Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu sargassum duplicatum

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum dup

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ HẢI ÂU

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC DUNG MÔI CHIẾT LÊN HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN

TỪ DỊCH CHIẾT RONG NÂU SARGASSUM DUPLICATUM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ HẢI ÂU

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC DUNG MÔI CHIẾT LÊN HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN

TỪ DỊCH CHIẾT RONG NÂU SARGASSUM DUPLICATUM

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong

nâu Sargassum duplicatum” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng

được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Khánh Hòa, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hải Âu

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo và các Thầy Cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho học viên trong quá trình học tập nghiên cứu

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS NCVC Phạm Đức Thịnh – Phó Viện trưởng và TS NCVC Đặng Xuân Cường cùng các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và đã tận tâm tận lực hướng dẫn học viên thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, ủng hộ, động viên trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2017

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

I Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU 3

1.1.1 Giới thiệu Rong nâu Việt Nam 3

1.1.2 Đặc điểm rong nâu 4

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong nâu 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN 6

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan 6

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của fucoidan 7

1.2.3 Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan trong các loài rong nâu 11

1.2.4 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan 13

1.3 CÁC P HƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI 16

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Phương pháp phân tích 25

2.2.2.1 Phương pháp định lượng fucoidan 25

2.2.2.2 Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate 26

iv

2.2.2.3 Phương pháp phân tích thành phần đường đơn 26

2.2.2.4 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate 27

2.2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng axít uronic 27

2.2.2.6 Phương pháp phổ hồng ngoại IR 27

2.2.2.7 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 28

2.2.2.8 Phương pháp định lượng protein 29

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29

2.2.3 Phương pháp chiết tách fucoidan và phân đoạn fucoidan 31

2.2.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên hàm lượng của fucoidan thô cùng các phân đoạn tinh chế của fucoidan trong dịch chiết rong Sargassum duplicatum 30

2.2.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên thành phần hóa học của fucoidan thô và các phân đoạn của fucoidan 34

2.4 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 35

2.4.1 Hóa chất 35

2.4.2 Thiết bị chủ yếu đã sử dụng 35

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THU NHẬN FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM DUPLICATUM 36

3.2 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM DUPLICATUM 40

3.3.PHÂN ĐOẠN TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 46

3.4.XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA FUCOIDAN VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA FUCOIDAN TRONG SẢN PHẨM 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

1.KẾT LUẬN 57

2.KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

HIV : Human Immunodeficiency Virus

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

IR : Infracted spectroscopy

L.B.Nga : Liên Bang Nga

MWCO : Moleculare Weight Cut Off

vi

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

PTFE : Poly Tetra Fluorethylene

SmF3 : Phân đoạn thứ 3 của fucoidan từ rong Sargassum mcclurei

TCA : Axít triclorua acetic

VNĐ : Việt nam đồng

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần hóa học (%) của một số loài rong nâu 5 Bảng 1.2: Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan chiết từ một số loài rong khác nhau .6 Bảng 1.3: Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan chiết từ một số loài rong khác nhau 11 Bảng 1.4 Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan thô từ bốn loài rong nâu ở Việt Nam 12

Bảng 1.5: Các phân số fucoidan thô thu được từ rong Undaria Pinnatifida 12 Bảng 1.6: Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan thô từ rong S Swartzii 13

Bảng 2.1: Các đỉnh đặc trưng IR của fucoidan 28 Bảng 3.1: Hàm lượng và thành phần hóa học cơ bản của các loài rong nâu ở Việt Nam 36 Bảng 3.2 Hàm lượng và thành phần monosaccharide của các phân đoạn fucoidan từ

rong S duplicatum khi sử dụng dung môi chiết là nước 48

Bảng 3.3 Hàm lượng và thành phần monosaccharide của các phân đoạn fucoidan chiết

từ rong S duplicatum khi sử dụng dung môi chiết là dung dịch axít HCl pH 2 49

Bảng 3.4 Hàm lượng và thành phần monosaccharide của các phân đoạn fucoidan chiết

từ rong S duplicatum khi sử dụng dung môi chiết là dung dịch CaCl2 2% 51

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Phiến lá và phao rong nâu 4

Hình 1.2: Một số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm 1980-2010 7

Hình 1.3: Cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus mô tả vào năm 1950 8

Hình 1.4: Cấu trúc fucoidan từ Fucus distichus L 8

Hình 1.5 Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus 8

Hình 1.6 Cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum 9

Hình 1.7: Cấu trúc của fucoidan trong kết quả đo ESI-MS ion dương của một đoạn trong phân đoạn fucoidan F20 từ rong S wartzii 10

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

Hình 2.2 Qui trình chiết và tách phân đoạn fucoidan theo bản quyền WO 2005/014657 31

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng của fucoidan thô và các phân đoạn của fucoidan 33

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của ba dung môi chiết lên thành phần hóa học của fucoidan thô và các phân đoạn của fucoidan 34

Hình 3.1: Khối lượng fucoidan thô khi chiết bằng ba dung môi 37

Hình 3.2: Sự biến đổi hàm lượng fucoidan tinh khiết khi chiết bằng ba dung môi 38

Hình 3.3: Dịch chiết rong nâu S duplicatum chiết bằng ba dung môi 39

Hình 3.4: Fucoidan thô thu được khi chiết bằng ba dung môi 39

Hình 3.5: Thành phần monosaccharide của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi 41

Hình 3.6: Sự biến đổi hàm lượng tổng carbohydrate của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi 42

Hình 3.7: Sự biến đổi hàm lượng sulfate của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi 43

Hình 3.8: Sự biến đổi hàm lượng axít uronic của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi 43

ix

Hình 3.9: Sự biến đổi hàm lượng protein của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi 44

Hình 3.10: Phân đoạn của fuccoidan chiết từ rong S duplicatum sử dụng dung môi

chiết là nước 46

Hình 3.11: Phân đoạn của fuccoidan chiết từ rong S duplicatum sử dụng dung môi

chiết là dung dịch axít HCl pH 2 48

Hình 3.12: Phân đoạn của fuccoidan chiết từ rong S duplicatum sử dụng dung môi

chiết là dung dịch CaCl2 2% 49

Hình 3.13: Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum sử

dụng dung môi chiết là nước 52

Hình 3.14: Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum sử

dụng dung môi chiết là axít HCl pH 2 53

Hình 3.15: Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum sử

dụng dung môi chiết là muối CaCl2 2 % 53 Hình 3.16: Phổ 1H-NMR của fucoidan chiết từ rong nâu S duplicatum sử dụng dung

môi chiết là muối CaCl2 2 % 55

x

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa

học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum

Giới thiệu về đề tài

Fucoidan là tên gọi chung cho các polysaccharide sulfate có nguồn gốc từ rong nâu, fucoidan được nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin cách đây hơn 100 năm [27] Fucoidan chứa các thành phần chính là fucose và sulfate và một số loại đường đơn khác như galactose, glucose, xylose, mannose, rhamnose và đôi khi là cả các gốc axetyl Nhờ sự đa dạng về cấu trúc mà fucoidan sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú

vị như: kháng ung thư, kháng viêm, điều hòa miễn dịch, kháng đông tụ máu, kháng virút, với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung, mỹ phẩm và dược phẩm Vì vậy, fucoidan đã và đang được quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới Fucoidan từ rong nâu Việt Nam bắt đầu được nghiên cứu khoảng hơn 10 năm trở lại đây và số các công trình công bố

về fucoidan của rong nâu Việt Nam vẫn còn ít, đặc biệt là thông tin về thành phần hóa học và các nghiên cứu về quy trình chiết tách của fucoidan Trong khi đó thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan biến đổi phụ thuộc vào loài rong cũng như các phương pháp chiết tách, các dung môi chiết tách Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ chế biến để phát triển chúng thành các sản phẩm hữu ích đối với sức khỏe con người

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết

rong nâu Sargassum duplicatum” được thực hiện

Mục tiêu của đề tài

(1) Xác định được hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các

phân đoạn tinh chế của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum

(2) Đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các phân đoạn tinh chế từ dịch chiết rong nâu

xi

Phương pháp nghiên cứu

Rong nâu S duplicatum sử dụng nghiên cứu có đặc điểm sau: rong có màu nâu

đặc trưng, rong đã trưởng thành và không bị dập nát

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi chiết (nước, dd axít HCl pH

2, dd CaCl2 2 %) lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan trong dịch chiết

rong nâu Sargassum duplicatum Sản phẩm fucoidan thu được đem phân tích hàm

lượng fucoidan, hàm lượng tổng carbohydrate, hàm lượng sulfate, hàm lượng axít uronic, hàm lượng protein và thành phần đường Sau đó, tiến hành tách phân đoạn tinh chế fucoidan từ 3 mẫu fucoidan thô đã thu ở trên và đem phân tích hàm lượng và thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan, từ đó đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần của các phân đoạn thu được từ fucoidan thô

Dữ liệu thực nghiệm được phân tích trên phần mềm SPSS 16.0 với kiểm định LSD để kiểm tra sự khác biệt giữa các giá trị trung bình với mức ý nghĩa α = 0,05

Kết quả thu được

1 Hàm lượng fucoidan thu nhận từ rong nâu Sargassum duplicatum khi chiết với

3 dung môi: khi chiết dd CaCl2 2 % là cao nhất 2,77 %, khi chiết dd axít pH 2 là 2,28

%, khi chiết nước % là 2,15 %

2 Phân tích thành phần các gốc đường cho thấy fucoidan thu nhận từ rong nâu

Sargassum duplicatum khi chiết bằng 3 dung môi đều có thành phần đường fucose,

mannose, galactose, xylose và glucose Trong đó thành phần fucose và galactose có hàm lượng lớn hơn các thành phần đường còn lại

3 Phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR cho thấy fucoidan thu

nhận từ rong Sargassum duplicatum thuộc nhóm galactofucan sulfate hóa có nhóm

sunfate nằm ở vị trí C4 của vòng fucopyranosse

4 Fucoidan từ rong nâu Sargassum duplicatum chiết bằng ba dung môi đã được

tách phân đoạn và phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn thu được Chiết fucoidan bằng nước tách được 3 phân đoạn fucoidan, khi chiết bằng dd axít HCl pH 2 tách được 2 phân đoạn fucoidan, khi chiết bằng dd CaCl2 2 % tách ra được 2 phân đoạn fucoidan

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2016

1

MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Rong nâu Sargassum (Lớp Phaeophyceae) – nguồn tài nguyên sẵn có và dồi dào

trong đại dương với hơn 400 loài đã được mô tả Ở Việt Nam có trữ lượng rong nâu tự nhiên khá lớn vào khoảng 10.000 tấn khô/năm, với hơn 120 loài Rong nâu là loài rong biển có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, trong đó có một số hoạt chất sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm và các sản phẩm chức năng [47]

Fucoidan là tên gọi chung cho các polysaccharide sulfate có nguồn gốc từ rong nâu, fucoidan được nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin cách đây hơn 100 năm [29] Fucoidan từ rong nâu có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và khả năng phân nhánh của chúng với các vị trí sulfate được xếp đặt không theo qui luật Fucoidan chứa các thành phần chính là fucose và sulfate và một số loại đường đơn khác như galactose, glucose, xylose, mannose, rhamnose và đôi khi là cả các gốc axetyl Nhờ sự

đa dạng về cấu trúc mà fucoidan sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng ung thư, kháng viêm, điều hòa miễn dịch, kháng đông tụ máu, kháng virút, với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung, mỹ phẩm và dược phẩm Vì vậy, fucoidan đã và đang được quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới Fucoidan từ rong nâu Việt Nam bắt đầu được nghiên cứu khoảng hơn 10 năm trở lại đây và số các công trình công bố về fucoidan của rong nâu Việt Nam vẫn còn ít, đặc biệt là thông tin về thành phần hóa học và các nghiên cứu về quy trình chiết tách của fucoidan Trong khi đó thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan biến đổi phụ thuộc vào loài rong cũng như các phương pháp chiết tách, các dung môi chiết tách Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan

có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ chế biến để phát triển chúng thành các sản

phẩm hữu ích đối với sức khỏe con người Sargassum duplicatum là loài rong nâu

phân bố rộng và có thể khai thác trong các vùng ven biển miền Nam Việt Nam Đây là loài được cho là có tiềm năng về hoạt tính sinh học cao Tuy nhiên, thông tin về ảnh

2

hưởng các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan trên loài

rong Sargassum hiện nay rất hạn chế

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết

rong nâu Sargassum duplicatum” được thực hiện

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các

phân đoạn tinh chế của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum

Đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các phân đoạn tinh chế từ dịch chiết rong nâu

Sargassum duplicatum

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thu nhận fucoidan từ rong nâu S duplicatum theo các dung môi

chiết tách khác nhau (chiết bằng nước, chiết bằng dung dịch axít HCl pH=2, chiết

- Phân tích hàm lượng và thành phần hóa học của các sản phẩm fucoidan thu được

- Tách phân đoạn và phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan

- Đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan và các phân đoạn tinh chế của fucoidan.,

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Các kết quả của đề tài là cơ sở cho việc sản xuất fucoidan tự nhiên chất lượng tốt

từ rong nâu, đáp ứng nhu cầu nâng cao sức khỏe cộng đồng cũng như giá trị kinh tế của nguồn tài nguyên rong nâu ở Nha Trang

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Luận văn là cơ sở để thu nhận fucoidan từ rong nâu tại Khánh Hòa là cơ sở cho việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa fucoidan, hỗ trợ chữa bệnh cho con người

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU

1.1.1 Giới thiệu rong nâu Việt Nam

Năm 1837 cuộc thám hiểm bờ biển Việt Nam được thực hiện trên tàu “La

Bonite”, Gaudichaud đã thu được một loài Turbinaria và 4 loài Sargassum, sau đó

Busseuil thu thêm 4 loài nữa Mãi đến năm 1954 Dawson đến làm việc tại Viện Hải Dương Học Nha Trang có mô tả thêm 2 loài Toàn bộ các mẫu vật đó hiện nay đều không còn lưu giữ tại Việt Nam Giáo sư Phạm Hoàng Hộ năm 1961 trong luận án đã

mô tả 15 loài, đến năm 1967 mô tả được 41 loài ở Miền bắc, Nguyễn Hữu Dinh trong luận án năm 1972 mô tả được 22 loài, nếu so với rong Miền nam đã bổ sung được 9 loài cho hệ rong mơ Việt Nam Năm 1992 Nguyễn Hữu Đại trong luận án đã mô tả 52 loài và trong “Rong mơ Việt Nam nguồn lợi và sử dụng” 1997 đã mô tả 68 loài [8] Hầu hết các loài rong nâu sinh trưởng và phát triển ở dạng sống bám với hình thức sinh sản chủ yếu là hữu tính, thích hợp với điều kiện sinh thái môi trường có độ mặn cao, nước trong và có sóng Vì vậy rong nâu phân bố phổ biến ở các bãi triều đáy cứng (đá tảng, đá, san hô chết, các rạn ngầm ) ven biển và các đảo Do đặc điểm của địa hình có nhiều núi ở ven biển hoặc lấn ra sát biển, tạo thành nhiều mũi và bãi triều đáy đá cứng và có nhiều rạn san hô chết kéo dài, độ muối ổn định và cao quanh năm, các dòng sông ngắn và có nhiều đảo, nên vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình Châu, đảo

Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Văn Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước) có nhiều rong nâu Còn vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu, ven biển có nhiều bãi triều đáy cát, chỉ có một ít mũi bãi triều đáy đá ở mũi Né, Long Hương (Bình Thuận), Long Hải, Vũng Tàu (Bà Rịa - Vũng Tàu) nên rong nâu không nhiều Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang chỉ từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia, xuất hiện nhiều bãi triều đáy đá và các đảo, độ muối cao và

ổn định mới có rong nâu phát triển Nhìn một cách tổng quan vùng ven biển và đảo từ

4

Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) là hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt Nam rong nâu phân bố tập trung

1.1.2 Đặc điểm rong nâu

Rong nâu là loài rong to mọc thành bụi, có nhánh mang nhiều phiến dạng của lá, phiến có răng mịn giống như lá mơ do đó có tên là rong lá mơ hay gọi tắt là rong mơ Các loài rong nâu đều có phao, phao nhiều hay ít to nhỏ khác nhau, hình dạng của phao là hình cầu trái xoan, đường kính của phao nhỏ khoảng 0,5:0,8 mm, phao lớn khoảng 5:10 mm, phao có thể mang cánh hoặc không Nhờ có hệ thống phao rong luôn giữ được vị trí thẳng đứng môi trường biển [4]

Hình 1.1: Phiến lá và phao rong nâu Sargassum duplicatum

Rong nâu mọc trên tất cả các loài vật bám cứng, trên các thành vách đá dốc đứng, các bãi đá tảng, các vùng có đá ngầm hay san hô ngầm, nhưng thích nghi nhất là trên vật bám đá san hô Trên vùng san hô chết, chúng mọc thành quần thể dày, phân bố thành quần thể dày, phân bố tương đối đều, mật độ khi rong trưởng thành có thể đạt 10

cá thể/dm2, cho nên vào mùa phát triển của chúng rất ít các loài rong biển khác có thể mọc chen được vào trong quần thể rong này [4] Mùa vụ rong nâu có sự sai khác chút

ít tùy thuộc từng loài, nơi phân bố, tùy các điều kiện môi trường sống, nhưng nhìn chung quy luật về mùa vụ khá rõ rệt Chúng tăng trưởng rất mạnh từ tháng 2 đến tháng

3, đa số các loài có kích thước tối đa vào tháng 3, 4 và hình thành các cơ quan sinh sản, sau đó sẽ bị sóng nhổ tấp vào bờ và tàn lụi Đến tháng 7 các bãi rong đều trơ trụi

Một số loài như S mcclurei, S kjellmanianum, S polycystum phát triển và tàn lụi sớm (tháng 4) Trong khi đó các loài ở vùng dưới triều như S binderi, S microcystum,

mọc chậm hơn, đến tháng 6, 7 đôi nơi vẫn còn quần thể rong này Một vài loài rong

5

thích nghi trong các vùng vịnh yên sóng có thể tồn tại và phát triển tốt vào tháng 7 như

S polycystum và S longicaulis [4]

Trong luận văn này, loài rong Sargassum duplicatum là loài mới và cũng có sản

lượng ở Khánh Hòa, hiện ở Việt Nam chưa có công bố cụ thể nào về ảnh hưởng của các dung môi chiết đến fucoidan của một loài rong nâu cụ thể Do vậy chọn loài rong

S duplicatum làm nguyên liệu để đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên hàm

lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ rong nâu Từ đó lựa chọn loại dung môi tối ưu với mục đích sử dụng khác nhau của fucoidan

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong nâu

Rong nâu có chứa đa dạng các thành phần hóa học, chúng đều là các thành phần

có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginate và fucoidan (Bảng 1.1) Trong số các hợp chất polysaccharide của rong nâu thì fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do chúng sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ máu, kháng virút, kháng viêm, chống oxi hóa, ) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu [31,65]

Bảng 1.1: Thành phần hóa học (%) của một số loài rong nâu [5]

Loài Ascophyllum nodossum Laminaria digitata Alaria esculenta

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan

Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [29], khi đó nó có tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính tạo nên polysaccharide này Các polysaccharide rong nâu thực tế có thành phần phức tạp hơn nhiều Ngoài fucose và sulfate, chúng còn có thể chứa nhiều các monosaccharide khác như: galactose, xylose, manose, axít glucuronic, đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virút, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogentic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v [31] Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng, dược liệu Cùng với số đó các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng 10 năm trở lại đây (Hình 1.2) [38]

7

Hình 1.2: Một số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm

1980-2010 [38]

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của fucoidan

Fucoidan là một polysaccharide sulfate được tách chiết từ rong nâu, có cấu tạo gồm mạch chính có mặt α-L-Fucose sulfate, ngoài ra có thể có D-galactose, D- mannose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose, axít D-uronic và có thể có phân bố ngẫu nhiên của các gốc acetyl [54] Cấu trúc của fucoidan có trong rong nâu là vô cùng phức tạp và không đồng nhất với những thay đổi về mô hình liên kết, sự phân nhánh,

vị trí nhóm sulfate cũng như các gốc đường [11] Vì vậy, việc phân tích cấu trúc của fucoidan vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật phổ NMR phân giải cao mới nhất Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan Dưới đây là một số ví dụ về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ rong biển:

Percival và Ross (1950) đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus vesiculosus là

một polysaccharide có bộ khung mạch chính là α-L-fucose(1→2), vị trí mạch nhánh là gốc đường α-L-fucose(1→3) và nhóm sulfate chủ yếu gắn ở vị trí C4 của gốc đường L-fucospynanose (Hình 1.3) [54]

8

Hình 1.3: Cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus mô tả vào năm 1950 [54]

Năm 2004 và 2006, Bilan và cộng sự đã công bố hai cấu trúc fucoidan từ rong

Fucus distichus L và Fucus seratus được tạo thành bởi các gốc (1→3)-α-L-Fucp liên

kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C-2 và C-2,4 (Hình 1.4 và Hình 1.5) [40, 41]

Hình 1.4: Cấu trúc fucoidan từ Fucus distichus L [40]

Hình 1.5 Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus [59]

Năm 2011, Chevolt và cộng sự đã phân lập được fucoidan từ rong nâu

Ascophyllum nodosum [35], cấu trúc fucoidan oligosacharide (bậc polyme hóa từ 8-14)

của loài rong này được cấu thành bởi các liên kết luân phiên α(1→3) và α(1→4) Hình 1.7 [18]

9

Hình 1.6 Cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum [18]

Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về cấu trúc của fucoidan từ rong đã được công bố trên các tạp chí, các tác giả thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Nha Trang cũng đã và đang thực hiện một số đề tài khoa học liên quan đến cấu trúc và hoạt tính của fucoidan Năm 2007, Bùi Minh Lý và cộng sự đã có 2 công bố về đặc điểm cấu trúc của 5 loài rong nâu phổ biến ở miền trung, hàm lượng D-galactose

chiếm tỉ lệ gần bằng của L-fucose trong 4 loài rong S polycystum, S swartzii, S

oligocystum và S denticarpum Ngoài ra còn có các đường D-xylose, D-glucose chiếm

tỉ lệ nhỏ 2-9 %, đường D-rhamnose và D-manose với khoảng 9-17 % Năm 2008, cấu

trúc phân đoạn fucoidan từ loài rong S swartzii đã được xác định (Hình 1.7) [5]

10

Hình 1.7 Cấu trúc của fucoidan trong kết quả đo ESI-MS ion dương của

một đoạn trong phân đoạn fucoidan F20 từ rong S swartzii

a): cấu trúc một đoạn trong phân đoạn fucoidan F20

b): sơ đồ cắt mảnh của một đoạn trong phân đoạn fucoidan F20

Năm 2013, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố cấu trúc từ rong

Turbinaria có hàm lượng sulfate cao và thành phần đường rất đơn giản chỉ gồm fucose

và galactose Cấu trúc bộ khung của fucoidan là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate

chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 [62]

Năm 2015, Bùi Minh Lý và cộng đã công bố cấu trúc của phân đoạn fucoidan

SmF3 từ rong S mcclurei Mạch chính của fucoidan SmF3 gồm:

→3)-Fucp(4,2SO3-)-(1→3)- Fucp(4,2SO3-)-(1→

Mạch nhánh tồn tại các đoạn mạch sau:

Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc

và Gal(2SO3-)-(1→3)-Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc-(1→3)-Fuc

Như vậy, các công bố về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ các loài rong vùng ôn đới, thành phần hóa học của các loại fucoidan này nhìn chung chỉ một gốc đường fucose và sulfate Trong khi đó, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thành phần hóa học của fucoidan phức tạp hơn nhiều khi trong phân tử của chúng thường tồn tại đồng thời nhiều gốc đường khác nhau

11

1.2.3 Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan trong các loài rong nâu

Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong Năm 1997, Park và cs đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20 % trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [52] Trước đó, công bố của Stewart và cs (1961) cho rằng hàm lượng fucoidan của rong nâu không thay đổi nhiều khi thu rong ở các mùa vụ khác nhau [60] Năm 1994, Koo đã công bố hàm lượng fucoidan được

phân lập từ các loài rong Laminaria religiosa, Undaria pinnatifida, Hizikia fusiforme

và Sargassum fulvellum lần lượt là 2,7 %; 6,7 %; 2,5 % và 1,6 % [28]

Trên thế giới một số loài rong nâu khác cũng đã được nghiên cứu và công bố hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan chiết từ một số loài

rong khác nhau

lượng *

A xít uronic **

Fucose ♥ Sulfate ♣ Protein ♦

*: hàm lượng tính theo khối lượng rong khô đã loại chất béo

**: axít uronic được đo bằng phương pháp axit carbazole-sulfuric (Bitter & Muir, 1962)

♥ hàm lượng Fucose được đo bằng phương pháp cysteine-sulfuric (Dische & Shettles, 1948)

♣ hàm lượng sulfate được đo bằng phương pháp Bari Clorid (Dodgson & Price, 1962)

♦ protein được đo theo phương pháp Bradford (Bradford, 1976)

12

a: (Mabeau et al., 1990); b: (Wang et al., 2007); c: (Usov et al., 2005); d: (Ly et al., 2005); e: (Li et al., 2006); f: (Ponce et al., 2003); g: (Lee et al., 2006); h: (Yang, Chung, & You, 2008), j: (Eluvakkal et al., 2010)

Ở Việt Nam thành phần hóa học của fucoidan có trong các loài rong nâu trong đó

có loài rong nâu S duplicatum đã được chúng tôi công bố năm 2016 (Phụ lục III) thể

**: Hàm lượng tính theo khối lượng của fucoidan

Fucoidan thô được tách phân đoạn bằng sử dụng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE-cellulose, một kỹ thuật phân tách các phân tử dựa trên tổng lượng điện tích của phân tử Do các fucoidan có nhóm sunfate mang điện tích âm, chúng có thể liên kết với các cột trao đổi anion, chứa các nhóm chức tích điện dương như diethylaminoethyl

(DEAE) Bảng 1.5 cho thấy phân đoạn của fucoidan thô từ Undaria pinnatifida sử

dụng DEAE Sephadex A-25 [59] Bảng 1.6 cho thấy thành phần hoá học của các phân

đoạn fucoidan thu được sau khi cho fucoidan thô từ rong S swartzii chạy qua cột

DEAE Sephadex A-25 [35]

Bảng 1.5: Các phân số fucoidan thô thu được từ Undaria pinnatifida [59]

1.2.4 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan

Nghiên cứu về fucoidan cho đến nay đã được thực hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Pháp, Úc, Trung Quốc và Hoa Kỳ Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng fucoidan không độc, không gây dị ứng, và không có tác động tiêu cực lên cơ thể con người khi sử dụng [58] Trên thực tế các sản phẩm fucoidan từ rong nâu như thực phẩm chức năng và các chất bổ sung thực phẩm có chứa fucoidan đã bán trên thị trường không có tác hại nào [19] Không có sự thay đổi về độc tính khi dùng fucoidan trên chuột với liều lên đến

1000 mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày kéo dài trong 28 ngày, nhưng khi liều fucoidan tăng lên 2000 mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày có sự tổn thương gan Như vậy, việc tiêu thụ fucoidan lên tới 1000 mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày là an toàn

ở loài gặm nhấm

Fucoidan được biết là có nhiều hoạt tính sinh học Trong số đó là: chống đông máu, chống oxy hóa, chống virút, chống huyết khối và chống ung thư [31] Các hoạt tính sinh học này liên quan đến thành phần hoá học của fucoidan [61] Các polysaccharide có trong rong thường không đồng nhất và phân nhánh; nó có thể chứa các thành phần monosaccharide với các nhóm acetyl và lượng sulfate là không đều [11] Sự đa dạng về cấu trúc của fucoidan có thể khác nhau giữa các loài với các loài,

14

tùy thuộc vào phương pháp chiết xuất Vì lý do đó, mỗi loại fucoidan có đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau có thể là một loại thuốc mới [24]

a Hoạt tính chống đông máu

Một số nghiên cứu khoa học khẳng định khả năng của fucoidan ngăn chặn sự tạo thành cục máu đông Nishino và cộng sự, đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu

của fucoidan được phân lập từ các loài rong Hizikia fusiforme, Laminaria angustata

var.longissima kết quả cho thấy chúng có hoạt tính kháng đông tụ máu cao hơn so với

heparin [48] Hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng đông tụ máu càng lớn [31] Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất quan trọng đối với hoạt tính kháng đông tụ của fucoidan Theo các nghiên cứu [18,22] fucoidan sulfate hóa ở vị trí C2 hoặc C3 thể hiện hoạt tính kháng đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này

Trọng lượng phân tử cũng có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng đông tụ máu

Fucoidan tự nhiên từ Lesonia vadosa (Phaeophyta) có khối lượng phân tử (320.000

Da) cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử (32.000 MW) [18]

Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đường (fucose, galactose, v.v) của fucoidan có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông máu Thành phần axít uronic không ảnh hưởng trực tiếp lên hoạt tính chống đông máu, nhưng nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống đông máu của fucoidan thông qua việc làm cho chuỗi đường trở nên linh động hơn [31]

c Hoạt tính kháng u

Năm 1990 Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã sàng lọc trên 46 loài rong

ở dạng bột khô (tron đó có 4 loài rong lục, 21 loài rong nâu, 21 loài rong đỏ), hoạt tính

chống ung thư biểu mô dạng Ehrlich có tín hiệu ở rong nâu Scytosiphon lomentaria (ngăn chặn 69,8 %), Lessonia nigrescens (60,0 %), Laminaria japonica (57,6 %),

Sargassum ringgoldianum (46,5 %), rong đỏ Porphyra yezoensis (53,2 %), Eucheuma gelatinae (52,1 %) và rong lục Enteromorpha prolifera (51,7 %) Năm loài rong nâu

và bốn loài rong đỏ cho tín hiệu chống ung thư dạng Meth-A fibrosarcoma Ba năm

15

sau cũng nhóm tác giả này tiến hành chiết các hợp chất trong rong nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến axít, đem thử hoạt tính kháng ung thư và họ nhận ra rằng hai phân đoạn 13500 Da và 19000 Da có hoạt tính kháng ung thư Chúng đã tương tác trực tiếp với tế bào ung thư và tiêu diệt chúng, hai phân đoạn này không tan trong nước và phải chiết ra bằng axít nóng Bằng các phương pháp phân tích hóa học cũng như các phương pháp phổ cơ bản họ đã chứng minh được các hợp chất này chính là fucoidan [68]

Năm 1995 qua tạp chí Nghiên cứu chống ung thư (Anticancer Research) các nhà khoa học đã công bố rằng fucoidan ức chế việc lan truyền ung thư phổi Dùng chuột thí nghiệm họ đã phát hiện ra rằng, tiêm fucoidan ngăn chặn ung thư biểu bì phổi lan truyền Họ đã kết luận rằng những phát hiện của họ làm xuất hiện khả năng rõ ràng rằng fucoidan có thể có giá trị lâm sàng thực sự trong việc ngăn chặn ung thư trong cơ thể Các nhà khoa học đã khám phá ra tác dụng chống ung thư tương tự và ám chỉ cho fucoidan tác dụng chống sinh sổi nảy nở trong các tế bào ung thư trong một ấn phẩm xuất bản năm 1993

d Hoạt tính chống oxy hóa

Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm in vitro Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên tuyệt vời và

có khả năng lớn để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do Fucoidan từ

Laminaria japonica có thể ngăn chặn sự tăng peroxide lipid (LPO) trong huyết thanh,

gan và lá lách của chuột bị tiểu đường một cách rõ ràng Tuy nhiên, không phát hiện thấy hiệu quả ức chế trên cả peroxy lipid của homogenates và cả hiệu quả ức chế gây

ra bởi Cys/FeSO4 trong thử nghiệm in vitro

Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan [11] Cả khối lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan đều đóng vai trò quan trọng trong việc tác động lên các gốc azo 2-2’-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) gây ra quá trình oxy hóa LDL [33]

h Các ứng dụng của fucoidan

Những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số lượng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một loại polysaccharide

16

sulfate hóa giàu fucose từ rong nâu Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ dày,… Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, … U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional & Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra sự giáng hóa các tế bào ung thư,…

Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi Import & Export Co., Ltd., Trung Quốc

được sử dụng để phục hồi khả năng kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virút, điều trị ung thư và tim mạch,… [5] Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor’best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch, [20]

Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK

và Fucogastro Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Công ty Sannest Khánh Hòa

Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI

Dưới đây là một số phương pháp điều chế fucoidan từ rong nâu đã được biết:

 Năm 1950 Percival và Ross [51] đã điều chế fucoidan từ Fucus vesiculosus,

Fucus spiralis, bằng cách:

- Chiết với nước sôi trong 24 giờ

- Loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate

- Kết tủa fucoidan như một phức hydroxit bằng cách thêm Ba(OH)2

 Năm 1952 Black đã áp dụng 2 phương pháp chiết fucoidan trong nước nóng và

trong dung dịch axít loãng và khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết và

tỷ lệ dung dịch chiết với rong lên hiệu suất thu hồi fucoidan [14]:

Điều kiện chiết fucoidan tối ưu bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl (1:10) ở pH = 2,0 - 2,5 tại nhiệt độ 70oC trong 1giờ Theo tác giả, bằng cách xử lý này chỉ 1 lần chiết có thể thu được 50% fucoidan, còn nếu chiết 3 lần thu được hơn 80

% fucoidan

Fucoidan được thu nhận bằng cách chiết trong nước nóng theo tỷ lệ 1 phần rong khô với 10 phần nước tại 100oC trong 3 - 7,5 giờ Bằng cách tăng tỉ lệ H2O : rong, thời gian chiết hoặc số lần chiết có thể tăng được hiệu suất chiết Theo tác giả chiết nước là không thích hợp do khó tách cặn rong khỏi dung dịch nước Fucoidan thô được tách khỏi dịch chiết axít bằng cách trung hòa và cho bay hơi đến khô, hòa tan lại trong nước, và kết tủa phân đoạn với cồn ở nồng độ 30 % và 60 % (v/v) Phân đoạn 60 % là fucoidan thô có chứa 30-36 % fucose Có thể điều chế fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40 % từ sản phẩm thô bằng cách xử lý với formaldehyde và tách hợp chất không tan tạo thành

Fucoidan còn có thể thu nhận bằng cách chiết trong nước nóng theo tỷ lệ 1 phần rong khô : 10 phần nước tại 100oC trong 3-7,5 giờ Bằng cách tăng tỉ lệ nước/rong, thời gian chiết và số lần chiết có thể đạt hiệu suất thu hồi fucoidan 55-60 %

 Những nỗ lực đầu tiên nhằm đưa ra một phương pháp mang tính tổng quát để

chiết fucoidan đã được thực hiện bởi Mian và Percival (1973):

- Tiến hành chiết tuần tự, bắt đầu bằng xử lý với formaldehyde

- Tiếp theo chiết với cồn ở nồng độ 80% để loại bỏ mannitol, muối và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp

- Sau đó rong được khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2 % (ở nhiệt độ phòng và

18

70oC) để chiết laminaran và fucoidan (khi đó alginate tồn tại dưới dạng muối Ca không tan)

- Fucoidan được chiết tiếp với dung dịch HCl (pH=2)

- Cuối dùng bã được chiết với Na2CO3 để thu lại alginate hòa tan Hai dung môi

bổ sung cuối cùng nhằm chiết tận thu các phân đoạn fucoidan

Quy trình chiết tuần tự phức tạp này hầu như không được sử dụng về sau, nhưng

đã trở thành cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

 Zvyagintseva và Duarte (1999, 2001) [68, 22] đã sử dụng các phương pháp

chiết thô fucoidan tương đối đơn giản nhưng sau đó sử dụng các bước làm sạch tương đối phức tạp và tốn nhiều công sức hơn Trước tiên, bột rong được cho chiết với cồn ở nhiệt độ phòng (24 giờ), sau đó bã rong chiết tiếp với aceton và clorofom ở nhiệt độ phòng (24 giờ), chiết tiếp bã rong bằng dung dịch axít 0,1N HCl cùng với một lượng nhỏ formandehyde khuấy ở nhiệt độ phòng (4 giờ), tiếp tục chiết bằng nước nóng (60oC) Sau đó fucoidan được tách khỏi laminaran bằng cách cho đi qua cột PTFE (poly tetra fluorethylene) Đến năm 2005 tác giả Zvyagintseva đã đưa ra phương pháp mới chỉ sử dụng cồn cho công đoạn trước khi chiết fucoidan

Trong rong nâu thường có nhiều kim loại nặng trong đó có nhiều nguyên tố độc hại đối với người Chii-FaLin và cs (1978), đã làm sạch polysaccharide rong nâu bằng cách ngâm chiết rong với dung dịch 3M KCl trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trước khi tách chiết polysaccharide, nhờ vậy đã loại được 80 % Asenic Tuy nhiên phương pháp này không tránh khỏi sự mất mát fucoidan

 Kimura và cs (1995) [27] đã thu nhận fucoidan từ các loài rong nâu nhằm sử

dụng sửa chữa ung thư dạ dày bằng cách chiết bột rong trong dung dịch axít acetic loãng nồng độ 0,01 mol (pH = 4) với nhiệt độ phòng rồi nâng dần lên 100oC Sau khi loại bã rong bằng ly tâm, phần dung dịch được trung hòa bằng NaOH và sau đó loại bỏ axít alginic bằng cách kết tủa nó với dung dịch CaCl2 Dung dịch chứa fucoidan cho lọc qua màng siêu lọc để cô đặc và loại các phân tử trọng lượng thấp cỡ 5000 Da, sau

đó cho thẩm tách để loại phân tử lượng nhỏ hơn 8000 Da Cuối cùng dung dịch fucoidan được làm sạch bằng sắc ký gel nhằm đạt tiêu chuẩn chất lượng chữa bệnh

là kết tủa fucoidan bằng cồn và sấy để thu nhận sản phẩm bột fucoidan

Năm 2007 trên European Patent Oficce có công bố đăng ký patent RU2302429: rong được cắt nhỏ cỡ mm, chiết trong axít thực phẩm 1 %, dịch chiết được cô đặc bằng màng siêu lọc 100 kDa, sau đó sấy phun thu sản phẩm Patent này hoàn toàn tương tự qui trình của các tác giả Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, đã thực hiện xong vào năm 2006 được nghiệm thu suất sắc với đề tài: “Nghiên cứu công nghệ

và thiết bị sản xuất fucoidan qui mô pilot từ một số loài rong nâu Việt Nam”

Các bài viết và đăng ký phát minh sáng chế khác về sau này cũng chiết fucoidan bằng phương pháp tương tự Cho đến nay, các phương pháp như trên cho ra fucoidan sạch và được coi là phương pháp tách chiết hiện đại, tuy nhiên giá thành khá lớn và thiết bị siêu lọc công suất lớn đầu tư quá đắt Đồng thời hiệu suất chiết rất thấp (do chiết một lần chỉ thu được 50% fucoidan, nhưng nếu chiết tiếp lần nữa thì chi phí hóa chất, nước và chi phí tách loại nước về sau cao hơn giá mua rong nguyên liệu nên buộc phải bỏ bã rong vẫn còn chứa fucoidan) và có nhiều khả năng bị nhiễm bẩn vi sinh vì thời gian ngâm chiết quá dài

Năm 2010 Wilson, Sonsini, Goodrich & Rosati (Mỹ) đã có một đăng ký mới ở

cục quản lý phát minh sáng chế Mỹ về phương pháp mới chiết fucoidan (US patent 20100056473), họ sử dụng sóng siêu âm có gia nhiệt để đưa fucoidan vào dịch chiết nước pH = 7, không có axít alginic tan theo dịch chiết Trong thực tế dù không có siêu

âm, đun nóng rong trong nước 60oC kéo dài 4 giờ vẫn thu được dịch chiết tương tự, tất nhiên hiệu suất thấp hơn nhưng không tránh được đầu tư thiết bị siêu âm có gia nhiệt cho sản xuất lớn [66]

 Nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu các hoạt tính sinh học của các phân

20

đoạn fucoidan, Ponce và cộng sự đã thiết lập quy trình xử lý như sau:

- Xử lý rong nâu với cồn 80%

- Bã sau đó được chiết với ba dung môi khác nhau thường được sử dụng để thu nhận fucoidan là nước cất, dung dịch CaCl2 2% và dung dịch axít HCl (pH=2)

- Trong trường hợp chiết ở nhiệt độ phòng và sau đó ở 70oC hiệu suất chiết và đặc tính của sản phẩm hầu như là tương tự nhau đối với cả 3 dung môi Các dung dịch chiết ở nhiệt độ phòng cho ra sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester

sulfate được gọi là “galactofucan”, thể hiện tính năng ức chế chống lại herpes simplex

virút 1 và 2, nhưng không gây độc tế bào

- Thành phần chính của dịch chiết thu được ở 70oC bao gồm chủ yếu là fucose đi kèm với các monosaccharide khác (phần lớn là mannose, nhưng đồng thời cả glucose, xylose, rhamnose, galactose), với một lượng đáng kể axít uronic và một lượng nhỏ sulfate este, được gọi chung là “uronofucoidan” Thành phần uronofucoidan này không thể hiện hoạt tính kháng virút, nhưng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

Trong những thập kỷ gần đây đã có nhiều công trình công bố về quy trình chiết fucoidan dưới dạng các patent và tùy theo sản phẩm fucoidan sử dụng với mục đích gì

mà quy trình công nghệ có những thay đổi phù hợp với yêu cầu sản phẩm

Như vậy có thể thấy phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần, cấu trúc cũng như hoạt tính của fucoidan

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

* Tình hình nghiên cứu về fucoidan trên thế giới

Qua các tài liệu đã công bố nghiên cứu về fucoidan trên thế giới nhận thấy fucoidan từ rong nâu có thành phần hóa học tương đối phức tạp ngoài fucose và sulfate, còn có các gốc đường khác như galactose, xylose, manose, rhamnose, glucose, và cả gốc acetyl Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan thay đổi phụ thuộc vào địa điểm, thời gian thu rong và kỹ thuật chiết tách

Fucoidan là một sulfate polysaccharide dị thể với thành phần cấu tạo hết sức phức tạp Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định là

21

một polysaccharide có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và axít uronic được xem là các tạp chất [68] Tuy nhiên, trong công bố của Percival và Ross

(1950) cho thấy fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus

vesiculosus, Fucus spiralis và Himanthalia lorea có chưa 38 % ester sulfate, 56,7 %

fucose 4 % galactose, 1,5 % xylose, 3 % axít uronic và 8 % khoáng [54] Dilon và

cộng sự (1953) đã phân lập được fucoidan từ loài rong Ascophyllum nodosum có tỉ lệ fucose:galactose = 8:1 [60] Thành phần của fucoidan từ rong Fucus vesiculocus là

44,1 % fucose, 26,3 % sulfate, 31,1 % tro và một lượng nhỏ amino-glucose Như vậy, thành phần của fucoidan phụ thuộc vào các loài rong

Ngoài ra, phương pháp chiết có thể ảnh hưởng tới thành phần của fucoidan [57]

Theo công bố tác giả Percival (1968) đã phân lập fucoidan từ rong Ascophyllum

nodosum bằng cách chiết với nước nóng và dung dịch kiềm loãng nóng, kết quả tìm

được fucoidan có thành phần gồm fucose, xylose, sulfate và axít uronic, trong khi đó

cũng với loài rong Ascophyllum nodosum tác giả Marais và Joseleau (2001) đã tiến

hành chiết bằng dung dịch 0,01 % NaCl và 1 % CaCl2 thu được fucoidan có thành phần là fucose, glucose, galactose và sulfate [44]

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về thành phần và cấu trúc của fuoidan của nhiều loài rong biển Những công bố về cấu trúc của fucoidan rõ ràng nhất là fucoidan

được phân lập từ loài rong nâu sinh trưởng ở vùng ôn đới như Fucus evnescens C.Ag,

Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Ascophyllum nodosum, trong thành phần đường

hầu như chỉ có 01 gốc đường là fucose và một lượng rất nhỏ các gốc đường pyranose khác

Fucoidan đa dạng về cấu trúc và có hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực công nghiệp dược liệu Nên mặc dù đã được bắt đầu nghiên cứu từ hơn 100 năm trước nhưng hiện nay fucoidan vẫn thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm những loại thuốc mới

* Tình hình nghiên cứu về fucoidan ở Việt Nam

Ở trong nước, fucoidan lần đầu tiên được biết đến và nghiên cứu bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Cho đến nay đã cố một số đề tài nghiên cứu về

22

fucoidan từ rong nâu Việt Nam, theo đó các công trình công bố về fucoidan trên các tạp chí uy tín ở trong nước cũng như quốc tế ngày một tăng lên trong những năm gần đây Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan (polysaccharide fucan sulfate phóa) từ rong Nâu Việt Nam Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học tự nhiên vốn có của chúng [2]

Nước ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú, riêng chi

Sargassum đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng ước tính tới 10.000 tấn

khô/năm [35], hàm lượng fucoidan trong các loài rong chi Sargassum từ 1-2,5 % trọng

lượng rong khô, đây có thể là nguồn dược liệu tiềm năng rất lớn của biển Việt Nam Cho đến nay các nghiên cứu công bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra đặc điểm về cấu trúc như thành phần đường, vị trí nhóm sulfate và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thô [4,8]

Năm 2005, tác giả Bùi Minh Lý và công sự đã công bố fucoidan từ rong

Sargassum ở Việt Nam có hoạt tính kháng tế bào ung thư

Năm 2007, Bùi Minh Lý và cs cũng có 2 công bố về đặc điểm cấu trúc của 5 loài rong nâu phổ biến ở miền trung, hàm lượng D-galactose chiếm tỉ lệ gần bằng của L-

fucose trong bốn loài rong S polycystum, S swartzii, S oligocystum và S

denticarpum, trừ mẫu fucoidan từ rong S mcclurei Các đường D-xylose và D-glucose

chiếm tỉ lệ nhỏ hơn (2-9 %) so với đường D-rhamnose và D-manose với khoảng 9-17

% Hàm lượng đường D-xylose lớn nhất ở loài S denticarpum (9,24 %), nhỏ nhất ở loài S mcclurei (2,53 %) Đường rhamnose lớn nhất ở S mcclurei (25,25 %), nhỏ nhất

ở loài S polycystum (9,71%) Đường D-manose nhiều nhất ở loài S oligocystum (17,76 %), và ít nhất ở loài S polycystum (9,71 %) Hàm lượng đường D-glucose dao động không nhiều, lớn nhất ở S denticarpum (9,83 %), nhỏ nhất ở S mcclurei (4,04

%) Hàm lượng sulfate dao động trong khoảng 20-33 % (w/w) so với tổng lượng mẫu

phân tích, lớn nhất ở S mcclurei (33 %), nhỏ nhất ở S swartzii (20,4 %) Hàm lượng

axít uronic dao động trong khoảng 14-23 % [5]

23

Năm 2008, tác giả Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự đã công bố thành phần và cấu

trúc của phân đoạn fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành

phần chủ yếu là fucose (>45 %), bên cạnh đó các đường đơn khác như rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81-22,07 %) [4]

Năm 2013, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố fucoidan từ rong Turbina

ornata có hàm lượng sulfate cao và thành phần đường rất đơn giản chỉ gồm fucose và

galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa Cấu trúc bộ khung

của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị

trí C4 Nhóm sulfate cũng được phát hiện thấy chiếm ưu thế ở vị trí C2 và một phần ở

vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh được tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [62]

Các công bố về hoạt tính sinh học cũng mới chỉ được thử nghiệm với hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu polysaccharide chiết thô từ rong nâu Mặc dù hoạt tính sinh học của fucoidan dạng galactofucan sulfate hóa được dự đoán là rất đa dạng như hoạt tính kháng virút, chống nghẽn mạch, bảo vệ dạ dày, kháng ung thư,… Nước ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa

dạng và phong phú, riêng họ Sargassum đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng

lên tới 10.000 tấn khô/năm, đây có thể coi là nguồn dược liệu tiềm năng rất lớn Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan Việt Nam còn rất hạn chế

Kết luận: hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan có sự khác nhau tùy thuộc vào thời gian thu rong, vị trí địa lý, kỹ thuật chiết tách rong Xác định hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan làm nền tảng cho việc phân tích và xác định cấu trúc của fucoidan một cách rõ hơn Hiện nay mặc dù có rất nhiều công bố về cấu trúc của fucoidan nhưng chỉ một số công bố đưa ra được cấu trúc một cách rõ ràng mà phần lớn chỉ đưa ra cấu trúc của một phân đoạn lặp lại cao của chúng Việt Nam có nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú, tuy nhiên các

nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu vẫn còn hạn chế Do vậy, tôi chọn đề tài “Khảo

sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của

24

fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum” nhằm hoàn chỉnh thêm

những nghiên cứu về fucoidan từ rong biển ở Việt Nam

25

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng được lựa chọn nghiên cứu là rong nâu Sargassum duplicatum được thu

vào giữa tháng 5 năm 2016 tại Hòn Rùa vùng biển Nha Trang tỉnh Khánh Hòa Mẫu rong sau khi thu được đưa về Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang rửa sạch tạp chất bằng nước biển, rửa sạch lại với nước ngọt 4 đến 5 lần Sau đó phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, trung bình 10 kg rong tươi cho 1,3 kg rong khô với độ

ẩm thường vào khoảng 25-28 % Mẫu rong được thu và xác định tên bởi KS Nguyễn Bách Khoa (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân tích

2.2.1.1 Phương pháp định lượng fucoidan

Trong điều kiện vật liệu và dụng cụ đơn giản đang có được, phương pháp dễ thực hiện nhất để tách chiết và tinh sạch được lựa chọn đó là: fucoidan được tinh chế theo phương pháp của Hitoshi KAWAMOTO [26]

50g bột rong đã sấy khô đến khối lượng không đổi được đem trộn đều với 500 ml dung dịch axit HCl 0,1N; ngâm 24 giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng có khuấy trộn Dịch được tách ra khỏi bã rong qua vải lọc, sau đó qua cột cát và than hoạt tính, tiếp theo được cô đặc bằng thiết bị lọc rây phân tử MWCO 1kDa đến khi còn 50 ml; 2,84g Na2SO4 được thêm vào khuấy tan, chia dung dịch thành 2 phần bằng nhau vào 2 ống

ly tâm 50 ml đã biết trước khối lượng, rửa sạch cốc chia vào 2 ống, cân và điều chỉnh khối lượng 2 ống ly tâm đến bằng nhau bằng nước cất Thêm vào mỗi ống 2 ml BKC 80% lắc đều trong 10 phút Ly tâm, loại bỏ dịch trong Thêm 30 ml nước cất vào mỗi ống, lắc rửa nhiều lần, ly tâm, để loại các chất khác (rửa nước khoảng 3 lần) Ly tâm lần cuối loại bỏ nước Thêm 30 ml ethanol 90% và 2 g muối NaCl lắc mạnh hỗn hợp, kết tủa dính nhầy không tan trong nước, sẽ chuyển sang kết tủa fucoidan tinh, rời rạc,

dễ tan trong nước, lắc rửa mạnh với 40 ml ethanol 85% (v/v) ba lần để rửa hết muối và BKC Sau cùng mới rửa bằng ethanol tuyệt đối hoặc aceton Sấy khô sản phẩm đến

26

khối lượng không đổi, xác định khối lượng hai ống ly tâm, trừ cho khối lượng hai ống

đã biết trước khi thực hiện thí nghiệm thu được kết quả khối lượng fucoidan tinh là M Hàm lượng fucoidan đó trong mẫu rong là: (M x 100)/50 (%) = 2M (%)

Trong đó M là khối lượng fucoidan tinh đã tách chiết được từ 50g rong

Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm xác định hàm lượng fucoidan từ rong Sargassum

duplicatum (chiết bằng nước, chiết bằng dung dịch axít HCl pH 2, chiết bằng dung

dịch CaCl2 2%) Mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 100g rong khô Các mẫu thí nghiệm đều

lặp lại 3 lần, kết quả trung bình chung giữa các lần thí nghiệm

2.2.1.2 Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate

Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [23]

Lấy 200 µl dung dịch cần xác định có hàm lượng carbohydrate trong khoảng

20-100 µl /mg, thêm vào 200 µl thuốc thử phenol 5 % lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm Sử dụng glucose làm chất chuẩn

2.2.1.3 Phương pháp phân tích thành phần đường đơn

Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC, sau khi fucoidan được thủy phân axít về các monomer [51]

Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn có dung tích 5 ml, thêm 1

ml TFA (axít triflorua acetic) 2 M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư Phần cặp còn lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích carbohydrate ICS-3000 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA-07/S2504 (0.4x25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0,6 ml/phút Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp HAEC Các đường đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn Hàm lượng các đường đơn được tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn