NGHIÊN cứu QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT và TINH SẠCH sơ bộ ENZYM CELLULASE từ TRICHODERMA VIRIDE (2)

Tận dụng phụ phế liệu này làm nguồn carbon để sản xuất enzym cellulase bằng cách nuôi cấy nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới

Tp HCM, tháng 08 năm 2009

i

LỜI CẢM ƠN

Đề tài tốt nghiệp là một công trình nhỏ nhưng lại mang ý nghĩa lớn lao đối với sinh viên ngành công nghệ thực phẩm Nó được đúc kết từ những kiến thức suốt 4 năm học cũng như những kinh nghiệm thực tế Đóng góp vào công trình này là sự quan tâm không nhỏ của rất nhiều người

Nhân đây, tôi xin đặc biệt cảm ơn: sự tận tâm hướng dẫn của thầy Huỳnh Quang Phước, cùng thầy cô Khoa công nghệ thực phẩm Trường đại học kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Sự hỗ trợ nhiệt tình từ giáo viên quản lý và các bạn nghiên cứu chung tại phòng thí nghiệm vi sinh

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến mẹ người đã động viên chia sẻ và giúp đỡ con trong suốt thời gian qua

Một lần nữa xin chân thành cảm ơn

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2009

Sinh viên

HUỲNH THỊ HỒNG SƯƠNG

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẨN

MỤC LỤC

Trang bìa lót i

Nhiệm vụ đồ án Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh mục hình vẽ v

Danh mục bảng biểu vi

Danh mục các từ viết tắt vii

CHƯƠNG 1: LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về cellulose 3

2.1.1 Cấu tạo cellulose 3

2.1.2 Đặc tính của cellulose 4

2.2 Giới thiệu sơ lược về enzym 5

2.2.1 Giới thiệu về enzym cellulase 8

2.2.2 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15

2.3 Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzym 18

2.4 Yêu cầu của giống trong công nghệ sản xuất enzym 18

2.5 Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp cellulase 19

2.5.1 Sinh tổng hợp enzym cảm ứng 19

2.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến quá trình STH cellulase 20

2.6 Giới thiệu phương pháp lên men bề mặt 21

2.6.1 Ưu nhược điểm của phương pháp lên men bề mặt 21

2.6.2 Phương pháp lên men thu nhận enzym từ T viride 22

2.7 Tách và tinh sạch chế phẩm enzym 23

2.8 Ứng dụng của cellulase 24

2.8.1 Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc 24

2.8.2 Thủy phân gỗ và các phế liệu gỗ 25

2.8.3 Phá vỡ thành tế bào 25

CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Nguyên vật liệu 26

3.1.1 Giống vi sinh vật 26

3.1.2 Nguyên liệu 26

3.1.3 Môi trường nuôi cấy 27

3.1.4 Thiết bị nghiên cứu 27

3.2 Các phương pháp nghiên cứu 27

3.2.1 Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh 27

3.2.2 Phương pháp phân tích vi sinh 35

3.3 Bố trí thí nghiệm 37

3.3.1 Thí nghiệm 1- Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu 37

3.3.2 Thí nghiệm 2- Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy đến khả năng STH cellulase 37

3.3.3 Thí nghiệm 3- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng STH cellulase 38

3.3.4 Thí nghiệm 4- Khảo sát tỷ lệ nước cất và đệm acetate tối ưu để tách chiết enzym 38 3.3.5 Thí nghiệm 5- Khảo sát tỷ lệ cồn, aceton, muối để tủa enzym 39

3.3.6 Thí nghiệm 6- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm enzym .43

3.3.7 Thí nghiệm 7- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm 43

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

4.1 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu của bã khoai mì 44

4.2 Kết quả chọn chủng có hoạt lực cellulase mạnh 44

4.2.1 Kết quả lựa chọn sơ bộ bằng thạch đĩa 44

4.2.2 Kết quả lựa chọn bằng phương pháp lên men định lượng hoạt độ cellulase 46

4.3 Kết quả sát định đường cong tăng trưởng của nấm mốc T.viride 46

4.4 Kết quả ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

của T viride 47

4.5 Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 48

4.6 Kết quả nghiên cứu tỷ lệ nước cất và đệm acetate tối ưu để tách chiết enzym 49

4.6.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ nước cất tối ưu để chiết enzym 50

4.6.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ acetate tối ưu để chiết enzym 51

4.6.3 Kết quả hoạt tính cellulase của dịch chiết thô 52

4.7 Kết quả nghiên cứu quá trình tinh sạch enzym bằng phương pháp tủa 53

4.7.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzym 53

4.7.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ aceton dùng để tủa enzym 54

4.7.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ muối ammonium sulfate dùng để tủa enzym 55

4.7.4 So sánh kết quả của 3 phương pháp tủa 56

4.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến chế phẩm enzym cellulase 57

4.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzym cellulase 60

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

5.1 Kết luận 64

5.2 Kiến nghị 64 Tài liệu tham khảo I PHỤ LỤC II

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 Bảng 2.1: Hàm lượng cellulose trong một số loại thực vật 3

2 Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc của exoglucanase 10

3 Bảng 3.1: Thành phần hóa học bã khoai mì 26

4 Bảng 3.2: Môi trường nuôi cấy nấm mốc 26

5 Bảng 3.3: Chuẩn bị dựng đường chuẩn glucose 33

6 Bảng 3.4: Chuẩn bị dựng đường chuẩn protein 35

7 Bảng 3.5: Tỷ lệ giữa nước cất và canh trường nuôi cấy để chiết enzym 38

8 Bảng 3.6: Tỷ lệ giữa đệm acetate và canh trường nuôi cấy để chiết enzym 39

9 Bảng 3.7: Tỷ lệ giữa dung môi ethanol và dịch chiết enzym dùng để tủa enzym 40

10 Bảng 3.8: Tỷ lệ giữa dung môi aceton và dịch chiết enzym dùng để tủa enzym 41

11 Bảng 3.9: Tỷ lệ giữa dung dịch muối và dịch chiết enzym dùng để tủa enzym 42

12 Bảng 4.1: Thành phần hóa học của bã khoai mì 44

13 Bảng 4.2: Hoạt lực cellulase của các chủng nấm mốc 44

14 Bảng 4.3: Hoạt lực cellulase bằng phương pháp định lượng đường khử 47

15 Bảng 4.4: Hàm lượng sinh khối khô của T.viride theo thời gian 45

16 Bảng 4.5: Kết quả hoạt tính cellulase theo độ ẩm môi trường nuôi cấy 47

17 Bảng 4.6: Kết quả hoạt tính cellulase theo thời gian môi trường nuôi cấy 48

18 Bảng 4.7: Kết quả chiết enzym cellulase bằng nước cất 50

19 Bảng 4.8: Kết quả chiết enzym cellulase bằng acetate 51

20 Bảng 4.9: Hoạt tính và làm lượng protein của dịch chiết enzym thô 52

21 Bảng 4.10: Hoạt tính enzym trong các phân đoạn tủa cồn 53

22 Bảng 4.11: Hoạt tính enzym trong các phân đoạn tủa aceton 54

23 Bảng 4.12: Hoạt tính enzym trong các phân đoạn tủa muối 55

24 Bảng 4.13: So sánh kết quả của các mẫu tủa 56

25 Bảng 4.14: Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chế phẩm enzym cellulase 57

26 Bảng 4.19: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm enzym cellulase 58

T viride: Trichoderma viride

A oryzae: Aspergllus oryzae

DANH MỤC HÌNH VẼ

1 Hình 2.1: Cấu tạo phân tử cellulose 4

2 Hình 2.2: Cấu trúc cellulose và các vị trí cắt của enzym 14

3 Hình 2.3: Hình thái nấm mốc Trichoderma Viride 18

4 Hình 4.1: Vòng tròn phân giải cellulose của A oryzae 45

5 Hình 4.2: Vòng tròn phân giải cellulose của T viride 45

6 Hình 4.3: Đường cong tăng trưởng của T viride trên môi trường lỏng 46

7 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase theo độ ẩm 48

8 Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase theo thời gian 49

9 Hình 4.6: Đồ thị biểu thị hoạt tính và protein của dịch chiết enzym bằng nước cất 50

10 Hình 4.7: Đồ thị biểu thị hoạt tính và protein của dịch chiết enzym bằng đệm acetate 52

11 Hình 4.8: Đồ thị hoạt tính enzym từ các phân đoạn tủa cồn 53

12 Hình 4.9: Đồ thị hoạt tính enzym từ các phân đoạn tủa aceton 55

13 Hình 4.10: Đồ thị hoạt tính enzym từ các phân đoạn tủa muối 56

14 Hình 4.11: Đồ thị biểu thị hoạt tính enzym cellulase theo pH của chế phẩm enzym 57

15 Hình 4.12: Đồ thị biểu thị hoạt tính enzym cellulase theo nhiệt độ của chế phẩm enzym 58

TÓM TẮT ĐỒ ÁN

Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong nông nghiệp enzym này dùng chế biến thức ăn cho vật nuôi, bên cạnh đó chúng còn được ứng dụng cho sản xuất phân hữu cơ Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu cellulose (rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa, dăm bào…) để tạo thành glucose, mật đường thay thế dần cho thủy phân bằng acid Việc tinh sạch enzym cellulase là một trong những bước tiến quan trọng của lĩnh vực công nghệ enzym Kỹ thuật này đã công cấp lượng enzym sạch phục vụ cho rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học Nắm bắt được nhu cầu của thị trường tôi tiến

hành nghiên cứu việc thu nhận và tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ Trichodema viride lên

men từ bã khoai mì

Đề tài gồm những nội dung chính sau đây:

- Nuôi cấy và khảo sát một số yếu tố như: độ ẩm, thời gian để thu được chế phẩm enzym có hoạt lực cao

- Chiết xuất enzym cellulase thô từ canh trường nuôi cấy Trichoderma viride

- Tinh sạch sơ bộ bằng cách tủa phân đoạn enzym bằng một số tác nhân tủa: dung dịch muối ammonium sulfate bão hòa, ethanol lạnh, aceton lạnh

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ phân giải cellulose từ bã khoai mì

Kết quả đạt được như sau:

-Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm mốc trên bã khoai mì là 60%

-Thời gian thích hơp để nấm mốc phát triển trên môi trường bã khoai mì thu được enzym có hoat lực cao nhất là: 3 ngày

-Thu nhận enzym bằng phương pháp tủa cồn và aceton tối ưu nhất ở tỷ lệ 1:4, tủa muối tối ưu nhất ở phân đoạn thứ 5

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH: nhiệt độ tối ưu để thực hiện phản ứng là:

40oC, pH tối ưu để thực hiện phản ứng là pH = 5

Chương 1: LỜI MỞ ĐẦU Công nông nghiệp ngày càng phát triển, lượng chất hữu cơ thải ra càng nhiều Tận dụng phụ phế liệu này làm nguồn carbon để sản xuất enzym cellulase bằng cách nuôi cấy nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam Cơ chất thường được sử dụng nhiều nhất là bã mía, bã mì, do có hàm lượng cellulose cao Đây là cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất cellulase ở quy mô lớn

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có nền nông nghiệp khá phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển Lượng phế phẩm và phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào nhưng lại không nhận được sự quan tâm đúng mức Theo đó chất thải hữu cơ cũng tăng lên rất nhiều Trong đó phụ liệu của ngành sản xuất tinh bột khoai mì là một ví dụ điển hình và chiếm khoảng ½ khoai nguyên liệu Nếu công suất nhà máy tinh bột khoai mì là 200 tấn/ ngày thì mỗi ngày nhà máy thải ra môi trường khoảng 20 tấn bã khoai mì gây ô nhiễm nghiêm trọng chính vì thế đã và đang có nhiều hướng giải quyết lượng bã khoai mì sau sản xuất như phơi khô làm thức ăn gia súc nhưng chưa khả thi do không thực sự đảm bảo nguồn dinh dưỡng, và không tận dụng triệt để nguồn phế phẩm Nguồn phế phẩm này để lâu sẽ bị vi sinh vật tấn công gây hư hỏng tạo mùi khó chịu gây ô nhiễm môi trường và hao tốn diện tích Trong bã khoai mì có hàm lượng cellulose cao nên ta có thể tận dụng bã khoai mì như nguồn cacbon để cảm ứng cho vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase

Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong nông nghiệp enzym này dùng chế biến thức ăn cho vật nuôi, bên cạnh đó chúng còn được ứng dụng cho sản xuất phân hữu cơ Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu cellulose (rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa, dăm bào…) để tạo thành glucose, mật đường thay thế dần cho thủy phân bằng acid

Việc tinh sạch enzym cellulase là một trong những bước tiến quan trọng của lĩnh vực công nghệ enzym Kỹ thuật này đã công cấp lượng enzyme sạch phục vụ cho rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học

Nắm bắt được nhu cầu của thị trường tôi tiến hành nghiên cứu việc thu nhận và tinh

sạch sơ bộ enzym cellulase từ canh trường nuôi cấy Trichodema viride trên bã khoai mì

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chúng tôi cố gắng giải quyết các vấn đề sau:

- Chọn chủng nấm mốc thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase

- Tách chiết enzym thô

- Tinh sạch sơ bộ enzym thô

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzym sau khi tinh sạch sơ bộ

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cellulose [16]

2.1.1 Cấu tạo cellulose

- Cellulose là polyanhydroglucose có mức độ trùng hợp khoảng 14000, có dạng hình sợi Nhiều phân tử celluose liên kết với nhau tạo thành chùm gọi là micelle nhờ liên kết hydro Mỗi mixen thường có khoảng 60 phân tử cellulose Sợi cellulose không hòa tan chính

là do các phân tử cellulose được xếp song song, sát lại với nhau và phía ngoài được bao bằng lớp vỏ chung có chứa sáp và pectin

Bảng 2.1: Hàm lượng cellulose trong một số loại thực vật

Hình 2.1: Cấu tạo của phân tử cellulose

- Trong phân tử cellulose có nhiều nhóm hydroxyl tồn tại ở dạng tự do, hydro của chúng dễ dàng bị thay thế bởi một số gốc hóa học ví dụ như metyl, hoặc các gốc acetyl hình thành nên các gốc ete hoặc este của cellulose Mặt khác, cũng có nhiều dẫn xuất của cellulose

có ý nghĩa quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp Ví dụ như các dẫn xuất nitrocellulose, acetylcellulose trong kỹ nghệ sợi nhân tạo, da nhân tạo, kỹ nghệ chất nổ, chất dẻo Đặc biệt trong thời gian gần đây, các dẫn xuất cellulose như carboxymetyl cellulose, dietylaminoetyl cellulose được dùng rất hiệu quả trong các phương pháp sắc ký trao đổi ion để phân chia hỗn hợp protein

- Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng đối với con người nhưng ngược lại ở gia súc đó là nguồn cung cấp năng lượng chính yếu vì chúng có thể tiêu hóa cellulose một cách dễ dàng nhờ vi khuẩn cộng sinh trong dạ cỏ có khả năng tiết ra enzym cellulase để phân giải cellulose thành chất dinh dưỡng

2.1.2 Đặc tính của cellulose

2.1.2.1 Tính chất vật lý

- Cellulose là chất rắn không màu, không mùi, không vị, không tan trong nước ( chỉ phồng lên nếu hấp thụ nước), không tan trong các dung môi hữu cơ, không có trạng thái nóng chảy Khi đun trong chân không thì bị phân hủy thành glucose

- Cellulose bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt 40-500C do sự thủy phân cellulose bởi enzym cellulase

- Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao

- Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin và lignin Điều này ảnh hưởng đến sự phân hủy cellulose của enzym cellulase

- Cellulose còn có tác dụng với anhydric acetic tạo sợi diacetat hay tác dụng với acid nitrit tạo ra nitro cellulose có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thuốc nổ

2.2 Giới thiệu sơ lược về enzym [10,11]

- Pavlov đã nói: “ hoạt động của enzym là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống Không có sự sống nào lại không có quá trình enzym” Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của Ăng- Ghen: “Sự sống đó chính là phương thức tồn tại của thể protein” Như vậy enzym

có bản chất là protein có hoạt tính xúc tác chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật

- Trong cơ thể sinh vật, các phản ứng sinh hóa được xảy ra liên tục Nhờ có phản ứng như thế các cơ thể sinh vật mới tồn tại và phát triển được Thực hiện và điều khiển các phản ứng này lại hoàn toàn do enzym

- Enzym có mặt trong mọi mô, mọi tế bào, nhưng mỗi tế bào, mỗi loại mô thường có những hệ thống enzym đặc biệt, và cùng một enzym có trong các mô khác nhau hoặc thậm chí

ở các bộ phận khác nhau của cùng một loại tế bào cũng có thể khác nhau về lượng và có khi

cả về chất

- Các loại enzym trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt xích hoàn

chỉnh Sự trục trặc nào đó ở trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm cho rối loạn cả hệ thống Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzym lại do gen

- Các enzym không chỉ tham gia các phản ứng xúc tác sinh hóa trong cơ thể vi sinh vật

mà còn tham gia các phản ứng ngoài cơ thể do quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Quá trình trao đổi chất này được sự tham gia của các enzym tạo ra được các sản phẩm Các sản phẩm trao đổi chất được chia thành hai loại: loại sản phẩm trao đổi chất bậc 1 (các sản phẩm phục vụ trực tiếp trong xây dựng tế bào) và loại trao đổi chất bậc 2 (các sản phẩm trao đổi chất hoặc dư thừa hoặc không tham gia trực tiếp vào quá trình xây dựng tế bào)

- Các enzym xúc tác hầu hết cho các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống Bảo đảm cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng cân đối, theo những chiều hướng xác định Enzym đảm bảo cho sự thay đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là đảm bảo tiên quyết cho sự tồn tại của cơ thể sống

- Enzym không những hoạt động xúc tác trong tế bào mà còn ngoài tế bào vi sinh vật, chính điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng enzym vào nhiều lĩnh vực khác của công nghiệp và đời sống

- Enzym có hiệu suất xúc tác cực kì lớn, hoạt động xúc tác của enzym lớn gấp hàng trăm hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác Ví dụ như trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng saccharase làm xúc tác tốc độ phản ứng tăng gấp 2x1012 lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác

- Điều quan trọng là enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh lý Hơn nữa enzym lại có khả năng lựa chọn cao đối với phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà

nó tác dụng

- Vì enzym là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hóa học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học Enzym có trong tất cả các cơ quan,

mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật

- Enzym được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau: từ động vật (pepsin từ dạ dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…) Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này để làm nguyên liệu sản xuất với quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzym nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân Như vậy, trong các

nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn Viện sỹ viện hàn lâm khoa học Liên Xô A.A.Imsenetxki

đã nhấn mạnh: “Số lượng, tính đa dạng và hoạt tính enzym của vi sinh vật là vô cùng đặc biệt, động vật và thực vật không tài nào so sánh được” Enzym thu nhận từ nguồn vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính độc đáo vượt xa các enzym từ động vật và thực vật

- Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzym với một lượng lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và

có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công nghệ khác nhau

- Hệ enzym vi sinh vật vô cùng phong phú Từ vi sinh vật không những chỉ có thể thu được một số lượng lớn các enzym khác nhau, mà từ một số rất lớn vi sinh vật đã biết luôn luôn có thể tìm được những vi sinh vật có phức hệ thích ứng tốt hơn nhiều với điều kiện của sản xuất Vi sinh vật có thể đồng hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên Trong lúc đó có nhiều chất mà động vật và thực vật không thể đồng hóa được

- Enzym của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các vi sinh vật khác Do vậy chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzym có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất Người ta tính rằng trong 24 giờ, vi sinh vật có thể chuyển hóa một lượng lớn thức ăn gấp 30-40 lần so với trong lượng cơ thể của chúng

- Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước

bé nhưng tỉ lệ enzym trong tế bào tương đối lớn nên trong quá trình sản xuất chế phẩm enzym khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao Trong một thời gian ngắn, với qui mô nhỏ cũng có thể sản xuất được enzym Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối

vi sinh vật làm nguồn enzym

- Phần lớn thức ăn dùng để nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền Đa số vi sinh vật cho enzym thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản rẻ tiền như các phụ phế liệu, phế phẩm của các ngành sản xuất

- Ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động của môi trường, có khả năng thích ứng với nguồn dinh dưỡng Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh

tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi cấy Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu được enzym có độ thuần khiết cao

2.2.1 Giới thiệu về enzym cellulase [11]

và β-glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, β-glucosidase) Các enzym này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ cho nhau Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết hydrogen trong phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose và sau cùng là β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose

2.2.1.2 Phân loại

Theo phân loại của hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB-International Union of Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzym: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucosidase

có ký hiệu EC 3.2.1.21

 Endoglucanase EC 3.2.1.4

- Tên thường gọi là cellulase

- Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase

- Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzym này bằng những tên khác : endo-1,4- glucanase; β-1,4- glucanase; cellulase A; endoglucanase D; alkali cellulase;cellulase A3; celludextrinase…Enzym này thường thủy phân các kiên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose

β-D-và các β-D-glucan của ngũ cốc

 Exoglucanase EC.3.2.1.91

- Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase

- Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase

- Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1; C1 cellulase; exo- 1,4-glucan-cellobiohydrolase…

β Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4β ββ Dβ glucosid trong cellulose và cellotetraose từ đầu không khử

 β-glucosidase EC 3.2.1.21

- Tên thường gọi là β-glucosidase

- Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase

- Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase; salicilinase; arbutinase…

- Enzym này thủy phân các gốc glucosid Một số trường hợp cũng thủy phân galactosidase, β-D-fucoside; β-D-xyloside; α-L- arabinoside

β-D-2.2.1.3 Cấu tạo của cellulase

- Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn những phần phụ khác Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm đuôi vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym

- Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 KDal Cấu trúc không gian khoảng 280-600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin

- Bằng cách bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan, hệ enzym cellulase đã thủy phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose Trong đó exoglucanase là enzym chính trong quá trình thủy phân cellulose

- Exoglucanase là một enzym chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn cellulose qua một vùng liên kết được glycosil hóa cao Exoglucanase gồm có 2 chuỗi gọi là chuỗi A và chuỗi B Cả hai chuỗi đều có 434 acid amin gốc nhưng giữa chúng cũng có sự khác nhau để phân biệt

Bảng 2.2 : Đặc tính cấu trúc của exoglucanase 1

Hai bản xoắn β không song song dựng chụm vào nhau mặt đối diện tạo một kẹp β Phần còn lại bao gồm các vòng ngắn được cố định bởi các cầu disulfide và nối các sợi β với nhau và có 4 xoắn α trong cấu trúc

Có một nguyên tử Ca2+ ở cà hai chuỗi A và B của cellulose và ở mỗi chuỗi có kết hợp với glu 295 và glu 325 Một phân tử nước được gắn vào Ca2+

2.2.1.4 Tính chất

 Tính đặc hiệu

Cellulase thủy phân các liên kết 1,4- β-D-glucosid trong cellulose và gốc β-D-glucan của ngũ cốc Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động lên trên các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellobose, β-glucosidase thủy phân các gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu của phân tử cellulose

 Đặc tính hóa lý và hóa sinh

Theo nghiên cứu hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần các acid amin giống nhau Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Bên cạnh hoạt tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động khác của enzym và các hoạt động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm

- Nhiệt độ tối ưu: 40-50oC

- pH tối ưu: 4-5

2.2.1.5 Các chất ức chế

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose Ion

Hg2+ ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn2+, Ag+, Zn2+ ức chế nhẹ

- Để xác định hoạt tính enzym C1 người ta thường sử dụng các loại cellulose tự nhiên nhất là sợi bông thấm nước

- Enzym Cx còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase Enzym này thủy phân các cellulose thành cellobiose, chữ x cho ta biết đây là loại enzym có nhiều thành phần khác nhau Người ta thường chia Cx thành 2 loại:

- Exo-β-1,4-glucanase: xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose

- Endo- β-1,4-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosid ở bất kỳ chổ nào bên trong chuỗi cellulose phân tử

- Để xác định hoạt tính enzym Cx người ta thường sử dụng CMC (cacboxymetyl cellulose) hay HEC (hydroxyetyl cellulose)

Theo Ogawa và Toyama (1967) cho rằng còn có một enzym khác có tác dụng trung gian giữa C1 và Cx Enzym C2 tác động vào các cellulose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng thành những loại cellulosedextrin hòa tan Enzyme Cx sẽ tiếp tục thủy phân các loại này thành cellobiose

Enzyme β-glucosidase là những enzym rất đặc hiệu, enzym này thủy phân cellobiose thành cellohexose (D-glucose)

 Cơ chế tác động của cellulose được nêu ra bởi nhiều tác giả khác nhau:

 Theo Wakabayasi và Nisizawa (1964)

Cellulose tự nhiên cellulose kết tinh có glucose

mức cao phân tử thấp

 Theo Mandels và Reese (1964)

Cellulose Cellulose Cellobiose Glucose

phản ứng

C1 Cx β- glucosidase

 Theo Iwasaki và các đồng sự (1965)

Cellulose Cellodextrin Glucose

Endoenzyme Exoenzyme

 Theo Ogawa và Toyama (1967)

Cellulose Cellulose Các sản phẩm hòa tan Cellobiose

tự nhiên không tan

C1 C2

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vị trí cắt của enzym

2.2.2 Vi sinh vật tổng hợp cellulase [12,13]

2.2.2.1 Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase

Cellulase có mặt trong các hạt thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm, ốc sên Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn cung cấp cellulase khá phong phú gồm các loại xạ khuẩn,

vi khuẩn, nấm mốc Popov (1875) là người đầu tiên xác nhận khả năng phân giải cellulose của

vi sinh vật kỵ khí G Van Iterson (1903) phát hiện khả năng phân giải cellulose của các vi sinh vật hiếu khí

Trong điều kiện hiếu khí các loài nấm phân hủy cellulose mạnh hơn nhiều so với các loài vi khuẩn Ngược lại trong điều kiện kỵ khí thì các loài vi khuẩn lại tỏ ra khả năng này mạnh hơn các loài nấm sợi

Trong quá trình phân giải các chất hữu cơ có chứa cellulose, nấm và vi khuẩn tạo ra các sản phẩm và sinh khối của chúng, khí CO2 hoặc CH4 và các sản phẩm phụ khác Trong các loài nấm chỉ có một số rất ít có khả năng sinh tổng hợp enzym cellulose cao Các công trình nghiên cứu về các sản phẩm enzym này phát triển không ngừng Ngày nay nhiều nước trên thế giới sản xuất chế phẩm cellulase vi sinh vật công nghiệp ở quy mô lớn, và đã áp dụng trong nhiều lĩnh vực

2.2.2.2 Xạ khuẩn

Nhiều tác giả đã nghiên cứu khả năng khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn

Streptomyces, Actinomyces… các ông đã nhấn mạnh rằng trong cùng một loài tính phân giải

cellulose của các chủng khác nhau là khác nhau

Các loài xạ khuẩn phân giải cellulose thuộc loài Actinomyces có thể được xếp hạng

theo mức độ từ mạnh xuống yếu

- Loại 1: Act coelicolor, Act sulfureus, Act aureus, Act ellulosae, Act chromogenes, Act verne, Act glaucus…

- Loại 2: Act hydroscopycus, Act griseoflavus, Act albidus, Act viridans, Act griseolus…

- Loại 3: Act themoficus, Act xanthostromus

- Loại 4: Act flavochromogenes, Act bovis, Act sampsonii

Bằng phương pháp điện di trên tinh bột Enger và Steeper (1965) chứng minh cellulose

do Streptomyces antibioticus sinh ra thuộc loài Cx, enzym này gồm 3 thành phần khác nhau

Sietsma và cộng sự (1968) lại nghiên cứu về enzym cellulase của một chủng xạ khuẩn chưa

định tên (Streptomices sp 0143) và nhận thấy enzym này có tác động lên CMC, pH thích hợp

nhất là 5 còn nhiệt độ thích hợp nhất là 400C

Fergus (1969) chứng minh xạ khuẩn ưu nhiệt Streptomices thermoviolaceusvar Pingens có khả năng phân giải giấy lọc, chúng sinh khá nhiều enzym Cx khi phát triển trên

các môi trường chứa CMC

Phức hệ enzym cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ nấm Myrothecium verrucaia

Bằng phương pháp điện di, người ta thấy phức hệ enzym này có 6 cấu tử nhưng chỉ có 3 cấu

tử có khả năng thủy phân được cellulase nguyên thủy (sợi bông) và cellulase hòa tan Ở nấm

Polyporus versicolor thì phức hệ cellulase có 4 cấu tử trong đó có một là β- glucosidase Các

enzym này khác nhau về khối lượng phân tử, về tính đặc trưng và về tốc độ tác dụng lên cellulose

Trong đó giống nấm sợi Trichoderma đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu sản xuất

cellulase, nấm này sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β- glucosidase

Quá trình sinh tổng hợp β- glucosidase thường xảy ra chậm hơn quá trình tổng hợp C1 và

Cx là do bản chất của β- glucosidase là một enzym tham gia quá trình chuyển hóa cellulose biến tính chứ không có khả năng chuyển hóa cellulose kết tinh Như vậy cellulose biến tính có thể xem như là chất cảm ứng của β- glucosidase, mà cellulose biến tính được hình thành trên

cơ sở dưới tác dụng của enzym C1

2.2.2.5 Giới thiệu về nấm sợi Trichoderma viride [13]

 Vị trí phân loại

- Lớp Deuteromycetes

- Bộ Moniliales

- Họ Moniliaceae

- Giống Trichoderma

- Loài Trichoderma viride

Trichoderma được phân bố nhiều trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất có

chứa phân hữu cơ

Trichoderma viride hoạt tính ưu việt là hệ cellulase của chúng hoạt động rất mạnh và

khả năng phân giải hoàn toàn cellulose tự nhiên tạo thành glucose với hiệu suất cao

Hình 2.3: Hình thái nấm mốc Trichoderma viride

2.3 Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzym

Trong công nghệ enzym từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định:

- Giống vi sinh vật quyết định đến năng suất của enzym

- Giống vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính enzym)

- Giống vi sinh vật quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

- Giống vi sinh vật quyết định giá thành cho sản phẩm Như vậy giống vi sinh vật có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật

2.4 Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzym

Công nghệ sản xuất enzym thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp Do đó giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ enzym cần có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định Đó là:

- Giống vi sinh vật phải tạo ra sản phẩm mà ta mong muốn Sản phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác Vì vậy trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp nhiều chất và tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau Chính vì thế giống vi sinh vật dùng cho sản xuất một sản phẩm nào

đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng

- Cho năng suất sinh học cao

- Có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp

- Có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại đại phương nơi nhà máy đang hoạt động

- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh

- Có tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo ra sản phẩm mong muốn, dễ tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất

- Ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản

Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết

2.5 Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp cellulase [12,13]

2.5.1 Sinh tổng hợp enzym cảm ứng

Một quá trình sinh tổng hợp enzym được gọi là cảm ứng nếu như nó chỉ xảy ra với mức độ đáng kể khi môi trường có cơ chế đặc hiệu của enzym này hoặc các chất có cấu trúc tương tự cơ chất Các enzym thuộc loại này được gọi là enzym cảm ứng Các cơ chất kích thích quá trình sinh tổng hợp enzym này được gọi là cơ chất cảm ứng Cellulase là một hệ enzym thuộc hệ enzym cảm ứng Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên môi trường chứa cellulose hay dẫn xuất của cellulose và lactose, còn trên môi trường chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không sinh ra Một trong các phân tử kích thích nấm sợi sinh tổng hợp cellulase có hiệu quả nhất là sophorose, chất này có nguồn gốc từ các phân tử celloligosaccharide

2.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase của vi sinh vật.[11]

2.5.2.1 Nguồn carbon

Để vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase , trong môi trường nhất thiết phải có chất cảm ứng là cellulose Cellulose trong môi trường có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, mùn cưa, rơm… Ngoài ra chất cảm ứng của cellulase còn có thể là cám mì, lactose

Những loài vi sinh vật khác nhau thì có những nguồn cản ứng khác nhau vì từ chất cảm ứng đó vi sinh vật sẽ sinh ra enzym có hoạt tính mạnh nhất

Các nguồn carbon khác nhau như glucose, cellobiose, acetat, citrat, oxalate và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs, nếu trong môi trường có nồng độ rất ít thì có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển và tạo ra enzym, nhưng nếu có nồng độ cao thì kìm hãm sinh tổng hợp cellulase

2.5.2.2 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất rõ rệt với việc tạo thành cellulase

ở nấm Theo Sin và Sinden (1951) khi sử dụng hết 1g nitơ nhiều vi sinh vật phân giải cellulose sẽ phân giải được khoảng 24-25g cellulose

Hoạt tính enzym có thể thay đổi rất nhiều khi ta thay đổi các thành phần chính của môi trường trong đó có nitơ Nitrat là nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật

Trong môi trường nuôi cấy, các muối amon làm acid hóa môi trường nên nó ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzym cellulase mà thậm chí còn ức chế quá trình sinh tổng hợp enzym, và có thể làm mất hoạt tính enzym sau khi tạo thành

Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Tùy theo đặc tính sinh lý của từng giống mà các hợp chất nitơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, còn cao ngô kích thích sinh ra exoglucanase I và exoglucanase II Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt các acid amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác

2.5.2.3 Các nguyên tố khoáng và vitamin

Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rất rõ rệt đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Trong đó, Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzym này ở nhiều chủng Nồng độ tối thích của Zn là 1,1- 2,2mg/l, Fe 2-10mg/l, Mn 3,4-27,2 mg/l

Biotin và thiamin trong môi trường dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến tổng hợp enzym cellulase

2.5.2.4 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật Hoạt động của các loài vi sinh vật dựa trên sự chuyển hóa của hàng loạt các phản ứng dựa theo những trình tự xác định Khi nhiệt độ tăng tốc độ các phản ứng này cũng tăng theo, nhưng khi nhiệt độ tăng quá một giới hạn nào đó thì tốc độ các phản ứng sẽ giảm

Các loài khác nhau thì có nhiệt độ hoạt động khác nhau, như Aspergillus niger, Trichoderma koningi phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-300C, đối với loài xạ khuẩn ưa nhiệt

như Thermonospora curvate phát triển ở nhiệt độ 50-600C và tích lũy nhiều enzym phân giải cellulose trên môi trường nuôi cấy chứa cellulose vi tinh thể và cao nấm men

2.6 Giới thiệu phương pháp lên men bề mặt

Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vi sinh vật thường được thực hiện theo phương pháp lên men bề mặt Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzym mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống

2.6.1 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

- Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:

+ Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp

+ Lượng enzym tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại

+ Chế phẩm enzym thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật, enzym

và nước) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém

+ Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy, những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn

- Phương pháp nuôi cấy bề mặt có những nhược điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là tốn khá nhiều diện tích nuôi cấy Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích

2.6.2 Phương pháp lên men bề mặt và thu nhận enzym cellulase từ nấm Trichoderma viride

2.6.2.1 Lên men bề mặt

Là quá trình mà vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất trên cơ chất rắn (bã mì, bã mía, bột bắp…) được làm ẩm với nước nhưng không có dòng nước tự do (hàm lượng nước từ 30-70% phụ thuộc vào khả năng hấp thụ nước của cơ chất và thế nước tối thiểu cần cho sự phát triển của vi sinh vật)

Trichoderma viride phát triển trên môi trường chất dinh dưỡng dạng rắn ( môi trường

rắn trước khi nuôi cấy nấm mốc cần làm ẩm trước) Để môi trường không bị bết dính trong khi hấp chín người ta bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác Sau khi hấp môi trường được làm nguội 30-400C rồi cấy vi sinh vật vào, trộn đều và nuôi ở nhiệt độ 28-300C trong 35-48 giờ, trong phòng thí nghiệm vô trùng có độ ẩm không khí 80-90%

Nấm khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxy của không khí để hô hấp Để đảm bảo nấm mọc đều trên bề mặt của môi trường và sử dụng nhiều chất dinh dưỡng để sản sinh enzym, lớp môi trường rắn cần phải mỏng, chiều dày khoảng từ 2-5 cm

Sau khi nuôi đủ thời gian để Trichoderma viride tổng hợp enzym, thu lấy môi trường

đem sấy nhẹ ở nhiệt độ 400C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ, thủy tinh hay túi PE Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế

2.6.2.2 Cơ chất cảm ứng

Bã khoai mì là chất thải có được từ quá trình chế biến tinh bột khoai mì Lượng bã thải này chiếm khoảng 20% lượng nguyên liệu và chiếm 50% tổng bả rắn

Theo số liệu của tổng cục thống kê năm 1998, diện tích trồng khoai mì ở nước ta gần

300000 ha với năng suất bình quân khoảng 9-10 tấn/ha, cho sản lượng gần 3 triệu tấn/năm Với kỹ thuật chế biến như của nước ta hiện nay lượng bã chiến khoảng ½ lượng nguyên liệu

và như vậy sẽ đạt đến trên 1 triệu tấn/năm Có nhiều nhà máy sản xuất tinh bột khoai mì với công suất bình quân 200 tấn/ngày, thải ra khoảng 120 tấn bã khoai mì tươi/ ngày

- Trong hàm lượng bã khoai mì có hàm lượng tinh bột kể cả carbohydartes hòa tan chiếm 40-70%, xơ khoảng 10-20%, protein 2-4%, chất béo 1-2% và lượng khoáng tổng không quá 3%

- Phần bã lâu nay vẫn chưa được sử dụng một cách hợp lý đồng thời cũng là một nhân

tố làm ô nhiễm môi trường sống của dân cư vùng chế biến Với số lượng lớn như vậy, việc xử

lý và sử dụng có hiệu quả nguồn bã thải này sẽ có ý nghĩa kinh tế xã hội đáng kể

2.7 Tách và tinh sạch chế phẩm enzym

- Trong cơ thể sinh vật , enzym có trong tế bào chất của tế bào Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng của tế bào Do đó để có thể chiết rút enzym nội bào trước hết cần phải

phá vỡ cấu trúc của tế bào Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học ( nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết bị đồng hóa) bằng tác dụng của các dung môi hữu cơ (rượu butylic, aceton, glycerin…), của sóng siêu âm

- Việc tách enzym ra khoải tế bào gặp rất nhiều khó khăn, do đó khi tách chúng phải hết sức lưu ý:

+ Enzym có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác

Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn

+ Enzym là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài

+ Enzym là protein mà proteine enzym luôn luôn đi cùng với những loại protein không phải enzym nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau Do đó việc tách protein enzym ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất định

- Đa số các ngành sản xuất thực phẩm cũng như công nghiệp nhẹ thì lại đòi hỏi phải dùng enzym sạch Để tách chiết enzym từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính và các dung dịch đệm thích hợp Trong đó, nước được sử dụng rộng rãi

và cho kết quả tốt nhất Các enzym được chuyển từ tế bào vào nước do sự chênh lệch nồng

độ Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzym được cô đặc dưới áp suất thấp sao cho hàm lượng chất khô không nhỏ hơn 50-55%

- Theo phương pháp khuếch tán bằng nước, có thể chiết được lượng enzym trên 90-95% và trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan Nước thường dùng để chiết có nhiệt độ 25-280C Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10-15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống còn 10-120C Trong dịch chiết ngoài enzym còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác , để loại bỏ chúng cần thực hiện nhiều biện pháp khác nhau

- Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng biện pháp thẩm tích đối với nước hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel

- Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc

pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel

2.8 Ứng dụng của cellulase [8]

Enzyme cellulase là enzym thủy phân cellulose, tạo ra các sản phẩm đường dễ tiêu hóa Thêm chế phẩm cellulase vào thức ăn giàu cellulose của động vật, thậm chí của người làm cho thực phẩm này mềm ra, dễ tiêu hóa hơn, do vậy tăng chất lượng và độ hấp thụ thức

ăn này

2.8.1 Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc

Chúng ta đều biết cellulose là thành phần quan trọng của vỏ tế bào thực vật Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được gia công bằng chế phẩm cellulase sẽ mềm ra tăng hệ số đồng hóa, chất lượng được tăng lên Do đó rất bổ ích khi sử dụng thức ăn cho trẻ em, cho người ăn kiêng cũng như chế biến thức ăn cho gia súc Việc nghiên cứu và sử dụng trực tiếp enzym cellulase trong quá trình chế biến thực phẩm cũng như trong chế biến thức ăn gia súc để cải thiện độ tiêu hóa đang được chú ý rất nhiều Ở Trung Quốc đang có phong trào sử dụng nấm mốc để chế biến các phụ phẩm nông nghiệp thành thức ăn cho lợn, còn ở Việt Nam đang có những ứng dụng cellulase trong việc thủy phân vỏ dứa, vỏ chuối…để làm thức ăn gia súc

2.8.2 Thủy phân gỗ và các phế liệu gỗ

Cellulase thủy phân gỗ và các phế liệu của gỗ, giấy báo cũ thành glucose Enzym

cellulase của Trichoderma viride thủy phân 100g cellulose thành 25g đường Trong quá trình

ủ cỏ xanh, sự phối hợp giữa enzym cellulase và các enzym thủy phân khác như pectinase, hemicellulase…có tác dụng phân giải thành tế bào thực vật, do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho

nhóm vi sinh vật Lactobacillus lên men sinh acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh

vật có hại khác

2.8.3 Cellulase được sử dụng để phá vỡ thành tế bào

- Cellulase phá vỡ tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật từ cây thuốc dễ dàng Điều này còn giúp cho việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào trần nhằm tạo các tế bào lai có những tính trạng mới theo mong muốn

- Cellulase được sử dụng để sản xuất tinh bột Cellulase của chủng Trichoderma viride và của

một số chủng nấm còn được sử dụng để tách tinh bột ra khỏi khoai lang và đậu tương Sau khi tách rời các tế bào khoai lang hay đậu tương ra nhờ các enzym tách tế bào người ta cho tiếp xúc với cellulase để phá vỡ thành tế bào và do đó giải phóng tinh bột ra một cách thuận lợi

hơn Cellulase còn có tác dụng làm mềm vải nên được bổ sung vào thành phần chất giặt tẩy trong công nghiệp bột giặt

- Một ứng dụng khác của cellulase là thủy phân cellulose để cung cấp cơ chất cho quá trình lên men, tạo ra hàng loạt các sản phẩm mong muốn như ethanol, glycerin, protein đơn bào…

việc sử dụng cellulase của T.viride để chuyển hóa các phế liệu chứa cellulose thành ethanol

cũng đang được nghiên cứu và áp dụng Người ta nhận thấy trộn xăng với ethanol là biện pháp hữu hiệu để giảm bớt chi phí về xăng cho các loại xe hơi, xe máy và bớt bụi khói

Chương 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên vật liệu

3.1.1 Giống vi sinh vật

Vi sinh vật sử dụng cho nghiên cứu là nấm mốc: Trichoderma viride, Aspergillus oryzae Các giống vi sinh vật được phân lập và giữ giống tại phòng thí nghiệm vi sinh Trường đại học kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

3.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường 1: môi trường giữ giống cấy chuyền (môi trường Czapek-agar)

Bảng 3.2: Môi trường nuôi cấy nấm mốc

3.1.4 Thiết bị nghiên cứu

Nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH, quang phổ kế, máy ly tâm(1000-4000rpm), máy lắc Tham khảo phần phụ lục C

3.2 Các phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Các phương pháp phân tích hóa lý và hóa sinh

3.2.1.1 Phương pháp định lượng nitơ tổng và protein thô bằng phương pháp Micro- Kjeldahl [3]

 Nguyên tắc

Khi đốt nóng phần vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa Carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O Còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0,1N Định phân lượng H2SO4