Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS để sản xuất chế phẩm PROBITICS

Cơ chế tác động của probiotics Sự tương tác lẫn nhau bình thường của hệ vi sinh đường ruột là một trong các yếu tố quan trọng đảm bảo sức khỏe của vật chủ, sự tương tác này bị gián đoạn

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đề Tài:

TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI

KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ

LỚP: 05DSH

TP Hồ Chí Minh, Thng 6 năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp ngoài nổ lực bản thân còn có sự giúp

đỡ của quý thầy cô và các bạn trong lớp

Tôi xin chân thành cảm ơn:

TS Nguyễn Hoài Hương là người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý bo trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp

Thầy cô khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tập 4 năm tại nhà trường

Thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hòan thành tốt đồ án tốt nghiệp

Tất cả các bạn sinh viên lớp 05DSH đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đồ án

Lời cảm tạ cuối cùng xin được giành gia đình Con xin cảm ơn ba mẹ Ba mẹ luôn là điểm tựa vững chắc, là niềm động viên và tạo điều kiện cho con có ngày hôm nay

CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU

Probitics là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng cách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Vi khuẩn probiotics giúp hoàn thiện hệ tiêu hóa, kháng các vi khuẩn gây bệnh thông qua các chất kháng khuẩn ( acid, bacteriocins, H2O2), tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol trong máu, khắc phục hiện tượng không tiêu hóa đường lactose

có trong sữa, giảm tiêu chảy Đặc biệt vi khuẩn probiotics không gây hại cho vật chủ

Hiện nay probiotics được ứng dụng rộng rãi trong các thực phẩm, dược phẩm, trong chăn nuôi Sử dụng probiotics trong dược phẩm và chăn nuôi có thể hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động đến sức khỏe con người

Phần lớn các chế phẩm probiotics là vi khuẩn lactic được phân lập từ hệ

đường ruột của người và động vật và được xem là an toàn: L acidophilus, L

casei

Môi trường MRS là môi trường chuẩn để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lacitc để thu sinh khối, nhưng nếu sử dụng môi trường này thì giá thành sản phẩm cao, kết quả chế phẩm tạo thành giá rất cao

Đề tài :” Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus

acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotics ” Với mục đích tận dụng các

nguồn nguyên liệu rẻ tiền để thay thế cho môi trường MRS trong sản xuất

sinh khối vi khuẩn lactic nói chung và L acidophilus nói riêng

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

 Khảo sát chọn nguồn cacbon thay thế glucose trong môi trường lên men

 Tối ưu hóa môi trường cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

L acidophillus

 So sánh động học nuôi cấy L acidophilus trên môi trường MRS và môi

trường tối ưu

 So sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E coli) của dịch nuôi cấy

L acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu

CHƯƠNG 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Probiotics

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu Probiotics

Vào những năm đầu của thế kỷ 19, những nghiên cứu đầu tiên về sự tương tác của vi sinh vật với cơ thể vật chủ đã bị phủ nhận Đến đầu 1885, Escherich đã miêu

tả về sự hình thành hệ vi sinh vật trong ruột của trẻ em và nêu ra những lợi ích của chúng trong tiêu hoá Doderlein khẳng định rằng sự có lợi của vi khuẩn trong âm đạo bằng cách sản xuất ra acid lactic, nó có thể ngăn chặn hoặc ức chế sự phát triển của

vi khuẩn gây bệnh Các vi khuẩn sản xuất acid lactic trong quá trình trao đổi chất

mà tiêu biểu là nhóm vi khuẩn lên men lactic đã được sử dụng kết hợp với các sản phẩm lên men sữa Cuốn sách Prolongation of Life của Metschnikoff đã đưa ra những lợi ích của vi khuẩn lactic đến sức khoẻ của con người khi con người sử dụng những sản phẩm sữa kết hợp với các vi khuẩn lactic Ông cho rằng người Cap-ca có thể sống lâu là do họ đã sử dụng một lượng lớn các sản phẩm sữa lên men [19] Henry Tissier là một bác sĩ khoa nhi ở Pháp kiểm tra phân của những trẻ em bị

tiêu chảy và thấy rằng chỉ chứa một lượng ít các vi khuẩn “bifi” Trong khi đó vi

khuẩn này lại tồn tại một lượng lớn trong phân của các trẻ em có sức khoẻ tốt Ông cho rằng vi khuẩn này có thể giúp bệnh nhân hồi phục lại bệnh.[45]

Năm 1900, Tissier cho rằng Bifidobacteria và một số nhóm vi khuẩn khác sản

sinh acid lactic nhưng chủ yếu là vi khuẩn lactic có tác dụng tốt đối với sức khoẻ [19]

Năm 1917, trước khi Alexander Fleming khám phá ra ampicilin, giáo sư

Alfred Nissle người Đức đã phân lập ra một chủng thuộc loài E coli không gây

bệnh từ phân của các chiến binh trong chiến tranh thế giới thứ nhất và ông đặt tên

chủng này là Nissle 1917 Các chiến binh này bị bệnh viêm ruột kết và chủng vi khuẩn Nissle 1917 được sử dụng như là probiotics để trị bệnh cho các chiến sĩ [46]

2.1.2 Định nghĩa Probiotics

Probiotics là thuật ngữ có nguồn gốc từ Hy Lạp bao gồm có hai từ: “pro” có ý nghĩa là vì, “biosis” có nghĩa là sự sống Probiotics được định nghĩa đầu tiên là do

Parker(1974): “ những sinh vật và các chất mà giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột” Nhưng 1989, Fuller đã định nghĩa lại Probiotics:” những vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn mà chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật chủ bằng cách

tạo cân bằng hệ sinh vật đường ruột” [17] Bifidobacteria và lactobacilli là chi được

sử dụng rộng rãi nhất Nấm men (Saccharomyces cerevisiae), một vài chủng E coli

và Bacilllus spp cũng được sử dụng như một probiotics [46]

Havenaar và Huis Int Veld, 1992 định nghĩa:” probiotics là một hoặc sự kết hợp của các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ, hoàn thiện hệ vi sinh vật đường ruột [26]

Theo viện khoa học quốc tế ( International Life Sciences Institute), nhóm làm việc tại châu Âu (1998) định nghĩa probiotics: “ là vi sinh vật sống bổ sung vào thức

ăn tác động có lợi đến vật chủ” [26]

Theo tổ chức thực phẩm, nông nghiệp và sức khỏe thế giới “ probiotics là những vi sinh vật sống, khi mà sử dụng một lượng đầy đủ như là thức ăn, sẽ mang lại sức khỏe tốt cho vật chủ ” [25]

Theo FAO:” Những vi sinh vật khi sử dụng với một lượng đủ sẽ tác động có lợi đến vật chủ” Hầu hết probiotics là vi khuẩn, sinh vật đơn bào [49]

2.1.3 Cơ chế tác động của probiotics

Sự tương tác lẫn nhau bình thường của hệ vi sinh đường ruột là một trong các yếu tố quan trọng đảm bảo sức khỏe của vật chủ, sự tương tác này bị gián đoạn có thể dẫn đến một số bệnh lý do mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột làm tăng nhanh số lượng vi khuẩn gây bệnh Probiotics được chứng minh là có khả năng chống lại một

số tác nhân gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes,

Helicobacter pylori, và rotavirus Cơ chế tác động của probiotics như sau:

2.1.3.1 Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn: bao gồm bacteriocins, acid hữu cơ, và hydrogen peroxide

Bacteriocins là một chất kháng khuẩn, được chia làm 4 lớp:

 Lớp thứ nhất là những phân tử peptid nhỏ (< 5 kDa)

 Lớp thứ hai là những phân tử peptid nhỏ (< 10 kDa), thường là những phân tử peptid hoạt động ở màng tế bào

 Lớp thứ 3 là những phân tử protein lớn (>30 kDa), bền về nhiệt, gồm các enzyme ngoại bào

 Lớp thứ tư là những bacteriocins phức tạp, ngoài protein còn có các thành phần khác như lipid và cacbohyrate [35]

Bacteriocins được sản xuất bởi vi khuẩn lactic, khi tiến hành phân tích gen cuả

các vi khuẩn lactobacilus gồm L plantarum, L acidophilus NCFM, L johnsonii

NCC 533, và L sakei đều thấy chúng là các loài có khả năng sinh bacteriocins và

chúng thường độc đối vi khuẩn gram dương như Lactococcus, Streptococcus,

Staphylococcus, Listeria, và Mycobacteria Cơ chế hoạt động cơ bản của

bacteriocins chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng tế bào chất và sau đó enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đồi chất của vi khuẩn gây bệnh Một vài vi

khuẩn thuộc chi Bifidobacteria cũng có khả năng sản xuất ra bacteriocins gây độc

cho cả vi khuẩn gram âm và gram dương Đặc biệt probiotics còn kích thích các tế bào biểu mô ruột sản xuất ra các chất kháng khuẩn [25]

Acid hữu cơ cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được

sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, acid propionic làm pH môi trường hạ

thấp xuống ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh Một vài vi khuẩn chi

Lactobacillus ngăn chặn sự phát triển của Salmonella enterica bằng cách sản xuất ra

acid lactic [25]

Hydrogen Peroxide cũng là chất kháng khuẩn, một vài vi khuẩn

Lactobacillus trong cơ quan âm đạo phụ nữ được tìm thấy chúng có khả năng sản

sinh ra hydrogen peroxide ngăn cản sự phát triển vi khuẩn gây bệnh gonococci trong

cơ quan sinh dục nữ Ngoài ra vi khuẩn Lactobacillus còn ngăn chặn sự phát triển của Gardnerella vaginalis khi có sự kết hợp của hydrogen peroxide, lactic acid, và

bacteriocins [25]

2.1.3.2 Cạnh tranh vị trí gắn kết

Khả năng gắn kết trn biểu mơ ruột l một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật cư trú trên ruột, và cũng chính là giai đoạn đầu của qu trình xm nhiễm Probiotics trong

hệ tiêu hóa có chức năng ngăn chặn khả năng bám dính của tác nhân gây bệnh và

giảm lượng chất độc của chúng trên biểu mô ruột Một vài vi khuẩn Lactobacilli và

Bifidobacteria có khả năng cạnh tranh vị trí với vi khuẩn gây bệnh bao gồm S enterica, Yersinia enterocolitica và bám dính trên tế bào biểu mô ruột Một vài

trường hợp, vi khuẩn probiotics có thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi khuẩn gây bệnh ngay cả khi những vi khuẩn gây bệnh này đã bám chặt trên tế bào biểu mô nếu được

xử lý với probiotics [25] Lactobacillus GG và Lactobacillus plantarum 299V cạnh tranh vị trí bám với Escherichia coli 0157H7 và HT-29, Lactobacilli fermentum RC-

14 cạnh tranh vị trí bám dính với Staphylococcus aureus do đó làm giảm sự bám

dính của các tác nhân gây bệnh [25]

Ngoài ra probiotics còn có các cơ chế khác tác động lên các vi khuẩn gây

bệnh Vi khuẩn probiotics như Treptococcus thermophilus và Lactobacillus

acidophilus enha hoạt hóa tạo ra protein bịt kín vùng bị tổn thương của ruột Thứ hai,

các vi khuẩn probiotics khác như Lactobacillus rhamnosus GG có khả năng ngăn

ngừa bệnh viêm ruột và các tế bào chết bám trên biểu mô ruột Cuối cùng là chức

năng ngăn chặn, lactobacillus được chứng minh rằng là chủng có khả năng làm giảm

độ thẩm thấu vào màng nhầy, hạn chế được sự xâm nhập của vi sinh vật có kích thước nhỏ ở chuột [26]

Sinh tổng hợp chất nhày là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân gây bệnh, chất nhầy sẽ cô lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh MUC2 và MUC3 là hai mRNA làm tăng kích thích sản sinh ra chất nhầy, bảo vệ tế bào biểu mô chống lại sự

bám dính của vi khuẩn gây bệnh Lactobacillus plantarum 299v được chứng minh rằng có khả năng làm giảm tác động của E coli trên tế bào biểu mô ruột

2.1.3.3 Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng

Probiotics còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dữơng để phát triển, chẳng

hạn sự phát triển vi khuẩn probiotics sử dụng đường đơn (glucose, fructose) làm

giảm sự phát triển của Clostridium difficile (sử dụng đường đơn ) [26]

Sắt là yếu tố quan trọng đối với tất cả các tế bào sống ngoại trừ Lactobacillus

plantarum và Borrelia burgdorferi, nó cần thiết trong các quá trình sinh hóa trong tế

bào và có thể gây độc ở ngưỡng cao Sự hấp thu và lưu trữ sắt được điều chỉnh bởi tế bào [19] Siderophore lá chất có khối lượng phân tử thấp, có khả năng gắn kết các ion sắt Siderophore có thề hòa tan sắt tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật Do

đó tận ứng yếu tố này, có thể chọn các vi sinh vật vô hại có khả năng sản xuất siderophore làm vi khuẩn probiotic, nó sẽ cạnh tranh ion sắt với vi khuẩn gây bệnh

[9] Bifidobacteria có khả năng sản sinh siderophore và cạnh tranh ion sắt trong ruột già như E coli [19]

Ngoài ra probiotics còn tác động đến hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây độc, quorum sensing có liên quan đến quá trình điều hòa các nhân tố gây độc của vi

khuẩn đặc biệt là Virio Vi khuẩn probiotics sẽ phá vỡ hệ thống này, đây cũng là một

biện pháp mới để chống lại các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản

2.1.3.4 Kích thích miễn dịch

Mặc dù cơ chế vẫn chưa được sáng tỏ, việc sử dụng probiotics có tác dụng làm tăng dáp ứng miễn dịch, nhất là miễn dịch tự nhiên Spanhaak et al thí nghiệm sử

dụng Lactobacillus casei Shirota ở 20 người đàn ông Những ngừơi đàn ông này

được ăn theo chế độ trong 8 tuần, 10 người đàn ông được uống sữa lên men bổ sung 1x1012 cfu/ml Lactobacillus casei Shirota, 10 người còn lại uống sữa lên men Kết

quả làm tăng đáp ứng miễn dịch ở 10 người sử dụng sữa chua có bổ sung

Lactobacillus casei Shirota [27] Nhiều chủng Lactobacillus có khả năng hoạt hóa

đại thực bào, kích thích hình thành bạch cầu trung tính, kích thích tế bèo tua (dendrit) làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma

2.1.4 Vi sinh vật probiotics:

2.1.4.1.Vi khuẩn lactic:

Lactobacillus : Hầu hết các vi sinh vật probiotics đều là các vi khuẩn sản sinh

ra acid lactic Từ xưa con người đã biết cách sử dụng các vi khuẩn có lợi bổ sung vào

các sản phẩm lên men, chủ yếu thuộc loài L casein và một vài chủng L acidophilus

Cách đây khoảng 40 năm và 30 năm ở Đức vi khuẩn lactic đã được ứng dụng bổ

sung vào trong các sản phẩm sữa lên men Hai loài “Lactobacillus acidophilus” và

“Bifidobacterium bifidum” được giới thiệu rất phổ biến ở Đức vào cuối 1960 trong

các sản phẩm bơ sữa bởi vì nó có thể giúp ổn định vi khuẩn đường ruột và tạo một cảm giác chua nhẹ gây cảm hứng cho người tiêu dùng trong các sản phẩm sữa chua

Ở Đức sản phẩm có tên thương mại là “mild yogurts” hoặc “bio-yogurts“ Ở Mỹ sữa acidophilus lại được phát triển và điều quan trọng đối với các loài này là phải được

chứng minh là an toàn với người sử dụng L casei/paracasei, L rhamnosus, L

acidophilus, và L johnsonii đây là những loài được sử dụng nhiều nhất và đã được

chứng minh là an toàn cho người sử dụng [19]

Lactobacillus có khoảng 60 loài bao gồm L acidophilus, L plantarum, L casei, và L rhamnosus… Cách đây hơn 100 năm con người đã sử dụng các vi khuẩn Lactobacillus bổ sung vào thực phẩm nhằm tăng thời gian bảo quản, tăng vị ngon,

tạo ra các cấu trúc khác nhau trong thực phẩm Hương vị của sản phẩm là do các sản

phẩm trao đổi chất của Lactobacillus Chẳng hạn acetaldehyde có trong yogurt,

diacety có trong có trong các sản phẩm sữa lên men [19]

Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của lactobacillus đã được nghiên cứu trong điều kiện in vitro, đặc biệt khả năng bám dính và cạnh tranh vị trí bám dính của

lactobacillus với các vi khuẩn gây bệnh Coconnier et al, chứng minh được L acidophilus ngăn cản sự bám dính của E coli O157:H7, Salmonella enterica, Yersinia pseudotuberculosis và Listeria monocytogenes trên tế bào Caco-2 cells

Tương tự như vậy, Forestier et al cũng chứng minh được khả năng ngăn cản bám

dính của L casei và L rhamnosus Lcr35 đối với E coli và Klebsiella pneumoniae

trên tế bào Caco-2 cells Ngoài cớ chế cản trở sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh thì

Lactobacillus còn ức chê vi khuẩn gây bệnh bằng sinh acid làm pH môi trường

giảm xuống và bacteriocins Theo nghiên cứu của Vescovo et al, ông tiến hành thử

nghiệm khả năng kháng khuẩn của năm chủng L casei trên Aeromonas hydrophila,

L monoytogenes, S typhimurium,và S aureus trong điều kiện invitro Tuy nhiên ở

nghiên cứu này, L casei IMPCLC34 là chủng có tác động mạnh nhất đối với

Aeromonas hydrophila, S typhimurium, và S aureus, tuy nhiên nó không có tác

động kháng đối với L monocytogenes Nhưng ngược lại Lactobacillus spp phân lập

từ gà lại có khả năng kháng lại Campylobacter spp trong điều kiện invitro [19]

Dựa vào khả năng sinh bacteriocins của Lactobacillus, mà Lactobacillus được

sử dụng rất nhiều trong các sản phẩm rau quả, thịt, và cá lên men Khả năng sinh

bacteriocins của lactobacillus được khám phá vào 1975, và nhiều loại bacteriocins khác đã được biết đến Hiện nay lactobacillus được ứng dụng rộng rãi trong các sản

phẩm cá, bơ sữa, và thịt trong vấn đề bảo quản và nâng cao chất lượng sản phẩm

Hầu hết các chủng sinh bacteriocins đều đã được biết, như Lactocin 705 bởi L casei

CRL705 kháng S aureus, L monocytogenes, S pyogenes, Acidocin CH5 bởi L acidophilus CH5 kháng vi khuẩn gram âm, acidophilin 801 bởi L acidophilus IBB

801 kháng một số vi khuẩn gram âm và gram dương… [19]

Bifidobacteria: Vi khuẩn Bifidobacteria được phát hiện đầu tiên bởi Henry

Tissier (1899, 1900) khi ông nghiên cứu vi sinh vật trong phân của những đứa trẻ

Lúc ban đầu Tissier xếp nó vào chi Bacillus, nhưng đến năm 1924 xếp nó vào chi

Bifidobacteria sau khi quan sát thấy những đặc điểm khác nhau về mặt hình thái học

và cấu tạo vách tế bào so với chi bacillus Chúng hình roi, không di chuyển, không

sinh bào tử, kị khí bắt buột Trong cơ thể người có khoảng 500 vi khuẩn, trong đó

Bifidobacteria là một trong những vi khuẩn chiếm số lượng đáng kể trong ruột Mười

loài khác nhau của Bifidobacteria đã được phân lặp từ cơ thể người Trong số các loài đó là B longum, B bifidum, và B infantis đã được biết đến

Bifidobacteria cũng như lactobacillus có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây

bệnh bằng acid lactic và acetic và các chất kháng khuẩn như bacteriocins Một số vi

khuẩn Bifidobacteria được sử dụng như thuốc kháng khuẩn trong điều kiện in vitro

và in vivo với Salmonella, Shigella, Clostridium, Bacillus cereus, Staphylococcus

aureus, Candida albicans, và Campylobacter jejuni Một nghiên cứu thực tiễn cho

thấy B bifidum có khả năng kháng Shigella dysenteriae trong điều kiện in vitro [19]

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh

và vi khuẩn gây hỏng thức ăn Trong đó, Gagnon et al thử khả năng kháng của năm

loài thuộc chi bifidobacterial đối với E coli O157:H7 trong invitro, và kết quả hai trong năm lòai thể hiện khả năng kháng E coli O157:H7 O’Riordan và Fitzgerald sàng lọc được 22 vi khuẩn Bifidobacterium và trong đó có 12 loài có khả năng kháng

vi khuẩn gram âm và gram dương, bao gồm Pseuedomonas spp., Salmonella spp, E

coli,… Trong nghiên cứu của Gibson and Wang về khả năng kháng của 8 vi khuẩn bifidobacteria trong điều kiện invitro với Listeria monocytogene, Clostridium perfringens, Salmonella spp, vibrio cholerae, và E coli, hầu hết E coli và C perfringens bị tiêu diệt bởi B infantis va B Longum bifidobacterial còn được ứng

dụng bổ sung vào thức ăn cho những đứa bé gớp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu

chảy và tiêu chảy cấp do rotavirus do với những đứa trẻ bình thường [19]

Không giống với Lactobacillus, bifidobacteria rất hạn chế về các tài liệu về bacteriocins Bifidin là một bacteriocins được sinh ra từ B bifidum NCDC 1452 có khả năng kháng rất nhiều vi khuẩn : E coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,

Micrococcus flavus, và Pseudomonas fluorescens [19]

2.1.4.2.Nấm men:

Lactobacillus, Bifidobacterium được sử dụng rộng rãi nhất trong các sản phẩm

probiotics, tuy nhiên nấm men cũng được sử dụng như một probiotics Theo nghiên cứu của H Kumura, Y Tanoue, M Tsukahara, T Tanaka, và K Shimazaki kiểm tra

hoạt tính probiotic của tám loài nấm :Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces

lactis, Kluyveromyces lodderae, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, và Yarrowia lipolytic được phân lập từ kefir [21]

Saccharomyces boulardii tác dụng trị tiêu chảy ở trẻ nhỏ Theo bác sĩ Karpa

S boulardii có khả năng sinh enzyme khử độc tố của C difficile Saccharomyces boulardii, khác với lactobacilli hoặc bifidobacteria nó không tạo hệ vi sinh trong

ruột người mà nó chỉ tồn tại một hoặc hai tuần trong ruột Chúng ngăn chặn các tác

nhân gây bệnh và sau đó ra khỏi ruột, đồng thời giúp lactobacilli và bifibacteria phát

triển nhanh [55] Theo kết quả nghiên cứu của McFarland và Bernasconi

Saccharomyces boulardii phát triển tốt nhất ở 370C và có thể sống sót khi trãi qua hệ

tiêu hóa của người và động vật S boulardii có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Candida albicans [19]

Hiện nay các sản phẩm probiotics trên thị trường chủ yếu sử dụng

Lactobacillus và bifidobacteria Probiotics có thể chỉ là chế phẩm chi tồn tại một lòai

hoặc có sự kêt hợp với các loài khác như Bacillus cereus, B clausii, B pumilis,

Escherichia coli (Nissle), Propionibacterium freudenreichii, P jensenii, P acidopropionici, P thoenii, và Saccharomyces boulardii Ngoài ra nấm men cũng

được sử dụng như một probiotics bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi Có khoảng 65% các sản phẩm sữa probiotics được bán trên thị trường châu Âu, trong khi đó ở Nhật thì có khoảng 70% trong các loại thực phẩm bán trên thị trường Ở Mỹ, Canada, Châu Âu người ta sử dụng kết hợp nhiều chi khác nhau để trị các bệnh trên lợn và

gia cầm: Bifidobacterium Lactobacillus, Streptococcus, Bacillus, Bacteroides,

Pediococcus, Leuconostoc và Propionibacterium (Lloyd-Evans, 1989; Tobey,

1992) Nhưng ở Nhật và một số nước phía Đông sử dụng thêm chủng Clostridium

với tên thương mại là Broilact và Aviguard sử dụng để phòng bệnh nhiễm

Salmonella ở gia cầm

2.1.5 Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics:

Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau:

- Không gây bệnh, khi sử dụng nó sẽ có tác động tốt đối với vật chủ

- Có khả năng tồn tại khi đi xuyên qua dạ dày ( dịch tiêu hoá, dịch acid, dịch mật)

- Có khả năng bám đính tốt trên niêm mạc ruột của đường tiêu hoá vật chủ

- Sản xuất các kháng sinh chống lại các mầm bệnh: acid, bacteriocin, H2O2….

- Duy trì tốt khả năng sống trong quá trình sản xuất, bảo quản và sử dụng

- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hoá vật chủ

- Dễ nuôi cấy

- Kích thích hoạt động của gen kháng và sinh ra chất chống ung thư

- Tăng cường khả năng hấp thụ lactose

- Giảm huyết áp của những người bị chứng cao huyết áp

- Ngăn ngừa và giảm mức độ gây bệnh tiêu chảy

- On định cấu trúc gen trong quá trình tạo chế phẩm

2.1.6 Ứng dụng của probiotics

2.1.6.1 Trong thực phẩm và dược phẩm

Trong cơ thể người tồn tại khoảng 1014 tế bào vi sinh vật với sự đa dạng của các loài, có khoảng 400 loài Các vi sinh vật tồn tại trong đường ruột tác động qua lại giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột Sự tồn tại của các vi sinh vật trong hệ tiêu hoá còn phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng trong cơ thể Trong cơ thể luôn tồn tại các vi khuẩn cơ hội, khi gặp điểu kiện thuận lợi nó sẽ phát triển đủ số lượng và gây độc cho

cơ thể

Vi khuẩn probiotics được rộng rãi trong các sản phẩm khác nhau trên khắp thế giới, chúng được bổ sung vào thực phẩm, tạo ra các chế phẩm thuốc và bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi

Thực phẩm probiotics là thực phẩm chứa các vi khuẩn sống có lợi và không ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Chẳng hạn, trong các sản phẩm sữa lên men

bổ sung Lactobacillus acidophilus có thể giúp cho những người không có khả năng

hấp thu sữa có thể hấp thụ tốt hơn Một số thực phẩm probiotics như là phomat, sữa chua, kifer, dưa cải, giấm… [50]

Thực phẩm probiotics hiện nay được bán rất phổ biển ở Mỹ phần lớn là

yogurt Yogurt được làm từ sữa kết hợp với các loài Streptococcus thermophilus và

Lactobacillus acidophilus hoặc Lactobacillus bulgaricus Sữa có nguồn gốc từ bò,

dê, cừu…

Kefir cũng là một sản phẩm lên men, có thể được làm từ nhiều nguồn gốc khác nhau: sữa bò, sữa cừu, sữa dê Ngoài ra có thể làm từ sữa đậu nành, sữa gạo và nước dừa Khi chọn được vi khuẩn probiotics thích hợp sẽ cấy vào sữa, những loài

có thể dùng là Lactobacillus kefiri, một số chi Leuconostoc, Lactococcus

Thức uống probiotics được giới thiệu đầu tiên vào 2007 bởi New Food, được

khám phá bởi Steve Demos, đây là loại đồ uống chứa Lactobacillus plantarum 299v

Ngoài ra còn nhiều sản phẩm lên men khác mang tính chất truyền thống: món dưa cải bắp ở Đức, kim chi ở Hàn quốc, choucroute ở pháp[51]

Probiotics được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh, hiện nay trên thị trường ngoài các sản phẩm đa dạng về probiotics ở dạng thực phẩm, còn có các dạng viên nén, dạng dịch, dạng bột dùng điều trị một số bệnh đường tiêu hóa:

- Tiêu chảy do kháng sinh: khoảng 20% người dùng thuốc kháng sinh, đặc biệt là Clindamycine, Cephalosporine, Penicilline bị mắc bệnh tiêu chảy Nguyên nhân là do kháng sinh sẽ giết các vi sinh vật đường ruột làm mất cân bằng hệ vi sinh

đường ruột Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca là hai tác nhân gây bệnh chính,

khi hệ vi sinh đường ruột ổn định chúng vẫn tồn tại với số lượng ít trong ruột, khi mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc tố là A và B gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh tiêu chảy

do kháng sinh và kết quả cho thấy S boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG,

Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt Chúng làm giảm đáng kể thời gian phục

hồi khi mắc bệnh [39] Một nghiên cứu sử dụng L acidophilus để trị bệnh tiêu chảy

do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin, nghiên cứu này tiến hành trên 16 người,

một nữa cho sử dụng 125ml sữa chua chứa L acidophilus mỗi ngày, nữa nhóm còn lại cho sử dụng sữa chua không có L acidophilus Kết quả nghiên cứu, nhóm sử dụng sữa chua có chứa L acidophilus bệnh hồi phục trong 2 ngày, nhóm còn lại 8

và Boulloche đã thực hiện nghiên cứu sử dụng Lactocbacillus acidophilus để điều

trị tiêu chảy cấp ở trẻ em Bin tiến hành nghiên cứu 50 trẻ en bị tiêu chảy cấp ở

Trung Quốc Ông lấy ngẫu nhiên 30 người điều trị bằng cách sử dụng L acidophilus,

còn 20 bé còn lại thì điều trị bằng phương pháp bình thường Kết quả cho thấy không

có sự khác biệt giữa hai cách chữa trị, thời gian khỏi bệnh của hai phương pháp chữa bệnh là như nhau Nghiên cứu của Boulloche et al ở 103 bé còn bú sữa mẹ và trẻ em

bị tiêu chảy cấp sử dụng L acidophilus đã bất hoạt bằng cách sử dụng nhiệt Kết quả

cũng cho thấy không có sự khác biệt giữa hai nhóm điều trị Thời gian phục hồi bệnh như nhau [27]

- Viêm đường tiêu hóa: do nhiều tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi rút, kí

sinh trùng nhưng nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm rotavirus và Helicobacter

pylori gây viêm loét và ung thư dạ dày Chúng xâm nhập vào các tế bào ở đỉnh

nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng Do khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn động trong ruột, dẫn đến tiêu chảy và mất nứơc nghiêm trọng gây nguy hiểm cho trẻ sơ sinh và trẻ dưới ba tuổi và trẻ suy dinh dưỡng [9]

- Ngừa ung thư: Một số thành viên của vi khuẩn đường ruột có khả năng tiết ra

các enzyme như glycosidase, azoreductase, nitroreductase và - glucoronidase,

chúng sẽ hoạt hóa các chất tiền ung thư thành các chất ung thư hoạt hóa Những

nghiên cứu trên người sử dụng L acidophilus hoặc Lactobacillus casei làm giảm

đáng kể hoạt động của các enzyme trên [36]

- Giảm cholesterol: Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật Khi lượng cholesterol trong máu cao sẽ gây ra một số bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch, huyết áp tăng, bệnh lý ở hệ thống mạch vành như nhồi máu cơ tim, đột quỵ Trong cơ thể, cholesterol có 2 dạng mà y học gọi là LDL-C có trọng lượng phân

tử thấp (hay còn gọi là cholesterol có hại) và HDL-C có trọng lượng phân tử cao(hay còn gọi là cholesterol có lợi) HDL vận chuyển cholesterol đến các cơ quan, vì vậy nếu hàm lượng của HDL trong máu càng cao thì càng giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành Ngược lại LDL-C vận chuyển cholesterol từ cơ quan đến mạch máu cho nên nếu nồng độ LDL-C trong máu cao là có nguy cơ mắc bệnh cao LDL-C luôn tạo ra

các mảng xơ vữa trên thành các động mạch nói chung và động mạch vành tim nói riêng Các mảng xơ vữa này làm cho lòng các động mạch vành bị chít hẹp hoặc có thể bít tắc, từ đó gây nên tình trạng thiếu máu đến nuôi dưỡng tế bào cơ tim, gây ra các cơn đau thắt ngực và nhồi máu cơ tim Nghiên cứu của Gilliland SE, Nelson CR,

Maxwell C trong điều kiện in vitro vi khuẩn có thể làm giảm lượng colesterol trong

môi trường nuôi cấy Một nghiên cứu của Lin et al về khả năng làm giảm cholesterol

trong máu của Lactobacillus bulgaricus và Lactobacillus acidophilus Ông tiến hành

trên 23 người cho sử dụng thuốc dạng viên nén chứa 3x107 CFU Lactobacillus

bulgaricus và Lactobacillus acidophilus trong 16 tuần, và 15 người không sử dụng

thuốc Kết quả ở nhóm cho sử dụng thuốc thì hàm lượng cholesterol trong máu giảm xuống từ 5.7 xuống 5.4 sau 16 tuần [27] Nghiên cứu ở Ấn Độ, sử dụng sữa trâu lên

men bằng loài L acidophilus làm giảm lượng cholesterol trong máu 12 - 20% sau một tháng sử dụng [27] Hai nghiên cứu khác sử dụng E faecium và S thermophilus,

các nhà nghiên cứu tiến hành thử nghiệm trên 29 người đàn ông, cho sử dụng sữa lên men chứa 108 - 1011 cfu/ml E faecium và S thermophilus và 28 người đàn ông sử

dụng sữa bình thường Kết quả cho thấy hàm lượng cholesterol trong máu giảm 0.37

- 0.41 mmol/L sau 6 tuần sử dụng, nhóm sử dụng sữa bình thường thì hàm lượng cholesterol không đổi Sau đó tác giả tiến hành nghiên cứu lần hai ở phậm vi rộng hơn, ông tiến hành tương tự ở 87 người đàn ông và phụ nữ kết quả cho thấy hàm lượng cholesterol giảm nhiều sau 4 -12 tuần và thí nghiệm cuối cùng 24 tuần và 30

tuần thì thấy không có sự thay đổi nhiều Ông đưa ra kết luận E faecium có khả năng

làm giảm Cholesterol trong máu nhanh [27]

- Tăng cường khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme khác: Hiện tượng không có khả năng tiêu hóa lactose tìm thấy khắp trên thế giới do cơ thể không có enzyme lactase thủy phân lactose Enzyme này được giải phóng khi vi khuẩn bị dung giải do tác dụng của acid mật [9] Triệu chứng của bệnh thường gây phìn bụng, đầy hơi, tiêu chảy Theo kết quả nghiên cứu của Rasstal et al 2000 vi

khuẩn latobacii và bifidobacteria làm tăng enzyme lactase trong ruột non [17] Ở

trẻ sơ sinh thường mắc chứng kém tiêu hóa đường saccarose, khắc phục bằng cách

cho uống saccharomycess cerevisiae, trong nấm men có chứa enzyme saccarase

2.1.6.2 Nông nghiệp

2.1.6.2.1 Nuôi trồng thủy hải sản

UN FAO ước tính tới năm 2020 một nữa lượng thủy sản cung cấp cho tòan thế giới sẽ được cung cấp nhờ nuôi trồng thủy sản do các nguồn cá khai thác tự nhiện

bị khai thác quá mức Ở Việt Nam nuôi trồng thủy sản cũng đang trên đà phát triển, năm 2002 chính phủ đã quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên, trong đó nuôi tôm là ngành mũi nhọn nhằm tăng kinh ngạch xuất khẩu, chuyển đổi cơ cấu kinh tế kém hiệu quả, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao việc sử dụng đất và tạo việc làm cho người dân Năm 2002 Việt Nam đã xuất khẩu trên 2 tỉ USD thủy sản, trong

đó tôm chiếm 50% đứng hàng thứ 5 trên thế giới Hiện nay phổ biến nhất là nuôi tôm

sú và cá ba sa, tuy nhiên hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản đang mắc phải khó khăn chủ yếu là dịch bệnh do vi khuẩn, virút, nấm, ký sinh trùng gây ra Khi phát hiện bệnh nông dân thường sử dụng kháng sinh đổ xuống hồ hoặc bổ sung thêm vào thức

ăn Kháng sinh có thể điều trị tức thời đối với các vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi

sử dụng nhiều lần vi khuẩn sẽ trở nên kháng thuốc ( khó trị hơn), mặc khác khi sử dụng thường xuyên sẽ để lại dư lượng kháng sinh trong tôm, cá nuôi gây ảnh hưởng đến con người dẫn đến nguy cơ khó dùng kháng sinh trị bệnh cho con ngươi và không thể nhập khẩu sang các nước khác gây thiệt hại lớn Nhiều nông dân sử dụng kháng sinh như một tác nhân phòng bệnh ngay khi vật nuôi chưa phát bệnh

Virút là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa hàng đầu đối với ngành nuôi trồng thủy sản Hiện nay người ta phát hiện khoảng 20 virut

gây bệnh trên tôm, hầu hết là thành viên họ Pavoviridae, Baculoviridae,

Piconaviridae, Togaviridae cùng một số họ khác Bệnh đầu vàng ở tôm được phát

hiện đầu tiên ở Thái vào 1990 tại một hồ nuôi tôm sú do Yellow Head Virus gây ra

Bệnh đốm trắng do virut thuộc chủng Baculoviru được phát hiện đầu tiên tại Đài

Loan tỷ lệ chết rất cao có thể 100% sau 3 - 5 ngày nhiễm bệnh [8]

Vi khuẩn cũng là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đặc biệt là Virio làm tôm chết

rất nhanh Ngoài ra nấm và kí sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên tôm Tôm

thường nhiễm nấm là lagenidium calinectes và Sirolpidium spp ở giai đọan ấu trùng

nên tỷ lệ chết rất cao Kí sinh trùng là động vật nguyên sinh có thể lây nhiễm tất cả

các giai đoạn phát triển của tôm như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, anophrys,

Acineta ssp, Lagenophrys, Ephelota là các tác nhân kí sinh bên ngoài [8]

Ngoài yêu tố dịch bệnh Ngoài yếu tố dịch bệnh ô nhiễm môi trường nuôi trồng cũng là vấn đề khó khăn Với mục đích tăng sản lượng, người dân nuôi với mật

độ cao và không có biện pháp xử lý thích hợp gây hiện tượng thiếu oxy trong ao dẫn đến tôm bị ngạt Thức ăn dư thừa dẫn đến hiện tượng phú dưỡng hóa làm tảo phát triển, các chất hữu cơ trong ao trích lũy ngày một tăng sẽ làm giảm lượng oxy hòa tan Lớp bùn lắng động lâu ngày tạo điều kiện cho các vi khuẩn kị khí phát triển sinh khí H2S và CH4 Amoni tồn tại dưới dạng NH3 hoặc NH4+ tùy thuộc vào pH của môi trường NH3 độc tính cao hơn NH4+ do NH3 không mang điện tích dễ thấm qua màng

tế bào mang cá và hòa tan tốt trong chất béo, NH4

+

có kích thước lớn hơn, mang điện

và kết hợp với nước nên khó thấm qua tế bào mang cá Khi nồng độ NH3 cao tôm sẽ

bị ngộ độc cấp tính và chết nhanh Các hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa gồm nitrite

và nitrate khi vượt qua nồng độ 0.3mg/l sẽ gây ngộ độc cho tôm [9]

Cơ chế tác động của probiotics trong thủy sản: cạnh tranh vị trí gắn kết với vi khuẩn, sản xuất ra các chất ức chế, cạnh tranh nguồn năng lượng, tăng cường khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, nâng cao đáp ứng miễn dịch, can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh, nâng cao chất lượng nước ao

Hiện nay có một số biện pháp khắc phục như dùng kháng sinh đổ trực tiếp hoặc

bổ sung vào thức ăn cho tôm, phương pháp này hiện nay không được chấp nhân Ở tôm hệ miễn dịch không đặc hiệu, nó không có khả năng ghi nhớ được các bệnh nên

sử dụng vacine một mặt không đạt được kết quả cao, mặc khác chi phí cao, tốn nhiều thời gian Do đó biện pháp tốt nhất là sử dụng probiotics trong phòng và chữa bệnh ở tôm Probiotics được dùng với nhiều hình thức như tiêm trực tiếp, bom vào đường ruột, nhúng vào dung dịch probiotics, bổ sung vào thức ăn Phương pháp hữu hiệu

nhất là nhúng tôm vào dung dich probiotics ( tôm ở giai đoạn ấu trung hoặc bổ sung vào thức ăn hàng ngày cho tôm)

- Vi khuẩn và nấm được sử dụng nhiều nhất có vai trò như probiotics

Bacillus spp là vi khuẩn gram dương được sự dụng phổ biến trong cải tạo môi trường

nước trong các ao nuôi, chúng chuyển hóa các chất hữu cơ thành CO2 và sinh khối, giảm vi khuẩn gây bệnh trong ao [40] Một nghin cứu của Watchariya Purivirojkul,

Nontawith Areechon, Prapansak Srisapoome v Monchan Maketon phân lập Bacillus

spp từ ruột của tôm gồm 3 chủng B pumilus NW01, B sphaericus NW02 và B subtilis NW03, sau đo sử dụng ba chủng trên kiểm tra khả năng kháng với V harveyi trong điều kiện in vitro với mật độ 102 CFU/ml, kết quả lượng vi khuẩn V

harveyi từ mức 4.23x10 2 ở 0 giờ sau đó tăng 1.40±0.21 × 10 7 cfu/ml ở 24 giờ rồi tiếp tục giảm 7.80±1.90 × 10 5 cfu/ml ở 120 giờ [31]

- Các vi khuẩn sinh acid lactic cũng được sử dụng rộng rãi, Gatesoupe(1991)

chứng minh được Lactobacillus giúp loài cá bơn phát triển nhanh [48] Một thí

nghiệm khả năng kháng của vi khuẩn dị dưỡng đường tiêu hóa của cá hồi và cá bơn

với tác nhân gây bệnh là A samodicida, kết quả cho thấy vi khuẩn tạo vòng kháng

và bao phủ lên A samodicida [48] J Brunt and B Austin tiến hành thí nghiệm trên

cá hồi, ông tiến hành phân lập vi khuẩn trong ruột cá hồi và test với hai chủng

Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318 Vi khuẩn được phân lập

trên môi trường MRS và định danh bằng sinh hoc phân tử, tên là Aeromonas sobria

GC2 Khi tiến hành test hai Aeromonas sobria GC2 với Lactococcus garvieae 29-99

và Streptococcus iniae 00-318 kết quả cho thấy Aeromonas sobria GC2 có khả năng kháng Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318 ( là hai chủng gây

bệnh chết ở cá hồi và được phân lập Viện Nghiên Cứu Thủy Sản ) Sau đó tiến hành thực nghiệm, bổ sung thức ăn cá hồi bị bệnh với liều lượng 5x10-7 tế bào/ gam thức

ăn, kết quả thiệt hại 75% đến 100% khi không bổ sung probiotics vào thức ăn, nhóm điều trị thì thiệt hại từ 0- 6% [13] Một nghiên cứu về khả năng sống sót của tôm

Litopenaeus vannamei sau khi bị nhiễm Virio harveyi, tác giả phân lập vi khuẩn

lactic từ ruột tôm trưởng thành tại trường đại học Santa Catarina, Brazil, chọn các

khuẩn lạc hình cầu và xác định hình thái bằng phương pháp nhuộm gram Các vi khuẩn phân lập được trãi trên môi trường MRS ủ 24h và 350C, sau đó đục lỗ thạch

đường kính 1cm, V harveyi được trãi trên môi trường Marine Agar, đặt thạch lên ủ

cùng môi trường Marine Agar ủ 24h ở 300C Kết quả cho thấy vòng kháng của hai

chủng C2 và B6 có vòng phân giải lớn nhất là 8.0 ± 0.5mm và 6.0 ± 0.6 [13].Theo

nghiên cứu của Lara-Flores et al (2003), ông sử dụng hai chủng probiotics là nấm (

Saccharomyces cerevisiae) bổ sung vào thức ăn cho cá bột Nile tilapia (Oreochromis

niloticus), kết quả nghiên cứu giảm tỷ lệ chết ở cá bột, cá tăng trưởng nhanh hơn [15]

2.1.6.2.2 Chăn nuôi

Sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã cải biến di truyền tăng năng suất gia cầm Khi điều này là tốt cho ngành chăn nuôi gia cầm, con người bắt đầu tăng mật độ nuôi, làm tăng nguy cơ nhiễm các bệnh nguy hiễm cho vật nuôi, đặc biệt

là vi khuẩn như E coli, Salmone spp, Clostridium perfringens và Campylobacter

spp Một thời gian rất dài con người đã sử kháng sinh trong điều trị các loại bệnh

này Nhiều quốc gia đã nghiêm cấm sử dụng kháng sinh bởi vì chúng sẽ tạo ra các vi khuẩn kháng thuốc sẽ khó chữa trị cho con người hơn khi bị nhiễm Do đó một biện pháp thay thế tốt nhất và kinh tế nhất là sử dụng các chế phẩm probiotics bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi

Probiotics được sử dụng trị các bệnh rối loạn hệ vi sinh đường ruột và tăng khả năng thẩm thấu của ruột Trong hệ tiêu hóa vi khuẩn di chuyển qua dạ dày đến ruột non và bám chặt vào biểu mô, chúng giúp tăng tốc độ phát triển và khả năng chuyển hóa thức ăn ở heo, gà và thú con Probiotics giúp trung hòa lượng độc tố

trong ruột do E coli gây ra ( đây là vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở heo)

Vi khuẩn probiotics cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh như

Clostridium perfringens, giảm khả năng hoạt động của vi khuẩn phân hủy urê, tổng

hợp vitamin, kích thích hệ thống miễn dịch, duy trì hệ vi sinh đường ruột, hòan thiện

hệ tiêu hóa [43]

Những sản phẩm probiotics đã được biệt đến rất nhiều qua các sản phẩm sữa lên men và sản phẩm bơ sữa Các sản phẩm probiotics được ứng dụng trong chăn nuôi ở các nộng trại chỉ được giới thiệu cách nay khoảng hai thập niên với mong đợi

là giúp nâng cao hệ thống miễn dịch chống lại các tác nhân gây bệnh Việc sử dụng probiotics đã được quan tâm rất nhiều đặc biệt ở các quốc gia phát triển như châu Âu

đã ngăn cấm sử dụng kháng sinh ngăn ngừa và trị bệnh cho động vật nuôi [43]

Gia cầm: Sản xuất gia cầm thu lãi rất cao, do lợi nhuận mà các chủ trang trại không quan tâm đến sức khỏe con người mà sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi,

do đó việc cấm sử dụng thưốc kháng sinh ở châu Âu vào ngày 1 tháng 1 năm 2006 ở các trang trại chăng nuôi gia cầm đã được ban hành Một trong những thành công

của chế phẩm probiotics sử dụng trong chăn nuôi gia cầm là Bacillus subtilis với tên

thương mại là CloSTATM Chế phẩm này giúp hoàn thiện khả năng phát triển của vật

nuôi B subtilis còn được biết đến có khả năng ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong hệ tiêu hóa của gà B subtilis PB6, Streptococcus pneumonia

đã được chứng minh rằng có khả năng giết Clostridium perfringens, Campylobacter

jejuni, Các chế phẫm của B subtilis thường được bảo quản ở các dạng viên nén

Các chế phẩm probiotics có thể chỉ chứa một loài như Enterococcus faecium với tên

thương mại là Protexin® , nhưng đồng thời cũng có thể là sự kết hợp của nhiều loài

thuộc các chi như Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus Cơ chế bảo vệ của

probiotics ở gia cầm chủ yếu cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh Sự bám dính của vi khuẩn probiotics trên ruột của gia cầm là một trong những đặc điểm quan trọng cho việc tuyển chọn các vi khuẩn probiotics Các nghiên cứu được biết

đến rộng rãi như vi khuẩn latic, B subtilis, Enterocuccus faecium là những loài có

sức sống tốt nhất trong hệ tiêu hóa của động vật Nhiều tác động có lợi của probiotics như hoàn thiện hệ thống miễn dịch, hòan thiện hệ vi sinh đường ruột, giảm các tác nhân gây viêm, giảm lượng amoniac và urê thải ra, giảm lượng cholesterol, tăng khả năng bám dính Hiện nay có nhiều nghiên cứu xa hơn sử dụng probiotics nâng cao

khả năng phát triển và tăng chất lượng trứng gà [43] Salmonella là tác nhân chính

gây bệnh thương hàn, phó thương hàn, bạch lỵ ở gia cầm, chúng thừơng tồn tại trong

đường tiêu hóa của gà và có thể gây bệnh cho con người qua thức ăn Nghiên cứu của J Vicente, S Higgins, L Bielke, G Tellez,D Donoghue, A Donoghue, and B

Hargis ở gà tây bị nhiễm salmonela, tiến hành hai thí nghiệm với bảy loài, chia làm hai nhóm: nhóm thứ nhất năm loài: :Escherichia coli, Kluyvera ascorbata, Klebsiella

travesanii, Lactobacillus casei, và Lactobacillu cellobiosus, nhóm thứ hai hai loài: L casei và L cellobiosus Ơ thí nghiệm thứ nhất sử dụng probiotics ở mật độ 108 và

106 đồng thời kết hợp với phun acid hữu cơ Kết quả cho thấy sử dụng probiotics ở nồng mật độ cao(108) thì salmonella giảm tới 90% Trong khi đó khi xử lý với mật

độ probiotics thấp( 106) có sự kết hợp với xử lý với acid hữu cơ thì hiệu quả xử lý

đến 100%, không còn sự xuất hiện của Salmonella Ơ thí nghiệm thứ hai chỉ sử dụng

probiotics riêng lẻ với mật độ tương tự thí nghiệm thứ nhất hoặc sử dụng acid hữu

cơ Kết quả thí nghiệm đạt kết quả không cao, chỉ đạt từ 75 - 85% [41] Do đó việc

vệ sinh chuồng trại cũng không kém phần quan trọng trong chăn nuôi

Heo: Heo ở giai đoạn cho bú, rất dễ bị xâm nhiễm bởi các vi khuẩn gây bệnh

do hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của heo chua hoàn chỉnh, do đó việc sử dụng kháng sinh trong trị bệnh và phòng bệnh heo con rất phổ biến, tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người Cấm sử dụng thuốc kháng sinh trong chữa bệnh hoặc đưa ra những quy định nghiêm ngặc trong sử sụng kháng sinh để trị bệnh cho động vật nuôi ở châu Âu đã được ban hành Sử dụng probiotics giúp hoàn thiện sự phát triển và tăng khả năng kháng các vi sinh vật gây bệnh ở heo đã được nghiên cứu rộng rãi và khuyến khích sử dụng Kế hoạch HEALTHYPIGUT của EU

đề ra vào giữa 2001 và 2004, trong nghiên cứu này có sự kết hợp giữa nấm và

Pediococccus acidilactici bổ sung vào trong chế độ ăn của heo con, kết quả giúp

hòan thiện chức năng mô cơ trong hệ tiêu hóa heo con [43] Baird (1977) đã nghiên

cứu thành công bổ sung lactobacillus vào thức ăn giúp tăng trọng lượng trung bình

của heo, tương tự Pollman (1986) cũng đã thành công trong nghiên cứu của mình

giúp tăng trọng lượng heo bằng bổ sung lactobacillus [16]

Động vật nhai lại: Trong dạ cỏ của động vật nhai lại xảy ra quá trình phân hủy cabohydrat và protein Trong dạ cỏ pH từ 5.8 - 6.5, thiếu oxy, đây là điều kiện

thuận lợi cho động vật nguyên sinh, vi khuẩn kị khí và nấm Một trong những ứng dụng sớm nhất của probiotics trong xử lý tăng acid trong dạ cỏ động vật nhai lại bằng nấm Tăng acid trong dạ cỏ là do sản xuất thừa lượng acid hữu cơ dễ bay hơi như acid probionic, acetates trong thức ăn của chúng Nếu không chữa trị dẫn đến giảm sự ngon miệng, tiêu chảy, giảm thành phần chất béo trong sữa Do đó việc bổ sung nấm vào trong thức ăn sẽ làm giảm vấn đề tăng acid trong dạ dày, tạo điều kiện cho các vi khuẩn phân hủy cellulose phát triển, hòan thiện hệ tiêu hóa [43]

Một phần sử sụng nấm để giảm bớt hàm lượng acid trong dạ cỏ, ngoài ra còn

sử sụng vi khuẩn cũng được sử dụng với nhiều thành công từ những năm 1970 làm tăng khả năng sản xuất sữa và trọng lượng, hoàn thiện sức khỏe và tăng khả năng kháng bệnh

Trong dạ cỏ của động vật nhai lại khi trưởng thành sẽ chứa một lượng lớn các

vi khuẫn, nấm, chúng có khả năng ngăn cản sự xâm nhập các vi sinh vật bênh ngoài

Hệ vi sinh vật trong ruột non và ruột già của những động vật nhai lại còn non thì vắng mặt các động vật nguyên sinh, và sự rối loạn hệ tiêu hóa ở thú con có thể sử dụng probiotics để chữa trị Hệ vi sinh dạ cỏ của thú con ban đầu chủ yếu là vi khuẩn cellulose và vi khuẩn lên men metan và vi khuẩn lên men lactate và mật độ vi khuẩn lên men lactate sẽ giảm dần đến tuần thứ 13, sau đó hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của bê

sẽ giống với hệ vi sinh của các động vật nhai lại trưởng thành Động vật nguyên sinh cũng được tìm thấy trong dạ cỏ sau tuần thứ 13

Mục đích chủ yếu của việc sử dụng thức ăn bổ sung probiotics là giảm bớt tỷ

lệ chết và những nguyên nhân gây chết với bệnh đường tiêu hóa và hô hấp Sử dụng

S cerevisiae và A oryzae được sử dụng trộn lẫn vơi nhau trong thức ăn làm tăng

lượng sữa tiết ra ở bò cái Một số nghiên cứu sử dụng probiotics bổ sung vào thức ăn làm tăng lượng chất khô, năng suất sữa và một số thành phần quan trọng trong sữa Tuy nhiên một khuynh hướng tốt để hòan thiện khả năng phát triển và tiết nhiều sữa bằng cách kết hợp giữa probiotics và prebiotic, chẳng hạn kết hợp giữa các vi khuẩn lactic và mannanoligosaccharide ở bò [43]

2.2 Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics:

Hiện nay probiotics được ứng dụng và nghiên cứu rộng khắp thế giới Chế phẩm probiotics rất đa dạng và dần dần thay thế phương pháp trị liệu các bệnh đừơng tiêu hóa bằng kháng sinh, nâng cao hệ thống miễn dịch, của người và động vật nuôi, giúp vật nuôi tăng trưởng nhanh và tăng cao chất lượng sản phẩm

Một chế phẩm probiotics với tên “YEASTURE-W” chứa chủng nấm Saccharomyces

cerevisae do công ty “Cenzone” của Mỹ sản xuất , được sử dụng cho gia cầm, giúp

gia cầm tăng trọng nhanh và tăng chất lượng thịt [23]

All - Lac Denka là chế phẩm probiotics do công ty denka Pharmaceutial Nhật

bản sản xuất, chứa hai chủng Lactobacillus acidophilus và Enterococcus faecium

chứa 5x109 cfu/g [33]

Health Plus First Probiotics 90 Vcapsules đây là probiotics cung cấp cho trẻ

em, chứa 40 tỷ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, sử dụng bổ sung vào thức ăn cho

trẻ Giúp trẻ duy trì cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng khả năng hấp thụ thức ăn… [54]

Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng xuất hiên nhiều sản phẩm dạng probiotics như sản phẩm Probio thuốc dạng đông khô chứa khoảng 1 tỷ tế bào

Lactobacillus acidophilus trị một số bệnh đường ruột Sản phẩm do công ty dược

phẩm IMEXPHARM sản xuất

Một nghiên cứu rất thành công của TS Võ Thị Hạnh sản xuất hai chế phẩm Probiotics Bio I và Probiotics Bio II Bio I sử dụng cho gia súc, gia cầm, kích thích tiêu hóa cho, tăng trọng, giảm tiêu tốn thức ăn, ức chế các vi khuẩn gây bệnh trong đường ruột, phòng trị các chứng rối loạn tiêu hóa, các chứng tiêu chảy do sử dụng kháng sinh lâu dài, nâng cao sự hấp thu các chất dinh dưỡng Chế phẩm Bio II sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, góp phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cá như các vi khuẩn Vibrio spp, tăng năng suất nuôi trồng

Quy trình sản xuất chế phẩm Probiotics rất phức tạp và trãi qua nhiều giai đọan, sơ

đồ tổng quát như sau:

Sơ đồ 2.1: Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics

Giai đoạn chọn giống rất quan trọng, phải đảm bảo giống có đầy đủ những chức năng như trên, đặc biệt có khả năng kháng lại các vi sinh vật gây bệnh trên các

đối tượng mà ta sử dụng chữa trị Chẳng hạn, chọn loài Lactobacillus acidophillus có khả năng kháng lại E.coli gây bệnh tiêu chảy cho người Vấn đề thứ hai là môi

trường để nhân sinh khối, môi trường chuẩn dùng để lên men thu sinh khối vi sinh

vật thường rất đắc tiền, nếu sử dụng thì chi phí tạo thành phẩm rất cao, giá thành cao, sản phẩm khó tiêu thụ, do đó chúng ta cần tìm những môi trường thay thế thích hợp, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cho vi sinh vật Đặc biệt, ta có thể tận dụng nguồn phế thải của ngành công nghiệp khác, giảm bớt giá thành sản phẩm Chúng ta có thể tận dụng rỉ đường ( phế thải ngành công nghiệp mía đường) thay thế cho nguồn đường cần bổ sung trong môi trường lên men

Trong quá trình lên men cần phải theo dõi suốt quá trình lên men, đối với vi khuẩn lactic, trong quá trình lên men chúngsẽ tạo acid lactic làm pH môi trường giảm ức chế ngược trở lại sự phát triển của chúng

Chế phẩm probiotic có thể được bảo quản ở dạng dịch hoặc dạng bột sau khi

đã sấy phun, tùy theo công nghệ, đặc tính của từng loại vi khuẩn, và những phụ gia thích hợp mà chọn các phương pháp thích hợp nhất sao cho giá thành tốt nhất mà vẫn đảm bảo chất lượng

2.3 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

2.3.1 Phn loại

Loài Lactobacillus acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Firmicute, lớp

Bacilli, bộ Lactobacillales, họ Lactobacillaceae, giống Lactobacillus Nó thường

được sử dụng với Streptococcus salivarius và Lactobacillus delbrueckii ssp

bulgaricus trong các sản phẩm lên men như sữa chua

Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn gram dương không sinh bào tử, hình que, lên

men hiếu khí lẫn kị khí

2.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý

Hình 2.1 Lactobacillus acidophilus dưới kính hiển vi

Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn, kích thước 0.6-0.9  m dài 1.5-6m

Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn có khả năng động

[7] Lactobacillus acidophilus tồn tại trong hệ tiêu hóa, miệng, âm đạo của người

[52] Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C

2.3.3 Đặc tính sinh hóa

Lactobacillus acidophilus lên men trong điều kiện yếm khí Lactobacillus acidophilus thiếu cytochromes, porphyrin, những enzyme hô hấp, do đó nó không có

hiện tượng hô hấp Trong quá trình lên men từ phân tử glucose thông quá trình

đường phân, từ một phân tử glucose Lactobacillus acidophilus chỉ tạo ra năng lượng

là 2ATPs, do đó vi khuẩn cần phải chuyển hóa một lượng cơ chất lớn để đảm bảo

lượng năng lượng cần thiết cho hoạt động trao đổi chất của chúng Lactobacillus

acidophilus thường tồn tại trong môi trường nhiều đường như đường ruột của người

và động vật Glucose là nguồn carbon ưa thích nhất của Lactobacillus acidophilus,

tuy nhiên nó vẫn có khả năng sử dụng maltose, lactose, galactose, sucrose ….[14]

L acidophilus lên men đồng hình, sản phẩm lên men chủ yếu là acid lactic

Lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP Từ một phân tử glucose

sẽ chuyển thành hai phân tử acid lactic và 2ATP

Hình 2.2 : sơ đồ nguyên chuyển hóa glucose cở L acidophilus

Lactobacillus acidophilus có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp, chúng có khả năng sử

dụng cacbohydrate, protein, một số vitamin như vitamin B, acid nucleic, khoáng như

Mg, Mn, Fe, cần thiết cho sự phát triển của chúng [7]

2.3.4 Hoạt tính probiotic

Lactobacillus acidophilus được biết đến như một probiotics Chúng được sử dụng

phổ biến trong các sản phẩm sữa lên men, đặc biệt là yogurt Rất nhiều nghiên cứu

đã chứng minh rằng Lactobacillus acidophilus mang lại lợi ích cho con người

Lactobacillus acidophilus còn được bổ sung vào thuốc trị một số bệnh thay cho

thuốc kháng sinh Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được rằng Lactobacillus

acidophilus giúp làm giảm lượng cholesterol trong máu, và loại cholesterol ra khỏi

môi trường nuôi cấy (Gilliland et al 1985, Rasic et al 1992, Lin and Chen 2000, Saito 2004)

Sinh ra các chất kháng khuẩn, đây là một trong những ưu điểm của vi khuẩn

probiotics Lactobacillus acidophilus cũng có chức năng trên, nó có khả năng tạo ra

các acid hữu cơ, diacetyl, -hydroxypropionaldehyde, bacteriocins ( Acidophilucin A,

Acidocin J1132) [35] Theo nghiên cứu của Gilliland và Speck, Lactobacillus

acidophilus NCFM có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureu, salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, E.coli gây bệnh đường

ruột và Clostridium perfringens [34]

Lactobacillus acidophilus sử dụng bổ sung cho những người không có khả năng

tiêu hóa đường lactose Lactobacillus acidophilus tập hợp ở đường tiêu hóa Khi sử

dụng với một lượng đầy đủ sẽ làm giảm triệu chứng không dung nạp sữa[7] Do

Lactobacillus acidophilus có khả năng tổng hợp  galactosidase Lactose sẽ được

thấm qua màng tế bào vi khuẩn và dưới tác dụng của  galactosidase sẽ biến đổi lactose thành glucose và D-galactose [7]

Lactobacillus acidophilus có khả năng tác động đến enterocytes, cạnh tranh vị trí

bám dính trên biểu mô ruột [34]

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

Môi trường chuẩn vi khuẩn Lactic nói chung, Lactobacillus acidophilus nói

riêng là môi trường MRS, thành phần MRS/l gồm: glucose 20g, Peptone 10g, Beef extract 8g, Sodium acetate.3H2O 5g, Yeast extract 4g, K2HPO4 4g, Triammonium citrate 2g, MgSO4·.7H2O 0.2g, MnSO4·.4H2O 0.05g tween 1ml Trong môi trường glucose cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn Nấm men, peptone, beef ectrack cung cấp nguồn nitơ, đặc biệt trong cao nấm men rất giàu nguồn vitamin nhóm B rất cần

thiết cho vi khuẩn L acidophilus phát triển Theo nghiên cứu của Sunhoon Kwon,

Pyung Cheon Lee, Eun Gyo Lee, Yong Keun Chang, Nam Chang tại viện khoa học

và kỹ thuật Hàn Quốc tiến hành khảo sát sự phát triển của L rhamnosus trên bảy

vitamin: d-biotin, pyridoxine, p-aminobenzoic acid, nicotinic acid, thiamine, pantothenic acid, và riboflavi bổ sung vào dịch dịch đậu nành thủy phân Kết quả cho

thấy pantothenic acid, và riboflavi có ảnh hưởng mạnh nhất đối với sự phát triển của

L rhamnosus, khi không bổ sung hai vitamin này trong môi trường thì lượng tế bào

khô chỉ đạt 0.029 và 0.05 g/l[ ] Vi khuẩn lactic nói chung và L acidophilus nói riêng

các thành phần trong môi trường là yếu tố quan trọng giúp tỗng hợp các chất có hoạt tính sinh học Theo nghiên cứu của Marco J van Belkum, Darren J Derksen, Charles M

A P Franz một vài bacteriocins được tổng hợp nhờ cảm ứng của một số peptide[24] MgSO4·.7H2O, MnSO4·.4H2O cung cấp Mn, Mg cho vi khuẩn Trong sản xuất với quy mô công nghiệp nếu sử dụng môi trường MRS thì giá thành sản phẩm rất cao, do

đó để giảm bớt giá thành, chúng ta tìm những nguồn thay thế thích hợp Chủ yếu dựa vào nguồn carbon và nitơ mà có thể thay thế bằng các nguyên liệu khác và rẻ hơn mà vẫn đảm bảo cung cấp đủ nguồn carbon và nitơ với mục đích giảm giá thành và tận dụng các phế thải của ngành công nghiệp khác

2.4.1.Nguồn carbon

Bất cứ vi sinh vật nào cũng cần nguồn carbon Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất C có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào Đồng thời hầu hết các nguồn C trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật Chẳng hạn, qua quá trình đường phân từ một phân tử glucose sẽ giải phóng năng lượng dứơi dạng ATP, một glucose giải phóng 38 phân tử ATP, nguồn năng lượng này được dùng tổng hợp cấu trúc tế bào, tổng hợp các cao phân tử sinh học, sinh trưởng và sinh sản … có rất nhiều sản phẩm cung cấp nguồn carbon cho vi sinh vật phát triển như: huyết thanh sữa, rỉ đường, tinh bột sắn, dịch chiết dứa…

Huyết thanh sữa

Huyết thanh sữa: Là dung dịch sau khi đã tủa protein sữa, là phế thải của ngành công nghiệp sản xuất phomát, chứa khoảng 60-75 % lactose Huyết thanh sữa

có hai loại, loại thứ nhất gọi là huyết thanh ngọt, khi pH khảng 5.6 dùng rennet tủa protein sữa Loại thứ hai là huyết thanh chua pH thấp hơn 5.1 dùng acid đông tụ, có

thể dùng acid acetic hoặc acid citric Thành phần chủ yếu của huyết thanh sữa là đường lactose Bảng sau thể hiện thành phẩn của huyết thanh sữa [30]

Bảng 2.1: Thành phần hóa học huyết thanh Tên huyết thanh Protein (g/l) Lactose (g/l) Khoáng (g/l)

Hiện nay ngành công nghiệp sản xuất phomát phát triển khắp thế giới, mỗi năm sản xuất khoảng 15x106 tấn chiếm 35% tổng các sản phẩm sữa, sản xuất chủ yếu ơ châu Âu đạt 8,201 tấn / năm Tại Mỹ, hàng năm sản xuất khoảng 25.650 x10 6tấn dịch huyết thanh sữa [10] Ngoài cung cấp nguồn carbon huyết thanh sữa còn cung cấp một lượng protein cho vi sinh vật phát triển Đối với các nước có ngành sản xuất phomat phát triển thì lượng chất thải, thải ra với một lượng lớn như ở châu Âu,

Mỹ, có thể tận dụng nguồn này như là nguồn cung cấp carbon cho vi sinh vật phát triển, một phần có thể giải quyết được lượng nước thải một phần có thể tạo ra được các sản phẩm mong muốn như acid lactic, protein đơn bào, khí sinh học, ethanol, acid lactic, acetate [10] Hiện nay ở Việt Nam vấn đề sản phomat ở Việt Nam chưa phổ biến và chỉ mang tính chất gia đình, do đó việc ứng dụng vẫn còn nhiều hạn chế Nghiên cứu của Javier Parrondo, Mĩnica Herrero, Luis A García và Mario Díaz sử dụng huyết thanh sữa để sản xuất acid acetic, trong nghiên cứu này đầu tiên tác giả

sử dụng chủng nấm men Kluyveromyces fragilis để sản xuất rượu, sau đó tiếp tục sử

dụng dịch lên men này để sản xuất acid acetic, kết quả đạt nồng độ 5 - 6% [29] Một nghiên cứu khác của Sanaa Omar và Soraya Sabry tại trường đại hoc Alexandria của

Ấn Độ, sử dụng nguồn lactose trong huyết thanh sữa để lên men sản xuất protein đơn bào Trong nghiên cứu khảo sát 18 chủng nấm men và 12 chủng vi khuẩn [28]

Rỉ đường: Mật mía hoặc củ cải đường không kết tinh được trong quá trình sản xuất được gọi là rỉ đường Tỷ lệ rỉ đường thường chiếm 3 - 3.5% trọng lượng của mía, rỉ đường là nguồn cung cấp carbon rẽ tiền Rỉ đường ngoài chứa hàm lượng đường cao còn chứa một lượng nitrogen, vitamin và các muối vi lượng Tuy nhiên rỉ

đường cũng chứa một số chất keo và vi sinh vật tạp nhiễm gây bất lợi cho quá trình lên men sau này, do đó cần xử lý trước khi dùng làm môi trường nuôi cấy Thành phần rỉ đường tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, phương pháp sản xuất, điều kiện bảo quản và vận chuyển rỉ đường

Trong rỉ đường có 15-20% nước và 80 - 85% chất khô hòa ta, trong chất khô có tới lớn hơn 50% là đường ( 30-35% là đường saccharose và 15 - 20 % là đường khử) Phần còn lại chất khô là chất không phải đường, trong đó có 30 - 32% chất hữu cơ và

18 - 20% là chất vô cơ Ngoài ra rỉ đường còn chứa một số sinh tố: thiamin, Riboflavin, Acid nicotinic, Acid folic, Biotin, Acid pantotenic [3]

Rỉ đường trước khi sử dụng cần phải xử lý để loại bỏ các hóa chất độc hại như các kim loại nặng, các chất keo vi sinh vật không sử dụng được hoặc vi sinh vật tạp nhiễm đồng thời bỏ sung thêm lượng nitơ cho sinh trưởng vi sinh vật trong quá trình lên men ( peptone, cao nấm men )

Mía đừơng là thế mạnh của việt nam, vào năm 2000 đạt năng suất triệu tấn/ năm Do

đó khả năng tận dụng nguồn rỉ đường là rất lớn Hiện nay rỉ đường chủ yếu được ứng dụng sản xuất acid lacitc và ethanol, Ấn Độ là nước sản xuất mía đường lớn nhất với sản lượng hàng năm khoảng 20 triệu tấn/năm, do đó thải ra với một lượng rỉ đường rất lớn và lượng rỉ đường chủ yếu ứng dụng trong sản xuất acid lactic Nghiên cứu của Arti Dumbrepatil, Mukund Adsul, Shivani Chaudhari, Jayant Khire, and Digambar Gokhale tại , Ấn Độ , sử dụng nguồn rỉ đường để lên men sản xuất acid lactic, tác giả đã sử dụng nguồn đường trong rỉ đường cung cấp nguồn carbon cho vi

khuẩn Lactobacillus delbrueckii subsp, do trong rỉ đường hàm lượng protein rất thấp

do đó cần bổ sung cao nấm men cung cấp nitơ cho vi khuẩn Kết quả khảo sát hàm lượng cao nấm men và hàm lượng acid lactic đạt nồng độ tối ưu là0.5g/l và 166g/l [18]

Dịch chiết dứa

Dứa là loại cây ăn quả không kén đất, có thể trồng trên vùng đất xấu nghèo chất dinh dưỡng Ở đồng bằng sông Cửu Long dứa chủ yếu trồng trên vùng đất phèn, giúp cho người dân có thể tận dụng được quỹ đất để có thêm sản phẩm và mang lại

lợi ích kinh tế Trồng dứa thu hoạch rất nhanh, năng suất sau 1 - 2 năm có thể đạt từ

10 - 20 tấn/năm, tuy nhiên nếu chăm sóc tốt có thể đạt 30 - 35 tấn/ha (Trần Thế Tục

và Vũ Mạnh Hải, 1996) [6]

Hiện nay dứa chủ yếu phục vụ cho ngành dứa đống hợp xuất khẩu nước ngoài, thị trường chủ yếu của Việt Nam là Nga, Đức, Mỹ, Hà Lan, Ai Len, Ukraina, Romania, Úc Ngoài ra dứa còn phục vụ cho ngành công nghiệp enzyme, trong dứa chủ yếu có enzyme Bromelin ( enzyme thủy phân protein)

Về mặt dinh dưỡng, dứa được xem là một loại trái cây giàu chất dinh dưỡng, thành phần dinh dưỡng dứa trong 100g như sau :

Bảng 2.2: Thành phần hóa học dịch chiết dứa

bảo cho vi khuẩn phát triển tốt nhất [32] Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cần

một số vitamin cho quá trình phát triển như Pantothenic acid, Niacin (Vit B3), Riboflavin (Vit B2), Mn, và Zn Tuy nhiên hàm lượng protein vẫn còn thấp cần phải bổ sung thêm nguồn nitơ Malaysia là một trong những nước có ngành sản xuất

đồ hợp lớn ở khu vực Đông Nam Á, chất thải chủ yếu là chất thải rắn từ vỏ, cùi dứa,

và nước dứa trong quá trình cắt vỏ, lấy cùi ra, lượng dịch nước dứa thải ra chủ yếu được ứng dụng sản xuất acid lactic, một phần giải quyết được vấn đề ô nhiễm, giảm chi phí xử lý, một phần có thể thu được lợi nhuận từ sản xuất acid lactic

và sẽ hấp thụ vào tế bào Nguồn cung cấp nitơ cho vi khuẩn lactic từ môi trường MRS chủ yếu là từ peptone, cao thịt, cao nấm men, tuy nhiên những nguồn này thì đắt tiền, do đó có thể tìm nguồn thay thế một phần để giảm chi phí sản xuất Những nguồn này gồm : dịch chiết malt, dịch chiết gạo lức, protein và vitamin trong dịch chiết đậu nành

Dịch chiết gạo lức :Gạo lứt, gạo lức hay gạo rằn là loại gạo chỉ xay bỏ vỏ trấu, chưa được xay xát loại bỏ cám gạo Đây là loại gạo rất giàu dinh dưỡng đặc biệt là các vitamin và nguyên tố vi lượng Gạo lức khi xay xát toàn phần và một phần thì cho ra gạo trắng và một lượng tấm và cám Gạo lức và gạo trắng gần giống nhau về lượng calories, carbohydrate, chất béo và protein nhưng có một số vitamin như B1, B3 và một số chất khoáng mất trong quá trình xay xát

Lúa được cấu tạo bởi 3 thành phần chính là vỏ, nội nhũ, phôi với tỉ lệ khác nhau : vỏ

16 - 27%, phôi 2 - 2.5%, nội nhũ 72% Thành phần vỏ chủ yếu là cellulose, hemicellulose, lignin không có giá trị dinh dưỡng nên cần loại bỏ càng sạch càng tốt

Bảng 2.3 : Thành phần hóa học trong từng thành phần của hạt thóc

Đường (%)

Cellulose (%)

Pantozan (%)

Chất Béo (%)

Tro (%)

Các chất khác (%) Toàn

bộ hạt 10.07 59.00 4.43 2.76 8.10 2.24 2.18 1.22 Nội

Thành phần hóa học gạo lức xay :

Bảng 2.4 : Thành phần hóa học gạo lức xay

Hàm lượng % theo chất khô Tên gạo

Protein Chất béo Tro cellulose

Hàm lượng protein trong gạo lức khoảng 6.6 - 7.3%, từ 6.2 - 6.9% Trong quá trình xay xát hàm lượng protein giảm theo mức độ xay xát Các chất này tập trung chủ yếu ở tầng ngoại biên của hạt thóc dưới lớp vỏ cứng Ngoài ra trong gạo lức còn chứa một lượng vitamin và muối khoáng, trong đó chủ yếu là niacin là yếu tố quan

trọng cho sự phát trển của Lactobacillus acidophilus Theo nghiên cứu Seung Hee Baek (2005) sử dụng bi khuẩn Lactobacillus acidophillus tiến hành lên men gạo lức

ở 370C trong 60h với 30.56% nước và 6.94% là mật ông, chế phẩm này có tên là FB( fermented Brown Rice) và được chứng minh là giảm cholesterol ở chuột [7]

Yuji ODA (2002) và cộng sự nghiên cứu sử dụng Lactobacillus amylovorus như là

một vi sinh vật an toàn dùng để đường hóa tinh bột trong gạo lức, để sản xuất đồ

uống tương tự như Amazake Lactobacillus amylovorus có khả năng tổng hợp

-amylase, glucoamylase Kết quả dịch đường hóa sau cùng tạo tinh bột hòa tan, oligosaccharide, lactose tạo nên vị ngọt nhẹ trong sản phẩm lên men [7]

Dịch chiết malt: Matl là những hạt đại mạch sau khi đã nảy mầm, mục đích ngâm đại mạch tạo ra hệ enzyme ( amylase và proteaza) để phân hủy tinh bột và protein Thành phần hóa học của matl như sau; trọng lượng tính theo % chất khô.( Harris, 1962) [2]

Bảng 2.5: Thành phần hóa học của Malt

Thành phần Malt Tinh bột

6 - 7

Trong matl, lượng đường khử và đường saccarose chỉ chiếm lượng thấp, thành phần chủ yếu là tinh bột Do đó để sử dụng làm môi trường cho sự phát triển vi khuẩn thì cần thủy phân tinh bột tạo thành đường Matl sau khi được nghiền, sau đó trộn với nước với tỷ lệ nhất định rồi trích phần dịch ra Còn lại phần matl đã nghiền đem hồ hóa, sau đó đưa dịch đã trích trở lại dung dịch hồ hóa ở một nhiệt độ thích hợp để amylase phân hủy tinh bột trong một thời gian nhất định Ngoài ra trong matl còn chứa hàm lượng protein 8 - 11%, là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật phát triển Một công trình nghiên cứu của A Laitila, M Saarela, L Kirk, M Siika-aho, A Haikara, T Mattila-Sandholm và I Virkaja rvi sử dụng môi trường dịch chiết malt (

MSE )với mục đích thay thế môi trường MRS để giảm chi phí sản xuất O đây tác giả sử dụng chính nguồn amylase có sẵn trong malt để thủy phân tinh bột thành đường glucose, đồng thời tiến hành khảo sát thêm lượng cao nấm men bổ sung vào,

do trong dịch chiết không đủ lượng nitơ cung cấp cho vi sinh vật phát triển tốt nhất Kết quả khảo sát cho thấy MSE có thể thay thế MRS với hàm lượng cao nấm men bổ sung 4g/l [22]

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật

2.5.1 Ảnh hưởng của pH

pH là số đo hoạt tính của ion hydrogen trong môi trường Thang pH thay đổi từ 0

- 14, pH có ảnh rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Mỗi vi sinh vật điều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất Vi sinh vật ưa acid có pH phát triển tốt nhất khoảng 0 - 5.5, vi sinh vật trung tính từ 5.5 - 8,

vi sinh vật ưa kiềm từ 8.5-11.5, vi sinh vật ưa kiềm cực đoan sinh trưởng tối ưu ở pH

10 và lớn hơn Mặc dù mỗi nhóm vi sinh vật có một khoảng pH khá rộng nhưng mức chịu đựng của chúng cũng có một giới hạn nhất định Khi pH trong tế bào có sự biến đổi một cách đột ngột sẽ phá vỡ màng sinh chất, ức chế hoạt tính của enzyme hay protein chuyển màng Vi sinh vật nhân nguyên thủy bị chêt khi pH nội bào giảm xuống thấp hơn 5.0-5.5 [53]

Khi pH môi trường thay đổi tương đối lớn, vi sinh vật vẫn có phương pháp thích nghi ở một giới hạn cho phép Phần lớn pH nội bào của vi sinh vật vẫn giữ trung tính, nguyên nhân là do tính thấm H+ qua màng sinh chất tương đối thấp Vi sinh vật trung tính thông qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K+ thay cho H+ Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan dùng Na+ thay cho H+ từ môi trường bên ngoài Ngoài ra hệ thống chất đệm nội bào cũng có tác dụng ổn định pH nội bào Trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật sinh ra các chất có tính acid hoặc base giúp trung hòa pH môi trường

Chẳng hạn, Thiobacillus có thể oxy hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh tạo acid

sulfuric, một số vi khuẩn phẩn giải acid amin tạo NH3 làm kiềm hóa môi trường [53]