Luận văn nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily sibberia và bước đầu chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tu

Luận văn nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily sibberia và bước đầu chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I

-
-

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO CHO CÂY LILY SIBBERIA VÀ BƯỚC ðẦU CHUYỂN GEN

NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Trồng trọt

Mã số: 606201

Người hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ2

đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 thỏng 9 năm 2007

Tỏc giả luận văn

Nguyễn Thị Hương

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới

PGS.TS.Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất

nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp, cũng như trong thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới

GS.TS.Nguyễn Quang Thạch, Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp,

Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội, ñã tạo ñiều kiện về vất chất cũng như tinh thần tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian tôi làm việc cũng như thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp tại Viện

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths ðinh Trường Sơn, và

toàn thể anh chị em của Viên Sinh học Nông nghiệp ñã giúp ñỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi thực hiện ñề tài

Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2007

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hương

1.2.3 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của ñề tài 3

2.1.4.1 Tình hình phát triển hoa lily trên thế giới 7 2.1.4.2 Tình hình phát triển hoa lily ở Việt Nam 8

2.2.2 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 9 2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn

2.3.1 Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật 10

2.3.1.2 Sự phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá của tế bào 11 2.3.1.3 Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật 13

2.3.2 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14

2.3.2.5 Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 22 2.4 Tình hình phát triển cây trồng chuyển gen 23 2.4.1 Những hướng chuyển gen chính ở thực vật 23 2.4.2 Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu 25 2.5 Nghiên cứu chuyển gen trên cây hoa lily 26

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh tạo nguyên liệu chuyển gen 30 3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ ñường saccaroza 30 3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất cytokinin 30 3.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất auxin 31 3.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng 32 3.2.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tái sinh mô vẩy củ tạo mẫu cho chuyển gen 34 3.3.2 Phương pháp nuôi cấy và lây nhiễm vi khuẩn 34

4.1 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro 37 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ saccaroza 38 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của chất ñiều tiết sinh trưởng 41 4.1.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin 41 4.1.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất auxin 46 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng 52 4.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường

4.2 Nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens 63

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của cefotaxime 64 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy 66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 38Bảng 4.2 Ảnh hưởng của kinetin ñến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy 42Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 43

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của IAA ñến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy 46Bảng 4.5 Ảnh hưởng của αNAA ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 47Bảng 4.6 Ảnh hưởng của 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 49Bảng 4.7 Ảnh hưởng tổ hợp kinetin + 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của

Bảng 4.8 Ảnh hưởng tổ hợp BA + 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của tổ hợp BA + 2,4D + saccaroza ñến sự phát sinh

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của cefotaxime ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của nồng ñộ cefotaxime ñến khả năng diệt khuẩn 66Bảng 4.12 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mọc khuẩn 67Bảng 4.13 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu sạch và mẫu

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mang gen

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 14

Hình 2.3 Mô hình chuyển nạp T-ADN từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây 21

Hình 4.1 Mẫu tái sinh tạo callus, chồi và rễ trên môi trường 30g/l sacaroza 40Hình 4.2 Ảnh hưởng của sacaroza ñến sự phát sinh hình thái của lát mỏng

Hình 4.3 Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên môi trường 1mg/l kinetin 45Hình 4.4 Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên môi trường 1mg/l BA 45Hình 4.5 Ảnh hưởng của BA và kinetin ñến sự phát sinh hình thái của mô

Hình 4.6 Mẫu tái sinh tạo callus, rễ trên môi trường 2mg/l αNAA 51Hình 4.7 Mẫu tái sinh tạo callus và rễ trên môi trường 1mg/l 2,4D 51Hình 4.8 Ảnh hưởng của IAA, αNAA và 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mô

Hình 4.11 Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin ñến sự phát sinh hình thái của

mô vẩy củ Trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l kinetin và

Hình 4.14 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BA + saccaroza ñến sự phát sinh hình

Hình 4.15 Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 3 ngày ðNC 69Hình 4.16 Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 5ngày ðNC 69Hình 4.17 Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 7 ngày ðNC 69Hình 4.18 Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 10ngày ðNC 69Hình 4.19 Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 15 ngày ðNC 69

Hình 4.21 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mang

1 mẻ ệẵu

1.1 đẶT VẤN đỀ

Lily là loại hoa cắt rất quan trọng trên thế giới và ở Việt Nam Trong nhiều năm qua, hoa lily luôn ựược ựánh giá là một loại hoa cao cấp, có giá trị kinh tế cũng như giá trị xuất khẩu cao Nhu cầu về loại hoa này trên thị trường hoa trong nước và trên thế giới là rất lớn Vì thế, loại hoa này hiện ựang rất ựược quan tâm và trú trọng phát triển

để phát triển loại hoa này ở Việt Nam, nhiều cơ quan và nhà nghiên cứu ựã tập trung nghiên cứu nhân giống bằng cả phương pháp truyền thống (nhân giống bằng củ) và phương pháp nuôi cấy mô, tế bào đã có rất nhiều thành công trong việc nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy mô,

tế bào, như: Nhân giống lily bằng phương pháp tạo củ in vitro; nhân giống lily bằng phương pháp tạo cây in vitro,Ầ(Viện Sinh học Nông nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp) Tuy nhiên, chúng ta mới chỉ thành công trong việc nghiên cứu nhân giống, còn việc nghiên cứu tạo giống vẫn còn

là vấn ựề mới mẻ và chưa ựược tập trung nghiên cứu cụ thể đến nay, việc nghiên cứu tạo giống hoa lily thắch ứng với ựiều kiện khắ hậu Việt Nam vẫn chưa ựược ựề cập ựến

Trong tạo giống hoa nói chung và hoa lily nói riêng thì phương pháp chuyển gen ựược coi là phương pháp có hiệu quả Việc chuyển gen cho cây hoa lily nhằm mục ựắch tạo sự ựa dạng về màu sắc hoa hay tăng khả năng thắch nghi cho cây ở các ựiều kiện trồng trọt khác nhau là nội dung rất ựược quan tâm của nhiều nhà khoa học nông nghiệp trên thế giới và cả trong nước

Hiện nay trên thế giới, việc tạo giống cây trồng chuyển gen ngày càng phát triển và thu ñược nhiều thành tựu Năm 2006 diện tích cây trồng chuyển gen ñạt trên 100 triệu ha, với 22 nước trồng cây biến ñổi gen Các loại cây trồng chuyển gen chủ yếu ñược chuyển nạp ñặc tính kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu, bệnh Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gen vào cây lily

ñã ñược thực hiện bởi các phương pháp chuyển gen trực tiếp như bắn gen (Nishihara và cộng sự, 1993; Sanford và cộng sự, 1993; Wilmink và cộng sự, 1995; Tsuchiya và cộng sự, 1996), sử dụng xung ñiện (Miyoshi và cộng sự, 1995) Trong những năm gần ñây, sự thành công trong nghiên cứu chuyển

gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñã ñược công bố trên một số loài thuộc họ

liliaceae bao gồm: Asparagus officinalis (Kiasaka và Kameya, 1998), Allium

sativum (Kondo và cộng sự, 2000), và Muscari armeniacum (Suzuki và

Nakano, 2002) Gần ñây nhất, tác giả Y Hoshi và cộng sự ñã nghiên cứu

thành công quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, Lilium

Oriental hybrid “ Acapulco” bằng vi khuẩn Agrobacterium Tuy nhiên cho

ñến nay việc nghiên cứu chuyển gen cho cây lily còn hoàn toàn chưa ñược ñề

cập ở Việt Nam Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành ñề tài:

"Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily Sibberia

và bước ñầu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens"

1.2 MỤC ðÍCH, YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI

1.2.1 Mục ñích

+ Nghiên cứu các ñường hướng tái sinh in vitro nhằm tạo nguyên liệu cho công tác chuyển gen cho cây hoa lily

+ Bước ñầu nghiên cứu một số khâu kỹ thuật ñể chuyển gen cho cây

hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm cơ sở cho việc xây

dựng quy trình chuyển gen

1.2.2 Yêu cầu

a Xây dựng hệ thống tái sinh

* Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của ñường saccaroza tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

* Xác ñịnh ñược ảnh hưởng riêng rẽ và tổ hợp của một số chất ñiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

* Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường saccaroza tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

b Các thí nghiệm chuyển gen

* Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của một số nồng ñộ chất kháng sinh cefotaxim tới khả năng sống và tái sinh của mẫu thí nghiệm

* Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của một số nồng ñộ chất kháng sinh cefotaxim

tới sự sống sót của vi khuẩn A tumefaciens sau quá trình ñồng nuôi cấy

* Bước ñầu thử nghiệm chuyển gen GFP (gen chỉ thị) vào cây hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.3 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của ñề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

ðề tài sẽ cung cấp thêm nhưng dẫn liệu cơ bản góp phần xây dựng hệ thống tái sinh in vitro ở cây hoa lily, ñặc biệt là ñường hướng tái sinh tạo callus từ mô vẩy củ tạo nguyên liệu phù hợp cho quá trình chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Kết quả nghiên cứu của ñề tài chứng minh khả năng có thể chuyển gen vào cây hoa lily một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Trong nghiên cứu chọn tạo giống hoa nói chung và ñặc biệt là chọn tạo giống hoa lily ở nước ta còn rất hạn chế Kết quả nghiên cứu của ñề tài làm tiền ñề và thúc ñẩy việc ứng dụng một phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa lily nói riêng ở Việt Nam là tạo giống cây trồng chuyển gen

1.3.3 Tính mới của ñề tài

ðề tài là một trong những công trình ñầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu

chuyển gen cho cây lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Việc chuyển

nạp thành công gen chỉ thị GFP (green fluoresence protein) cho mô vẩy củ của cây hoa lily Sibberia là những kết quả ñầu tiên rất có ý nghĩa của hướng nghiên cứu hoàn toàn mới nêu trên

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY HOA LILY

2.1.1 Nguồn gốc

Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên,

Mỹ và một số nước khác Hoa lily ñã ñược nghiên cứu và thuần hóa gần 100 năm nay từ các loài hoang dại phân bố ở hầu hết các châu lục từ 100 ñến 600

vĩ bắc, ñặc biệt là những vùng có khí hậu ôn ñới và lạnh, hoặc ở những vùng núi cao từ 1200m trở lên của các vùng nhiệt ñới như Trung Quốc, Ấn ðộ, Indonexia, Việt Nam [7]

2.1.2 Vị trí phân loại thực vật

Trong hệ thống phân loại thực vật cây hoa lily ñược xếp vào nhóm cây

một lá mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales),

họ hành (Liliaceae), chi Lilium.[14]

Chi Lilium có tới hơn một trăm loài, ở châu Á có khoảng 50 ñến 60 loài (Nhật, Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam ), Bắc Mỹ có tới 24 loài (Mỹ, Canada, Argentina), châu Âu có 12 loài (Hà Lan,Ý, Pháp) [7]

Ở Việt Nam mới chỉ phát hiện thấy 2 loài cây là cây bách hợp (L.brownii

F.E Brow war oldiesteriwils), mọc hoang dại trên các ñồi cỏ ở Bắc Giang, Thái

Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, có vẩy củ của thân dùng làm thuốc và loài Lilium

poilanei Ganep có ở ñồi cỏ Sa Pa, Hoàng Liên Sơn

Ngoài ra, hiện nay có rất nhiều giống lai ñược tạo ra bằng phương pháp lai hữu tính giữa các loài hoa loa kèn với nhau Các giống loài này có sức sinh trưởng

khỏe, có khả năng chống sâu bệnh, mang lại các ñặc trưng hình thái, dạng hoa trung gian của bố và mẹ với các màu sắc hết sức ñộc ñáo và lạ mắt [11]

2.1.3 ðặc tính sinh vật học

Cây hoa lily là loại cây thân thảo, thân cao từ 50-200cm Bộ phận trên mặt ñất là thân, lá, hoa và quả, là phần thương phẩm của lily Bộ phận dưới mặt ñất là rễ và thân vẩy (củ) là bộ phận làm giống của cây lily

Thân cây lily thường mọc ñơn có lá Lá luôn có hình mũi mác hay hình vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung quanh thân, không có cuống hoặc cuống rất ngắn, một số ít giống ở nách lá có mầm, có thể dùng nhân giống Hoa lưỡng tính, kích thước lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn Hoa có hình loa kèn, hình phễu, hình sao, hình cái chén nông Màu sắc hoa rất phong phú: màu trắng, màu vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu ñỏ, màu tím Màu cánh hoa thường là ñơn sắc hoặc có ñốm màu nâu, màu tím một số có hương thơm Hoa có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao hoa 6 mảnh dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, ñầu nhụy hình ñầu, chia 3 thùy Quả nang có 3 góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt, ñộ lớn, trọng lượng hạt tùy theo giống Trong ñiều kiện khô, lạnh, hạt có thể bảo quản ñược ba năm

Rễ lily có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay trên củ giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ và thân trên mặt ñất gọi là rễ thân

Phần thân vẩy là phần phình to của thân tạo thành, có màu trắng hoặc màu hồng nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc, nên gọi là thân vẩy trần Trên ñĩa thân vẩy có vài chục vẩy hợp lại, chất ñất, kỹ thuật trồng

và tuổi của thân vẩy ảnh hưởng rất lớn ñến hình thái thân Màu sắc, kích thước của thân vẩy tùy thuộc vào loài, giống khác nhau ðộ lớn của thân

vẩy tương quan chặt chẽ với số nụ hoa Thân vẩy chứa 70% nước, 23% chất bột, một lượng nhỏ protein, chất khoáng và chất béo Theo Linline (1970) [4], số thân vẩy cũng tỷ lệ thuận với số lá và số nụ hoa, số vẩy càng nhiều thì số lá và số nụ hoa càng nhiều Nếu bóc bỏ lớp vẩy củ ngoài thì tốc ñộ nảy mầm của của củ nhanh hơn, nhưng tốc ñộ hình thành của các cơ quan sinh sản giảm, ra hoa muộn hơn

2.1.4 Tình hình phát triển hoa lily

2.1.4.1 Tình hình phát triển hoa lily trên thế giới

Trên thế giới, lily cùng với tuylip, freesia là ba loại hoa dạng thân củ chủ yếu quan trọng trong ngành sản xuất hoa, chiếm 24% giá trị sản phẩm hoa thương mại Những vùng sản xuất hoa lớn trên thế giới gồm các nước Châu Âu như Hà Lan, Pháp, Bỉ, ðức, Ý, ; các nước Bắc Mỹ như Mỹ, Canada ; một số nước ở Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, [4]

Năm 1997, Hà Lan có 356 ha lily, ñứng thứ hai trong tổng diện tích hoa cắt trồng bằng củ ở ñất nước này (sau tuylip) Sở dĩ hoa lily ñược phát triển mạnh trong những năm gần ñây là do người Hà Lan ñã tạo ra rất nhiều giống mới có hoa ñẹp, chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất cao Hiện nay, Hà Lan mỗi năm trồng khoảng 18.000 ha hoa lily trong ñó xuất khẩu 70% Hà Lan còn là nước có công nghệ tạo giống và trồng lily tiên tiến nhất hiện nay Mỗi năm Hà Lan tạo ra từ 15 ñến 20 giống mới, sản xuất 1,315 triệu củ giống lily, cung cấp cho 35 nước khác nhau trên thế giới [4]

Ở Italia, tổng diện tích trồng hoa chiếm 8000ha, tổng giá trị hàng năm khoảng 1,1tỷ ñôla, trong ñó hoa lily là một trong những loại hoa cắt quan trọng chiếm 280 – 300ha với tổng giá trị thu ñược hang năm là 71 triệu ñôla [34]

Kenia là nước sản xuất hoa tươi chủ yếu của Châu Phi và là nước

xuất khẩu hoa tươi lớn nhất châu lục này Mỗi năm nước này xuất khẩu

sang Châu Âu là 65 triệu USD, trong ựó riêng lily chiếm 35% [4]

Ở Canada, hoa lily ựược sử dụng chủ yếu ở các dạng hoa cắt và hoa

chậu Sản lượng hoa lily cắt cành tăng lên qua các năm Năm 1998, sản lượng

hoa cắt cành là 11,28 triệu cành, hoa chậu là 4,2 triệu chậu; tăng lên 17,13

triệu cành và 4,39 triệu chậu vào năm 2000 [4]

Từ năm 1999 ựến năm 2003, tỷ lệ hoa cắt tăng 6-9% so với những năm

trước ựó, ựem lại lợi nhuận trên 35tỷ ựôla, tập trung chủ yếu ở các nước như

Hungari, Trung Quốc, Nhật Bản, Hà Lan [4]

Nhật Bản có 1558 ha trồng các loại hoa có củ cho sản lượng hàng năm

là 33,047 triệu yên Nhật trong ựó diện tắch trồng hoa lily chiếm khoảng 508

ha cho sản lượng hàng năm khoảng 15,068 triệu yên Nhật [34]

2.1.4.2 Tình hình phát triển hoa lily ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hoa lily ựã ựược trồng thành công ở nhiều tỉnh nước ta

như đà Lạt - Lâm đồng, Sapa Ờ Lào Cai, Mộc Châu Ờ Sơn La, Hà Nội với

hiệu quả kinh tế rất cao

Hoa lily ở nước ta ựược xem là một trong bốn loại hoa quan trọng ựang

ựược nghiên cứu, nhằm ựưa loại hoa này thành mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn

của ngành trồng hoa trong tương lai đà Lạt là nơi hiện ựang có diện tắch trồng

hoa lily lớn nhất trong cả nước (chiếm 8% diện tắch trồng hoa trong cả nước)

Tình hình phát triển hoa lily ở đà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu

ựãi cho sự phát triển của các giống hoa nói chung và cho hoa lily nói riêng, một

phần do kỹ thuật trồng hoa lily ở đà Lạt tương ựối cao nên hoa sinh trưởng phát

triển khá tốt Hiện nay, lily trong những loại hoa ựem lại hiệu quả kinh tế cao

nhất cho một số công ty ở đà Lạt như: Công ty Hasfarm, công ty Bonifarm,

công ty Thanh Sơn,Ầ Phân viện sinh học nhiệt ựới đà Lạt Trong ựó, công ty Hasfarm ựã áp dụng công nghệ trồng hoa mới trên 28 ha với 60% sản lượng hoa xuất khẩu sang Singapo, Nhật Bản, Thái Lan, Úc Hoa lily là một trong số những loại hoa ựược sản xuất nhiều nhất của công ty này [32]

2.2 CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

2.2.1 Khái niệm về kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ựưa một hay nhiều gen lạ ựã ựược thiết

kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ựộng vậtẦ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ựộng tổng hợp nên các protein ựặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ựặc tắnh mới ở cơ thể chuyển gen

2.2.2 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chắnh:

+ Nhóm phương pháp chuyển gen gián tiếp gồm: Phương pháp

chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium và phương pháp chuyển gen nhờ virus

+ Nhóm phương pháp chuyển gen trực tiếp gồm: Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm (Mild sonication); chuyển gen nhờ kỹ thuật ựiện xung (electroporation); kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide; chuyển gen bằng phương pháp súng bắn gen; phương pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn (pollen tube)

Trong các phương pháp chuyển gen nói trên thì phương pháp chuyển gen

gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp ựược sử dụng nhiều nhất

hiện nay ðây là phương pháp khá ñơn giản, dễ dàng thực hiện và hiệu quả thành

công tương ñối cao Dựa vào cơ chế chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens,

người ta ñã dùng vi khuẩn ñể chuyển các gen mong muốn trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmid của vi khuẩn sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây ñộc cho cây Người ta ñã tạo ra các dạng vectơ mới ñể chuyển gen là những vectơ liên hợp và vectơ nhị thể Các hệ thống vectơ mới ñược tạo thành này ñều ñược dựa trên cơ sở cải tiến Ti-plasmid Phần T-ADN của Ti-plasmid sẽ bị cắt bỏ những gen gây u và gen tổng hợp opine, thay thế vào ñấy là các gen mong muốn kèm theo gen chỉ thị

và gen khởi ñộng

Ngoài ra, phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn (pollen tube) cũng là phương pháp ñược sử dụng rộng rãi Phương pháp chuyển gen này còn ñược xem là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô Phương pháp này ñược nhóm Ray Wu ñại học Cornell (Mỹ) ñề xuất năm 1988 trên ñối tượng cây lúa Theo phương pháp này thì ADN chuyển vào có thể theo ñường ống phấn chui vào bầu nhuỵ cái và chuyển gen ngay sau khi hạt phấn mọc qua vòi nhụy và bắt ñầu ñưa tinh tử vào thụ tinh Theo tác giả thì chuyển gen qua bao phấn tốt nhất ngay sau khi quá trình thụ tinh sảy ra ở noãn nhưng tế bào sinh dục cái chưa phân chia Như vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra ñối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không xuất hiện thể khảm ở Việt Nam, phương pháp này ñang ñược Viện nghiên cứu cây bông và Viện Công nghệ sinh học thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông [13]

2.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

2.3.1 Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật

2.3.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902), lần ựầu tiên ựã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật ựa bào ựều có khả năng tiềm tàng ựể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm của sinh học hiện ựại thì mỗi tế bào riêng rẽ ựã phân hoá ựều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và

ựủ của cả cơ thể sinh vật ựó Khi gặp ựiều kiện thắch hợp, mỗi tế bào ựều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tắnh toàn năng của tế bào Tắnh toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chắnh là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho ựến nay con người ựã hoàn toàn chứng minh ựược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [13], [24]

2.3.1.2 Sự phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chắnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, ựược hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào ựó ựều bắt nguồn từ một tế bào ựầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai ựoạn ựầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau ựó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục ựược biến ựổi thành các tế bào chuyên hóa ựặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau đó là quá trình phân hoá tế bào ở cơ thể thực vật [13]

Tuy nhiên, khi tế bào ựã phân hoá thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến ựổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở ựiều kiện thắch hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình ựó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào

Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,

ức chế các gen Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen ñược hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) ñể cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị ñình chỉ hoạt ñộng ðiều này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn ñược hài hòa

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của

khối mô sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho ñến cùng là kỹ thuật ñiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong ñiều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách ñịnh hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn của tế bào thực vật ðể ñiều khiển sự phát sinh

Tế bào phôi sinh

Tế bào phôi sinh (mô sẹo)

Quá trình phân hoá Quá trình phản phân hoá

Quá trình tái phân hoá

hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin

Tuỳ theo mục ñích nghiên cứu ñặt ra như tạo mô sẹo, tạo chồi phụ, tạo

rễ, tạo phôi vô tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy, mà môi trường thích hợp là rất cần thiết [13]

2.3.1.3 Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì nguồn vật liệu

thường ñược sử dụng ñể chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẩu callus, phôi, những tế bào tách rời… Những vật liệu này sau khi ñã ñược biến nạp thành công, các tế bào ñã dung nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho những tế bào này tái sinh ñược thành một cơ thể hoàn chỉnh bằng cách ñặt nó vào một môi trường tái sinh thích hợp Nếu như, sự tái sinh thành cây hoàn chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu ñã ñược biến nạp ñó sẽ trở nên vô nghĩa Chính vì vậy, sự thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế bào Do vậy, việc lựa chọn và ñiều chỉnh môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñóng vai trò hết sức quan trọng, mang tính quyết ñịnh tới thành công hay thất bại của thí nghiệm biến nạp, bên cạnh ñó, vấn ñề sử dụng mô hay tế bào thích hợp ñể biến nạp cũng là mục tiêu nghiên cứu không kém phần quan trọng [9]

James F Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Peter Waterhouse, năm 2000 [26] nhận thấy: ñể có thể tạo ñược giống mới nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả thì phải ñảm bảo 4 yêu cầu sau:

- Hệ thống tái sinh thích hợp ñể tái sinh ñược cây ñã chuyển gen

- Hệ thống vectơ thích hợp ñể có thể ñưa các gen lạ vào bộ gen của ñối tượng ñược chuyển gen

- Có các gen thích hợp ñã ñược nhân dòng và ñã xác ñịnh ñược các ñặc tính

- Các phương pháp ñể ñánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm, nhà kính và ñồng ruộng

2.3.2 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn ñược sử dụng phổ biến

nhất trong chuyển nạp gen Agrobacterium tumefaciens thuộc vi khuẩn ñất,

gram âm, hình que, có khả năng di ñộng (có 5-11 lông roi), không sinh bào tử

và cùng họ với vi khuẩn cố ñịnh ñạm Rhizobium Vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tối ưu ở nhiệt ñộ 290C [10]

Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây do nó có khả năng chuyển T-ADN vào tế bào cây chủ, sau ñó T-ADN này hợp nhất vào bộ gen của tế bào cây chủ dẫn ñến hình thành khối u Khối u ñược hình thành trên rễ (phần nằm trên mặt ñất) và ñỉnh của nhiều loài cây hai lá mầm, một số loài cây ăn quả như táo, lê, ñào, nho và những cây cảnh như hoa hồng [15]

Hình 2.1 Khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra

(nguồn http://biologi.uio.no/plfys/haa/gen/gmo.htm)

Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có kiến trúc vòng,

kích thước 2,6 Mb Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước

200-800 kbp, phần lớn những gen có liên quan ñến sự hình thành khối u ở thực vật ñều

nằm trong plasmid này nên ñược gọi là Ti-plasmid [15]

2.3.2.1 Ti-plasmid

Ti-plasmid là một phân tử ADN sợi ñôi mạch vòng nằm tách biệt với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách ñộc lập trong tế bào vi khuẩn Cấu trúc chung của một Ti-plasmid gồm: vùng T-ADN - trình tự mã hoá ñược

chuyển vào trong cây; vùng mang các gen vir - vùng trực tiếp tham gia tạo ADN sợi ñơn và chuyển T-ADN này vào tế bào cây; vùng rep - cần cho sự tái bản của Ti-plasmid, vị trí tra và trb - tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của Ti-

T-plasmid, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine Hai yếu tố quan trọng trong cấu trúc của Ti-plasmid cần cho sự chuyển gen vào cây là ñoạn T-

ADN bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai bờ của ñoạn T- ADN và gen vir [13], [15]

2.3.2.2 Chức năng của T-DNA

T-ADN là một ñoạn ADN có kích thước từ 10-30 kbp, có mang các gen mã hoá cho việc tổng hợp auxins, cytokinins, opines và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN ñược giới hạn bởi các trình tự lập lại có chiều dài khoảng 25 bp nằm ở 2 ñầu gọi là bờ phải và bờ trái Tuy nhiên, bờ trái của T-ADN bị mất không ảnh hưởng ñến tính ñộc nhiều, trong khi ñó bờ phải lại cần thiết và ñược ñề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước rồi tiến dần về phía trái Việc ñảo ngược bờ phải sẽ làm yếu ñi khả năng tạo khối u [13]

T-ADN mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây ñược chuyển gen sẽ làm thay ñổi hình thái của cây Theo Binns và Costantino (1998) [15], T-ADN mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen ñược chuyển mang nhiều ñặc ñiểm của các gen trong nhân của thực vật, thí dụ như kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box) Một nhóm các gen của T-ADN ñiều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của

cây, những hormon này làm các tế bào tăng trưởng và làm thay ñổi hình dạng

bên ngoài Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH ñiều khiển sự chuyển hoá

tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin) Sản phẩm

của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP và các enzyme

trong cây ñược cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl Hai gen trên T-ADN khác ñược cho là có chức

năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b) Sản phẩm của gen 5

ñiều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, ñó là một chất ñồng ñẳng với auxin

Trong khi ñó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức ñộ nhạy cảm của các

tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa ñược giải thích Gen tml

có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác

Một nhóm gen ñược chuyển vào tế bào ñể ñiều khiển sản xuất nguồn

dinh dưỡng cho vi khuẩn Agrobacteriu tumefaciens phát triển, ñó là các

opines ðây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc với một ñường Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng lớn các opines Các opines này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-ADN và thường trên plasmid ñộc) cần cho việc phân giải các opines ñược tổng hợp từ khối u [13], [15]

2.3.2.3 Chức năng của gen Vir

Quá trình chuyển T-ADN từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sang

tế bào cây chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir Có ít nhất 25 gen ñược nhận biết trong 7 ñơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE,

virG, virF và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp Theo Stachel và ctv (1987) [15] vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen ñó là: virA, virB,

virC, virD, virE và virG Những gen vir này có vai trò trong việc tạo sợi ñơn

T-ADN trong vi khuẩn và chuyển nó vào tế bào cây chủ rồi gắn vào nhiễm sắc thể cây chủ

Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông

qua tín hiệu hoá học là chất acetosyringone (AS) tiết từ vết thương Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra ñược nhận biết trước tiên

bởi protein virA, rồi ñến protein virG ñể làm kích hoạt các gen ñộc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết Sự cảm ứng gen vir phụ thuộc vào nhiệt

ñộ thấp và ñiều kiện pH axit Hệ thống ñiều hoà gen vir hoạt ñộng thông qua

hai gen ñộc: virA và virG Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào Protein virA ñáp ứng với sự trao ñổi chất của vết

thương của cây và có thể ñáp ứng nhạy cảm với sự thay ñổi của môi trường

Với một nồng ñộ AS thích hợp virA có thể ñược kích thích bởi ñường, các opine khối u hoặc amino axit Protein virA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào virG ñược phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi virA tự phosphoryl hoá và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12 bp trong trình tự “vir box” Sự phosphoryl hoá làm cho protein virG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH [15]

Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi ñơn T-ADN trong vi khuẩn

và ñưa sợi ñơn T-ADN vào trong tế bào cây Các protein ñược mã hoá bởi

gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-ADN Protein

virD2 là một endonucleaz, protein này có chức năng xúc tác cắt sợi T-ADN

ở vị trí 5’của bờ phải sau ñó virD1 cắt rời sợi T-ADN tại vị trí ñầu 3’ của

bờ trái tạo thành một sợi ñơn Ngoài chức năng cắt sợi T-ADN virD2 còn

có chức năng khác như bám dính vào ñầu 5’ ñể tránh sự tác ñộng của enzim nucleaza và chuyển sợi ñơn T-ADN vào nhân tế bào thực vật vì trong

virD2 còn chứa một tín hiệu gọi là tín hiệu ñịnh vị trong nhân (nuclear

locolization signal) Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong

sự kết nạp T-ADN ñã ñược ñề nghị: virD2 vừa làm nhiệm vụ của một

enzim integraza vừa làm nhiệm vụ của một enzim ligaza [15]

VirE2 là một protein nối kết vào sợi ñơn T-ADN, nó sẽ bảo vệ T-ADN

khỏi sự phân giải của các enzim nucleaz trong tế bào cây giống như virD2,

virE2 cũng có chứa một tín hiệu ñịnh vị trong nhân VirB có chức năng hình

thành một cái kênh xuyên qua vách tế bào thực vật, giúp chuyển sợi ñơn ADN vượt xuyên qua tế bào vi khuẩn ñến vách, màng tế bào thực vật và sau

T-ñó vượt qua các lỗ nhân ñể vào nhân tế bào Hai sản phẩm của gen vir cũng ñược cho là có chức năng trong việc tạo T-ADN sợi ñơn là: virC1 và virC2

virC1 ñã ñược thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải,

và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-ADN ở vị trí bờ vai của virD1/virD2 endonucleaz Một số tác giả khác cho rằng virC1 và virC2 không cần cho tạo

T-ADN sợi ñơn Nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-ADN vào cây khá thấp Do ñó ñề nghị rằng chúng có chức năng trong việc

tăng cường sản xuất sợi ñơn T-ADN Cùng với protein virD4, mười một protein virB, virE2 và virF tham gia ñưa T-ADN vào nhân Hệ thống chuyển nạp T-ADN ñược mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen Sự chuyển phức hợp T-ADN dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và

ñột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này ñều làm mất khả

năng tạo pili và tạo khối u Các protein virB ñiều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tương tự như chiên mao tiếp hợp) và virB2 là tiểu phần chính của chiên mao này Hai protein virB là virB4 và virB11 có hoạt tính ATPaz và

ñược cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác,

cho vận chuyển T-ADN, hoặc cả hai Hệ thống virB ñưa T-ADN tới tế bào

chất của tế bào cây, nơi ñây các bước cần cho chuyển T-ADN vào nhân và kết

nạp với ADN của cây ñược thực hiện Cầu nối virB có thể gắn kết với phức hợp T-ADN bởi protein virD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp Hệ thống virB/virD4 ñưa phức hợp T-ADN–virD2 và protein virE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-ADN cuối cùng

ñược tạo ra bằng cách phủ T-ADN với protein virE2 [15]

2.3.2.4 Cơ chế lây nhiễm

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñược tìm thấy ở trên và xung

quanh bề mặt rễ Nhưng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm ñược vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân ðiều này có thể dễ dàng ñược chứng minh bằng các thí nghiệm Trong ñiều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn ñược dẫn

dụ ñến vết thương nhờ các tín hiệu hoá học Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang Ti-plasmid sẽ ñáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng nhận diện ñược các hợp chất phenolic tiết ra từ vết thương như acetosyringone (AS)

Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng ñộ thấp (10-7 M) Bởi vậy, một trong những chức năng của Ti-plasmid là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các hợp chất hoá học Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và

có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương Acetosyringone ñóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm ở nồng ñộ cao (10-5 – 10-4 M)

hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Ti-plasmid Các gen vir ñược kích hoạt tốt

nhất ở nhiệt ñộ 25-270C Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt ñộng

ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 18-200C [15]

Hình 2.2 Quá trình tạo phức hợp sợi ñơn T-DNA

(nguồn Valentine, 2003 )

Sau khi ñược kích hoạt, các gen vir sẽ ñiều khiển quá trình tạo T-ADN sợi

ñơn trong tế bào vi khuẩn (hình 2.2) Quá trình tạo T-ADN sợi ñơn ñược thực

hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1 và virD2 thực hiện Sau ñó protein virD2 gắn vào sợi ñơn T-ADN ñể tạo thành phức hợp T-ADN Ngoài

virD1 , virD2 người ta còn cho rằng virC1 và virC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-ADN sợi ñơn Phức hợp T-ADN-virD2 cùng với protein virE2 ñược

chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp ñược mã hoá bởi

các gen virB Cùng với một số thành phần trong tế bào chất của tế bào cây, các

protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục ñưa phức hợp T-ADN vào trong nhân tế bào

Trong nhân tế bào cây, T-ADN ñược kết nạp vào bộ gen của cây không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-ADN vào

bộ gen của cây ñã ñược ñề nghị Theo mô hình này, ñầu tiên ñầu 3’ của T-ADN nhận diện các ñoạn tương ñồng với ADN của cây và gắn vào Cả việc tách sợi ADN của cây và overhang ñầu 3’ của T-ADN ñều ñược enzyme nucleaza thực

hiện Cuối cùng nucleotide gắn với virD2 tìm các ñoạn vi tương ñồng

(microhomology) trên ADN của cây và gắn vào Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực ñiện tử của ñầu 5’ ñến gần ñầu 3’ nucleophilic của ADN cây mà bị tách ra Cuối cùng sự gắn kết trên sợi ADN của cây ñược hoàn

thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp ñoạn T-ADN dẫn ñến sự kết nạp của T-ADN hoàn thành

Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-ADN hoạt ñộng tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn Các opines ñược tạo

ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào ñược vi khuẩn biến

dưỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opine trên Ti-plasmid Tùy theo kiểu opine mà ñược chuyển hóa bởi các gen khác nhau [15]

Khả năng chuyển nạp ñoạn ADN của Agrobacterium vào trong tế bào cây

cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật, chuyển nạp gen

thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium ngày càng ñược ứng dụng rộng rãi

ñể chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng do có nhiều ưu ñiểm so với các phương pháp chuyển nạp gen khác: gen ñược chuyển nạp gắn vào hệ gen cây một cách ñơn giản, hiện tượng tái sắp xếp lại của các gen ít xảy ra, có ít bản bản sao của gen ñược biến nạp tạo thuận lợi trong việc phân tích cũng như biểu hiện gen mới trong cây chuyển gen, các gen chuyển nạp duy trì bền vững qua các thế hệ sau Trước ñây, phương pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do

Hình 2.3 Mô hình chuyển nạp T-ADN từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây

(nguồn Zhu và ctv, 2000)

tin rằng Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hai lá mầm Sau này, người ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhưng nó

có thể nhiễm vào cây một lá mầm Trước ñây ñối với cây một lá mầm như lúa,

phương pháp chuyển nạp gen nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium rất khó thành

công Tuy nhiên gần ñây công trình nghiên cứu của Hiei và Komari (1996) [3] ñã

minh chứng ñược hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium vào cây

một lá mầm (lúa) cũng cao như ñối với cây hai lá mầm

2.3.2.5 Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñã ñược áp dụng

thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng, ñặc biệt là cây hai lá mần như: khoai tây, cà chua, thuốclá, ñu ñủ, việc chuyển gen vào cây một lá mầm khó thành công hơn Nhưng gần ñây, người ta cũng ñã thành công trong việc

chuyển gen cho cây một lá mầm nhờ vi khuẩn Agrobacterium như: lúa, ngô

ðể thực hiện thành công việc chuyên gen nhờ vi khuẩn người ta thường sử

dụng kỹ thuật ñĩa lá Các bước của kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn gồm:

* Bước 1: Tạo các ñĩa lá và ngâm trong dịch khuẩn

ðối tượng sử dụng ñể chuyển gen ñược cắt ra thành những mảnh

nhỏ, sau ñó xử lý chúng trong dung dịch có chứa vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens mang plasmid chứa gen mong muốn ñã ñược thiết kế trong

vài chục phút

* Bước 2: Tiến hành ñồng nuôi cấy ñĩa lá và vi khuẩn

ðĩa lá sau khi ñược xử lý trong dung dịch khuẩn, chúng ñược cấy lên môi trường ñồng nuôi cấy Quá trình ñồng nuôi cấy này ñược thực hiện trong ñiều kiện tối hoàn toàn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào ñối tượng chuyển gen Trong môi trường ñồng nuôi cấy có bổ sung acetosyrigone ñể tăng cường khả năng hoạt hoá gen vùng Vir qua ñó thúc ñẩy thêm quá trình

chuyển gen ðây là giai ñoạn quyết ñịnh hiệu quả của công tác chuyển gen

* Bước 3: Làm sạch khuẩn trên ñĩa lá và cấy lên môi trường tái sinh

Quá trình làm sạch ñĩa lá ñược thực hiện nhờ phương pháp rửa sạch bằng dung dịch kháng sinh Cefotaxime ñể diệt hết khuẩn Sau khi rửa sạch các ñĩa lá tiến hành thấm khô chúng bằng giấy thấm vô trùng, sau ñó ñặt

chúng lên môi trường tái sinh tạo cây hoàn chỉnh

* Bước 4: Nuôi cấy tái sinh ñĩa lá

Quá trình này ñược thực hiện trong ñiều kiện nhiệt ñộ, ánh sáng thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái của ñĩa lá

* Bước 5: Chọn lọc các cây mang gen chuyển vào

Quá trình này ñược thực hiện qua sự phát hiện các gen chỉ thị Việc phát hiện các gen chuyển vào có thể ñược thực hiện thông qua việc phân tích ADN và ñánh giá biểu hiện của gen thông qua biotest

* Bước 6: Nhân dòng và ñánh giá sinh trưởng của cây chuyển gen

Quá trình này trước tiên ñược thực hiện trong ñiều kiện nuôi cấy nhân tạo (in vitro), sau ñó ñánh giá sự sinh trưởng của chúng ở ñiều kiện in vivo (vườn ươm), và cuối cùng là ñánh giá sự sinh trưởng phát triển của chúng trong ñiều kiện tự nhiên (ñồng ruộng)

2.4 TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

2.4.1 Những hướng chuyển gen chính ở thực vật

* Trên thế giới,

Hịên nay, các nhà khoa học trên thế giới ñang hướng tới tạo những cây chuyển gen thế hệ thứ 2 có ñặc ñiểm tăng giá trị dinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến Những lợi ích này hướng trực tiếp vào người tiêu dùng như:

- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt

- Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột

- Vacxin ăn ñược ở ngô và khoai tây

- Những giống ngô trồng ñược trong ñiều kiện nghèo dinh dưỡng

- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ ñậu nành và cải dầu

Bên cạnh ñó, các thành tựu của biến nạp gen ở thực vật còn tập trung vào một số hướng khác nữa như:

- Tạo giống cây trồng chịu chất diệt cỏ

- Tạo giống cây trồng kháng bệnh virus

- Tạo giống cây trồng kháng các loài gây hại

- Tạo giống cây trồng chống chịu các bệnh nấm

- Thay ñổi thành các axit béo

- Làm chậm chín quả ở cà chua

- ðiều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột ñể làm chủ mức tinh bột trong sản phẩm

- Cải thiện chất lượng ñạm tích lũy trong hạt

- Tăng hàm lượng vitamin A trong hạt gạo

* Ở nước ta, một số phòng thí nghiệm lớn ñã và ñang ñi sâu vào công

tác cải thiện giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen Các nghiên cứu ñã ñược thực hiện ñó là:

(1)- Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị như gen CryIA(b),

CryIA(c), gen ức chế tryspin ñể trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi khuẩn, gen

chịu lạnh, gen protein giàu tryptophan

(2)- Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ

thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trực

tiếp bằng súng bắn gen ðến nay, nhiều dòng lúa chuyển gen Xa21, CryIA(c), ñu

ựủ chuyển gen chắn chậm và kháng virus ựốm vòng ựã ựược tạo ra Các dòng cây chuyển gen này sẽ ựược ựưa vào phân tắch phân tử

(3)- Chuẩn bị thiết bị ựể tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ

việc ựánh giá theo dõi cây chuyển gen như PCR, lai Southern, RFLP, AFPD

2.4.2 Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ựổi gen trên toàn cầu

Năm 2006 trên thế giới ựã có 22 nước trồng cây trồng biến ựổi gen, bao gồm 11 nước ựang phát triển và 11 nước công nghiệp Xếp theo thứ tự từ lớn ựến bé là Mỹ, Achentina, Braxin, Canada, Ấn độ, Trung Quốc, Paraguay, Nam Phi, Uruguay, Phillipine, Australia, Rumani, Mexico, Tâybannha, Colombia, Pháp, Iran, Honduras, Cộng hòa Czech, Bồ đào Nha, đức và Sloavakia Mỹ, Achentina, Braxin, Canada, Trung Quốc, Ấn độ tiếp tục là những nước chắnh trên thế giới trồng cây biến ựổi gen Mỹ vẫn giữ vị trắ dẫn ựầu với diện tắch trồng 54,6 triệu ha (chiếm 53% diện tắch trồng cây biến ựổi gen trên toàn cầu), tiếp theo là Achentia với 18,0 triệu ha, Braxin trồng 11,5 triệu ha, Ấn độ trồng 3,8 triệu ha, Trung Quốc trồng 3,5 triệu ha đậu tương biến ựổi gen tiếp tục là loại cây trồng có diện tắch gieo trồng lớn nhất với 54,4 triệu ha năm 2005 (chiếm 60% diện tắch cây trồng biến ựổi gen trên toàn cầu) tăng lên 58,6 triệu ha năm 2006 (chiếm 57% diện tắch cây trồng biến ựổi gen trên toàn cầu) Tiếp theo là cây cải bắp (25,2 triệu ha, chiếm 25%), cây bông (13,4 triệu ha, chiếm 13%), và cây cải dầu (4,8 triệu ha, chiếm 5%)

Trong vòng 11 năm từ 1996 ựến 2006, tắnh trạng chịu ựược thuốc diệt

cỏ liên tục là tắnh trạng nổi bật, chiếm ưu thế với 68% (69,9 triệu ha), tiếp ựến

là tắnh trạng kháng sâu BT với 19% (19 triệu ha) và các gen xếp chồng mang

cả 2 ựặc tắnh trên (13,1 triệu ha, chiếm 13%) Các giống chuyển gen xếp chồng là nhóm giống tăng trưởng nhanh nhất tới 30% giữa năm 2005 và

2006, còn các nhóm giống khác sự tăng trưởng chỉ ñạt 17% (nhóm kháng sâu)

và 10% (nhóm kháng thuốc trừ cỏ)

Theo ước tính của hãng phân tích thị trường Cropnosis, năm 2005, thị trường cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu trị giá khoảng 5,25 tỉ ñôla, chiếm 15% trong tổng giá trị thị trường cây trồng ñược bảo hộ trên toàn cầu trong năm 2005 (34,02 tỉ ñôla), và chiếm 18% trong tổng giá trị thị trường hạt giống toàn cầu (khoảng 30 tỉ ñôla) Trong số 5,25 tỉ ñôla trị giá thị trường cây trồng biến ñổi gen toàn cầu thì 2,42 tỉ ñôla từ ñậu tương biến ñổi gen (tương ñương 46% thị trường cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu), 1,9 tỉ ñôla từ ngô biến ñổi gen (chiếm 36%), 0,72 tỉ ñôla từ bông biến ñổi gen (chiếm 14%) và 0,21

tỉ ñôla từ cải dầu canola (chiếm 4%) Năm 2006, thị trường cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu tiếp tục phát triển, ñem lại lợi nhuận to lớn cho nông dân trồng cây chuyển gen (27 tỷ ñôla, trong ñó 13 tỷ ñôla ñối với các nước ñang phát triển và 14 tỷ ñôla ñối với các nước công nghiệp) Việc phát triển cây trồng chuyển gen ñã làm giảm ñáng kể tổng lượng thuốc trừ sâu từ năm 1996

- 2005 là 224.000 tấn hoạt chất, tương ñương với việc giảm 15% trong tác ñộng môi trường xung quanh của việc sử dụng thuốc trừ sâu ñối với các loại cây trồng nói trên [33]

2.5 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TRÊN CÂY HOA LILY

Năm 2002, Sakae Suzuki and Masaru Nakano [32] công bố kết quả

nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens cho 3 giống cây thuộc họ

Liliace là Lilium formosanum, Agapanthus praecox ssp Orientalis và

Muscarri armeniacum Kết quả nghiên cứu ñã không thu ñược mô hoặc cây

chuyển gen trên giống Lilium formosanum mặc dù có sự biểu hiện tạm của gen gus trong callus trong quá trình ñồng nuôi cấy Tuy nhiên, ñã thu ñược một số cụm tế bào có khả năng kháng hygromycin của giống Agapanthus

praecox ssp Orientalis và Muscarri armeniacum trên môi trường có bổ sung

hygromycin Callus kháng hygromycin ñã tái sinh tạo cây hoàn chỉnh qua phôi soma, hầu hết trong số chúng ñược xác ñịnh là cây chuyển gen dựa trên phép thử GUS histochemical assay và phân tích PCR Bằng lai Southern ñã phát hiện ñược 1 – 5 copy của gen trong bộ gen của cây chuyển gen của 2 giống trong ñó hầu hết là có 1 hoặc 2 copy Hệ thống chuyển gen vào

Muscarri armeniacum và Agapanthus praecox ssp Orientalis có thể là một

công cụ ñể phát triển trong các nghiên cứu về sinh học phân tử

Năm 2004, các tác giả Byung Joon Ahn, Young Hee Joung, Kathryn K Kamo [22] cũng ñã nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen cho huyền phù

tế bào của hoa Easter lily, Lilium longiflorum và ñưa ra kết luận: Sử dụng hạt

vàng cho sự biểu hiện của gen uidA cao hơn so với hạt ñạn bằng tungsten Tiền xử lý dung dịch huyền phù tế bào trước 3 giờ bằng osmoticum (0,125M) cho hiệu quả biểu hiện của uidA tăng 1,5 lần Sử dụng áp lực 1550psi, khoảng cách 6cm có kết quả tốt nhất so với các áp lực 1100, 1200, 1800 psi Sự biểu hiện tạm của uidA xuất hiện ở 493 tế bào/ñĩa petri ðể chuyển gen bền vững,

huyền phù tế bào của Lilium longiflorum ñược bắn với plasmid bao gồm

cucumber mosaic virus (CMV) replicase ñược ñiều khiển bởi Act1 promoter

và gen bar ñược ñiều khiển bởi CaMV promoter 10 cây tái sinh ñã ñược phân tích bởi PCR, 2 trong 10 cây ñã ñược khẳng ñịnh chuyển gen nhờ lai Southern 2 cây chuyển gen ñược chuyển ñộc lập trong ñó có 1 cây mang gen bar một cây mang cả hai gen bao gồm CMV replicase và gen bar Các cây này

ñã ñược xác ñịnh là có khả năng kháng PPT ở nồng ñộ 1000mg/l ở giai ñoạn

nở hoa chứng tỏ gen bar ñã ñược biểu hiện ở toàn bộ lá khi ñược ñiểu khiển bởi CaMV 35S promoter

Tiếp ñó, cũng năm 2004, các tác giả Y.Hoshi, M.Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashib [25] ñã nghiên cứu hệ thống tạo cây

chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium cho cây Oriental hybrid lily Lilium

Oriental hybrid “Acapulco” và ñã thu ñược 6 dòng lily kháng hygromixin (Hyg) từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thương callus với giấy ráp (sandpaper) trước khi ñồng nuôi cấy, callus ñược ñồng nuôi cấy trên môi trường MS không có NH4NO3, sử dụng hygromixin trong môi trường chọn lọc Các dòng tái sinh kháng Hyg tạo chồi sau ñó phát triển thành cây khi chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất ñiều tiết sinh trưởng Tất cả các cây ñược kết luận chuyển gen nhờ phân tích hoá học mô gen GUS (gen chỉ thị) và phân tích PCR ñảo

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu chuyển gen cho cây lily, ñặc biệt là bằng

vi khuẩn A.tumefaciens chưa ñược ñề cập Do ñó nghiên cứu phương pháp ñể

xây dựng ñược quy trình chuyển gen vào hoa lily bằng vi khuẩn

A.tumefaciens là hoàn toàn cần thiết

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- ðối tượng nghiên cứu là

Giống Lilium Oriental hybrid

“Siberia” hoa trắng, thơm

- Vật liệu nghiên cứu là mô

vẩy củ in vitro

- Vectơ sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen: là chủng vi khuẩn

Agrobacteriumm tumefaciens dòng AA16 mang plasmid pBIN m- gfp5- ER

Hình 3.1 Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia”

Hình 3.2 Sơ ñồ Plasmid mang gen GFP

Siberia

Hình 3.1 Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia”

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh tạo nguyên liệu chuyển gen

3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ ñường saccaroza

* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của ñường saccaroza ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria

CTTN gồm: CT1: MS + 2% saccaroza (ñ/c)

CT2: MS + 3% saccaroza CT3: MS + 4% saccaroza CT4: MS + 5% saccaroza

3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất cytokinin

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin ñến khả năng phát sinh

hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria

CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc)

CT2: MS + 1mg/l kinetin + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l kinetin + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l kinetin + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l kinetin + 3% saccaroza

* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria

CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc)

CT2: MS + 1mg/l BA + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l BA + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l BA + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l BA + 3% saccaroza

3.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất auxin

* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA ñến khả năng phát sinh hình

thái của lát mỏng vẩy củ Siberria

CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc)

CT2: MS + 1mg/l IAA + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l IAA + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l IAA + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l IAA + 3% saccaroza

* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA ñến khả năng phát sinh

hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria

CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc)

CT2: MS + 1mg/l αNAA + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l αNAA + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l αNAA + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l αNAA + 3% saccaroza

* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria

CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc)

CT2: MS + 1mg/l 2,4D + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l 2,4D + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l 2,4D + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l 2,4D + 3% saccaroza