose vàlignin được thu từ ruộng thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh ĐồngTháp Dùng khoan lấy mẫu ở độ sâu 0-20 cm, lấy 5 mẫu khoan, sau đó các mẫu đượctrộn đều thành một mẫu đại diện Mẫu đất đem về được phơi ở nhiệt độ phòng thínghiệm, sau đó nghiền qua rây 0,2 mm Một lượng mẫu đất khoảng 300 g sau khi xử

lý được gửi đi phân tích các chỉ tiêu hóa và lý học đất như: Sa cấu đất (cát, thịt và sét),

pH, chất hữu cơ, N tổng số, P tổng số và K tổng số

b Quy trình phân lập nấm có tiềm năng phân hủy cellulose và lignin

Cân 1g đất (trọng lượng khô kiệt) vào bình tam giác 100 mL tiệt trùng chứa 25

mL môi trường Bushnell Haas Medium (BHM) bổ sung CMC hoặc lignin như lànguồn carbon duy nhất cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển Môi trường BHMđược tiệt trùng trong 20 phút ở 121oC trong nồi hấp tiệt trùng Sau khi tiệt trùng,Nystatin với nồng độ 30 mg mL-1 cho vào môi trường dùng để phân lập nấm nhằmngăn cản sự phát triển của vi khuẩn Bình tam giác chứa đất và môi trường nuôi đượcđặt trên máy lắc với tốc độ 100 rpm ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm và để trongtối Quan sát sự phát triển của nấm trong môi trường nuôi cấy thường xuyên Khi thấynấm phát triển tốt, tiến hành hút 1 mL môi trường nuôi cấy chứa nấm vào trong bìnhtam giác tiệt trùng chứa 24 mL môi trường BHM mới và tiếp tục lắc trên máy lắc.Toàn bộ quy trình làm giàu mật số nấm có khả năng phân hủy cellulose và lignin trongmôi trường lỏng được lặp lại 5 lần Sau 5 lần nuôi cấy liên tục, 0,1 mL môi trườngnuôi cấy chứa nấm với các nồng độ pha loãng khác nhau (hệ số pha loãng là 10) đượctrải lên trên bề mặt môi trường agar BHM chứa CMC hoặc lignin như là nguồn carbon(15g agar/1 lít môi trường) để tách ròng và có được dòng thuần Sau 5 lần tách ròng vàlàm tinh sạch trên môi trường agar BHM có bổ sung CMC hoặc lignin, các dòng nấmphân lập được xem như là các dòng thuần và tiến hành khảo sát các đặc tính về hìnhthái và tế bào với các đặc tính như sau:

- Kích thước khuẩn lạc của nấm: là kích thước trung bình của đường kính khuẩnlạc của nấm (cm)

- Màu sắc sợi nấm: là màu sắc của tơ nấm phát triển trên đĩa agar

- Màu mặt sau khuẩn lạc: là màu sắc phía dưới khuẩn lạc bằng cách nhìn bêndưới đĩa agar

- Sắc tố hòa tan: là sắc tố khuếch tán vào môi trường agar nằm ở bờ rìa của khuẩnlạc.

- Dạng bào tử, sợi nấm, và cuống bào tử được quan sát trên kính hiển vi Mẫu vậtcủa nấm được chuẩn bị bằng phương pháp slide culture technique và được mô tả nhưsau:

Đặt giấy lọc hình tròn vào đĩa Petri, tiếp tục đặt 2 que tăm vị trí song song lêntrên giấy lọc, nhỏ nước khử khoáng tiệt trùng lên trên bề mặt giấy lọc cho đến khinước thấm đều khắp bề mặt giấy, đặt slide thủy tinh lên trên 2 que tăm, đặt một khốimôi trường agar BHM bổ sung 0,5% Malt Extract với kích thước (2 cm x 2 cm) lêntrên slide thủy tinh, tiếp theo cấy sợi nấm đang phát triển tốt trên môi trường agarBHM bổ sung 0,5% Malt Extract vào khối agar và sau đó, đậy glass cover lên trênkhối agar đã chủng nấm Dán parafilm bên ngoài để tránh nhiễm mẫu Đĩa Petri đượcđặt trong tối trong điều kiện phòng thí nghiệm trong 5 ngày Tất cả dụng cụ đều đượctiệt trùng khô ở nhiệt độ 175oC trong 2 giờ Trước khi quan sát trên kính hiển vi, lấyglass cover có chứa sợi nấm, bào tử và cuống bào tử ra khỏi đĩa Petri, nhỏ 1 giọtAlcohol 95% lên trên bề mặt glass cover, đợi đến khi Alcohol bốc hơi hoàn toàn, đặtglass cover lên trên slide thủy tinh có nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm Fuchsin acid 0,1% vàtiến hành xem trên kính hiển vi về hình thái sợi nấm, bào tử và cuống bào tử

1.4.3.2 Nội dung nghiên cứu 2: Đánh giá khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin trong điều kiện tiệt trùng của 17 dòng nấm phân lập

Mục tiêu của nội dung nghiên cứu 2 nhằm đánh giá khả năng phân hủy một sốvật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin trong điều kiện tiệt trùng của 17 dòng nấmphân lập và đồng thời so sánh khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơ của

17 dòng nấm phân lập này với dòng nấm Trichoderma sp (sản phẩm thương mại của

Đại học Cần Thơ) được sử dụng làm dòng nấm tham khảo (đối chứng dương)

a Nguồn vật liệu hữu cơ

Sáu vật liệu hữu cơ dùng cho thí nghiệm gồm: rơm, xác mía, mụn dừa, mùn cưa,

bã cà phê và vỏ trấu là những phế phẩm nông nghiệp được thu thập cho bố trí thínghiệm Rơm và xác mía được cắt thành đoạn ngắn khoảng 2 cm Tất cả các vật liệuhữu cơ thí nghiệm được rửa sạch với nước vòi 4 lần, sau đó rửa lại 2 lần với nước cất,trải mỏng và để khô trong điều kiện phòng thí nghiệm Sau đó, hiệu chỉnh đến 80% ẩm

độ của vật liệu thí nghiệm (Hình 1.1) Một số đặc tính hóa học của vật liệu hữu cơ sửdụng trong thí nghiệm được phân tích bao gồm: C tổng số, N tổng số, P tổng số và Ktổng số

Hình 1.1 Sáu vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin dùng trong thí nghiệm.

b Nguồn nấm

Tổng cộng 17 dòng nấm được phân lập từ 2 môi trường nuôi cấy bổ sung CMC

và lignin Trong đó, tổng cộng 11 dòng nấm được phân lập từ môi trường BHM bổsung CMC như là nguồn carbon duy nhất ký hiệu: PH-C1, PH-C2, PH-C3, PH-C4,PH-C5, PH-C6, PH-C7, PH-C8, PH-C9, PH-C10 và PH-C11 Tổng cộng 6 dòng nấmđược phân lập từ môi trường BHM bổ sung lignin như là nguồn carbon duy nhất kýhiệu: PH-L1, PH-L2, PH-L3, PH-L4, PH-L5 và PH-L6 Thêm vào đó, dòng nấm

Trichoderma sp từ sản phẩm thương mại của Đại Học Cần Thơ được chọn như là

dòng nấm tham khảo đối chứng dương vì dòng nấm này được cho là dòng có khả năngphân hủy các vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp rất hiệu quả và đang được bánrộng rãi trên thị trường Những dòng nấm này đã được tách ròng, tinh sạch và đượcnuôi cấy trong môi trường agar BHM bổ sung 0,5% Malt Extract trong 3 ngày Sau đódùng ống cắt agar hình trụ đường kính 0,6 cm đã tiệt trùng để cắt phần agar có sợi nấmđang phát triển tốt làm nguồn nấm cho thí nghiệm

c Bố trí thí nghiệm

Quy trình bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy một số vật liệu hữu cơ từphế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin bởi 18 dòng nấm được thực hiện trongđiều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm Quy trình được thực hiện như sau: Cân 16 g, 9 g,

5 g, 7 g, 17 g, và 18 g lần lượt các vật liệu hữu cơ gồm: mía, mụn dừa, rơm, trấu, mùncưa và bã cà phê (trọng lượng khô) sau khi rửa sạch và hiệu chỉnh ẩm độ về 80% cho

vào đĩa petri Sau đó tiệt trùng 3 lần trong nồi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 20phút Sau khi tiệt trùng, đặt 5 khối agar chứa nguồn nấm phát triển tốt (được chuẩn bị

từ mục 1.4.3.2b) tiếp xúc với vật liệu hữu cơ ở vị trí 4 góc và trung tâm đĩa petri, dán

parafilm bên ngoài mỗi đĩa petri để tránh nhiễm mẫu Nghiệm thức đối chứng đượcthực hiện tương tự như các nghiệm thức khác, tuy nhiên, không có dòng nấm nào đượcchủng vào vật liệu hữu cơ Thí nghiệm được bố trí với 3 lần lặp lại cho mỗi dòng nấmthử nghiệm đối với mỗi vật liệu và kéo dài trong 30 ngày

d Các chỉ tiêu theo dõi

Sau 30 ngày nuôi cấy, các đĩa Petri chứa mẫu vật liệu hữu cơ thí nghiệm đượcsấy ở nhiệt độ 105ºC trong 5 giờ trong tủ sấy, cân để xác định trọng lượng giảm đi sauthời gian nuôi cấy của vật liệu hữu cơ thí nghiệm Công thức tính khả năng phân hủy:(Khối lượng ban đầu – Khối lượng lúc sau)/Khối lượng ban đầu x 100

1.4.3.3 Nội dung nghiên cứu 3: Đánh giá khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin trong điều kiện không tiệt trùng của 4 dòng nấm tuyển chọn

Mục tiêu của nội dung nghiên cứu 3 nhằm đánh giá khả năng phân hủy đối vớimột số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin trong điềukiện không tiệt trùng của 4 dòng nấm tuyển chọn từ nội dung nghiên cứu 2, đồng thời

so sánh khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơ của 4 dòng nấm tuyển chọn

này với dòng nấm Trichoderma sp (sản phẩm thương mại của Đại học Cần Thơ) được

sử dụng làm dòng nấm tham khảo (đối chứng dương)

a Nguồn vật liệu hữu cơ

Tham khảo mục 1.4.3.2a.

b Nguồn nấm

Dòng PH-C5, PH-L4, PH-L3 và PH-L6 là 4 dòng nấm được tuyển chọn từ tổng

số 17 dòng nấm đã được phân lập để thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủyđối với một số vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin trong điều kiện không tiệttrùng Do dòng nấm ký hiệu PH-C5 thể hiện khả năng phân hủy cao hơn ở cả hai vậtliệu: rơm và bã cà phê so với các dòng nấm khác ở nội dung nghiên cứu 2 nên PH-C5được chọn để bố trí thí nghiệm phân hủy cho cả rơm và bã cà phê trong điều kiệnkhông tiệt trùng Tương tự, dòng nấm PH-L3 do phân hủy cao cả mụn dừa và xác míatrong nội dung nghiên cứu 2, nên được chọn bố trí thí nghiệm với cả hai vật liệu nàytrong điều kiện không tiệt trùng Hai dòng nấm ký hiệu PH-L4 và PH-L6 lần lượt thể

hiện khả năng phân hủy mùn cưa và vỏ trấu cao hơn so với các dòng nấm khác trongnội dung nghiên cứu 2, nên được chọn để bố trí thí nghiệm với hai vật liệu này trongđiều kiện không tiệt trùng Cách chuẩn bị nguồn nấm cho bố trí thí nghiệm, tham khảo

mục 1.4.3.2b.

c Bố trí thí nghiệm

Quy trình bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy một số vật liệu hữu cơ từphế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin bởi 4 dòng nấm tuyển chọn trong điềukiện không tiệt trùng được thực hiện trong phòng thí nghiệm Quy trình được thựchiện như sau: Cân 16 g, 9 g, 5 g, 7g, 17 g và 18 g lần lượt các vật liệu hữu cơ gồm:mía, mụn dừa, rơm, trấu, mùn cưa và bã cà phê (trọng lượng khô) sau khi rửa sạch vàhiệu chỉnh ẩm độ về 80% cho vào đĩa petri Đặt 5 khối agar chứa nguồn nấm phát triển

tốt (được chuẩn bị từ mục 1.4.3.2b) tiếp xúc với vật liệu hữu cơ ở vị trí 4 góc và trung

tâm đĩa petri, dán parafilm bên ngoài mỗi đĩa petri để tránh nhiễm mẫu Nghiệm thứcđối chứng được thực hiện tương tự như các nghiệm thức khác, tuy nhiên, không códòng nấm nào được chủng vào vật liệu hữu cơ Thí nghiệm được bố trí với 4 lần lặp lạicho mỗi dòng nấm thử nghiệm đối với mỗi vật liệu và kéo dài trong 30 ngày

d Chỉ tiêu theo dõi

* Ly trích DNA của nấm

Cho 25 mL môi trường BHM bổ sung 0,5% Malt Extract vào bình tam giác 100

mL sau đó tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút Sau khi tiệt trùng xong, cho khối agarBHM bổ sung 0,5% Malt Extract có chứa sợi nấm đang phát triển tốt vào bình tamgiác Tiến hành thu sinh khối nấm sau 3 ngày nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 100 rpm

và để trong tối (Hình 1.2)

Hình 1.2 Sự phát triển sinh khối hai dòng nấm phân lập PH-L5 và PH-L3 trong môi trường

BHM bổ sung 0,5% Malt Extract lỏng sau 3 ngày nuôi cấy

DNA của nấm được tách chiết bằng cách sử dụng CTAB 3% theo quy trình củaIhrmark và ctv (2012) Cân 0,45 g cát mịn sạch cho vào Eppendorf 1,5 mL sau đó tiệttrùng Thu sinh khối nấm sau 3 ngày nuôi cấy cho vào Eppendorf 1,5 mL chứa cát đãtiệt trùng Hút 1 mL CTAB 3% cho vào Eppendorf, sau đó dùng que chuyên biệt khửtrùng nghiền sinh khối nấm với cát Vortex đều mẫu, sau đó ủ ở 65oC trong 1 giờ (lưuý: cách 15 phút lắc đều mẫu) Sau khi ủ, mẫu được ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong

10 phút Hút 700 µL dịch trong bên trên cho vào Eppendorf 1,5 mL mới, cho thêm 500

µL chloroform vào, vortex nhanh và đều để tăng sự tiếp xúc của mẫu với chloroform

Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 8 phút Hút 500 µL dịch trong nằm ở trên cho vàoEppendorf 1,5 mL mới Kết tủa DNA bằng 750 µL isopropanol lạnh, trữ -20oC trong

30 phút Ly tâm mẫu ở tốc độ 13.000 rpm trong 30 phút Cẩn thận loại bỏ isopropanol.Tiếp tục làm sạch DNA thu được bằng 200 µL ethanol lạnh Ly tâm ở tốc độ 6.500 rpmtrong 5 phút Loại bỏ ethanol và mẫu được để qua đêm ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.Sau đó, cho thêm 100 µL TE buffer vào để trữ mẫu và cuối cùng mẫu được trữ vào tủđông ở -20oC cho các công việc sau

* Thực hiện phản ứng khuếch đại chuỗi trình tự (PCR)

DNA của các dòng nấm được chạy PCR với cặp mồi ITS 1FF/ITS4 (Do ThiXuan, 2012) nhắm vào vùng ITS Phản ứng PCR bao gồm (thể tích/1 phản ứng): 5 µLDream taq buffer (5x); 0,5 µL mồi xuôi ITS 1F (10 µM); 0,5 µL mồi ngược ITS 4 (10µM); 10 µL DNA tinh sạch được pha loãng 50 lần; 5,625 µL nước (không có DNA);0,5 µL dNTP (10 mM); 2,75 µL MgCl2 (25 mM) và 0,125 µL Dream taq (5 U/µL).Phản ứng PCR được thực hiện với chương trình nhiệt: Bước 1: 94oC trong 5 phút;Bước 2: 35 chu kỳ với: 94oC trong 30 giây; 55oC trong 30 giây và 72oC trong 30 giây,

và Bước 3: 72oC trong 7 phút

Sản phẩm PCR được cho vào các giếng trên gel agarose và thực hiện chạy điện di

để kiểm tra chất lượng DNA của các mẫu trước khi giải trình tự

PH-L5

L3

PH-* Điện di sản phẩm phản ứng PCR

- Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5% (Merck)

Cân 1,5 g agarose cho vào bình nắp xanh 250 mL, thêm 100 mL dung dịch TAE1X Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng khoảng 1 phút cho agarose hòa tan hoàntoàn Dung dịch agarose để nguội khoảng 50oC Sau đó, đổ nhẹ dung dịch vào khuôn

đã chuẩn bị sẵn, để khuôn nguội khoảng 30 phút cho gel đặc lại, sau đó, lấy lược rakhỏi khuôn

- Bước 2: Chạy điện di trên gel agarose

Đặt gel vào bể điện di chứa TAE buffer 1X (sao cho TAE buffer ngập bề mặt gel).Cho 4 μL thang chuẩn và sản phẩm trích DNA của nấm vào giếng của gel cùng vớiloading dye Bật nguồn điện, cho thiết bị chạy ở 130 V, 400 mA trong 45 phút Sau khichạy điện di, gel agarose được nhuộm với Ethium Bromide (nồng độ 15µl-20µl/400ml) trong 20 phút

- Bước 3: Chụp hình gel đã chạy điện di

Sau khi mẫu được điện di xong, quan sát sản phẩm PCR thông qua các băngDNA xuất hiện trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Logic 1500 Imaging System củaKodak

Các sản phẩm PCR có vạch DNA đậm và rõ trên gel agarose sẽ được gửi giải mãtrình tự gene tại công ty Macrogen, Hàn Quốc Từ kết quả giải trình tự, các trình tựnày sẽ được so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gene NCBI

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để xác định tên loài của bốn dòng nấm khảo sát

1.5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.5.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các dòng nấm bản địa trong nền đất thâm canhlúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp có tiềm năng phân hủy một sốvật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin

1.5.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi nghiên cứu chính của đề tài là mẫu đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa,huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Do đối tượng nghiên cứu là nấm và nội dung nghiêncứu đi sâu vào vi sinh, sinh hóa và sinh học phân tử nên các hoạt động nghiên cứu của

đề tài thuộc lĩnh vực vi sinh môi trường, công nghệ sinh học ứng dụng, sinh hóa vàmôi trường

2 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

2.1 Đặc tính hóa học của mẫu đất và một số vật liệu hữu cơ thí nghiệm

Kết quả phân tích một số đặc tính lý, hóa học đất được trình bày trong Bảng 2.1cho thấy mẫu đất lúa dùng phân lập nấm có thành phần sa cấu chủ yếu là thịt 49,9% vàsét 48,0% Giá trị pH là 5,2, các thành phần N, P, K tương đối thấp Tỷ lệ % chất hữu

cơ tương đối cao (5,36%) Điều này chứng tỏ mẫu đất này là môi trường thích hợpcho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển tốt trong đó có cộng đồng nấm phân hủy chấthữu cơ chứa cellulose và lignin

Bảng 2.1 Một số đặc tính lý và hóa học của mẫu đất thí nghiệm (Phòng phân tích Bộ

Môn Khoa Học Đất, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, TrườngĐại Học Cần Thơ)

Cát (%)

Sa cấu Thịt (%) Sét (%)

PH 5,2 0,27 0,072 1,21 5,36 2,10 49,9 48,0

Kết quả phân tích một số đặc tính hóa học của một số vật liệu hữu cơ dùng trongthí nghiệm được trình bày trong Bảng 2.2 Kết quả cho thấy: trong các vật liệu hữu cơthí nghiệm, bã cà phê có thành phần dinh dưỡng cao nhất thông qua các thông số sauđây: 1) Có hàm lượng carbon tổng số cao nhất (62,64%); 2) Hàm lượng đạm tổng sốcao nhất, chiếm 2,44% và 3) Hàm lượng lân tổng số cao nhất, chiếm 0,47% và 4) Tỷ lệC:N là 26 Điều này cho thấy bã cà phê có hàm lượng dinh dưỡng hữu dụng rất caocho cây trồng, đặc biệt là đạm và lân Trong khi đó, các vật liệu hữu cơ còn lại như:xác mía, vỏ trấu, mụn dừa, rơm và mùn cưa chứa chủ yếu hàm lượng carbon (chiếmtrên 40%), trong khi các thành phần dinh dưỡng khác rất thấp Các vật liệu hữu cơ này

có tỷ lệ C:N rất cao, dao động từ khoảng 66 – 231 Do đó, việc xử lý nhằm làm giảm

tỷ lệ C:N của các vật liệu này thông qua việc ủ compost là rất cần thiết

Bảng 2.2 Một số đặc tính hóa học của vật liệu hữu cơ thí nghiệm (Phòng phân tích Bộ

Môn Khoa Học Đất, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường

2.44 0.25 0.36 0.38

0.47 0.13 0.13 0.12

0.94 0.08 0.40 0.77

26 231 120 159

có tiềm năng phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin Trong đó, tổng cộng

11 dòng nấm được phân lập từ môi trường BHM bổ sung CMC như là nguồn carbonduy nhất ký hiệu: PH-C1, PH-C2, PH-C3, PH-C4, PH-C5, PH-C6, PH-C7, PH-C8,PH-C9, PH-C10, và PH-C11 và tổng cộng 6 dòng nấm được phân lập từ môi trườngBHM bổ sung lignin như là nguồn carbon duy nhất ký hiệu: PH-L1, PH-L2, PH-L3,PH-L4, PH-L5 và PH-L6 Một số đặc tính hình thái khuẩn lạc của 17 dòng nấm phânlập này được trình bày ở Bảng 2.3

Bảng 2.3 Một số đặc tính hình thái khuẩn lạc của 17 dòng nấm phân lập từ mẫu đất

thâm canh lúa.

lạc

Màu khuẩn lạc ở mặt dưới đĩa petri

Đường kính khuẩn lạc (cm)

1 PH-C1 Màu xanh nhạt, nhiều bào tử

xung quanh Xanh nhạt 2,3

2 PH-C2 Màu xanh đen, nhiều bào tử xung

quanh Vàng đậm 2,0

3 PH-C3 Màu trắng và nhô lên, dạng tròn Vàng nhạt 2,2

4 PH-C4 Màu xanh xám, nhiều bào tử

xung quanh Xanh đậm 5,7

5 PH-C5 Màu xám, dạng tròn, không nhô Xám 5,8

6 PH-C6 Màu xanh đậm, nhiều bào tử

xung quanh, không nhô Vàng nâu 2,0

7 PH-C7 Màu trắng, ít bào tử rơi ra, dạng

tròn Vàng nhạt 3,1

8 PH-C8 Màu vàng rơm, nhiều bào tử xung quanh Xanh nhạt 1,6

9 PH-C9 Màu trắng xanh ít bào tử xung quanh Xanh nhạt 5,6

10 PH-C10 Màu xanh đậm, nhiều bào tử

xung quanh Trắng xanh 2,1

11 PH-C11 Màu xanh đen, ít bào tử Vàng đậm 6,2

12 PH-L1 Màu trắng, đầu sợi nấm màu đen và nhô lên, nhiều bào tử Vàng nhạt 5,5

13 PH-L2 Màu trắng viền xanh thành vòng tròn Xanh nhạt 2,3

14 PH-L3 Màu xanh xám, tròn, không nhô Trắng đục 1,7

15 PH-L4 Màu xanh xám nhiều bào tử Xanh đen 2,5

16 PH-L5 Màu xám đen, nhiều bào tử Trắng đục 1,9

17 PH-L6 Màu vàng cam và nhô lên Vàng cam 9,0

Kết quả quan sát hình thái cuống bào tử nấm trên kính hiển vi cho thấy 17 dòng nấm phân lập được phân loại và nhận dạng với mức độ giống (chi) theo 2 nhóm như

sau: Nhóm 1: giống Aspergillus sp gồm 11 dòng mang ký hiệu: C1; C2;

PH-C3; PH-C4; PH-C5; PH-C7; PH-C10; PH-C11; PH-L1; PH-L4 và PH-L5 và nhóm 2:

giống Penicillium sp gồm 6 dòng mang ký hiệu: C6; L6; C8; C9;

PH-L2 và PH-L3 (Hình 2.1)

Hình 2.1 Hai dạng cuống bào tử nấm điển hình cho 17 dòng nấm phân lập: (A) cuống bào tử

giống Aspergillus sp và (B) cuống bào tử giống Penicillium sp được quan sát trên

kính viển vi ở vật kính 100

Kết quả về hình thái tế bào của bào tử nấm cho thấy có 2 dạng bào tử chính của

17 dòng nấm phân lập là: hình cầu và hình hạt lúa (Hình 2.2): Nhóm 1: dạng bào tửhình cầu gồm có 14 dòng nấm kí hiệu: PH-C1; PH-C2; PH-C3; PH-C4; PH-C6; PH-L6; PH-C8; PH-C10; PH-C11; PH-L1; PH-L2; PH-L3; PH-L4 và PH-L5 và nhóm 2:dạng bào tử hình hạt lúa gồm có 3 dòng nấm mang kí hiệu: PH-C5; PH-C7 và PH-C9

Hình 2.2 Hai dạng bào tử nấm điển hình cho 17 dòng nấm phân lập: (A) bào tử dạng hình

cầu và (B) bào tử dạng hình hạt lúa được quan sát trên kính viển vi ở vật kính 100

Kết quả quan sát trên kính hiển vi về hình thái sợi nấm của 17 dòng nấm phân lậpcho thấy sợi nấm không có mấu và được chia làm 2 nhóm dựa vào thông số có haykhông có vách ngăn (Hình 2.3) như sau: Nhóm 1: Sợi nấm có vách ngăn gồm: 16 dòngnấm ký hiệu: PH-C1; PH-C2; PH-C3; PH-C4; PH-C5; PH-C6; PH-L6; PH-C8; PH-C9; PH-C10; PH-C11; PH-L1; PH-L2; PH-L3; PH-L4 và PH-L5 và nhóm 2: Sợi nấmkhông có vách ngăn chỉ có một dòng nấm kí hiệu: PH-C7

Hình 2.3 Hai dạng sợi nấm điển hình cho 17 dòng nấm phân lập gồm: (A) Sợi nấm có vách

ngăn và (B) Sợi nấm không có vách ngăn được quan sát trên kính hiển vi ở vậtkính 100

2.3 Kết quả nội dung nghiên cứu 2: Đánh giá khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose và lignin trong điều kiện tiệt trùng của 17 dòng nấm phân lập

Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy đối với một số vật liệu hữu cơchứa cellulose và lignin trong điều kiện tiệt trùng cho thấy tất cả 17 dòng nấm phânlập từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp cókhả năng phân hủy một số vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin và đều khác biệt ý

nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng Điều này cho thấy vai trò quan trọngcủa vi sinh vật mà trong đó đặc biệt là cộng đồng nấm trong hệ sinh thái đất tham giavào việc phân hủy các vật liệu hữu cơ từ phế phẩm nông nghiệp.

2.3.1 Xác mía

Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy đối với vật liệu hữu cơ xác mía

sau 30 ngày của 17 dòng nấm phân lập và dòng nấm Trichoderma sp (sản phẩm của

Đại Học Cần Thơ) được trình bày ở Hình 2.4 Nhìn chung, tất cả 17 dòng nấm thửnghiệm đều có khả năng phân hủy xác mía rất cao, dao động từ 33,2% đến 46,9% vàđều khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng Dòng nấm PH-L3 có phần trăm phân hủy xác mía cao hơn các dòng khác, chiếm 46,9% Riêng dòng

nấm Trichoderma sp phân hủy 35,1% trọng lượng xác mía khô sau 30 ngày thí

nghiệm, thấp hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với dòng nấm PH-L3 Tóm lại, kếtquả thí nghiệm này cho thấy tất cả 17 dòng nấm phân lập và thử nghiệm đều có khảnăng phân hủy cao xác mía và dòng nấm PH-L3 là dòng có khả năng phân hủy cao đối

với vật liệu xác mía, cao hơn so với dòng nấm đối chứng dương, Trichoderma sp., do

đó, được chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo về phân hủy xác mía trong điều kiệnthí nghiệm không tiệt trùng

Hình 2.4 Khả năng phân hủy xác mía trong điều kiện tiệt trùng của 18 dòng nấm thử nghiệm

sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn)