Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm a(h1n1)pdm lưu hành tại miền trung việt nam, 2013 2015

Phân bố mẫu nghiên cứu theo độ tuổi và giới tính Hình 3.2 Tế bào MDCK trước khi gây nhiễm vi rút cúmA và hiện tượng hủy hoại tế bào CPE trên tế bào MDCK theo thời gian B,C,D Hình 3.3 Kết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

ĐOÀN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN GEN HA VÀ NA CỦA VI RÚT CÚM A(H1N1)pdm LƯU HÀNH TẠI

MIỀN TRUNG VIỆT NAM, 2013-2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2017

LỜI CAM ĐOAN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

ĐOÀN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN GEN HA VÀ NA CỦA VI RÚT CÚM A(H1N1)pdm LƯU HÀNH TẠI

MIỀN TRUNG VIỆT NAM, 2013-2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY

Chủ tịch Hội đồng:

PGS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA

Khoa sau đại học:

KHÁNH HÒA – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại Miền Trung Việt Nam, 2013-2015” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào cho tới thời điểm này

Khánh Hòa, ngày 06 tháng 7 năm 2017

Tác giả luận văn

Đoàn Thị Thanh Thủy

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của Quý phòng ban Trường Đại học Nha Trang, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Khoa Sau đại học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài Đặc biệt là sự hướng dẫn tận tình của PGS.TS Nguyễn Văn Duy đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Pasteur Nha Trang, Khoa Vi rút Viện Pasteur Nha Trang đã đồng ý hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài tại Viện Pasteur Nha Trang

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn

bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 06 tháng 7 năm 2017

Tác giả luận văn

Đoàn Thị Thanh Thủy

MỤC LỤC Trang

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về vi rút cúm 5

1.1.1 Phân loại vi rút cúm 5

1.1.2 Đặc điểm của vi rút cúm A 6

1.1.3 Cấu trúc, chức năng của protein Hemagglutinin và Neuraminidase 10

1.1.4 Các yếu tố quyết định độc lực 14

1.1.5 Các phương thức biến đổi kháng nguyên 14

1.1.6 Sự hình thành vi rút cúm A/(H1N1)pdm 17

1.1.7 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A trong tế bào 18

1.1.8 Các triệu chứng lâm sàng, điều trị và phòng ngừa bệnh cúm A(H1N1)pdm 20

1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước về vi rút cúm A(H1N1)pdm 21

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước về vi rút cúm A(H1N1)pdm 23

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.2 Thiết bị và hóa chất chuyên dụng 25

2.2.1 Thiết bị chuyên dụng 25

2.2.2 Hoá chất và sinh phẩm 25

2.3 Cách tiếp cận tổng quát của đề tài 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Phân lập vi rút cúm A(H1N1)pdm trên tế bào MDCK 27

2.4.2 Xác định hiệu giá kháng nguyên bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu 27

2.4.3 Tách chiết RNA tổng số 28

2.4.4 Khuếch đại gen bằng kỹ thuật RT-PCR 28

2.4.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 29

2.4.6 Giải và phân tích trình tự nucleotide 29

2.4.7 Xử lý và phân tích số liệu 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu 31

3.2 Kết quả phân lập các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm trên dòng tế bào MDCK 31

3.3 Kết quả thực hiện thử nghiệm ngưng kết hồng cầu HA 32

3.4 Kết quả RT-PCR và tinh sạch để tạo sản phẩm cho giải trình tự 34

3.5 Kết quả giải trình tự phát hiện đột biến trên gen HA và gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm 35

3.5.1 Kết quả phát hiện đột biến trên gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm 35

3.5.2 Cây phát sinh loài gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm 40

3.6 Kết quả giải trình tự phát hiện đột biến trên gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm 42

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 47

4.1 Kết luận 47

4.2 Khuyến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BSA Albumin huyết thanh bò Bovine Serum Albumin

CDC Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa

CPE Hiện tượng hủy hoại tế bào Cytopathogenic effect

FBS Huyết thanh bào thai bê Fetal Bovine Serum

HA Kháng nguyên Heamagglutinin Heamagglutinin AntigenMDCK Tế bào thận khỉ xanh Madin-Darby Canine Kidney

Cells

NA Kháng nguyên Neuraminidase Neuraminidase Antigen

NCBI Trung tâm quốc gia về thông tin

công nghệ sinh học

National Center for Biotechnology InformationNIID Viện quốc gia về nghiên cứu các

bệnh truyền nhiễm Nhật Bản

National Institute of Infectious DiseasesNIMR Viện nghiên cứu Y khoa quốc gia

RT-PCR Phản ứng phiên mã ngược khuếch

đại chuỗi

Reverse Transcription Polymerase Chain ReactionVIDRL Phòng thí nghiệm tham chiếu các

bệnh truyền nhiễm bang Victoria (Úc)

Victoria Infectious Diseases Reference Laboratory

WHO Tổ chức Y tế thế giới World Health Organization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm thực hiện phản ứng HA Bảng 3.2: Vị trí acid amin thay đổi trên protein HA của chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm

Bảng 3.3: Vị trí acid amin thay đổi trên protein NA của chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm

Hình 1.5 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A trong tế bào

Hình 2.1 Qui trình nghiên cứu gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm

Hình 3.1 Phân bố mẫu nghiên cứu theo độ tuổi và giới tính

Hình 3.2 Tế bào MDCK trước khi gây nhiễm vi rút cúm(A) và hiện tượng hủy hoại

tế bào (CPE) trên tế bào MDCK theo thời gian (B,C,D)

Hình 3.3 Kết quả thực hiện kỹ thuật HA trên chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm thu thập từ nước nổi tế bào MDCK

Hình 3.4 Kết quả RT-PCR trên nước nổi tế bào của 2 chủng phân lập có CPE nhưng không có hiệu giá HA

Hình 3.5: Kết quả RT-PCR cho giải trình tự (A) và kết quả tinh sạch phân đoạn số 1 (B) của gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm

Hình 3.6 Vị trí thay đổi acid amin D222G

Hình 3.7: Cây phát sinh loài gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm

Hình 3.8: Cây phát sinh loài gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Cúm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan theo đường hô hấp, do các type vi rút gồm cúm A, B và C gây nên Bệnh khởi phát đột ngột bằng sốt cao, nhức đầu, đau mỏi toàn thân và những dấu hiệu hô hấp, dễ dẫn đến viêm phổi, tỷ lệ tử vong cao Bệnh có thể gây thành đại dịch, ảnh hưởng tới 50% dân số trên toàn cầu

Vi rút cúm A(H1N1)pdm xuất hiện lần đầu tiên ở Việt Nam từ tháng 5 năm 2009 và tiếp tục lưu hành ở Việt Nam như các vi rút cúm mùa A(H3N2), cúm B Khánh Hòa

là địa phương đầu tiên ghi nhận ca tử vong do nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm vào năm 2009 Theo báo cáo của chương trình giám sát cúm quốc gia khu vực miền Trung, vi rút cúm A(H3N2) cũng được ghi nhận lưu hành quanh năm và số ca mắc

ở Khánh Hòa là nhiều nhất so với các điểm giám sát khác của khu vực miền Trung

Do đó việc giám sát phát hiện sự thay đổi ở mức độ phân tử gồm phát hiện kháng thuốc Tamiflu, amantadine và một số đột biến khác trên các chủng vi rút cúm lưu hành tại Khánh Hòa đóng vai trò quan trọng trong công tác giám sát cúm ở khu vực miền Trung Để chủ động trong công tác giám sát vi rút cúm, phát hiện theo dõi một

số thay đổi acid amin liên quan đến tình trạng kháng thuốc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi rút cúm lưu hành tại miền Trung, chúng tôi đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu

hành tại Miền Trung Việt Nam, 2013-2015” với mục tiêu nghiên cứu các đặc điểm

di truyền gen HA, gen NA liên quan đến đặc điểm sinh học của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực Miền Trung giai đoạn 2013-2015

Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trên 30 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm phân lập được trong giai đoạn 2013-2015 tại một số tỉnh thuộc khu vực miền Trung Các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm được giải trình tự gen HA và NA Kết quả chỉ đưa vào phân tích 29 trình tự gen HA và 28 trình tự gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm

Kết quả nghiên cứu cho thấy, so với chủng sản xuất vắc xin A/California/07/2009, đã phát hiện được 01/29 chủng có sự thay đổi acid amin D222G trên gen HA là đột biến có có liên quan tới tăng mật độ vi rút trong máu gây viêm phổi nặng và có liên quan đến bệnh nhân đã tử vong do nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm năm 2014 Nghiên cứu không phát hiện chủng nào mang đột

với kháng huyết thanh chồn sương trong phản ứng HI khi so sánh với chủng vắc xin A/California/07/2009 Sự thay đổi acid amin ở vị trí P183S, S185T, S203T, S451N

và E499K xảy ra ở tất cả các chủng nghiên cứu với tỉ lệ là 100% Đột biến P83S, I321V xuất hiện ở 27/28 chủng chiếm tỉ lệ 96,4% Đột biến D97N xuất hiện ở 26/28 chủng chiếm tỉ lệ 92,9% Ở vị trí K283E và E374K,sự sai khác acid amin xảy ra trên 23/28 chủng nghiên cứu, chiếm tỉ lệ 82,1% Đột biến K163Q xuất hiện ít hơn ở 17/28 chủng nghiên cứu tương ứng với tỉ lệ là 60,7% Đột biến A256T và V234I xảy ra lần lượt trên 13/28 và 11/28 chủng, chiếm tỉ lệ là 46,4% và 39,3% Các đột biến ở vị trí A141E, S162R và A186T xuất hiện ở 8/28 chủng với tỉ lệ thấp là 28,8

% Kết quả xây dựng cây phát sinh loài của gen HA cho thấy 28 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung giai đoạn 2013-2015 đều thuộc nhóm 6 với 100% chủng đều xuất hiện đột biển mang tính chỉ điểm cho nhóm là S185T, S203T, S451T và E499K Các chủng vi rút này xuất hiện thêm một số đột biến khác nhau nên được chia thành 2 phân nhóm là 6B 17/28 chủng và 6C với 11/28 chủng Các chủng phân lập trong năm 2013 đều thuộc phân nhóm 6C, trong khi toàn bộ các chủng phân lập trong năm 2015 lại thuộc phân nhóm 6B Các chủng phân lập trong năm 2014 thuộc 2 phân nhóm 6B và 6C gồm 11 chủng phân lập năm

2014 thuộc nhóm 6B, 6 chủng thuộc nhóm 6C

Đối với gen NA, kết quả nghiên cho thấy không có sự xuất hiện của đột biến tại vị trí acid amin H275Y kháng với thuốc điều trị cúm Tamiflu trên 29 chủng vi rút nghiên cứu trong giai đoạn 2013-2015 Trong khi đó, đột biến N369K xuất hiện

ở hầu hết 29/29 chủng vi rút nghiên cứu Ở vị trí N200S, có 24/29 chủng xuất hiện đột biến chiếm tỉ lệ là 82,3% Các đột biến N44S, V241I xuất hiện ở 22/29 chủng, chiếm tỉ lệ 75,9% Đột biến tại vị trí N248D xuất hiện ở 15/29 chủng với tỉ lệ là 51,7 % và đột biến K432E xuất hiện trên 13/29 chủng, chiếm tỉ lệ 44,8% Đột biến Y282N, I321V xuất hiện trên 10/29 chủng với tỉ lệ là 34,5% Các đột biến khác như I34V, S82P, N397K xuất hiện ở 9/29 chủng vi rút chiếm tỉ lệ 31,1% Đột biến V83A được phát hiện ở 8/29 chủng chiếm tỉ lệ 27,6% Đột biến tại vị trí S237P xuất hiện rải rác ở 5/29 chủng với tỉ lệ là 17,2% Chỉ phát hiện 3/29 chủng có sự khác biệt acid amin tại vị trí P154S Kết quả trên cây phát sinh loài gen NA cho thấy các chủng vi rút cúm lưu hành trong giai đoạn 2013 - 2015 trong nghiên cứu có trình tự tương đồng với các chủng lưu hành cùng năm trên thế giới và tách ra 2 phân nhóm

khác nhau gồm: phân nhóm 6B và phân nhóm 6C Tương tự như gen HA, gen NA của các chủng nghiên cứu năm 2015 thuộc phân nhóm 6B và các chủng phân lập năm 2013 có gen NA thuộc nhóm 6C Có 8 chủng phân lập năm 2014 có gen NA thuộc nhóm 6C và 10 chủng phân lập năm 2014 có gen NA thuộc nhóm 6B Những kết quả nghiên cứu trên đã cung cấp một số thông tin bước đầu về sự thay đổi ở mức độ kiểu gen trên một số chủng cúm lưu hành tại một số tỉnh khu vực miền Trung, góp phần vào công tác giám sát cúm tại khu vực miền Trung

Từ khóa: cúm A(H1N1)pdm, gen HA, gen NA

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh cúm là một bệnh truyền nhiễm đường hô hấp do vi rút cúm gây ra với các triệu chứng sốt, ho và đau cơ Bệnh có thể gây thành đại dịch, ảnh hưởng tới 50% dân số trên toàn cầu Mỗi người trong đời có thể mắc nhiều lần trong đó người già, trẻ em và người mắc một số bệnh mãn tính dễ bị bệnh cúm và có thể bị tử vong do biến chứng bội nhiễm vi khuẩn ở phổi Ở những người khỏe mạnh, vi rút cúm cũng gây bệnh dù nhẹ cũng phải nghỉ ốm nhiều ngày, gây tổn hại về mặt kinh tế xã hội Ở Đức, chi phí cho trận dịch cúm năm 1996-1997 ước tính khoảng 1045 triệu đô la Mỹ

Ở Mỹ, tiêu tốn hàng năm cho cúm vào khoảng 11.000-18.000 triệu đô la Mỹ Từ năm

1580 tới nay đã có hơn 30 đại dịch cúm bùng phát trên qui mô thế giới Trầm trọng nhất là dịch cúm Tây Ba Nha vào năm 1918-1919 làm gần 21 triệu người chết trên toàn thế giới, hơn cả số người chết trong chiến tranh thế giới lần thứ nhất (trích dẫn trong Lê Văn Hiệp, 2009) Năm 1957-1958, dịch cúm tại châu Á do H2N2 làm 1 triệu người tử vong và cúm Hồng Kông do H3N2 gây chết gần 1 triệu người nữa vào những năm 1968-1969 (trích dẫn trong Lê Văn Hiệp, 2009) Đến tháng 3 năm 2009, một lần nữa thế giới lại ghi nhận sự xuất hiện và gây thành đại dịch trên toàn cầu của

B và đã thay thế hoàn toàn cho vi rút cúm A(H1N1) cũ Tuy nhiên, theo báo cáo của

Tổ chức Y tế thế giới, ước tính khoảng 284 000 trường hợp tử vong do cúm A(H1N1)pdm trong 12 tháng đầu tiên lan truyền dịch

Ở Việt Nam, theo Bộ Y tế, có tổng cộng 11 047 trường hợp mắc với 50 trường hợp tử vong đã được báo cáo cho đến ngày 21 tháng 12 năm 2009 Theo báo cáo của Chương trình giám sát cúm quốc gia, tính chung giai đoạn từ năm 2006-2014, có 10,7% tổng số bệnh nhân đến khám tại các cơ sở y tế có chẩn đoán mắc Hội chứng cúm và 20% số ca xét nghiệm có kết quả dương tính với vi rút cúm Riêng tại khu vực miền Trung, tỉ lệ này tương ứng là 7% và 23,2% Số ca xét nghiệm có kết quả

dương tính ở miền Trung là 22,7%, cao nhất so với khu vực miền Bắc là 20,1%, miền Nam là 22,4% và Tây Nguyên là 6,1%

Cũng theo báo cáo Chương trình giám sát cúm quốc gia, trong giai đoạn từ năm 2009 đến năm 2013, từ 46,6% các trường hợp nhiễm vi rút cúm được xác định là cúm A(H1N1)pdm trong năm 2009 giảm xuống còn 28% vào năm 2010 khi nó lưu hành đồng thời với vi rút cúm A(H3N2) và cúm B, sau đó tiếp tục tăng lên 74,1% trong năm 2011 Sau khi lưu hành với tỉ lệ thấp vào năm 2012 thì vi rút cúm A(H1N1)pdm lại chiếm ưu thế vào năm 2013 với khoảng 30% các trường hợp bị nhiễm được báo cáo

Vi rút cúm A(H1N1)pdm là một phân type trong nhóm vi rút cúm A thuộc

họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt vi rút mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đến N9) Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen vi rút cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên

bề mặt màng của tế bào nhiễm HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng vi rút trong quá trình lây nhiễm

Sự thay đổi kháng nguyên HA và NA của vi rút cúm dẫn đến sự xuất hiện của các chủng vi rút cúm mới, làm giảm hiệu quả của vaccin phòng bệnh Sự thay đổi kháng nguyên này cũng làm xuất hiện tình trạng kháng các loại thuốc điều trị cúm hiện nay như Tamiflu và amantadine, gây bệnh tiến triển nặng trên bệnh nhân nhiễm cúm và ảnh hưởng đến kết quả điều trị Kể từ khi sự xuất hiện của vi rút cúm A(H1N1)pdm, có nhiều nghiên cứu phân tích phân tử đã xác định được một số đột biến liên quan tới biểu hiện lâm sàng, bệnh sinh, và đáp ứng miễn dịch đối với vi rút cúm Ví dụ, thay thế acid amin ở vị trí D222G / E / N trong phân tử HA có liên quan tới tăng mật độ vi rút trong máu gây viêm phổi nặng và tử vong; đột biến ở vị trí I219K ở vị trí gắn kết thụ thể của HA làm gia tăng số lượng thụ thể gắn kết của

người (Hang K L Nguyen và cs, 2015) Ngoài ra, thay đổi acid amin ở vị trí I117V, I223R, và H275Y trên protein NA làm giảm tính nhạy cảm với oseltamivir (Doherty và cs, 2006) Hơn nữa, vi rút cúm A(H1N1)pdm cũng có khả năng tái tổ hợp với các vi rút cúm mùa khác để tạo ra chủng vi rút mới làm tăng khả năng gây bệnh Do tính chất thay đổi của vi rút cúm A(H1N1)pdm, hệ thống cảnh báo và giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của WHO đã yêu cầu các quốc gia trên thế giới giám sát sự thay đổi về kiểu gen, và tính kháng nguyên của vi rút cúm

Để chủ động trong công tác giám sát cúm, phát hiện theo dõi một số thay đổi acid amin liên quan đến tình trạng kháng thuốc và một số đặc điểm sinh học của các

chủng vi rút cúm lưu hành tại khu vực miền Trung, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên

cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại Miền Trung Việt Nam, 2013-2015”

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung, 2013-2015

3 Nội dung của đề tài

- Phân lập một số chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung giai đoạn 2013-2015 trên tế bào MDCK

- Kiểm tra hiệu giá kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm bằng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu HA

- Khuếch đại gen HA và NA bằng kỹ thuật RT-PCR

- Xác định trình tự gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm

- Xây dựng cây phát sinh loài và phân tích các thay đổi acid amin trên protein

HA và NA liên quan đến đặc tính sinh học của vi rút cúm A(H1N1)pdm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

 Ý nghĩa khoa học: Xác định trình tự gen HA và NA của vi rút cúm

A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung giai đoạn 2013-2015, làm cơ sở dữ liệu cho việc xác định đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm cũng như phân tích các đặc điểm vi rút học của các vi rút này

 Ý nghĩa thực tiễn: Nâng cao kỹ năng phân lập vi rút cúm trên tế bào cảm

nhiễm trong phòng thí nghiệm Việc phân tích trình tự nucleotide của gen HA và NA của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm còn có ý nghĩa lớn trong việc xác định biến

đối di truyền của các chủng tại các địa phương khác nhau của khu vực miền Trung,

so sánh với các quốc gia và các vùng địa lý khác nhau, giúp cho việc sưu tập và duy trì các chủng theo đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hoá, từ đó có thể biết dịch tễ học ở mức độ sinh học phân tử Mặt khác, do vi rút cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên cao, có thể chủng vi rút cúm phân lập ở đầu và cuối ổ dịch đã khác nhau về đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên, vì vậy, cần phải có một số lượng các chủng đa dạng theo thời gian tạo tiền đề định hướng giám sát nguồn gốc dịch bệnh

Do đó, việc so sánh các trình tự nucleotide và acid amin từ các chủng phân lập hàng năm giúp chúng ta tìm hiểu những vùng gen thường thay đổi và không thay đổi trong toàn bộ hệ gen, góp phần xác định được loại vaccine phù hợp cho công tác phòng chống dịch cúm A(H1N1)pdm Cuối cùng, kết quả giải trình tự các chủng vi rút cúm

có thể ứng dụng để nghiên cứu tính kháng thuốc của vi rút cúm, tiến tới xác định đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm

Chương 1 TỔNG QUAN

2/ Nhóm vi rút cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con người, chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu

3/ Nhóm vi rút cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn

Ba nhóm vi rút cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên động vật có xương sống Vi rút cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF (hemagglutinin esterase fusion)

4/ Nhóm Thogoto vi rút gây bệnh cho động vật, người và động vật không xương sống (muỗi, rận biển) Kháng nguyên bề mặt của Thogotovi rút là GP (glycoprotein)

Vi rút cúm A được định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học của các glycoprotein bề mặt HA và NA Hiện nay, người ta đã xác định được 16 sub-type HA (H1 - H16) và 9 sub-type NA (N1 - N9) Từ năm 1980, việc xác định phân type HA

đã được chuẩn hóa cho tất cả các vi rút cúm type A từ gia cầm, chim, ngựa và người Huyết thanh từ gia cầm và chồn sương hồi phục sau khi mắc bệnh và kháng thể đơn dòng được thu thập dùng để xác định sự có mặt kháng nguyên của vi rút cúm trong từng phân type Kháng thể đơn dòng được dùng trong nghiên cứu chi tiết về các epitope trong từng kháng nguyên như so sánh HA của các vi rút H1N1 từ gà tây và lợn để thiết lập mối quan hệ về tính kháng nguyên của các HA của chúng (Frederick

G Hayden, 2009)

NA và protein đệm M (matrix) Lipid tập trung ở màng vi rút, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin Bên trong vi rút có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn Vỏ của vi rút được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của vi rút, mỗi gai có độ dài từ 10 -

14 nm Các gai này được cấu tạo bởi các glycoprotein Có hai loại glycoprotein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Các gai HA thường nhiều hơn và xen

kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4-5):1

Hệ gen vi rút cúm A là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt (Hình 1.1B), mã hoá cho 11 protein khác nhau của vi rút, các phân đoạn được sắp xếp theo trật tư: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M (gồm M1 và M2), NS (gồm NS1 và NS2) (Murphy, 1996 và Rabadan, 2006) Mỗi phân đoạn RNA của vi rút cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1C)

Các phân đoạn của hệ gen vi rút cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng vi rút cúm A)

và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ vi rút

HA có chức năng giúp vi rút bám dính vào tế bào cảm thụ và làm xâm nhập vật liệu di truyền của vi rút vào bên trong tế bào NA có chức năng thúc đẩy sự lắp

ráp để giải phóng vi rút từ các tế bào cảm thụ Các glycoprotein HA và NA quyết định tính kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type vi rút khác nhau và cũng là vị trí

để các loại thuốc kháng vi rút trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt

vi rút Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng nguyên trong sản xuất vaccine Phân tích thành phần hoá học các hạt vi rút cúm A có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8%

là carbohydrate (Murphy, Webster 1996)

(A) (B) (C)

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm A (A) Ảnh các dạng hình thái của vi rút cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi

điện từ truyền qua (Nguồn: Centers for Disease Control and Prevention Public Health Image Library); (B) Mô hình cấu tạo hạt vi rút cúm A (hemagglutinin: phân

tử kháng nguyên HA, neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzym polymerase của vi rút), (C) Cấu trúc của phức hợp

ribonucleoprotein RNP của vi rút cúm (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Về mặt dịch tễ học, theo Webster (1998), Ito T, Couceiro và cs (1998), vi rút cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật

và người Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật, cho nên vi rút cúm A thuộc nhóm vi rút nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections)

1.1.2.2 Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm A

Nhóm vi rút cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên

tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho một loại protein của vi rút Hai đầu 5' và 3' của RNA của hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn, đó là 5'- AGUAGAACAAGG và 3'-UCG(U/C)UUUCGUCC (Ito T và cs, 1998) Cũng theo Ito T và cs (1998), sáu phân đoạn (từ 1- 6) mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho một loại protein riêng biệt, phân đoạn 7 và 8 mã hoá cho từng phần của gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối-ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của vi rút Protein kháng nguyên bề mặt là HA thuộc protein màng type I liên quan đến sự bám dính của vi rút và là thụ thể của vi rút, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, hợp nhất vỏ vi rút với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà vi rút

Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt vi rút theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein Protein mang hoạt tính enzym là NA thuộc protein màng type II có chức năng của một enzym cắt thụ thể để vi rút thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của vi rút có chức năng "gắn" vào màng

tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình nhân lên và giải phóng

vi rút Protein màng không được glycosyl hóa là MA mang tính chất protein đệm, bao gồm M1 và M2 có vai trò bao gói RNA của hệ gen vi rút và là kênh vận chuyển các thành phần của vi rút qua màng Một protein khác là protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm hai tiểu phần NS1và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của

vi rút, nếu thiếu chúng vi rút sinh ra không hoàn chỉnh, trở thành vi rút thiểu năng 1.1.2.3 Chức năng các phân đoạn trong hệ gen của vi rút cúm A

Phân đoạn 1 mã hoá cho enzym polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã, có

độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là: 87 kDa) (Ito T và cs, 1998) Phân đoạn 2 mã hoá cho enzym polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNA transcriptase), có độ dài

2341 nucleotide, với trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) (Biswas S.K, Nayak D.P, 1996) Phân đoạn 3 mã hoá cho enzym kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) tham gia tổng hợp RNA, có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85 kDa) (Biswas S.K, Nayak D.P ,1996) Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu) Có 16 loại HA, trong đó chỉ có H1, H2, H3 tìm thấy ở các vi rút gây bệnh cho người Vi rút mang gen H5, H7 và H9 có thể lây nhiễm từ chim sang người HA được phân bố rải rác trên bề mặt của vi rút, là protein gắn vi rút vào thụ thể của tế bào, gây ngưng kết hồng cầu và tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của vi rút HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48 kDa và HA2 là 29 kDa) (Steinhaure D.A, 1999), chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type vi rút, đối với H5N1 là 1704 - 1707 bp, H7N1 là 1683 - 1695 bp, H9N1 là 1683 bp, H1N1 là 1701 bp Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử tính toán là 56 kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp (Ito T và cs, 1998) Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA) NA là các gai hình nấm trên bề mặt của vi rút, NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym phân cắt liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan truyền vi rút trong tế bào chủ NA có trọng lượng phân tử theo tính toán 50 kDa (thực tế: 48 - 63 kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H1N1 là 1350 – 1410 bp (Castrucci M.R và Kawaoka Y., 1993) Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và M2 Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của vi rút, có chức năng bao gói và tham gia vào quá trình nảy chồi của vi rút Tiểu phần M2 là protein nội màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của vi rút, trọng lượng phân tử tính toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25 kDa),

và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M có độ dài khoảng 1027 bp (Holsinger L

và cs, 1994) Phân đoạn 8 là gen NS có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A, mã hoá cho hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 Tiểu phần NS1 có chức năng vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng interferon và tiểu phần NS2

có vai trò vận chuyển RNP ra khỏi nhân, trọng lượng phân tử tính toán NS1 là 27 kDa (thực tế: 25 kDa), của NS2 là 14 kDa (thực tế: 12 kDa), NS có độ dài 890 bp (Luo G, Palese, 1992)

1.1.3 Cấu trúc, chức năng của protein Hemagglutinin và Neuraminidase

1.1.3.1 Protein hemagglutinin (HA)

Protein hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) là kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng vi rút cúm A (Larisa V Gubareva và cs, 2000), có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của vi rút Gen mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể ngăn cản sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu (HI, Hemagglutinin Inhibitory test) Theo Murphy B.R và Webster R.G (1996), vi rút cúm A có 16 phân type HA đã được phát hiện, trong đó

có 3 phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm đã xảy ra trong lịch sử

Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer) (Hình 1.5), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa vị trí gắn thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch F.X và cs, 1981)

Gen HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide Phần HA1 và HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng làm ngưng kết hồng cầu Màng bao lipid kép và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết vi rút vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm (Tiffany G Sheu và

cs, 2011) Trên phân tử HA có hai vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C Vùng kỵ nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi

HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc acid amin từ 186-211 của HA2) có nhiệm vụ neo giữ phân tử protein trên vỏ vi rút (Chen J, Skehel J và Wiley D.C, 1999) Sự biến đổi trong gen mã hoá cho kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hằng năm

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của vi rút trên vật chủ giúp cho vi rút xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong

tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử

HA của vi rút cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của vi rút ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner R, Maosovich M, Klenk H, 2002) Nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều của gen kháng nguyên hemagglutinin H5 của vi rút gây bệnh ở gà và H9 ở lợn, cũng như H5 của vi rút thích ứng gây bệnh trên người cho thấy : vi rút cúm

gà thích hợp với loại tế bào có thụ thể HA chứa acid sialic liên kết với đường galactose góc quay α-2,3, trong khi ở lợn và người vi rút cúm có thụ thể thich hợp ở góc quay α-2,6 Vị trí acid amin 226 (aa 226) của tiểu đơn vị HA1 được xác định là

vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu Ở hầu hết các chủng vi rút cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của vi rút cúm A) Ở các chủng vi rút cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2 gây bệnh ở người, vị trí này trên protein HA là leucine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6 sialic acid

có mặt ở tế bào biểu mô đường hô hấp dưới của người (Steinhaure D.A, 1999) Cũng theo Stainhaure D.A (1999), các tế bào cảm thụ với vi rút cúm A của lợn có cả hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ trung gian để vi rút cúm A tiến hóa thích ứng lây nhiễm sang người Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí acid amin liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Keawcharoen và cs, 2005) Protein HA kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa vi rút Vì thế HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của vi rút vừa là đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi rút ở cơ thể nhiễm và là cơ sở trong điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Horimoto T, Kawaoka Y, 2006 và Keawcharoen và cs, 2005) Chuỗi oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng (Ha Y và cs, 2001, Vey M và cs, 1992) Chuỗi này chứa một số acid amin mang tính kiềm (basic acid amin) làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân type Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối

quyết định tính độc lực của vi rút thuộc biến chủng mới (Horimoto T, Kawaoka Y, 2006) Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều acid amin kiềm (arginine và lysine) thì khả năng HA được phân cắt càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của vi rút cúm A (Bosch F và cs, 1981, Vey M và cs, 1992) Mức độ gây bệnh của vi rút cúm A còn phụ thuộc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzym protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid (Steinhaure D.A, 1999) Vi rút cúm A không có gen tổng hợp enzym protease, mà phải nhờ vào hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm vi rút Càng có điểm cắt protease hoàn chỉnh và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzym tham gia cắt thụ thể, thì vi rút mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều vi rút mới và mức

độ gây bệnh cũng vì thế mà nặng nề hơn

Theo báo cáo của WHO, kể từ khi xuất hiện vào tháng 3/2009 và lưu hành đến nay, gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm được nhóm thành 8 nhóm chính, trong đó nhóm 6 được tách thành các phân nhóm: 6A, 6B và 6C Đối với gen HA của vi rút cúm A(H3N2) được phân thành 7 nhóm, trong đó các chủng lưu hành năm 2012-

2014 tập trung trong nhóm 3C Các chủng H3 lưu hành năm 2013 và 2014 tương đồng với chủng vaccin A/Texas/50/2012, tuy nhiên các chủng năm 2014 có xu hướng tách thành nhóm riêng từ phân nhóm 3C.3

1.1.3.2 Protein neuraminidase (NA)

Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của vi rút cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA (Baigent S.J, McCauley J.W, 2001 và Wagner R Masovich M., Klenk H., 2002) Theo Wagner R Masovich M., Klenk H., 2002, phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng,

và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Castrucci M R., Kawaoka Y., 1993) Protein

NA có 3 chức năng chính:

- NA cắt acid sialic ra khỏi phân tử HA và cắt những phân tử NA khác ra khỏi các glycoprotein và glucolipit ở bề mặt tế bào, đẩy nhanh sự lây nhiễm của vi rút trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp của các hạt vi rút mới trên màng tế bào Vi rút cần phải có NA thì mới có thể xâm nhập được qua lớp màng mucin của

biểu mô hô hấp Hai phân type N1 và N2 được tìm thấy ở vi rút cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử (Chen H., 2009)

- Tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi vỏ bọc “uncoating” giải phóng hệ gen của vi rút vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của vi rút diễn ra nhanh hơn (Wang J và cs, 2009)

- Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho vi rút nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu

Vi rút cúm hình thành nên cơ chế để vượt qua sự bảo vệ của mucin đường hô hấp Colman P.M (1994) và Moscona A (2005) cho rằng, chức năng của NA liên quan đến khả năng của vi rút xuyên qua màng nhầy do phân cắt liên kết giữa mucin và sialic acid, vốn là mối liên kết ngăn cản sự xâm nhập của vi rút vào các thụ thể chức năng trên tế bào đích Mặt khác, NA có thể phá vỡ trục liên kết màng nhầy và IgA, tạo nên trạng thái ức chế miễn dịch cục bộ từng phần, nâng cao khả năng lây nhiễm của vi rút cúm và viêm phổi kế phát do vi khuẩn (Bhatia A, Kast R.E, 2007) Đột biến trong gen NA thường làm thay đổi hoạt tính của enzym này (Keawcharoen J và cs)

Nghiên cứu của Hasan Zaraket và Reiko Saito (2010) chỉ ra rằng, cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của vi rút cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA là đích tác động của các loại thuốc, hóa dược ức chế vi rút không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt

vi rút mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của vi rút, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh

ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng vi rút đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA

Trong hệ gen của vi rút cúm A, chức năng của gen NA chịu trách nhiệm trong quá trình tổng hợp neuraminidase Gen NP chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp nucleoprotein (giúp phân biệt 3 loại A, B, C) Gen M chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp matrix protein Gen NS chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp protein không cấu trúc (non- structural protein) Các gen còn lại là PA, PB1, PB2 là các thành phần tạo nên các RNA polymerase

Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của vi rút là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với vi rút cúm A và là cơ sở nghiên cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người (Wang R., Maosovich M., Klenk H, 2002)

1.1.4 Các yếu tố quyết định độc lực

Trong đa số trường hợp độc lực vi rút do nhiều gen quyết định, nhưng một gen (hoặc đột biến trong một gen) cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến độc lực của chúng Chuỗi nối giữa HA1 và HA2 chứa một số acid amin mang tính kiềm được mã hoá bởi một chuỗi oligonucleotide, là điểm cắt của protease và là vùng quyết định độc lực của vi rút (Wang R., Maosovich M., Klenk H, 2002)

Protein NS1 cũng đóng vai trò như một yếu tố độc lực của vi rút nhờ khả năng thoát khỏi tác động của IFN (interferon) trong quá trình lây nhiễm vi rút cúm A do ức chế sự tổng hợp IFN (Krug R.M và cs, 2003) Cùng với việc ngăn chặn đáp ứng của IFN, protein NS1 còn liên kết đặc hiệu với protein của tế bào nhiễm và phá vỡ chức năng của chúng Nhóm RNA-polymerase bao gồm protein PB1, PB2 và PA cũng liên quan đến độc lực của vi rút cúm A

1.1.5 Các phương thức biến đổi kháng nguyên

Theo Murphy B.R và Webster R.G (1996), đặc tính cơ bản của vi rút cúm A

là hệ gen luôn biến đổi, sự thay đổi kháng nguyên theo thời gian tồn tại giúp cho vi rút lưu hành rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều loài vật chủ khác nhau Sự thay đổi kháng nguyên của vi rút cúm tạo điều kiện cho sự lưu hành của chúng trong quần thể người và không thể dự báo được sự thay đổi đó

Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở vi rút cúm A 1.1.5.1 Sự trôi kháng nguyên (antigenic drift)

Xảy ra trong quá trình nhân lên của vi rút, RNA của vi rút có thể bị đột biến điểm tại các gen mã hóa cho HA và NA dẫn đến sự thay đổi của một vài acid amin Những thay đổi này tích lũy dần qua các năm và là nguyên nhân của các vụ dịch cục

bộ Vi rút cúm A rất dễ dàng thay đổi tạo nên một tổ hợp gen mới Hiện tượng này có thể xảy ra khi vi rút cúm người và vi rút cúm gia cầm cùng gây nhiễm trên một tế bào cảm nhiễm hoặc trực tiếp lây truyền từ loài này sang loài khác Do vi rút cúm A ký

sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản sao” (proof-reading) trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích, cho nên sự thiếu hụt enzym sửa chữa RNA dẫn đến các enzym sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể thêm nucleotide (đột biến thêm), làm mất đi (đột biến xoá) hoặc thay thế (đột biến điểm) một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới trong quá trình nhân lên của vi rút (Chen J và cs, 1999, Murphy B.R, Webster R.G., 1996)

Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các acid amin trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi đặc tính sinh học của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm) Tần suất xảy ra đột biến điểm (point-mutation) rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của vi rút cúm A) thì

có 1 nucleotide sai khác (Rabadan R., Levine A J., Robins H., 2006) Như vậy, gần như mỗi hạt vi rút mới được sinh ra đều chứa một hoặc hai đột biến điểm trong hệ gen của nó và như vậy, các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ vi rút sẽ làm xuất hiện một phân type vi rút mới có gen HA với những đặc tính kháng nguyên mới

có thể bị sai lệch Sự chuyển dịch lệch kháng nguyên cũng có thể xảy ra với gen NA

là gen có chứa nhiều acid amin quan trọng, những acid amin này khi đột biến sẽ làm cho vi rút kháng lại các thuốc ức chế neuramidase

Hình 1.2 Đột biến điểm của hiện tượng trôi kháng nguyên (antigenic drift) ở vi rút cúm A

(Nguồn: Medscape.org/antigenic drift/.antigenic shift)

Trôi kháng nguyên

1.1.5.2 Sự trượt kháng nguyên (antigenic shift)

Chủ yếu xảy ra ở phân đoạn 4 của vi rút cúm là phân đoạn gen HA Sự trượt kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên chỉ có ở vi rút cúm và ở rất ít một số vi rút RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép vi rút có khả năng biến chủng rất cao Sự trượt kháng nguyên là do có sự sắp xếp lại gen nên làm thay đổi thuộc tính của kháng nguyên Khi vi rút có sự trượt kháng nguyên làm thay đổi cơ bản kháng nguyên sẽ dễ dàng lan truyền trong cộng đồng người và đó chính là nguyên nhân gây ra đại dịch mới Sự trượt kháng nguyên chỉ xảy ra ở vi rút cúm type

A trong khi sự trôi kháng nguyên xảy ra ở cả vi rút cúm type A và B

Hình 1.3 Đột biến tái tổ hợp của hiện tượng trượt kháng nguyên (antigenic shift) của

vi rút cúm A

(Nguồn: Medscape.org/antigenic drift/.antigenic shift)

Hiện tượng này xảy ra như sau : Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của

vi rút cúm A được hai chủng vi rút cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào có thể trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gen giữa hai chủng vi rút đó trong quá trình kết hợp lại thành một hệ gen mới, tạo ra các dạng khác nhau của RNA hệ gen ở các hạt vi rút mới sinh ra, hỗn hợp từ thành phần các phân đoạn của hệ gen từ những vi rút ban đầu Kết quả là tạo ra thế hệ vi rút mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Chen J M và cs, 2007, Hilleman M R., 2002 và Macken C A., Webby R J., Bruno

W J.,2006)

Trượt kháng nguyên

1.1.5.3 Hiện tượng glycosyl hoá

Thông thường, các vi rút cúm A có mức độ đột biến điểm cao làm thay thế một số nucleotide tại những vị trí mà ở đó có thể tạo nên các acid amin mới có khả năng tiếp nhận carbon hydrate tạo nên hiện tượng glycosyl hoá (glycosylation) Hay nói cách khác, ở vi rút cúm A, glycosyl hoá là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) vào với acid amin asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí NXS hoặc NXT (trong đó, N: asparagine, X: acid amin bất kỳ, trừ proline, S: serine hoặc T: threonine) Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm vi rút Hiện tượng trôi kháng nguyên sinh ra do đột biến điểm ở một vị trí nào đó hình thành nên bộ mã của asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hoá xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và

NA, giúp cho vi rút thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà

sự nhân lên của vi rút (Baigent S J., Mac Cauley J.W., 2001) Hiện tượng trôi kháng nguyên và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng trượt kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của vi rút cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của vi rút cúm A(H1N1)pdm hiện nay, mặc dù vi rút này ít gây nguy hiểm cho người nhưng có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng từ người sang người Trong quá trình sao chép và tổng hợp, rất có thể vi rút cúm A(H1N1)pdm tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của các chủng vi rút cúm A(H5N1) độc lực cao gây nguy hiểm cho người, để tạo ra một biến chủng vi rút mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong công tác phòng chống dịch bệnh cúm (Arinaminpathy N., McLean A R., 2008)

1.1.6 Sự hình thành vi rút cúm A/(H1N1)pdm

Chủng cúm A/H1N1pdm do tổ hợp gen của nhiều nguồn khác nhau, bao gồm chủng A(H1N1) năm 1918 lưu hành ở lợn, chủng này tổ hợp với chủng A(H3N2) Bắc Mỹ-một chủng tổ hợp từ A/H3N2 của người và cúm gia cầm Bắc Mỹ-để có chủng cúm lợn A(H1N2) Bắc Mỹ Người ta nghi ngờ rằng chủng cúm lợn A(H1N2)

Bắc Mỹ tổ hợp với chủng A/H1N1 cúm lợn tương tự gia cầm Á-Âu để xuất hiện chủng A(H1N1)pdm (Hình 1.4)

Hình 1.4 Sự hình thành chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm

1.1.7 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A trong tế bào

Vi rút cúm A khi xâm nhập vào tế bào động vật hay người qua đường hô hấp trên hoặc hệ tiêu hóa, ngay lập tức vi rút sẽ bám vào lớp màng nhày niêm mạc vật chủ Vi rút được gắn vào bề mặt của tế bào thích ứng nhờ có cơ quan cảm thụ mà bản chất là glycoprotein chứa acid sialic, sau đó vi rút qua màng tế bào nhờ loại enzym đặc biệt để vào nguyên sinh chất và nhân tế bào (Hình 1.5) Tại đây, protein

HA bề mặt của vi rút gắn vào thụ thể chứa acid neuraminic của tế bào chủ và tiến hành nhập bào tạo nên endosome (“khoang ẩm bào”) Tiếp theo là quá trình dung hợp giữa vỏ ngoài của vi rút với màng endosome, điều này thực hiện được nhờ gai

HA chồi lên khi pH trong endosome thấp Sau khi dung hợp, ribonucleoprotein (RNP) và RNA-polymerase vào tế bào chất RNA-polymerase của vi rút được hoạt hoá ở giai đoạn này

Hình 1.5 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A trong tế bào

(Nguồn:Nature 459, 931-939,18/6/2009)

Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 phân đoạn RNA từ hệ gen sợi âm của vi rút là tạo ra 10 phân tử protein Sáu phân đoạn (từ 1 đến 6) RNA thông tin (mRNA) được tạo ra và chịu trách nhiệm tổng hợp thành 6 loại protein: HA, NA, NP, PB1, PB2, PA, còn phân đoạn 7 và phân đoạn 8 do có hai khung đọc trên mỗi phân đoạn, nên có hai mRNA tạo ra cho mỗi phân đoạn để tổng hợp các protein M1, M2 và NS1, NS2 Sau khi hợp nhất màng đã được thực hiện trong “khoang ẩm bào”, nucleocapsid của vi rút được chuyển vào trong nhân tế bào để thực hiện quá trình tổng hợp RNA nguyên liệu hệ gen cho các vi rút mới Hệ thống enzym sao chép của vi rút ngay lập tức tạo nên các RNA thông tin Đối với vi rút cúm, để tổng hợp RNA thông tin, các phân đoạn RNA hệ gen được mũ hoá ở 10 -13 nucleotide ở đầu 5’ với nguyên liệu

mũ hoá lấy từ RNA tế bào, nhờ vào hoạt tính enzym PB2 (polymerase basic protein 2) của vi rút RNA sợi đơn âm được chuyển thành RNA sợi đơn dương theo cơ chế

bổ sung, và sợi dương này lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA đơn

âm mới nhờ RNA polymerase Các sợi RNA được tạo ra là một sợi hoàn chỉnh, không được mũ hóa ở đầu 5' và không được adenyl hóa ở đầu 3', chúng sẽ được bao gói lại để hình thành nên ribonucleocapsid Sau khi được bao gói, ribonucleocapsid được vận chuyển đến màng tế bào mà ở đó các gai HA, NA, M2 đã được gắn sẵn nhờ

hệ thống Golgi chuyển ra và hạt vi rút mới được hình thành, lúc này NA sẽ cắt thụ thể sialic acid giải phóng vi rút khỏi tế bào chủ, bắt đầu một quá trình lây nhiễm mới

Quá trình phiên mã, sao chép của vi rút cúm đặc biệt khác với các RNA vi rút khác là quá trình này chỉ xảy ra trong nhân tế bào bị nhiễm Thời gian xâm nhiễm và giải phóng hạt vi rút mới của vi rút cúm kéo dài trong vài giờ, các hạt vi rút mới được tạo thành không làm tan tế bào bị nhiễm, nhưng các tế bào này dường như không còn khả năng sống sót do rối loạn ở hệ thống tổng hợp các đại phân tử sinh học

1.1.8 Các triệu chứng lâm sàng, điều trị và phòng ngừa bệnh cúm A(H1N1)pdm

1.1.8.1 Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn ủ bệnh: Thời gian ủ bệnh từ 02-05 ngày Trong thời kỳ ủ bệnh, mặc

dù cơ thể đã nhiễm vi rút nhưng chưa được xác định là nguồn lây nhiễm Không có biểu hiện triệu chứng trong giai đoạn ủ bệnh

Giai đoạn khởi phát: Xuất hiện sau giai đoạn ủ bệnh Bệnh nhân sốt thành cơn hay sốt liên tục cả ngày, nhiệt độ thường 38-40oC Bệnh nhân có cảm giác đau đầu, đau mỏi người, có thể thấy đau quanh hốc mắt Xuất hiện các triệu chứng viêm long đường hô hấp như ho, sổ mũi, hắt hơi Những dấu hiệu này thường khó phân biệt với các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp khác như á cúm, hô hấp hợp bào

Trong quá trình bị nhiễm vi rút cúm, kháng thể kháng glycoprotein HA và NA đóng vai trò quan trọng Kháng thể HA ngăn cản vi rút xâm nhập vào tế bào chủ Kháng thể NA ngăn cản sự giải phóng của vi rút ra khỏi tế bào chủ

Trong nhiễm trùng tiên phát, các kháng thể đặc hiệu với Hemagglutinin IgA, IgM và IgG xuất hiện ở dịch mũi được tiết ra một cách tích cực Kháng thể IgA có vai trò quan trọng trong ngăn chặn sự nhiễm vi rút, hoạt động của nó diễn ra tại bề mặt màng nhầy của bộ máy hô hấp

Trong nhiễm vi rút cấp tính, kháng thể IgG hạn chế sự nhân lên của vi rút và interferon cũng giúp cho sự hồi phục có hiệu quả

- Oseltamivir (Tamiflu) và zanamivir (Relenza): Ngăn cản sự giải phóng vi rút khỏi tế bào nhiễm nhờ ức chế hoạt động của NA Nhóm thuốc này được sử dụng cho điều trị cả cúm A và cúm B Điều trị bằng zanamivir có hiệu quả thấp hơn oseltamivir Tuy nhiên, oseltamivir lại khá đắt và chỉ sử dụng khi bệnh nhân nhiễm cúm đã xuất hiện triệu chứng

Trong điều trị nhiễm vi rút cúm, một số thuốc điều trị có thể có tác dụng vào lúc này nhưng không có tác dụng vào lúc khác đối với vi rút cúm do vi rút đã thay đổi để chống lại tác dụng thuốc, do đó làm giảm hiệu quả của việc điều trị hoặc ngăn chặn bệnh của thuốc Các chất ức chế M2 hay còn được biết đến là adamantane đã không còn có hiệu quả đối với vi rút cúm B, cúm A(H3N2) và cúm A(H1N1)pdm đang lưu hành là do đột biến ở vị trí S31N trên kênh ion M2 Tuy nhiên, một tỉ lệ nhỏ cúm A(H5N1) vẫn còn nhạy với adamantane Theo nhiều nghiên cứu đã được công

bố, vi rút cúm A(H3N2) kháng adamantane đã lưu hành trên toàn cầu kể từ năm

2003, vi rút cúm mùa A(H1N1) kháng oseltamivir đã lưu hành từ năm 2007 và vi rút cúm A(H1N1)pdm kháng adamantane đã lưu hành từ năm 2009 Khả năng đề kháng của vi rút cúm đối với adamantane thường xảy ra dễ dàng hơn khả năng đề kháng với các chất ức chế neuraminidase (Conenello và cs, 2007)

Đối với vắc xin phòng bệnh cúm hiện nay, người ta sử dụng vắc xin cúm bất hoạt được phân tách từ tiểu phân virus (tức virion), chứa đa kháng nguyên, được nhân bản trong phôi trứng gà Các chủng có chứa trong vắc xin cúm thay đổi mỗi năm, phù hợp với khuyến cáo hàng năm của WHO về chủng cúm lưu hành tại Bắc bán cầu và Nam bán cầu

1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước về vi rút cúm A(H1N1)pdm

Theo báo cáo tóm tắt của WHO ngày 6/6/2011, 5 phòng thí nghiệm vệ tinh của WHO gồm CDC, CNIC, NIMR, VIDRL và NIID đã thực hiện việc giám sát

độ nhạy của thuốc kháng vi rút đối với vi rút cúm từ tháng 9/2010 đến tháng 3/2011 cho thấy 1,5% vi rút cúm A(H1N1)pdm đã kháng với oseltamivr Tất cả các vi rút kháng với thuốc này đều có sự đột biến thay thế tại vị trí Histidine bằng Tyrosine ở vị trí acid amin 275 (H275Y) ở gen NA

Theo nghiên cứu của Jang - Hoon Choi và cộng sự (2009) về thực trạng kháng thuốc điều trị vi rút cúm được thực hiện tại Hàn Quốc sau vụ dịch cúm năm

2009 cho thấy, 13 trong số 79 bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm có điều trị thuốc kháng vi rút oseltamivir và zanamivir đã xuất hiện đột biến H275Y Trong phân tích kiểu hình, đột biến H275Y có biểu hiện kháng thuốc với oseltamivir nhưng lại nhạy cảm với zanamivir Tất cả các chủng vi rút phân tích đều kháng với amantadine vì có đột biến S31N trên gen M2 Một nghiên cứu khác được thực hiện ở Anh từ năm 1968-1999 trên 1813 mẫu bệnh phẩm phân lập cho thấy tỉ lệ kháng thuốc amantadine và rimatadine của vi rút cúm là 1,5% (trích dẫn từ nghiên cứu của Frederick G Hayden, 2009) Amantadine được cho phép sử dụng ở Nhật

từ năm 1998, nhưng một nghiên cứu được thực hiện đã phát hiện tỉ lệ kháng amantadine là 3,4% trên tổng số 179 trẻ em trước khi bắt đầu điều trị thuốc kháng

vi rút vào mùa dịch năm 1999-2000 Ngoài ra, trong nghiên cứu của Frederick G Hayden, 2009 cũng trích dẫn bằng chứng về kháng thuốc của vi rút cúm A(H3N2)

đã tăng lên một cách đáng kể ở Trung Quốc, có lẽ liên quan đến việc sử dụng quá mức amantadine sau vụ dịch viêm đường hô hấp cấp do SARS Giai đoạn 2004-

2005, gần 70% chủng vi rút cúm phân lập ở Trung Quốc và Hồng Kông là cúm A(H3N2) và 15% trong số đó kháng với thuốc điều trị cúm amantadine

Một nghiên cứu ở Tunisia của Awatef và cs, 2013 cũng cho thấy, giai đoạn

từ 2009-2011, đã phát hiện trên vi rút cúm A(H1N1)pdm có một số đột biến tại các

vị trí của gen HA là L32F, K36R, N38D, R45K, V47I, S71Y/F, S74N, S84N, D86G/N, I96T, E103K, R113K, F114V, K160R, K171R, E172K, T270A, N276H, N294K/S, P297S, I300N, P304Q, K308E, A315S, và G317R Trong số này, đột biến H138Q, S203T, R205K, D222G, S162I, S183P, và S185T được tìm thấy ở vị trí gắn kết kháng nguyên của gen HA1 là Ca1, Ca2, Sa, và Sb Trong đó S203T ở Ca1 xuất hiện ở 46 trong số 50 (chiếm 92%) các chủng vi rút phân tích và R205K xuất hiện trên 10 trong số 50 chủng vi rút phân tích (20%) Một nghiên cứu khác của Hurt A.C và cộng sự (2012) đã phân tích các đột biến I117V và I117M trong neuraminidase vi rút cúm A(H1N1)pdm cho thấy I117V làm giảm nhẹ độ nhạy oseltamivir và tăng sức đề kháng khi kết hợp với đột biến H275Y Nghiên cứu này trái ngược với các báo cáo gần đây cho rằng đột biến I117M không làm thay đổi độ nhạy đối với oseltamivir

Một nghiên cứu khác của Anupam Mukherjee và cs về đặc điểm di truyền của

vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành năm 2015 ở miền Đông Ấn Độ cho thấy chưa phát