NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN HÒA TAN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA TỪ THỊT CÁ LÓC NUÔI

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân protein hòa tan được trích ly từ thịt cá lóc nuôi bằng enzyme alcalase nhằm tạo ra sản phẩm có khả năng kháng oxy hóa cao. Trên cơ sở mục tiêu chính đã đề ra, đề tài tiến hành các nội dung nghiên cứu chủ yếu sau: Xác định hiệu quả thu nhận protein hòa tan từ thịt cá lóc. Xác định hoạt tính enzyme alcalase bổ sung, thời gian, nhiệt độ và pH thích hợp cho quá trình thủy phân protein hòa tan tạo sản phẩm có hiệu quả kháng oxy hóa cao.

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN PHI VÂN

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN HÒA TAN

CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA

TỪ THỊT CÁ LÓC NUÔI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2017

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN PHI VÂN MSSV: B1306444

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN HÒA TAN

CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA

2017

LỜI CÁM ƠN

Trải qua những năm tháng học tập và rèn luyện dưới mái trường Đạihọc Cần Thơ Thầy Cô là người đã dành bao tâm huyết cho sự nghiệp trồngngười, đã trang bị những hành trang quí báu cho chúng em vững bước vàođời Nhờ sự yêu thương chỉ bảo của Thầy Cô cùng với sự phấn đấu của bảnthân, hôm nay em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, quý

Thầy Cô Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, quý Thầy Cô Bộ mônCông nghệ thực phẩm đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt thờigian học tập

Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Văn Mười, người luôntheo sát hướng dẫn tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu, đã chỉdẫn, cung cấp những kiến thức cần thiết giúp em hoàn thành đề tài này.Xin chân thành cảm ơn Cô Trần Thanh Trúc, cố vấn học tập lớp Côngnghệ thực phẩm K39 A1, người Cô luôn hết mình quan tâm, lo lắng và giúp

đỡ sinh viên chúng tôi trong suốt quá trình học tập

Con xin gửi lời cảm ơn thành kính đến Ba Mẹ và gia đình đã là chỗdựa vững chắc cho con vượt qua khó khăn

Cám ơn anh Võ Hoàng Ngân - nghiên cứu sinh ngành Công nghệ thựcphẩm đã truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ tận tình về kiến thức cũngnhư phương pháp học tập và nghiên cứu

Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị nghiên cứu sinh, anh chị học viêncao học khóa 22 phòng thí nghiệm D006 và các bạn lớp Công nghệ thựcphẩm K39 đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ nhau trong quá trình thực hiệnnghiên cứu

Lời cuối, xin được kính chúc quý Thầy, Cô của Bộ môn Công nghệthực phẩm luôn công tác tốt và tìm được nhiều niềm vui trong công việc.Chúc các bạn lớp Công nghệ thực phẩm khóa 39 thành công sau khi tốtnghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Phi Vân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung, số liệu được trình bày trong luậnvăn này là công trình nghiên cứu của tôi theo sự hướng dẫn của PGS TS.Nguyễn Văn Mười và các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất

cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày 15 tháng 5 năm 2017Giảng viên hướng dẫn Người viết

PGS TS Nguyễn Văn Mười

Nguyễn Phi Vân

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả thủy phânprotein hòa tan được trích ly từ thịt cá lóc nuôi để tạo ra sản phẩm có khảnăng kháng oxy hóa thông qua khả năng thu nhận gốc tự do DPPH bằngenzyme thương mại alcalase (Novozyme) Trong phạm vi nghiên cứu, đềtài đã tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme alcalase bổ sung và thời gianthủy phân thích hợp, ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, pH của quá trìnhthủy phân đến khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm protein thủy phân thuđược Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch protein thủy phân từ thịt cá lóc đạthiệu suất thủy phân là 33,56%, khả năng thu nhận gốc tự do cao nhất là29,1% khi tiến hành thủy phân protein hòa tan ở nhiệt độ thủy phân 55ºC,

pH 8, hoạt tính enzyme alcalase bổ sung và thời gian thủy phân tương ứng

là 3.000 U/g protein và 4 giờ Khả năng thu nhận gốc tự do DPPH cao chothấy tiềm năng rất lớn của việc phát triển các sản phẩm thủy phân proteinhòa tan từ thịt cá lóc có khả năng kháng oxy hóa

Từ khóa: cá lóc, enzyme alcalase, kháng oxy hóa, protein hòa tan,

thủy phân.

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nguyên liệu 3

2.1.1 Giới thiệu chung về cá lóc 3

2.1.2 Tình hình nuôi cá lóc ở Việt Nam 4

2.1.3 Thành phần dinh dưỡng của cá lóc 5

2.2 Tổng quan về protein thủy sản 7

2.2.1 Sơ lược về protein 7

2.2.2 Đặc điểm của protein chất cơ 8

2.3 Khái quát về enzyme protease 9

2.3.1 Tổng quan về enzyme protease 9

2.3.2 Tổng quan về enzyme alcalase 11

2.4 Gốc tự do và chất kháng oxy hóa 12

2.5.1 Gốc tự do 12

2.5.2 Tổng quát về chất kháng oxy hóa 13

2.5 Tổng quan về quá trình thủy phân bằng enzyme 14

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Phương tiện nghiên cứu 23

3.1.1 Địa điểm, thời gian 23

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 23

3.1.3 Hóa chất sử dụng 23

3.1.4 Nguyên liệu 24

3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu 24

3.2.2 Phương pháp đo đạc và xử lý số liệu 24

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25

3.3.2 Chuẩn bị nguyên liệu 26

3.3.3 Xác định các thành phần cơ bản của dịch trích protein hòa tan 27

3.3.4 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của hoạt tính alcalase bổ sung và thời gian thủy phân đến khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein từ thịt cá lóc

27 3.3.5 Thí nghiệm 2: Xác định nhiệt độ thủy phân protein hòa tan cho sản phẩm có khả năng thu nhận gốc tự do cao 28

3.3.6 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của việc điều chỉnh pH đến khả năng thủy phân protein hòa tan cho sản phẩm có khả năng thu nhận gốc tự do cao 29 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Thành phần hóa lý cơ bản dịch trích protein hòa tan 30

4.2 Ảnh hưởng của hoạt tính alcalase bổ sung và thời gian thủy phân đến khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein từ thịt cá lóc 31

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein 34

4.4 Ảnh hưởng của việc điều chỉnh pH đến khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân 36

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 49

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 54

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của cá lóc 7

Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng có trong 100 mL dịch trích ly từ thịt cá lóc 8 Bảng 2.3: Thành phần acid amin trong protein thịt cá lóc 8

Bảng 2.4: Tính chất của enzyme alcalase 14

Bảng 2.5: Bậc phản ứng so với nồng độ cơ chất 19

Bảng 2.6: pH tối ưu của một số enzyme 22

Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu 27

Bảng 4.1: Thành phần hóa lý của thịt cá lóc nuôi 34

Bảng 4.2: Thành phần hóa lý cơ bản của dịch trích protein hòa tan 34

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của hoạt tính enzyme bổ sung và thời gian thủy phân đến hiệu quả thủy phân protein hòa tan từ thịt cá lóc nuôi 36

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của hoạt tính enzyme bổ sung và thời gian thủy phân đến khả năng thu nhận gốc tự do DPPH của dịch protein thủy phân 38

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thủy phân dịch protein hòa tan từ thịt cá lóc nuôi 40

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của việc điều khiển pH đến hiệu suất thủy phân protein hòa tan từ thịt cá lóc nuôi 42

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cá lóc (Channa striata) 4

Hình 2.2: Sơ đồ enzyme protease thủy phân protein 11Hình 2.3: Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase 12Hình 2.4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng thủy phân củaenzyme 20Hình 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân củaenzyme 21Hình 3.1: Fillet thịt cá lóc 28Hình 3.1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát quá trình thủy phân protein hòa tan 30Hình 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến khả năng kháng oxy hóacủa dịch protein hòa tan từ thịt cá lóc nuôi 41Hình 4.2: Ảnh hưởng của việc điều chỉnh pH thủy phân đến khả năng thunhận gốc tự do của dịch protein hòa tan từ thịt cá lóc nuôi 43Hình 4.3: Protein hòa tan và dịch protein thủy phân từ thịt cá lóc nuôi 44

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Những năm gần đây, các nhà khoa học ngày càng quan tâm tìm hiểu

về tác động của những nguồn thực phẩm có khả năng chống oxy hóa đếnsức khỏe con người Các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, Parkinson,Alzeheimer, xơ vữa động mạch, suy tim, viêm loét dạ dày hay nhồi máu cơ

tim đều có nguyên nhân từ stress oxy hóa (Halliwell and Barry, 2007; Singh et al., 1995) Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh

vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do (reactiveoxygen species - ROS) và hoạt động của các chất thu nhận gốc tự do hay

chất kháng oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009) Các chất

kháng oxy hóa là các chất có khả năng làm chậm, ngăn cản hay đảo ngượcquá trình oxy hóa các chất có trong cơ thể một cách trực tiếp hay gián tiếp.Trong điều kiện bình thường, hệ thống chống oxy hóa nội sinh có thể loại

bỏ các phản ứng oxy hóa thông qua enzyme (như superoxyde dismutase vàglutathione peroxydase) và phi enzyme chống oxy hóa (chẳng hạn nhưvitamin, nguyên tố vi lượng, coenzyme) Tuy nhiên trong một số trườnghợp, chất nội sinh trong hệ thống thất bại trong việc bảo vệ cơ thể chống lạicác phản ứng với gốc tự do Điều này mang lại sự cần thiết của chất chốngoxy hóa tổng hợp và tự nhiên, vẫn có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hoá

và tác hại của nó

Protein có nguồn gốc từ động vật sau quá trình thủy phân bởi enzyme

cho các hoạt tính sinh học đa dạng (Bahareh et al., 2010) Ngoài ra, các

chất chống oxy hóa tự nhiên từ thực phẩm an toàn cho sức khỏe và rất ít tácdụng phụ là một tiềm năng để bổ sung cho cơ thể Một số peptide từ thànhphần protein đã được tìm thấy có hoạt tính sinh học, khả năng chống oxyhóa của chúng đã được nghiên cứu rộng rãi (Marcuse, 1960) Protein thủyphân từ thủy sản, cụ thể như cá là sản phẩm của quá trình thủy phân cơ thịt

cá hay phụ phẩm của quá trình chế biến sản phẩm từ cá bởi enzyme cho sảnphẩm có giá trị dinh dưỡng, sinh học cao Hơn nữa, các peptide có khảnăng chống oxy hóa từ quá trình thủy phân protein cá có khối lượng phân

tử thấp, được coi là an toàn, dễ hấp thu, giá thành thấp và hoạt tính cao

(Sarmadi and Ismail, 2010; Mendis et al., 2004)

Mặt khác, đồng bằng sông Cửa Long (ĐBSCL) đang phát triển việcnuôi cá lóc với diện tích và sản lượng ngày càng tăng Thịt cá lóc được biếtđến là một trong những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng tốt, với hàm lượngprotein cao, lipid thấp, nhiều chất khoáng và vitamin Nghiên cứu gần đâynhất của Muhammad (2014) cho thấy có thể trích ly protein hòa tan - điểnhình là albumin từ thịt cá lóc để sản xuất ra chế phẩm giàu protein với hàmlượng albumin lên đến 20,80% và hàm lượng lipid thấp 1,78% Đồng thời,trong ngành công nghiệp sản xuất sản phẩm surimi lượng protein hòa tanđược loại bỏ ra nhằm tăng sự tạo gel, tăng sự ổn định và tính chất chức

năng của protein trong surimi (Hultin et al., 2005; Hultin and Kelleher,

1999) Thành phần protein này nếu được thu hồi và sử dụng như một chếphẩm sinh học hứa hẹn sẽ mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn đến giải vấn đềgiảm chi phí quản lý chất thải, giảm tác động môi trường Điều này cũng

mở ra triển vọng rất lớn trong việc thủy phân dịch protein hòa tan bằngenzyme để tạo ra các sản phẩm thực phẩm có khả năng ứng dụng để hạnchế sự oxy hóa và các biến đổi do sự oxy hóa trên sản phẩm, kéo dài thời

gian sử dụng (Herpandi et al., 2011) Trong số các enzyme thủy phân

protein, Alcalase cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tiến trình thủyphân đơn giản do khoảng pH và nhiệt độ thích hợp khá rộng Nhiệt độ hoạtđộng của alcalase tương đối cao cùng với tối thích trong môi trường kiềmgiúp hạn chế đáng kể sự phát triển vi sinh vật trong quá trình thủy phân

(Salawanee et al., 2013) Việc chọn enzyme alcalase cũng dựa trên đặc tính

của nó cho khả năng không hút nước của các acid amin vào giai đoạn cuối,dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (AdlerNissen, 1986), đồng

thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các acid amin thiết yếu (Kristinsson and

Rasco, 2000)

Chính vì vậy, nghiên cứu thủy phân protein hòa tan có khả năng khángoxy hóa từ thịt cá lóc nuôi được tiến hành giúp mở ra các tiềm năng pháttriển cho các chế phẩm có hoạt tính sinh học từ protein hòa tan được trích

ly của cá lóc nuôi

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu khảo sát một số yếu tố ảnhhưởng đến hiệu quả thủy phân protein hòa tan được trích ly từ thịt cá lócnuôi bằng enzyme alcalase nhằm tạo ra sản phẩm có khả năng kháng oxy

hóa cao.

Trên cơ sở mục tiêu chính đã đề ra, đề tài tiến hành các nội dungnghiên cứu chủ yếu sau:

- Xác định hiệu quả thu nhận protein hòa tan từ thịt cá lóc

- Xác định hoạt tính enzyme alcalase bổ sung, thời gian, nhiệt độ và

pH thích hợp cho quá trình thủy phân protein hòa tan tạo sản phẩm

có hiệu quả kháng oxy hóa cao

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nguyên liệu

2.1.1 Giới thiệu chung về cá lóc

Cá lóc là loài cá nước ngọt, có thể sống ở các vùng nước lợ với độ

mặn nhỏ hơn 15% (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993) Đây

là loài cá nước ngọt có hàm lượng dinh dưỡng có giá trị cao, là nguồn thựcphẩm được nhiều người ưu thích như cơ thịt trắng, rắn chắc và ít xương.Đây là loài cá có giá trị cao trong chế biến thực phẩm và nuôi trồng thủy

sản ở Châu Phi và nhiều quốc gia trên thế giới (Teugels et al., 1984).

Tên khoa học của cá lóc là Channa striata Hệ thống phân loại cá lóc (Nelson, 1994; trích dẫn bởi Walter et al., 2004), cá lóc được xác định như

Hình 2.1: Cá lóc (Channa striata)

(Nguồn: http://www.fao.org/fishery/species/3062/en, truy cập ngày 25/3/2017)

Theo kết quả nghiên cứu hình học hiện nay đã công bố, trên thế giới

cá lóc gồm có 30 loài Tập trung chủ yếu ở các vùng nhiệt đới như ChâuPhi và Châu Á Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy ở vùng ôn đới như

miền bắc Trung Quốc (Wee, 1982) Cá lóc họ Channidae gồm 2 giống Channa hiện biết có 27 loài phân bố chủ yếu ở Châu Á và họ Parachanna hiện biết có 3 loài ở khu vực Châu Phi (Teugels and Daget, 1984).

Cá lóc phân bố ở Việt Nam chỉ có duy nhất một giống Channa gồm 8 loài: cá Trèo đồi (Channa asiatica), cá Lóc bông (Channa micropeltes), cá Chuối (Channa maculata), cá Quả (Channa striata), cá Dày (Channa lucius), cá Lóc đen (Channa melasoma), cá Chành dục (Channa orientalis)

và cá Tràu mắt (Channa marulius) sống chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu

Long và đồng bằng sông Hồng (Nguyễn Văn Hảo, 2005) Riêng đồng bằng

sông Cửu Long có 4 loài phân bố trong tự nhiên là: cá Chành dục (Channa gachua), cá dày (Channa lucius), cá lóc đen (Channa striata), cá lóc bông (Channa micropeltes) Nhưng chỉ có 2 loài cá lóc đen (Channa striata) và

cá lóc bông (Channa micropeltes) hiện là các đối tượng nuôi chính trong cơ cấu đàn cá lóc nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long (Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung, 2010; Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993).

Môi trường sống phổ biến của cá lóc ở đồng ruộng, kênh rạch, ao hồ,đầm, sông, thích nghi được cả với môi trường nước đục, nước lợ, có thể

chịu đựng được ở nhiệt độ trên 30°C (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu

Hương, 1993) Chúng thích nghi với môi trường xung quanh rất mạnh, nhờ

có cơ quan hô hấp phụ nên có thể hít thở được oxy trong không khí Ở vùngnước có hàm lượng oxy thấp cũng vẫn sống được, có khi không cần nướcchỉ cần da và mang cá có độ ẩm nhất định vẫn có thể sống được thời giankhá lâu

Kích thước tương đối của cá lóc khoảng 17 cm, một số loài có kíchthước lớn hơn Cấu trúc ống tiêu hóa gồm mõm ngắn, răng bén nhọn, rănghàm dưới và vòm miệng có xen kẽ một số răng chó, răng hàm trên không

có, ruột ngắn và có dạ dày (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương,

1993) Cá lóc thuộc loại cá dữ, thức ăn chủ yếu là cá, ếch, rắn, côn trùng,giun đất, nòng nọc, và giáp xác (Nguyễn Văn Thường, 2004) Trong điềukiện nhân tạo, cá lóc cũng sử dụng nguồn thức ăn chế biến làm thực phẩm

(Trần Đắc Định và ctv., 2013) Đặc điểm ăn của cá lóc có ảnh hưởng đáng

kể đến sự hình thành chất béo trong thịt cá, trong nội tạng và cả hoạt động

của hệ enzyme tiêu hóa của cá lóc Theo Odo et al (2012) cá lóc là một

trong những nguồn protein rẻ nhất nên nó trở thành nguồn cung cấp thựcphẩm có giá trị, phổ biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Nam Á và một sốquốc gia Châu Phi

2.1.2 Tình hình nuôi cá lóc ở Việt Nam

Tại Đồng bằng sông Cửu Long nghề nuôi cá lóc phát triển từ những

năm 1950 chủ yếu tại 2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp (Long et al., 2004)

Cá lóc đen được nuôi từ giữa thập niên 1990 đến nay cá lóc là một trongnhững đối tượng nuôi nước ngọt chính ở ĐBSCL ngoài cá tra, cá điêu hồng

và tôm càng xanh (Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung, 2010)

Những năm gần đây, trong chương trình đa dạng hóa các sản phẩmnước ngọt thì cá lóc là một trong những đối tượng nuôi phổ biến với nhiều

mô hình nuôi khác nhau như thâm canh, bán thâm canh và kết hợp (Đỗ Thị

Thanh Hương và Ngô Tú Trinh, 2013) Theo số liệu của Tổng cục thống kê

thủy sản tháng 11 năm 2011, diện tích nuôi thủy sản cả nước năm 2010 là1.066.000 ha và sản lượng thủy sản nuôi trồng cả nước đạt 2.706.800 tấntăng cao so với năm 2007 diện tích nuôi thủy sản cả nước là 1.018.800 ha

và sản lượng thủy sản nuôi trồng chỉ đạt 2.124.600 tấn Từ đó cho thấy cálóc là đối tượng nuôi chủ lực ở ĐBSCL, là nguồn tiêu thụ lớn trong nướctheo sau cá tra Tuy nhiên, chính sự phát triển của diện tích nuôi cá lóc vànhu cầu tiêu thụ cá lóc trên thị trường tăng mạnh dẫn đến một lượng lớnphụ phẩm giàu protein của ngành công nghiệp chế biến thủy sản bị loại bỏ

mà không được quan tâm thu hồi, như lượng protein hòa tan loại bỏ trongquá trình sản xuất surimi nếu không có biện pháp tận dụng sẽ gây ô nhiễmmôi trường Ngoài ra, việc nuôi trồng với số lượng nhiều, ồ ạt như thế sẽdẫn đến hậu quả ứ đọng đầu ra và giá cá lóc thương phẩm sẽ bị giảm xuống

do vấn đề cung vượt cầu có thể ảnh hưởng đến lợi nhuận của người nuôi cá

Vì thế, việc nghiên cứu tận dụng và phát triển nguồn phụ phẩm từ côngnghiệp chế biến các sản phẩm từ cá lóc nuôi ở khu vực ĐBSCL cụ thể lànghiên cứu thủy phân dịch trích protein hòa tan từ thịt cá lóc nuôi khôngnhững mang lại giá trị kinh tế và góp phần bảo vệ môi trường và đa dạnghóa các sản phẩm từ loài cá có giá trị dinh dưỡng cao

2.1.3Thành phần dinh dưỡng của cá lóc

Cá lóc là loài thủy sản có giá trị dinh dưỡng cao, được coi là nguồnthực phẩm có giá trị y học cao, rất tốt cho sức khỏe con người bởi vì nó

chứa rất nhiều các acid amin và các acid béo (Haniffa et al., 2014) Những

yếu tố như giống loài, mùa vụ khai thác, thời tiết, vùng miền, điều kiện sinhtrưởng…ảnh hưởng quyết định đến thành phần dinh dưỡng của cá lóc.Thành phần dinh dưỡng của cá lóc bao gồm protein, lipid, nước và cácthành phần khác (muối vô cơ, carbohydrate và hocmon…) Thành phầndinh dưỡng cá lóc được biểu hiện ở Bảng 2.1

(Nguồn: Wimalasena and Jayasuriya, 1996)

Nước tham gia vào các phản ứng sinh hóa, quá trình khuếch tán trong

cá, tạo điều kiện vi sinh vật phát triển (Trần Như Khuyên và Nguyễn Thanh

Hải, 2007) Hàm lượng nước chiếm khoảng 55÷83%, đóng vai trò quantrọng trong hoạt động sống và chất lượng cá

Chất béo trong cá chứa một số vitamin (A, D), là chất xây dựng tế bào

và trao đổi chất Đồng thời, do chứa nhiều acid béo không no nên kém, dễ

bị oxy hóa nên khó bảo quản (Lê Văn Hoàng, 2004)

Hàm lượng protein trong cá dao động trong khoảng 16÷20%(Tranggono, 1991), protein từ thịt cá lóc dễ tiêu hóa và dễ hấp thu hơnprotein từ thịt động vật khác Trong đó bao gồm protein cấu trúc, protein

mô liên kết và protein tương cơ Protein chất cơ bao gồm một số lượng lớncác protein hòa tan (albumin, myoalbumin, globulin, myoglobulin…),heme-protein và các enzyme khác nhau tham gia vào quá trình chuyển hóa

tế bào (Harris, 1990) Các protein này có đặc tính là tan được trong nước,

tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp Đặc biệt, hàmlượng đáng kể albumin có khả năng chống oxy hoá, ngăn chặn và phản ứngvới các gốc tự do (Tranggono, 1991) Thành phần dinh dưỡng trong 100

mL dịch trích cá lóc được liệt kê trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng có trong 100 mL dịch trích ly từ thịt cá lóc

các vết thương (Zubaidah et al., 2015) Thành phần acid amin trong cá lóc

cũng có giá trị y học cao, đóng vai trò quan trọng trong việc giảm đau và

quá trình chữa lành các vết thương (Ma and Mj, 2012) Thành phần acid

amin trong protein thịt cá lóc Bảng 2.3

Bảng 2.3: Thành phần acid amin trong protein thịt cá lóc

470

560 180 70

2.2 Tổng quan về protein thủy sản

2.2.1 Sơ lược về protein

Protein là thành phần cơ bản cấu tạo nên tế bào và đơn vị cơ bản của

cơ thể sống Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sinh

vật (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004) Protein là những đại phân tử được cấu tạo

theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin, chúng kết hợp vớinhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (còn được gọi là chuỗipolypeptide), các chuỗi này có thể xoắn hoặc gấp theo nhiều cách để tạothành các cấu trúc không gian khác nhau của protein Theo Phan Thị ThanhQuế (2005) thì các acid amin trong chuỗi polypeptide của cá chứa đầy đủcác acid amin thiết yếu không thể thay thế như lysine và các acid amin cóchứa lưu huỳnh (methionine, cysteine)

Protein được phân nhóm theo nhiều nguyên tắc khác nhau, như dựavào hình dạng, tính tan hoặc chức năng, thành phần hóa học để phân nhómprotein Dựa vào khả năng hòa tan, protein cơ được chia thành 3 nhóm:protein chất cơ (protein tương cơ) tan trong nước hoặc dung dịch muốiloãng, protein tơ cơ (protein cấu trúc) tan trong dung dịch muối nồng độcao và stroma protein hay còn gọi là protein liên kết không tan trong nước,dung dịch muối cả loãng và đặc (Lawrie, 1991)

2.2.1.1 Protein tơ cơ (Myofibrillar protein)

Chiếm 55 ÷ 60% tổng protein mô cơ (Asghar et al.,1985) Protein tơ

cơ bao gồm myosin, actin, actomyosin, tropomyosine, troponin,… trong đómyosin chiếm khoảng 55% (Nguyễn Văn Mười, 2006) Các protein này hòatan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá cao (<0,5 M)(Huss, 1995) Các protein cấu trúc có chức năng co rút đảm nhận các hoạtđộng của cơ, actin và myosin tham gia trực tiếp vào quá trình co duỗi cơ(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

2.2.1.2 Protein mô liên kết (Stroma protein)

Protein mô liên kết, màng cơ hay stroma protein chiếm khoảng3÷10% tổng lượng protein của cá Collagen và elastine là hai thành phần cơbản của màng cơ Các protein này có trong thành phần của chất cơ và màngliên kết bao bọc sợi cơ Màng cơ có thể ở dạng chặt chẽ, dày đặc hay lỏnglẻo tùy thuộc vào thành phần và sự liên kết của các tế bào và của các sợi cơ

hiện diện (Nguyễn Văn Mười, 2006) Protein này không tan trong nước,trong dung dịch kiềm và trong dung dịch muối trung tính Protein mô liênkết có giá trị dinh dưỡng kém hơn so với protein cấu trúc và protein tương

cơ (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

2.2.1.3 Protein chất cơ

Protein chất cơ chiếm 30% đến 35% tổng protein cơ và chiếm khoảng

5% khối lượng mô cơ (Asghar et al., 1985), gồm albumin, myoalbumin, globulin, myoglobulin và các enzyme (Haard et al., 1994; Kijowski, 2001).

Các protein này có đặc tính là tan được trong nước, tan trong dung dịchmuối trung tính có nồng độ ion thấp (Masuelli, 2013) Protein tương cơ bịđông tụ khi đun nóng ở nhiệt độ trên 50°C (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011;Phan Thị Thanh Quế, 2005)

2.2.2Đặc điểm của protein chất cơ

Có khoảng 200 loại protein được biết đến trong protein chất cơ, màphần lớn là các enzyme glycoglytic giữ vai trò điều khiển các phản ứngenzyme trong mô cơ (Kijowski, 2001) Tuy nhiên, protein chất cơ chủ yếucủa cá là các enzyme tham gia quá trình đường hóa giống như ở động vật

hữu nhũ (Nakagawa et al., 1988) Một thành phần quan trọng của protein

chất cơ là protein albumin Albumin là một loại protein quan trọng, chiếm

60% trong tổng thành phần có trong huyết tương (Murray et al., 1999).

Cá lóc là một nguồn tài nguyên sinh học có giá trị kinh tế cao, do chứa

hàm lượng đáng kể albumin (Asfar et al., 2007; Tawali et al., 2012; Mustafa, et al., 2012; Sulistiyati, 2010) Dịch trích protein hòa tan có chứa

albumin và chất dinh dưỡng khác là tiềm năng trong việc cải thiện tình

trạng giảm albumin (Suprayitno et al., 2009; Santoso et al., 2009) Dịch

trích protein hòa tan từ cá lóc được sử dụng phổ biến hiện nay với các tácdụng quan trọng trong y học tổng hợp mô, làm lành vết thương và ức chếsản xuất các gốc tự do có tác dụng trong y học như chất chống lão hóa

(Mustafa et al., 2012).

Protein chất cơ là thành phần thường bị loại bỏ trong quá trình chếbiến các sản phẩm dạng gel (surimi) thông qua các công đoạn rửa do sự ảnhhưởng của chúng đến màu sắc, độ bền gel và khả năng giữ nước của sản

phẩm (Go and Hwang, 1995; Kim et al., 2005; Jafarpour and Gorczyca,

2009) Do đó, quá trình sản xuất các sản phẩm dạng gel sẽ thải ra mộtlượng lớn các protein chất cơ làm ảnh hưởng đến môi trường Tuy nhiên, dođây là thành phần protein có giá trị dinh dưỡng cao, chủ yếu là các thànhphần protein hòa tan trong nước nên việc nghiên cứu thu hồi thành phầnnày rất được quan tâm

2.3 Khái quát về enzyme protease

2.3.1 Tổng quan về enzyme protease

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Quátrình trao đổi chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều phản ứng hóa họckhác nhau Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóahọc đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhấtđịnh

Enzyme có tính đặc hiệu cao và tính chọn lọc khi tác dụng lên cơ chất.Mức độ đặc hiệu của enzyme là khác nhau và được chia ra thành các mức

độ khác nhau: đặc hiệu tuyệt đối, đặc hiệu tương đối, đặc hiệu nhóm và đặchiệu quang học Chúng có phân tử lượng rất lớn (20.000 đến 1.000.000dalton, chiếm khoảng 5% của tổng cộng protein tạo ra) Enzyme có cấu trúcrất đặc biệt liên quan đến bộ phận đặc hiệu gọi là trung tâm hoạt động Mỗienzyme thường có một trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động thường

là một phức hoặc một nhóm liên kết chặt chẽ với phần protein của enzyme.Các acid amin thường tìm thấy ở trung tâm hoạt động là cysteine, histidine,

serine, aspartic acid, glutamic acid và lysine (Nguyễn Công Hà và Lê

Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Protease là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên liên kếtpeptide trong phân tử protein, chúng có thể được tìm thấy trong các cơ thểsống (động vật, thực vật và vi sinh vật) (Nguyễn Công Hà, 2014) Ngoài ra,protease còn có khả năng thủy phân các liên kết ester, tham gia chuyển vịcác gốc acid amin (Cao Thị Mỹ Hội, 2011) Phản ứng thủy phân proteinbằng enzyme protease có thể được biểu diễn như Hình 2.1

Hình 2.2: Sơ đồ enzyme protease thủy phân protein

(Nguồn: Barrett, 2001)

Việc phân loại nhóm enzyme protease được thay đổi qua các thời kỳ

(Barrett, 2001) Theo Grassmann and Dyckerhoff (1928, trích dẫn bởi

Barrett, 2001) protease phân chia thành proteinase và peptidase Dựa vào vịtrí liên kết peptide trong phân tử protein có thể chia protease thànhendopeptidase (protease nội phân) và exopeptidase (protease ngoại phân)

Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase được thể hiện ở Hình2.3

Hình 2.3: Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase

(Nguồn: Đặng Thị Đăng Phương, 2005)

Theo cơ chế thủy phân, protease được phân thành hai lạiendopeptidases và exopeptidases Endopeptidase thủy phân chuỗipolypeptide tại các liên kết peptide nhạy cảm vị trí giữa mạch để tạo ra cácđoạn peptide ngắn hơn Trong khi đó, exopeptidase xúc tác thủy phân liênkết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do để tạo ra các acid min tự do (Adler-Nissen, 1993)

Một số tác giả chia protease thành 3 nhóm dựa vào pH hoạt động củachúng bao gồm protease acid, protease trung tính và protease kiềm Trong

đó, protease acid có pH tối thích trong khoảng 2÷5; protease trung tính có

pH tối thích khoảng hẹp 6,0÷7,5 không bền ở nhiệt độ cao và mất hoạt tínhkhi có sự hiện diện protease kiềm Protease kiềm có pH tối thích trongkhoảng 8÷11 Những protease kiềm là nhóm được quan tâm khá nhiều, vì

có thể sử dụng chúng như những chất phụ gia trong quá trình thuộc da,trong chất giặt tẩy, xử lý chất thải môi trường (Đặng Thị Đăng Phương,2005)

Dựa vào cơ chế tác động, cấu trúc của trung tâm hoạt động củaenzyme, có thể chia protease thành 4 nhóm: serine protease (EC 3.4.21),cysteine protease (EC 3.4.22), aspartic protease (EC 3.4.23) và metalloprotease (EC 3.4.24) Trong đó, hai hệ serine protease và cysteine protease

có khả năng thủy phân liên kết ester và liên kết amide của các dẫn xuất củacác amino acid Ngược lại các hệ metallo protease, aspartic protease thườngkhông có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của acid amin(Nguyễn Công Hà, 2014)

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từmức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được bố rộng rãi trên nhiều đốitượng từ động vật thường trong các cơ quan như gan, dạ dày bê… đến thựcvật như đu đủ, dứa…và vi sinh vật như vi khuẩn, nấm…So với proteaseđộng và thực vật, protease từ vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Như

là hệ protease từ vi sinh vật là hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzymerất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khótách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất Cũng vì thế mà protease từ vi sinh vậtthường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đadạng Protease là nhóm enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghiệpenzyme, chiếm khoảng 60% thị trường enzyme được tìm thấy trong thực

vật, động vật và cả vi sinh vật (Sawant and Nagendran, 2014; Motyan et al., 2013).

2.3.2 Tổng quan về enzyme alcalase

Alcalasae là một enzyme nội bào được tìm thấy lần đầu tiên vào năm

1960, là enzyme có đặc tính thủy phân protein được sản xuất từ quá trình

lên men chìm Bacillus lichenniformis Thành phần chính của enzyme này là

Subtilisin A thuộc nhóm serine S8 endoproteinase (Karl, 2004)

Alcalase là một chế phẩm enzyme sẵn có trên thị trường được sử dụngrộng rãi trong quá trình thủy phân protein do có thể hoạt động trong điềukiện nhiệt độ và độ pH tối ưu thuộc môi trường kiềm rất phù hợp với môitrường tự nhiên của dịch protein hòa tan, đồng thời có thể giảm thiểu sự

phát triển của vi sinh vật trong quá trình thủy phân Theo Cao et al (2011)

điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình thủy phân protein của alcalase

là ở 60ºC và pH 7,0 Đặc tính của enzyme alcalase được thể hiện cụ thể ởBảng 2.4 Tuy nhiên, giá trị này còn phụ thuộc vào các loại nguyên liệu thủyphân khác nhau như protein cá, tôm, cua

Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách xử lí nhiệt ở 90ºC trong10÷20 phút; trong 10÷15 phút ở 85ºC hoặc cao hơn khi pH bằng 8

(Johansen et al., 1968, trích dẫn bởi Novozymes, 2001) Enzyme dần bị mất

hoạt tính theo thời gian tùy thuộc vào nhiệt độ bảo quản Alcalase cũng vậy,chúng dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ Hoặc cũng có thể bất hoạt alcalase ở

pH 4 hay mức pH thấp hơn trong khoảng 30 phút Ngoài ra, phản ứng thủyphân có thể dừng tức thời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như acidacetic, lactic, hydrochloric, Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ tức thời khó đạtđược dưới các điều kiện công nghiệp, hơn nữa khó kiểm soát hiệu suất thủyphân protein do sự thủy phân có thể vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bấthoạt (Adler-Nissen, 1986)

Bảng 2.4: Tính chất của enzyme alcalase

Vị trí liên kết của chuỗi insulin (B-chain of

insulin (3)) chịu sự tác động của protease

45, 910, 1112, 1516, 2627

(1):DFP= Di-isopropyl fluorophosphate; PMSF= Phenylmethylsulphonylfluoride

(2):EDTA = Ethylenediamine tetra-acetic acid

ValCySO3H-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-

(3):NH2-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-CySO3H-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-(Nguồn: Johansen et al., 1968, trích dẫn bởi Novozymes, 2001)

Việc sử dụng enzyme alcalase dựa vào một số ưu điểm như tạo ra sảnphẩm dịch thủy phân ít vị cay, đắng hơn so với các loại enzyme khác trong

hệ protease (Liceaga-Gesualdo and Li-Chan, 1999) do nó có khả năng

không hút nước của các acid amin vào giai đoạn cuối (Adler-Nissen, 1986)đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các acid amin thiết yếu (Kristinsson

(Wang et al., 2008) Các “gốc tự do” hay nói chính xác hơn là các chất hoạt

động chứa oxy, nitơ và lưu huỳnh (Reactive Oxygen Species - ROS vàReactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơphân tử Phần lớn các gốc tự do hoạt động mạnh và gây tổn hại nhiều cho

cơ thể nhất là ROS

Trong cơ thể con người gốc tự do được sinh ra do nhiều nguyên nhânkhác nhau như quá trình hô hấp tế bào, ảnh hưởng của tia bức xạ, tia tử

ngoại, môi trường sống bị ô nhiễm (Singh and Rajini, 2004) Trong điều

kiện có thể kiểm soát bởi hệ thống kháng oxy hóa nội sinh, gốc tự do lànguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể Nhưng khi hệ thống kháng oxy hóanày bị suy giảm dẫn đến tăng số lượng gốc tự do gây ảnh hưởng xấu cho cơthể Thế nên, tìm hiểu về chất chống oxy hóa trở thành vấn đề được ngànhdược, thực phẩm thuốc cũng như ngành chế biến và bảo quản thực phẩm rấtquan tâm

2.4.2Tổng quát về chất kháng oxy hóa

Các chất kháng oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại,ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào

của cơ thể (Jovanovic and Simic, 2000; Lachman et al., 2000; Singh and

Rajini, 2004)

Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxi hóa được phânthành hai loại là chất kháng oxy hóa bậc một và chất kháng oxy hóa bậchai Trong đó, chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự

do, do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quátrình oxy hóa Các chất kháng oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành cácgốc tự do (hấp thu các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự

tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt oxy đơn) (Singh and Rajini, 2004;

Rolland, 2004)

Ngoài ra, chất kháng oxy hóa cũng có thể chia làm hai loại là:

+ Chất kháng oxy hóa tổng hợp: được hình thành từ con đường hóa

học như là BHT (butylated hydrotolene), BHA (butylated hydroanisole),

OG (octy gallate)…Do nguy cơ về sức khỏe của chất chống oxy hóa tổnghợp, việc tìm kiếm các chất kháng oxy hóa tự nhiên an toàn là quan trọng

+ Chất kháng oxy hóa tự nhiên: chúng được tách chiết từ nguyên

liệu tự nhiên hay được chuyển hóa bằng con đường sinh học Một số chấtchống oxy hóa được thu nhận từ tự nhiên như retinoids (vitamine A),tocopherols (vitamine E), ascorbic acid (vitamine C), polyphenols,carotenoids, manganese, zinc, selenium Protein thủy phân có hoạt tínhchống oxy hóa thu nhận từ quá trình thủy phân protein động thực vật bằngenzyme cũng được coi là chất chống oxy hóa tự nhiên

Các đoạn polypeptide khi còn trong chuỗi phân tử protein tồn tại nhưtiền chất chồng oxy hóa, chúng thể hiện khả năng kháng oxy hóa sau quátrình thủy phân Các peptide có khả năng kháng oxy hóa có thể được sảnxuất từ các nguồn chất đạm cá bằng cách sử dụng các quá trình khác nhaunhư thủy phân bằng enzyme, tự phân giải quá trình sử dụng men nội sinh,

vi sinh vật lên men và mô phỏng quá trình tiêu hóa ở dạ dày (Bougatef và ctv., 2010; Je et al., 2007; Kim, et al., 2007; Hanh et al., 2011; Phanturat et al., 2010; Rajapakse et al., 2005; Ren et al., 2008).

Các peptide có khả năng kháng oxy hoá có một số kim loại chelationhoặc hydro/electron tặng hoạt động, có thể cho phép chúng tương tác vớicác gốc tự do và chấm dứt chuỗi phản ứng cực đoan hoặc ngăn chặn sự

hình thành gốc tự do mới (Ren et al., 2008; You et al., 2010) Do đó, các

thành phần acid amin và trình tự của các peptide là rất quan trọng đối vớihoạt động chống oxy hóa của họ Hơn nữa, các acid amin kỵ nước hoặc tồntại một hay nhiều dư lượng histidine, proline, methionine, cystein, tyrosine,tryptophan có thể tăng cường các hoạt động của chất chống oxy hoá peptide

(Je et al., 2007; Ren et al., 2008; You et al., 2010b) Sự hiện diện của chuỗi

kỵ nước trong các peptide có thể tương tác với các phân tử chất béo và có

thể nhặt rác bằng cách tặng proton để lipid bắt nguồn gốc (Je et al., 2007).

Ngoài ra, trên thế giới xu hướng sử dụng các chất kháng oxy hóa có nguồngốc tự nhiên được quan tâm rất lớn nhờ tính an toàn và giá trị dinh dưỡng

2.5 Tổng quan về quá trình thủy phân bằng enzyme

2.5.1 Khát quát chung

Thủy phân là một quá trình ha học trong đó một phân tử bị phân cắtkhi có mặt của phân tử nước Một phần của phân tử sau khi cắt sẽ tương tácvới cation H+ từ phân tử nước, phần khác sẽ liên kết với anion OH- còn lại.Bản chất của quá trình thủy phân protein là quá trình phá vỡ các liênkết peptide khi có mặt của nước Trong quá trình thủy phân protein, protein

được thủy phân bởi enzyme protease, acid hay base (Hordur and Barbara,

2000) Hơn nữa, do liên kết peptide là liên kết bền, nên quá trình thủy phâncần có mặt chất xúc tác Các tác nhân xúc tác gồm:

+ Tác nhân hóa học: acid (HCl) hay base (NaOH)

+ Tác nhân hóa sinh học: enzyme thủy phân protein (protease)

Trong nhiều nghiên cứu, thủy phân bằng phương pháp sử dụngenzyme thủy phân là phổ biến nhất Thủy phân protein thường phải đượcphân đoạn để có được những peptide với chức năng cao hơn hoặc nâng caogiá trị dinh dưỡng ở dạng tinh khiết hơn Quá trình thủy phân protein tạo racác đoạn peptide, các acid amin tự do có giá trị dinh dưỡng, sinh học caođáp ứng các chức năng sinh lý cho cơ thể người, đây là phương pháp chếbiến mang lại hiệu suất thu hồi protein cao nhất và không ảnh hưởng lớn

đến chất lượng sản phẩm cuối cùng (Chalamaiah et al., 2012).

Quá trình thủy phân của liên kết peptide dẫn đến tăng số lượng các ion(NH4+ và COO-), đồng thời làm tăng tính kỵ nước và sự tích điện, giảm kíchthước các phân tử của chuỗi polypeptide và thay đổi cấu trúc phân tử, dẫn

đến phơi bày các nhóm kỵ nước ra môi trường phản ứng (Mahmoud et al.,

1992)

Theo Trần Thanh Trúc và ctv (2015) việc thủy phân protein làm giảm

kích thước các peptide, dịch thủy phân là nguồn acid amin có sẵn cho sinhtổng hợp protein Tuy nhiên, việc sử dụng acid mạnh hoặc bazơ mạnh đểthủy phân protein là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hại vớimôi trường Chính vì vậy, việc thủy phân protein hòa tan từ thịt cá lóc bằngtác nhân sinh học là enzyme có thể kiểm soát được quá trình thủy phân nêngiảm thiểu các phản ứng không mong muốn và giảm ô nhiễm môi trường

2.5.2 Protein thủy phân từ thủy sản

Protein có nguồn gốc từ động vật có hàm lượng dinh dưỡng cao hơncác loại thực vật vì có chứa các acid amin thiết yếu Protein có nguồn gốc

từ thịt và cơ thịt gia cầm có chất lượng rất cao và các protein từ cơ thịt cácũng có giá trị dinh dưỡng tương đương Trong cơ thịt cá cơ ngoài các acidamin thiết yếu còn là nguồn cung cấp các protein dinh dưỡng và dễ tiêu hóa

(Hordur and Barbara, 2000).

Protein thủy phân từ thủy sản, cụ thể là từ cá là sản phẩm của quátrình thủy phân cơ thịt cá hoặc phụ phẩm của quá trình chế biến sản phẩm

từ cá bởi enzyme hoặc hóa chất (acid, kiềm)

Protein thu hồi theo hình thức thủy phân có thể được sử dụng như làchất mùi và được đưa vào các loại thực phẩm, thức ăn cho nuôi trồng thủysản hoặc nguồn nitơ trong môi trường cho sự phát triển của vi sinh vật Bêncạnh đó, sản phẩm sau thủy phân là nguồn peptide có hoạt tính sinh học

mang đến tiềm năng đáng kể trong dược phẩm (Gildberg and Stenberg,

2001) Hầu hết các peptide này ở trạng thái không có hoạt tính trong cácprotein và chỉ thể hiện hoạt tính khi được phóng thích ra, quá trình nàythường là quá trình tiêu hóa hoặc có thể là chế biến chủ động Những

peptide này có kích thước 2-20 acid amin (Meise and FitzGerald, 2003) và khối lượng phân tử nhỏ hơn 6 kDa (Sun et al., 2004)

Protein thủy phân từ cá là một trong những sản phẩm từ protein cá có

tính chất chống oxy hóa, chống huyết khối, chống ung thư, điều hòa miễndịch, chống béo phì Sự hiện diện của các peptide là nguyên nhân tạo nêncác tính chất này, các peptide này thường được gọi là peptide có hoạt tínhsinh học Các peptide từ thực phẩm có khả năng kháng oxy hóa này đượccoi là an toàn Và các hợp chất lành mạnh có trọng lượng phân tử thấp, giáthành rẻ, hoạt động mạnh và dễ hấp thu Các thành phần chống oxy hóaprotein thủy phân từ cá có tiềm năng ứng dụng về mặt dinh dưỡng, dượcphẩm, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng do những lợi ích đối với sức khỏe

của chúng (Udenigwe and Aluko, 2012).

Các yếu tố của quá trình thủy phân protein như bản chất của cơ chất,bản chất của enzyme hay hiệu suất thủy phân là những yếu tố quan trọngnhất ảnh hưởng đến đặc điểm sản phẩm của quá trình thủy phân protein từ

cá

Bản chất của cơ chất như thành phần dinh dưỡng có trong nguyên liệunhư hàm lượng chất béo thấp ít gây ảnh hưởng đến sản phẩm dịch thủyphân và giảm bớt được công đoạn tách béo trước khi thủy phân do hàmlượng béo cao là nguyên nhân sự tối màu của sản phẩm protein thủy phânbởi sự oxy hóa chất béo Nếu lượng chất béo trong sản phẩm thủy phân lớnhơn 1% thì cần thiết phải thực hiện tách béo hoặc bổ sung các thành phầnchống oxy hóa để ổn định chất béo (Gildberg, 1994)

Bản chất của enzyme như việc sử dụng enzyme protease thích hợp ảnhhưởng đáng kể đến tính chất của sản phẩm dịch protein sau thủy phân Nếu

cơ chất protein chứa nhiều acid amin kỵ nước thì sự lựa chọn protease phải

ưu tiên phân cắt các acid amin kỵ nước (Adler-Nissen, 1986) Hay việc lựachọn loại enzyme protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng đã được sửdụng nhiều do hiệu quả thủy phân cao và ổn định với pH và nhiệt độ (Diniz

and Martin, 1997) Ngoài ra, hiệu suất thủy phân hay mức độ thủy phân

protein bởi enzyme protease là thông số then chốt mô tả đặc tính sản phẩmthủy phân protein Mức độ thủy phân protein được thể hiện qua số lượngliên kết peptide bị cắt và tổng số liên kết peptide trong protein ban đầu, kíchthước trung bình của các peptide (Adler-Nissen, 1986) Hiệu suất thủy phâncũng liên quan nhiều đến đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân nhưkhả năng kháng oxy hóa Nguyên nhân các ảnh hưởng này là do hiệu suất

thủy phân có ảnh hưởng nhiều đến sự phân bố khối lượng phân tử của cácpeptide trong sản phẩm protein thủy phân, mà các peptide có khối lượngphân tử khác nhau sẽ ảnh hưởng đến đến hoạt tính của chúng.

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein

2.4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng có mối quan hệ chặt chẽ vớinhau Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và cónhiều cấp bậc khác nhau (Bảng 2.5) Theo Wolfgang (2004) trích dẫn từ

Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, (2011) mỗi bậc phản ứng thể

hiện mối quan hệ giữa tốc độ phản ứng và nồng độ cơ chất

Bảng 2.5: Bậc phản ứng so với nồng độ cơ chất

chất

hai cơ chất phản ứng

(Nguồn: Wolfgang, 2004, trích dẫn từ Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơchất, nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trìnhphản ứng (Đỗ Quý Hai, 2004) Nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứngphụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất nên nếu nồng độ cơ chất tiếp tụctăng thì tốc độ phản ứng cũng tăng nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chấtđến mức nào đó, thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng hay ức chế ngượclại hoạt động xúc tác của enzyme (Hình 2.4) Vì vậy, tùy theo mỗi loạienzyme khi sử dụng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện

cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme

Hình 2.4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng thủy phân

của enzyme

(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)

2.4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với nồng độ enzyme (Hình2.5) Trong trường hợp thừa cơ chất nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc

độ phản ứng Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phảnứng sẽ chậm lại Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụthuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa tế bào của gen

Hình 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân của

enzyme

(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)

2.4.3.3 Ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, nhiệt độ vàthời gian cũng như pH môi trường là các yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đếnkhả năng thủy phân

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phảnứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng.Tốc độ phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Vì các nguyên tử trong phân tửenzyme có năng lượng cao hơn và xu hướng lớn hơn để di chuyển Tuynhiên, nhiệt độ bị giới hạn trong phạm vi sinh học bình thường Mỗienzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tốnhư nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng… Khi giatăng 10ºC đối với một phản ứng sẽ làm tăng độ hoạt động của enzyme lên

từ 50% đến 100% Chỉ cần thay đổi nhiệt độ phản ứng từ một đến hai độ sẽlàm thay đổi từ 10 đến 20% kết quả về hiệu quả phản ứng (Nguyễn Công

Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011) Tuy nhiên, đến một giới hạn nhất định

của nhiệt độ phản ứng, tốc độ phản ứng không thể tăng thêm Nguyên nhân

là do enzyme có bản chất là protein khi nhiệt độ phản ứng cao vượt mức tớihạn của enzyme sẽ gây biến tính nhiệt phá hủy hoạt động của enzyme Điềunày là do sự mở ra của chuỗi protein sau khi bị mất các liên kết yếu như

liên kết hydro, vì thế vận tốc phản ứng bị giảm (Nguyễn Công Hà và Lê

Nguyễn Đoan Duy, 2011) Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộcrất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường Điều kiệnnhiệt độ thích hợp cho hoạt động thủy phân phụ thuộc vào từng loạienzyme, đồng thời chịu sự chi phối của cơ chất phản ứng

Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chấtdài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệtđộ,… Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong

cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân Khi cơchất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc Thờigian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảochất lượng sản phẩm tốt Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác địnhbằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụthể (Đỗ Quý Hai, 2004)

Hơn thế nữa, enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường Enzyme bịảnh hưởng bởi sự thay đổi pH Giá trị pH giảm thấp hay quá cao ngoàiđiểm tối ưu thì tốc độ phản ứng thường giảm nhanh và hoạt tính của hầu hếtenzyme giảm một phần hay hoàn toàn, có thể do enzyme bị biến tính hay bịphân ly một cofactor quan trọng nào đó (Mai Xuân Lương, 2005).

Mỗi loại enzyme khác nhau có pH tối ưu khác nhau Đa số enzymebền trong khoảng pH= 5÷9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi chứa cácyếu tố làm bền như cơ chất, coenzyme, Ca2+,…Cùng một loại enzymenhưng thu từ các nguồn khác nhau cũng có pH tối ưu khác nhau (Phan ThịBích Trâm, 2010)

Bảng 2.6: pH tối ưu của một số enzyme

(Nguồn: Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Ở pH tối ưu, tốc độ phản ứng của enzyme là tốt nhất, với những giá trịlớn hơn hoặc nhỏ hơn pH tối ưu, tốc độ phản ứng enzyme giảm dần Tuynhiên, đối với một enzyme nhất định, pH tối ưu không phải lúc nào cũng cốđịnh mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: tính chất và nồng độ cơ chất,dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng… Với nhiều enzyme protease, pH thíchhợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có một số enzyme có pH thích hợp rấtthấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật,…) hoặc khá cao như subtilin, có

pH thích hợp lớn hơn 10 (Đỗ Quý Hai, 2004) Tại điểm đẳng điện, enzyme

bị biến tính dẫn đến không còn hoạt tính sinh học Nếu có biện pháp làmcho enzyme hòa tan trở lại thì khả năng hồi phục một phần hoạt tính tối đacủa enzyme là có thể.

2.5.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến vấn

đề thủy phân protein trích ly hòa tan

Nghiên cứu thủy phân protein theo con đường enzyme đã được quantâm từ rất sớm không chỉ ở các nước trên thế giới mà ngay cả ở Việt Nam.Trong những năm gần đây, các nghiên cứu sử dụng enzyme để thu hồiprotein từ thịt cá của quá trình chế biến thủy sản tạo nhóm sản phẩm thựcphẩm chức năng được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học hay thu hồiprotein nhằm đáp ứng yêu cầu chế biến đang bắt đầu được quan tâm

Nghiên cứu của Nguyễn Hồng Ngân và ctv (2014) đã xác định thành

phần hóa học của sinh khối Artemia và khám phá hoạt tính chống oxy hóacủa protein Artemia thủy phân (APH) Kết quả cho thấy, sinh khối Artemia

có chứa: 8,13% protein, 3,77% lipid và 85,92% nước Protein Artemia thủyphân bằng enzyme nội tại có hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao nhất sau 5giờ thủy phân và tổng năng lực khử cao nhất sau 4 giờ thủy phân ở 50ºC

Lý Thị Minh Phương (2008) nghiên cứu sản xuất chế phẩm dịch thủyphân từ thịt hàu biển Kết quả nghiên cứu cho thấy thịt hàu thủy phân bằngenzyme Allzyme FD thu được dịch thủy phân có hàm lượng acid amin cao,

có mùi thơm đặc trưng và đảm bảo các tiêu chuẩn về vi sinh vật Kết quảphân tích acid amin cho thấy dịch thủy phân hàu chứa hàm lượng cao acidamin phenylalanine, tyrosine và lysine

Huỳnh Dự (2010) nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân từ phế liệu mực

để bổ sung vào thức ăn nuôi cá Kết quả thu được dịch thủy phân có hàmlượng acid amin cao, dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ; khi bổ sung vào thức ăn nuôi

cá cho thấy tốc độ lớn của cá nhanh hơn

Klompong và ctv (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của mức độ thủy phân

và loại enzyme đến hoạt tính chống oxy hóa và đặc điểm, tính chất củaprotein thủy phân từ cá chỉ vàng Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóacủa protein thủy phân từ cá chỉ vàng thay đổi theo mức độ thủy phân vàloại enzyme sử dụng Khả năng tạo nhũ, tạo bọt của protein thủy phân cũngphụ thuộc vào hai nhân tố này Thêm vào đó tính chất, chức năng của

protein thủy phân còn bị ảnh hưởng bởi pH Vì vậy, protein thủy phân từ cáchỉ vàng có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm như là một chất chốngoxy hóa tự nhiên.

Nilsang (2004) nghiên cứu các thông số tối ưu cho quá trình thủy phânthịt cá hòa tan cô đặc bằng enzyme protease Kết quả cho thấy enzymeFlavourzyme có hiệu quả thủy phân tốt nhất đối với thịt cá hòa tan cô đặc

và điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme là 50 LAPU enzyme/1gamprotein, thời gian thủy phân 6 giờ, nhiệt độ thủy phân 45ºC Với điều kiệnnày protein thủy phân từ thịt cá có vị đắng thấp, sản phẩm này có thể sửdụng bổ sung vào các thực phẩm khác để tăng thêm mùi vị

Yun et al., (2016) đã tiến hành thủy phân ốc ngón tay (Sinonovacula constricta) bằng enzyme protease ở pH với tỷ lệ enzyme/cơ chất là

3000U/g protein Phản ứng được dừng lại bằng cách nung nóng hỗn hợp ở90ºC trong 10 phút, sau đó ly tâm ở 8000g trong 20 phút ở 4ºC Nhằm xácđịnh các peptide có hoạt tính sinh học cụ thể là khả nức chế enzyme chuyểnđổi angiotensin I

Trước đó, Samuel and Rong-Rong Lu (2010) đã nghiên cứu mức độ

thủy phân DH và hoạt tính kháng gốc tự do DPPH của dịch thủy phân wheyprotein Protein đã được thủy phân bằng các enzyme thương mại nhưtrypsin, promatex, flavorzyme, protease N và các enzyme thương mại thô,protease kiềm 2709 và ASI 398 trong thời gian thích hợp là 4 giờ ở điềukiện tối ưu của mỗi enzyme về pH và nhiệt độ Kết quả cho thấy, tất cả cácenzyme đều tạo ra sản phẩm thủy phân whey protein có hoạt tính chốngoxy hoá Trong đó, enzyme Flavorzyme và ASI 398 có nguồn gốc proteasetrung gian có DPHH cao nhất Diphenyl-picrylhydrazyl) trong khi đóprotease alkaline 2709 mang lại DH cao nhất Nhiệt độ, độ pH, nồng độchất nền và tỷ lệ enzyme so với chất nền chất nền (ES) đã cho thấy ảnhhưởng đến mức độ thủy phân DH và hoạt động kháng oxy hóa DPPH củawhey protein có nguồn gốc từ Trysin Đồng thời, xác định không có sựtương quan giữa mức độ thủy phân DH và hoạt động kháng oxy hóa DPPH.Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấytiềm năng của việc thu nhận protein hòa tan từ các nguồn nguyên liệu khácnhau có khả năng kháng oxy hóa Trên nền tảng các nghiên cứu này có thể

giúp tăng khả năng ứng dụng và khám phá ra những ứng dụng mới hay đặctính sinh học khác nhau từ nguồn dịch protein thủy phân Tuy nhiên, điềukiện để thu nhận protein hòa tan và khả năng kháng oxy hóa DPPH còn phụthuộc rất lớn ở mỗi loại nguyên liệu nên cần phải tiến hành khảo sát mộtcách cẩn thận trên từng đối tượng.

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm, thời gian

Các thí nghiệm được tiến hành bố trí, phân tích các chỉ tiêu và xử lý

số liệu tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nôngnghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 01/2017 đến tháng 4/2017

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

- Máy xay BIGSUNBB – 179, công suất 250 W, Việt Nam,

- Cân điện tử, độ chính xác 0,0001 g, Ohaus, Mỹ,

- Cân điện tử, độ chính xác 0,1 g, Satedo, Trung Quốc,

- Máy khuấy từ Toshiba, Magnestir MG-10, Nhật,

- Máy đo quang phổ Visibale Spectrophotometer 722, Trung Quốc,

- Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp, Herlme Z323K, Rotana 46 R, Đức,

- Hệ thống trích béo Shoxlet,

- Bộ chưng cất đạm Kjeldalh,Velp, Italy,

- Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1ºC, Ý

- pH kế HANNA, TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý

- Tủ đông Acson International, model Acson R134a, -25ºC, Nhật

- Một số dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm và một số dụng cụkhác có liên quan

3.1.3 Hóa chất sử dụng

- DPPH (2,2 –Diphenyl–1–picrylhydrazyl)

- Phenolphtalein, PA, Việt Nam,

- Sodium hydroxyde , độ tinh khiết 99,5%, Việt Nam,

- Sodium potasium tartrate, độ tinh khiết 99,5%, Việt Nam,

- Ống chuẩn natrihidroxide 0,1 N, Việt Nam,

- Ống chuẩn acid sulfuric 0,1 N, Việt Nam,

- Thuốc thử Reagent Folin Ciocalteau, Merck, Đức,

- Bovin serum albumin (BSA), Ấn Độ,

- Đồng sulfate, độ tinh khiết 99,5%, Việt Nam,

- Các hóa chất có liên quan khác

Tất cả các hóa chất được cung cấp bởi chi nhánh công ty cổ phần Hóachất và Vật tư khoa học kỹ thuật Cần Thơ; enzyme alcalase được nhập khẩu

và phân phối bởi công ty Trách nhiệm Hữu hạn và Thương mại Phúc Hưng(Phutraco, 364/37 Thoại Ngọc Hầu, Phường Phú Thạnh, Quận Tân Phú,Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam)

3.1.4 Nguyên liệu

Nguyên liệu cá lóc được mua từ vùng nuôi cá lóc ở huyện Tam Bình,tỉnh Vĩnh Long Cá sau khi thu mua vào buổi sáng (trước 6 giờ), được chứatrong các thùng nước, vận chuyển về phòng thí nghiệm với thời gian trungbình 1 giờ Đến phòng thí nghiệm (Bộ môn Công nghệ thực phẩm, KhoaNông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ), cá còn sốngđược giữ ổn định trong bể nước ít nhất 1 giờ trước khi xử lý, nhiệt độ nướcđạt khoảng 25°C

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích và đo đạc theo các phương phápđược tổng hợp ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

ST

T

không đổi theo phương pháp NMKL số