Luận văn xác định týp o virus lở mồm long móng ở việt nam bằng phương pháp RT PCR

Luận văn xác định týp o virus lở mồm long móng ở việt nam bằng phương pháp RT PCR

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp I

Người hướng dẫn khoa học: TS nguyễn viết không

Hà Nội - 2006

lời cam đoan lời cam đoan

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả và số liệu thể hiện trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc

sử dụng để bảo vệ bất cứ học vị nào

Tôi cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã

đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Phan Thanh Tuấn

Lời cảm ơn Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các cá nhân và tập thể Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Khoa Sau đại học, Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông nghiệp I đã đào tạo, truyền tải kiến thức khoa học cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Ban lãnh đạo Viện Thú y cùng tập thể cán bộ, nhân viên- Bộ môn Hoá sinh- Miễn dịch- Bệnh lý, Viện Thú y, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo:

TS Nguyễn Viết Không, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tôi thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và toàn thể bạn bè, đã luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và tiến hành luận văn

Tác giả luận văn

Phan Thanh Tuấn Phan Thanh Tuấn

Mục lục

2.2 Tình hình bệnh và nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng trên thế giới 32.3 Tình hình bệnh và nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng ở Việt Nam 192.4 Một số kỹ thuật chẩn đoán virus lở mồm long móng 222.5 Sự đa dạng sinh học của các týp virus lở mồm long móng và biến chủng 26

4.2 Kết quả gây nhiễm virus lở mồm long móng lên tế bào BHK-21 514.3 Kết quả thiết lập RT-PCR định týp virus lở mồm long móng 53

4.5 Kết quả RT-PCR định týp virus lở mồm long móng PV02 56

4.7 Kết quả tách và nhân dòng sản phẩm PCR mẫu PV02 604.8 Kết quả giải trình tự gene virus lở mồm long móng chủng PV02 684.9 So sánh sequence gene m] hoá protein VP1 của virus LMLM chủng PV02 với những sequence đ] công bố ở ngân hàng gene thế giới

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t

BHK-21 : Baby Hamster Kidney line 21

(TÕ bµo thËn chuét Hamster s¬ sinh dßng 21)

CPE : Cytopathogenic effect (BÖnh tÝch tÕ bµo)

EDTA : Ethylene- Diamine- Tetra- Acetic

FAO : Food and Agriculture Organization

(Tæ chøc N«ng-L−¬ng Liªn hîp quèc) FCS : Fetal Calf Serum (huyÕt thanh bµo thai bª)

FMD : Foot and Mouth Disease (bÖnh lë måm long mãng)

(Virus g©y bÖnh lë måm long mãng) FMD-WRL : Foot and Mouth Disease-World Reference Laboratory

(Phßng thÝ nghiÖm tham chiÕu vÒ bÖnh lë måm long mãng)

OIE : Office Internationale des Epizooties

(Tæ chøc DÞch tÔ ThÕ giíi) PBS : Phosphate- Buffered- Saline

RT-PCR : Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction

Bảng 3.6 Thành phần tham gia phản ứng tách DNA khỏi plasmid 46

Bảng 3.8 Thành phần các chất tham gia phản ứng sequencing 47

Bảng 4.1 Thành phần tham gia phản ứng tách DNA khỏi plasmid 66Bảng 4.2 Thành phần các chất tham gia phản ứng sequencing 69

Bảng 4.4 Mức độ tương đồng của gene VP1 chủng phân lập PV02 với các

Hình 4.3 Sản phẩm RT-PCR sử dụng các cặp primer đặc hiệu týp đối

Hình 4.4 Sản phẩm RT-PCR dùng FMD uni-primer đối với mẫu tế bào

Hình 4 5 Sản phẩm RT-PCR trong định týp virus LMLM PV02 56Hình 4.6 Sản phẩm RT-PCR của virus LMLM chủng phân lập PV02 và

chủng tham chiếu týp O, dùng các cặp primer chung cho các

týp (PuniR-F) và cặp mồi đặc hiệu cho týp O (P33/P38) 59

1 Đặt vấn đề

Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra ở các loài động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, dê, cừu, lợn Bệnh do virus chứa ARN thuộc họ Picornaviridae gây ra với diễn biến cấp tính và khả năng lây lan nhanh Bệnh có các biểu hiện đặc trưng là sốt cao và hình thành mụn nước ở niêm mạc miệng, kẽ chân và da vú của gia súc cảm thụ

Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế do khả năng lây lan nhanh trên nhiều loài gia súc, giảm sức sản xuất, gây ảnh hưởng xấu đến năng suất, chất lượng của sản phẩm chăn nuôi Bệnh LMLM đ] được Tổ chức Dịch tễ Thế giới (Office Internationale des Epizooties - OIE) xếp vào một trong các bệnh đứng

đầu danh mục bảng A - Bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm ở động vật

Bệnh LMLM đ] xảy ra ở hầu hết các châu lục: châu Âu (bệnh được ghi nhận vào những năm cuối thế kỷ 17), châu á (Pakistan, ấn Độ, v.v ), châu Phi (Nam Phi v.v.)

ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận lần đầu tiên tại Nha Trang, năm 1898 Theo số liệu tổng hợp của Cục thú y [5], tình hình dịch bệnh LMLM trong những năm gần đây diễn ra với số ổ dịch và số lượng gia súc mắc bệnh ngày càng tăng

Có 7 týp virus gây bệnh LMLM: O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 và SAT3 với trên 70 subtype [25], [27] Các týp virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhưng không có miễn dịch chéo cho nhau [2], [16], [17] Cho đến trước năm 2004, virus gây bệnh LMLM ở Việt Nam chủ yếu thuộc týp O Từ năm 2004, virus LMLM týp A lần lượt được phát hiện ở các tỉnh phía Nam đến Quảng Bình

Các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học như kỹ thuật bổ thể kết hợp, trung hoà virus, miễn dịch huỳnh quang, ELISA thường được dùng để xác

định týp huyết thanh của virus Những phương pháp này khó phân biệt được các subtype của cùng 1 týp virus LMLM

Gần đây, đ] có hiện tượng bệnh LMLM vẫn xảy ra trong khu vực đ] được tiêm phòng vacxin, thí dụ Ninh Thuận - 1997, Bắc Kạn - 1999 Trong nghiên cứu định týp virus LMLM trước đây, virus týp O của Việt Nam đôi khi RT-PCR không cho vạch đặc hiệu đối với týp O [27] khi dùng cặp mồi đặc hiệu của phòng thí nghiệm tham chiếu Pirbright Như vậy, đặc tính di truyền của virus LMLM týp O của Việt Nam khác với đa số các subtype O được nhận biết bởi cặp mồi đặc hiệu của phòng thí nghiệm Pirbright Việc tìm ra cặp mồi

đặc hiệu cho chủng virus týp O của Việt Nam sẽ có ý nghĩa lớn trong công tác chẩn đoán định týp virus Việc xác định chính xác các subtype của virus LMLM có ý nghĩa lớn trong lựa chọn chủng vacxin phù hợp trong công tác phòng chống bệnh

Xuất phát từ những yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định týp O virus lở mồm long móng ở Việt Nam bằng phương pháp RT-PCR”, với mục tiêu:

Tìm được cặp mồi đặc hiệu dùng trong RT-PCR xác định týp O virus LMLM ở Việt Nam

2 Tổng quan tài liệu

và cơ sở khoa học của đề tài

2.1 Khái niệm bệnh lở mồm long móng

Bệnh LMLM là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan rất nhanh, rất mạnh, rất rộng của các loài động vật móng guốc chẵn, chẽ đôi như; trâu, bò, lợn, dê, cừu … Bệnh gây ra do một loại virus qua lọc hướng thượng bì, có đặc

điểm là sốt cao và hình thành những mụn nước ở niêm mạc miệng, chân và vú của gia súc cảm thụ [9], [21]

Bệnh LMLM ít gây chết trâu bò, ngoại trừ bê nghé Thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra chủ yếu do tỷ lệ mắc bệnh cao (có khi tới 100%) Bệnh có thể lây lan gây ra các ổ dịch rộng lớn trong phạm vi một nước hoặc khắp châu lục [7], [15] Bệnh xảy

ra rất nghiêm trọng đối với trâu, bò, lợn, dê, cừu, gây những thiệt hại trực tiếp do: gây sảy thai khoảng 25%, làm giảm 25% sản lượng thịt, 50% sản lượng sữa và 25% sản lượng lông cừu Tính tổng hợp lại, ở những nước có bệnh, lượng sản phẩm chăn nuôi hàng năm từ gia súc giảm tới 25% so với khi không có bệnh [1]

Do tính chất nguy hiểm nên bệnh LMLM được OIE xếp là một trong những bệnh đứng đầu bảng A (bảng các bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm ở động vật) và bắt buộc các nước thành viên phải khai báo Cần thiết kiểm soát chặt chẽ việc vận chuyển buôn bán động vật và các sản phẩm động vật, đặc biệt các động vật móng guốc chẵn, nhằm ngăn chặn lây lan bệnh bằng các biện pháp phù hợp với điều kiện kinh tế, x] hội của toàn quốc gia [5] 2.2 Tình hình bệnh và nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng trên thế giới

2.2.1 Căn bệnh

Virus LMLM (Foot and Mouth Disease Virus - FMDV), là một loại Aphthovirus, thuộc họ Picornaviridae (Pico-nhỏ, rna-axit ribonucleic)

Các biểu hiện của bệnh đ] xuất hiện ở châu Âu từ thế kỷ XVII- XVIII nhưng m]i tới năm 1897, hai nhà khoa học Đức: Loeffler và Frosch, mới chứng minh được tính qua lọc của nhân tố gây bệnh [dẫn theo [10]]

Virus LMLM có 7 týp là O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 Hai týp O

và A do Vallee và Caree (Pháp) phân lập năm 1924, týp O được tìm thấy ở vùng Oise, týp A (Allemagne), và týp C do Waldmann và Trautwein phát hiện năm 1926 ở Đức Ba týp O, A, C có phổ biến trên thế giới; týp Asia1 do Brooksby và Rogere (1957) tìm thấy ở Pakistan, phổ biến ở một số nước thuộc châu á; týp SAT1, SAT2, SAT3 tìm thấy ở Nam Phi, phân bố chủ yếu ở châu Phi đến Rhodesia [dẫn theo [14], [23]]

Từ bảy týp virus LMLM cơ bản nêu trên, người ta đ] thừa nhận có hơn 70 subtype khác nhau: týp A có A1; A2; A3 ; týp O có O1; O2; O3 ; týp C có C1;

C2; C3 [24], [25]

* Sức đề kháng của virus

Virus LMLM không có vỏ bọc bên ngoài (đối với các virus khác, vỏ bọc bên ngoài thường là lipit) nên chúng có sức đề kháng cao với các dung môi hữu cơ như cồn, ê-te v.v Tuy nhiên, virus mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, axit, formol v.v [dẫn theo Nguyễn Tiến Dũng [9]] Virus có thể tồn tại ở pH

từ 6.7-9.5, nhưng bền vững nhất ở pH 7.2-7.6, virus bị vô hoạt rất nhanh ở pH<5 và pH>11 [8]

Với sức nóng, virus LMLM dễ bị tiêu diệt, ở 30-37oC virus sống được 4-9 ngày, ở 500C virus nhanh chóng bị bất hoạt, ở 70oC virus chết sau 5-10 phút Nhìn chung, virus mẫn cảm với nhiệt độ nhưng không nhạy cảm với độ lạnh [14] Virus vẫn còn hoạt lực đối với Crezol 3% sau 6 giờ Với Chloroform 1% sau 20 ngày virus vẫn còn độc lực Những chất sát trùng mạnh như NaOH 1% diệt virus trong 5-10 phút, formol 2% diệt virus trong 6 giờ [24]

* Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus

Virus LMLM là một loại ARN virus, giống Aphthovirus, thuộc họ Picornaviridae [2], [3], [11], [12] có kích thước từ 20nm – 30nm, hình đa diện

có 30 mặt đều, qua được các máy lọc Berkefeld, Chamberland và qua màng lọc Seitz [24] Hạt virus chứa 30% axit nucleic, đó là một đoạn ARN chuỗi

đơn Vỏ capsid có 60 đơn vị capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4), trong đó có VP1 đóng vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh và là kháng nguyên chính tạo ra kháng thể chống lại bệnh LMLM [dẫn theo [9]] Sợi đơn ARN của virus LMLM có chiều dài khoảng 8 kilobase, trọng lượng phân tử khoảng 8.6 kilodaltons, virion của virus có hằng số sa lắng 140S và phân tách thành các tiểu phần protein 12S [37]

Dưới kính hiển vi điện tử thấy virion của virus LMLM có dạng hình tròn,

bề mặt nhẵn Virus LMLM được phân biệt với các virus khác thuộc họ picorna bởi nó không có bề mặt xù xì, hang hốc Một đặc điểm khác của virion là sự hình thành các r]nh xung quanh một trục đối xứng cho phép tập trung các phân tử nhỏ (như CsCl) lên bề mặt vỏ capsid Kết quả là virus LMLM có mật

độ các hạt nhỏ bám lên bề mặt cao nhất trong số các picornavirus [30]

* Đặc điểm huyết thanh học

Các týp virus LMLM được phân biệt bằng các phản ứng huyết thanh học [39] Các týp virus khác nhau gây bệnh trên động vật với triệu chứng, bệnh tích giống nhau, nhưng lại không tạo miễn dịch chéo cho nhau [14], [16] Miễn dịch chéo chỉ xảy ra ở một số subtype của cùng một týp [3]

* Độc lực của virus

Độc lực là khả năng gây bệnh lâm sàng hay mức độ gây bệnh của virus Mọi chủng virus LMLM đều được coi là cường độc, mà không có chủng nhược độc

Về mặt lâm sàng, gia súc nhiễm virus LMLM có thể biểu hiện dưới nhiều mức

độ khác nhau, từ bệnh rất nghiêm trọng đến dạng lâm sàng thể ẩn [dẫn theo [9]]

* Tính gây bệnh

Virus LMLM gây bệnh tự nhiên ở hầu hết các loài guốc chẵn (trâu, bò, lợn,

dê, cừu ); mặc dù mức độ mẫn cảm với virus là ngang nhau nhưng mức độ phát bệnh lâm sàng khác nhau; bệnh thường biểu hiện rõ nhất và nặng hơn ở trâu, bò; sau đó đến lợn và sau cùng là dê, cừu Người cũng có thể mắc bệnh LMLM nhưng không có ý nghĩa quan trọng về mặt lâm sàng cũng như bệnh lý Gia súc non thường có biểu hiện lâm sàng nặng hơn và có tỷ lệ tử vong cao hơn gia súc trưởng thành Gia súc cao sản bị bệnh nặng hơn giống địa phương [21]

Động vật một móng như ngựa, lừa, la, gia cầm, chim không mắc bệnh nhưng có thể gây bệnh cho vịt được Trong vùng dịch LMLM ở trâu bò, người

ta có thể thấy nhím, chuột, hươu, nai, ho]ng bị chết nhiều Trong phòng thí nghiệm: chuột lang, chuột nhắt trắng, chuột đồng, chuột Hamster dễ cảm nhiễm Bê mới đẻ chưa bú sữa mẹ nếu được tiêm virus LMLM có thể chết sau 36-48 giờ [24]

* Đặc tính nuôi cấy

Virus LMLM có tính hướng thượng bì, do vậy thường cấy virus LMLM trên da thai lợn, da thai bò sống (giữ sống bằng phương pháp nhân tạo) Nếu nuôi cấy virus LMLM trên động vật thí nghiệm như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trưởng thành thì virus hay bị biến đổi và thường bị mất đặc tính gây bệnh Phương pháp nuôi cấy tốt nhất là nuôi cấy virus LMLM trên tổ chức thượng bì của lưỡi bò trưởng thành, sau nhiều lần cấy chuyển virus vẫn giữ được độc lực

đối với bò và động vật thí nghiệm [24]

Virus LMLM phát triển tốt trên các tế bào nhạy cảm với nó như: tế bào thận lợn, tế bào thận bê, cừu sơ cấp, tế bào tuyến giáp trạng bò sơ cấp; các tế bào dòng như tế bào thận chuột Hamster sơ sinh (BHK-21) và IB-RS-2 [dẫn theo [25]]

Tế bào BHK-21 rất mẫn cảm với virus LMLM, tế bào nhiễm virus có các bệnh tích điển hình [dẫn theo [9]]

Virus có trong máu của gia súc mắc bệnh vào giờ thứ 18 sau khi nhiễm bệnh và tồn tại trong khoảng 3-5 ngày Máu có độc lực ở giai đoạn hình thành mụn nước [dẫn theo [18]]

Sau khi vào máu, virus được đưa đến các vị trí thứ cấp gồm các cơ quan tuyến, hạch lympho khác và biểu mô quanh mồm, chân, nơi phát sinh các mụn nước Mụn nước cũng có thể phát sinh ở vú con cái

Da nguyên lành không để virus đi qua, nếu có vết sước thì có thể bị nhiễm virus Những sây sát hoặc vết thương ở da, nhất là ở vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ thể Virus có thể qua đường sinh dục, qua các niêm mạc khác, qua da của vành móng [14]

ở những con non và một số con trưởng thành bị kế phát sang viêm nội tâm mạc hoại tử điểm, dẫn đến suy tim và chết [7]

* Dịch tễ học bệnh LMLM

+ Loài mắc bệnh:

Trong tự nhiên: trâu, bò, lợn, dê, cừu, voi, lạc đà, hươu, nai, hoẵng, nhím

đều mắc bệnh Tuy nhiên, trâu bò mắc nặng hơn cả Ngựa và các loài chim không bị lây nhiễm

Trong phòng thí nghiệm người ta thường gây bệnh cho bê, chuột lang [dẫn theo [17]]

+ Lứa tuổi: Động vật ở các lứa tuổi đều có thể bị bệnh, súc vật non bị bệnh nặng hơn súc vật trưởng thành [dẫn theo [12]]

+ Mùa vụ:

Bệnh lây lan quanh năm, nhưng thường xảy ra vào những tháng mưa phùn,

ẩm ướt, ánh sáng dịu của mùa xuân và đầu mùa hè (từ tháng 2 đến tháng 4 dương lịch) [dẫn theo [17], [18]]

+ Khả năng lây lan:

Bệnh LMLM là một trong những bệnh lây lan mạnh nhất [11]

Bệnh lây lan rất nhanh, rất rộng trong một thời gian ngắn [dẫn theo [17]

Sự lây lan rất đặc biệt và rất nhanh chóng, trong vài ngày có thể cả 1 châu lục bị lây bệnh (vụ dịch ở châu Âu năm 1958) [dẫn theo [9]]

+ Tỷ lệ ốm và chết:

Những ổ dịch mới mắc lần đầu tỷ lệ mắc rất cao, tới 100%, sau thành dịch

địa phương, mắc đi mắc lại, tỷ lệ mắc giảm xuống

Bệnh không làm chết nhiều gia súc (tỷ lệ chết ở con trưởng thành chỉ 2%,

ở con non khoảng 20%) Lợn mắc bệnh thể cấp tính, có thể chết tới 20-50%, lợn con có thể chết 100% [dẫn theo [5]]

Theo Geering W.A (1990) [11], khi bị bệnh LMLM, bò trưởng thành có

tỷ lệ chết dưới 5%, bê con có tỷ lệ chết cao hơn và trong một số trường hợp chết tới 50%

+ Đường truyền lây:

Gia súc bị bệnh có thể bài thải virus nhiều ngày trước khi xuất hiện mụn nước Virus được bài xuất theo hơi thở, mọi chất dịch tiết và từ mụn nước bị vỡ [11] Bệnh có thể truyền trực tiếp do tiếp xúc giữa súc vật bệnh và súc vật khoẻ, khi nhốt chung chuồng, chăn cùng b]i, súc vật khoẻ ăn phải chất bài xuất của súc vật bị nhiễm bệnh hoặc truyền gián tiếp qua dụng cụ chăn nuôi, thức ăn, người chăn nuôi, những động vật không mẫn cảm (chó, mèo v.v ) có dính virus [dẫn theo [17]]

Việc truyền bệnh LMLM chủ yếu thông qua không khí trong một khu vực Tuy nhiên, trên thực tế, việc lây lan bệnh lại liên quan trực tiếp đến việc

di chuyển gia súc Tại Việt Nam cũng như nhiều nước khác, bệnh lây lan chủ yếu do việc vận chuyển và buôn bán gia súc, nhất là buôn bán bất hợp pháp [dẫn theo [9]]

Việc vận chuyển gia súc là cơ chế truyền bệnh LMLM thông thường nhất Bệnh cũng có thể truyền qua người chăn nuôi, qua các phương tiện giao thông Dưới các điều kiện nhất định, virus có thể được gió làm lan truyền rất xa (khoảng 60 km trên mặt đất và 300 km qua đường biển) Các điều kiện thuận lợi cho đường truyền virus qua không khí gồm có [8]:

- Lợn nhiễm bệnh là nguồn truyền virus qua không khí

Triệu chứng đặc trưng của bệnh LMLM là: “lở mồm” và “long móng”

đúng như tên gọi của bệnh Thời gian ủ bệnh nói chung từ 2 đến 3 ngày ở trâu,

bò ở lợn, thời gian ủ bệnh dài hơn Các triệu chứng chính của bệnh bao gồm: Tăng thân nhiệt: sốt thành hai đợt; đợt một do virus LMLM, đợt hai do nhiễm trùng thứ cấp

Đi khập khiễng do xuất hiện các mụn nước và vết lở loét ở xung quanh gờ vành móng, khe ngón và đế guốc Nếu nặng thì què do long móng

Xuất hiện các mụn nước sau đó vỡ loét ra ở xoang miệng, lưỡi, lợi v.v và

Bệnh tiến triển ở các thể khác nhau, có thể gặp hiện tượng nghiến răng, bồn chồn, đi lại bất thường, cào và g]i chân, viêm vú, giảm sản lượng sữa, gầy sút, thai chết và sảy thai

Các biến chứng do nhiễm trùng kế phát có thể gặp làm cho bệnh trầm trọng hơn: loét sâu niêm mạc lưỡi, long móng hoặc để lại di chứng móng biến dạng Bê nghé non có thể chết ngay trong khi chưa xuất hiện các triệu chứng

điển hình do bị viêm cơ tim

* Triệu chứng bệnh lở mồm long móng ở dê, cừu

Triệu chứng bệnh LMLM ở dê và cừu là không điển hình, tổn thương nhẹ thường chỉ thấy các vết loét ở vùng lợi Những tổn thương ở chân không rõ ràng Mất sữa là triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh LMLM ở cừu và dê cho sữa Dê và cừu non cũng dễ bị chết khi bị nhiễm virus

* Triệu chứng bệnh lở mồm long móng ở lợn

Tổn thương ở miệng của lợn nhẹ hơn của trâu bò Biểu hiện rõ nhất ở lợn

là đi lại khập khiễng do tổn thương nghiêm trọng ở các chi, đặc biệt là lợn nuôi trên nền chuồng bê tông Bệnh gây chết với tỷ lệ cao ở lợn con

2.2.2.2 Bệnh tích

* Bệnh tích đại thể

Bệnh tích chủ yếu của bệnh LMLM là các mụn nước, vết loét, sẹo ở xoang miệng, gờ vành móng, kẽ ngón, da vú v.v và hiện tượng lở mồm, long móng [dẫn theo [9]] Khi mổ động vật, ta có thể gặp các bệnh tích sau:

Mặt ngoài của tim có các vết xuất huyết thành vệt như da hổ, gọi là "tim hổ" [dẫn theo [9]] Nếu con vật sống sót thì thấy tim bị gi]n to và mềm nhũn Trên vết cắt cơ tim xuất hiện vết sọc với những nốt vàng rải rác nổi rõ trên phần cơ tim bình thường [5]

Ngoài biến đổi ở tim, con vật còn có những biến đổi sau [dẫn theo [17]]: viêm khí quản và viêm phổi; lách sưng to và đốm sẫm; có mụn nước kèm theo tụ huyết, xuất huyết ở niêm mạc đường tiêu hoá như lợi, mép chân răng, thực quản, dạ múi khế, ruột non v.v

H]n hữu có những trường hợp xuất hiện mụn nước ở vùng da đáy chậu, vùng da bên ngoài bộ phận sinh dục con đực cũng như con cái và ở mí mắt của chúng [36]

* Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể có thể quan sát thấy ở bề mặt biểu mô, cơ tim và cơ bắp

Đặc biệt là ở cơ tim của động vật non có thể bị hoại tử kéo dài, kèm theo sự xâm nhiễm mạnh của các tế bào lympho Đây là nguyên nhân phổ biến dẫn

đến tử vong ở gia súc non [36]

Bệnh tích ở lớp thượng bì: Tổn thương ở các tế bào biểu bì, thoái hóa ở các

tế bào ở giữa lớp biểu bì Bên trong tế bào bị thoái hóa, nguyên sinh chất bắt màu Eosin, nhân tế bào co lại và thẫm màu Dịch thủy thũng có thể có sợi fibrin Lớp tế bào bì có sự thâm nhiễm bạch cầu đa nhân trung tính Có hiện tượng hoại tử tan và thấm nước phù

Bệnh tích ở cơ vân: hoại tử các sợi cơ tạo thành những nốt kết hợp với sự thâm nhiễm các tế bào viêm

2.2.3 Tình hình bệnh lở mồm long móng trên thế giới

Bệnh LMLM đ] xảy ra ở hầu hết các nước trên thế giới, tại những nơi có chăn nuôi trâu bò Nhiều nước đ] thanh toán bệnh LMLM thành công nhưng bệnh này vẫn là nguy cơ đối với đàn động vật ngay cả ở các nước phát triển và tất nhiên nặng nề ở các nước đang phát triển [3] Những mô tả đầu tiên về một

ổ dịch giống như dịch bệnh LMLM được Heironymus Fractorius, một tu sĩ người Italia đưa ra vào năm 1514 [37]

á, Âu , Phi, Mỹ [dẫn theo[3]]

Từ khi ngừng việc dùng vacxin ở các nước thuộc Liên hiệp châu Âu (EU) vào năm 1991, dịch LMLM lại xảy ra ở Italia (1993), Hy Lạp (1994, 1996), Bungari (1991, 1993, 1996), Nga (1995), Anbani và Cộng hoà Macedonia (Liên bang Nam Tư cũ) và Cộng hoà Nam Tư cũ (Kosovo) (1996) Bởi vì phần l]nh thổ phía Bắc của Bosphorus (thuộc Thổ Nhĩ Kỳ) là một phần của châu

Âu, nên có thể nói rằng châu Âu chưa bao giờ hoàn toàn không có bệnh LMLM [dẫn theo[13]]

Gần đây, vào năm 2001, một đợt dịch khác đ] khởi phát từ Anh với

2030 trang trại nhiễm bệnh, sau đó bệnh lan sang Pháp, Hà Lan, Ireland mặc

dù số lượng ổ dịch đ] được giới hạn ở các nước này [30]

* Châu Mỹ

Bệnh xuất hiện lần cuối cùng ở Canada vào năm 1952, Mexico năm

1954 Tại nước Mỹ đ] xảy ra 9 vụ dịch từ 1870 đến 1929 Nước này đ] công

bố hoàn toàn hết dịch vào năm 1929 Một số nước thuộc Trung Mỹ, Newzealand, Panama được xem là chưa từng có dịch bệnh LMLM [37]

Argentina xảy ra 3 ổ dịch từ năm 2000 đến 2001, do týp O và týp A gây

ra Đến tháng 4 năm 2001, virus týp A ở Argentina lan sang Uruguay, sau đó dịch LMLM cũng xuất hiện ở Brazil và một số nước Nam Mỹ khác [19]

* Châu á

Theo OIE, từ năm 1995 đến nay, bệnh LMLM đ] được thông báo tại

Đài Loan (1997), Trung Quốc (1999) Năm 2000, dịch lây lan đến các nước

Đông Bắc á (Nhật Bản và Hàn Quốc) Năm 2004, các nước thuộc khu vực

Đông á là Mông Cổ và Trung Quốc báo cáo có dịch Từ đầu năm 2005, đ] xuất hiện týp virus Asia1 tại Trung Quốc, sau đó là Myanmar, đ] làm cho diễn biến dịch LMLM trong khu vực đ] phức tạp lại càng phức tạp hơn Tình hình dịch LMLM tại khu vực Đông Nam á diễn ra theo chiều hướng gia tăng và phức tạp hơn Các nước có dịch là Thái Lan, Myanmar, Lào, Campuchia, Malaysia, Philippin và Việt Nam [29]

Chủng virus týp O-PanAsia tiếp tục lây lan ở châu á và các châu lục khác trên thế giới Virus týp O xuất hiện nhiều nhất ở khu vực Đông Nam á:

Malaysia, Lào, Việt Nam, Philippin, Hồng Kông, Myanmar và Thái Lan; Thổ Nhĩ Kỳ báo cáo có các ổ dịch týp O, A và Asia1 ổ dịch do virus týp Asia1 cũng được báo cáo ở Iran, Afganistan, Georgia và Azerbaizan; những ổ dịch

do virus týp O gây ra được báo cáo ở một loạt các nước như Mông Cổ, Kuwait, Bahrain, Yemen, ả Rập Xê-út, Quatar, các tiểu vương quốc ả Rập thống nhất, Oman, Karakhstan, Kyrgyzstan, Abkharia, Irắc, Butan và Nêpan [19]

* Châu Phi

Tình trạng bệnh LMLM ở các nước châu Phi là không rõ ràng do không tiến hành điều tra hoặc điều tra rất ít Hầu hết các quốc gia ở Tây, Trung và

Đông Phi có khả năng xuất hiện dịch [19]

Năm 1989, virus LMLM serotype O đ] thâm nhập vào Tuynidi do cừu và dê mắc bệnh nhập khẩu từ vùng Trung Đông; sau đó, bệnh lây sang bò và được nhận biết ngay lập tức; tuy nhiên, lúc này bệnh đ] có thời gian lây lan và trước khi các biện pháp phòng chống được triển khai, bệnh đ] lan tỏa qua Angiêri và sau đó là Marốc Virus LMLM serotype O đang lưu hành ở Ai Cập, Libi và liên tục có sự xâm nhập của virus, có lẽ là từ Libi vào Tuynidi vào những năm 90 ở

hầu hết vùng hạ Sahara của châu Phi, phía Nam Tandania, Malauy, Zaia và Angola đều có dịch LMLM Không có bệnh ở Mađagatca và động vật nuôi phổ biến ở Zimbabuê, Bốtxoana, Namibia và cộng hoà Nam Phi nhưng bệnh lại xảy

ra chủ yếu ở trâu châu Phi của các nước này, tập trung chủ yếu ở các vườn thú Các ổ dịch LMLM do virus thuộc serotype SAT2 tái xuất hiện ở Zimbabuê trong những năm 1980, thường được coi là lây lan từ trâu ổ dịch cuối cùng trong số các ổ dịch này là vào năm 1991, ổ dịch cuối cùng ở Bôtxoana là vào năm 1980

ở Namibia có một ổ dịch do virus LMLM thuộc serotype SAT3 vào năm 1994

và ở cộng hoà Nam Phi, ổ dịch cuối cùng được thông báo là do serotype SAT2, ở loài linh dương tại vườn thú quốc gia Kruger vào năm 1993 [13]

Tây Bắc Phi có thể thỉnh thoảng xuất hiện dịch nhưng không có báo cáo từ năm 1999 Virus týp O gây nên dịch địa phương ở Ai Cập và có thể ở cả Libi Trong năm 2001, Uganda báo cáo có hàng loạt ca bệnh do virus týp O gây nên trên bò ở một đồng cỏ lớn gần với vùng Kiboga Malauy báo cáo có một ổ dịch do virus týp SAT1 gây ra trong cùng một vùng với những ổ dịch đ] xuất hiện vào tháng 4- 5/2000 Trong tháng 1/2001, tại Swaziland xuất hiện một ổ dịch do virus týp SAT1 gây ra trên bò ở miền Bắc vùng Hhohho theo dọc biên giới với Nam Phi, trong một vùng an toàn dịch LMLM từ lâu của Swaziland Trong tháng 2/2001, xuất hiện một ổ dịch do virus týp SAT2 gây ra trên bò ở một quận của tỉnh Mhana-phía Bắc của Nam Phi Zimbabwe thống kê có 18 ổ dịch do virus týp SAT2 gây ra từ 17/8 đến 22/10/2001 tại các tỉnh Metabeland

và Masvingo [19]

2.2.4 Phân bố týp virus lở mồm long móng và địa dư bệnh

Hàng năm, các nước trên thế giới báo cáo tình hình dịch bệnh LMLM cho

tổ chức OIE/FAO và việc định týp virus LMLM thường do phòng thí nghiệm tham chiếu về bệnh LMLM (World Reference Laboratory Foot and Mouth Disease, FMD-WRL) đảm nhận

Dịch LMLM và các chủng virus gây bệnh đ] được xác định trong năm

2005 được minh hoạ ở hình 2.1 Thông báo về các týp theo địa danh ở Đông Nam á và châu Mỹ được ghi nhận ở bảng 2.1 và 2.2

Hình 2.1 Bản đồ phân bố bệnh LMLM trên thế giới năm 2005

Trong năm 2005, FMD-WRL đ] phân tích 366 mẫu bệnh phẩm LMLM từ

21 quốc gia khác nhau thuộc châu Âu, châu á và châu Phi Các týp đ] gây dịch LMLM năm 2005 gồm O, A, C, SAT1, SAT2 và Asia1, trong đó trên 60% các trường hợp dương tính là týp O

Bảng 2.1 Týp virus LMLM năm 2005 tại khu vực Đông Nam á

Cam- Pu- Chia Chưa xác định Penisnsular O, A

Trong thời gian gần đây, diễn biến dịch bệnh LMLM đ] có những thay

đổi Sự bùng phát dịch đồng thời tại nhiều quốc gia nhưng do những týp khác nhau: týp O tại Brazil, týp A tại Colombia, týp Asia1 ở Trung Quốc, Mông Cổ

và Nga, týp SAT2 tại Boswana, týp SAT1, 2, 3 và týp A tại Công-gô

Týp Asia1 đ] không chỉ khu trú ở khu vực ấn Độ, Iran, Pakistan, mà đ] lan rộng đến một loạt các quốc gia: Trung Quốc, Hồng Kông, Mông Cổ, Myanmar, Nga, Tajiskisan Người ta đ] xác định có 5 biến chủng của Asia1 lưu hành trong năm 2005 tại những quốc gia này

Nhìn chung, sự phân bố của các týp virus LMLM thường có tính đặc trưng vùng l]nh thổ: virus LMLM týp O, A, C có mặt trên khắp thế giới; týp Asia1

có nguồn gốc ở châu á, sau một thời gian dài chỉ có mặt lục địa này, gần đây lan sang châu Âu và châu Mỹ Các týp SAT1, SAT2, SAT3 chỉ có ở châu Phi, hiếm khi thoát ra ngoài (ngoại trừ trường hợp dịch do SAT1 ở Trung Đông năm 1962)

Diễn biến của týp O cũng trở nên rất phức tạp trong những năm gần đây: (1) Týp O có mặt ở nhiều quốc gia ở khắp 4 châu lục: châu Phi (Sudan, Mali và Togo), châu á (Iran, Pakistan, Arab Saudi, Nepan, Bhutan, Philippin, Việt Nam, Myanma và Thái Lan), Nam Mỹ (Mato Grosso do Sul, Brazil, Southern Cone,

Ecuador và Venezuela); (2) týp O đ] sớm tái phát ở Southern Cone và xảy ra ở những vùng đ] được tiêm phòng thuộc Mato Grosso do Sul và Brazil và (3) dịch xảy ra do nhiều topotype O theo vùng địa lý

2.2.5 Vacxin phòng bệnh lở mồm long móng

Đối với bệnh LMLM, người ta chỉ sử dụng vacxin vô hoạt Ngay từ những năm 1920 người ta đ] bắt đầu thử nghiệm, nghiên cứu chế virus vô hoạt Vacxin virus vô hoạt với các thành phần khác nhau hiện có bán nhiều trên thị trường Một cách tổng quát, dùng virus gây nhiễm tế bào nuôi và sau đó là làm sạch, vô hoạt bằng ethylenimine và bổ sung tá chất Nhiều vacxin LMLM là dạng vacxin đa giá để có thể kích thích sinh đáp ứng miễn dịch chống lại nhiều serotype mà con vật có thể nhiễm phải trong một môi trường cụ thể nào đó [26]

Năm 1926, các nhà khoa học Pháp đ] thử nghiệm xử lý virus gây bệnh LMLM bằng formaldehyd và chế tạo vacxin formol

Nhà nghiên cứu người Nga tên là Rimsovski đ] kết hợp phương pháp hấp phụ virus bằng hydroxit nhôm và vô hoạt virus bằng formaldehyd và nhiệt để chế tạo vacxin

Các tác giả người Đức- Villems, Rioves và Pile đ] nghiên cứu khả năng bảo quản của vacxin vô hoạt Vacxin có tác dụng trong vòng 2 năm nếu bảo quản ở 4-70 C

ở Liên Xô, các tác giả Ratner và Gribanov đ] chế thành công vacxin có tên VIEV phù hợp với điều kiện khí hậu khác nhau

Năm 1934, Schmidt và Hansen đ] tiến hành các thử nghiệm dùng chất bổ trợ với virus LMLM đ] được vô hoạt để làm tăng khả năng gây miễn dịch Năm 1938 Waldmann và Kobe đ] thông báo sử dụng thành công vacxin này trên thực địa Vacxin này được gọi là vacxin Schmidt- Waldmann và nó

được sử dụng rất thành công ở nhiều nước châu âu và châu Mỹ la tinh

Một phương pháp sản xuất vacxin khác có tên là vacxin Rosenbusch (Rosenbusch, 1948) đ] được nghiên cứu và áp dụng ở Achentina

Frenkel và cộng tác viên (1947-1951), đ] đưa ra phương pháp nuôi cấy virus gây bệnh LMLM trên tế bào Hiện nay, phương pháp này đ] được hoàn thiện, dùng trong các nhà máy sản xuất vacxin LMLM

Một số vacxin virus vô hoạt khác dùng virus chế từ nuôi cấy tế bào thận

bò sơ cấp trong bình Roux và sau này bằng các chai dung tích lớn (Ubertini, 1963) Tuy nhiên, sản lượng tế bào bị hạn chế do khó khăn trong việc bào chế thận dẫn đến đậm độ tế bào thấp

Năm 1962, tế bào thận chuột Hamster sơ sinh (Baby Hamster Kidney: BHK - 21) được dùng để nhân virus LMLM [34], cho sản lượng cao và đặc tính kháng nguyên ổn định [55] Với sự tiến bộ của khoa học, phương pháp nuôi tế bào treo với dòng BHK-22 đ] cải thiện đáng kể sản lượng tế bào nuôi

và virus dùng trong sản xuất vacxin Vacxin chế từ tế bào BHK cũng có hiệu lực tương tự như các vacxin vô hoạt khác

Brown, Hyslop, Crick và Morrow (1963) đ] công bố vacxin chế bằng phương pháp vô hoạt virus bằng Acetylethyleneimine có hiệu lực tương tự như các vacxin formalin Khi thêm chất bổ trợ dầu, các vacxin có hiệu lực hơn các vacxin formalin bởi vì độ dài miễn dịch ở bò và lợn dài hơn [26]

2.3 Tình hình bệnh và nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng ở Việt Nam

2.3.1 Tình hình bệnh lở mồm long móng ở Việt Nam

ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận lần đầu tiên tại Nha Trang (1898) [10] Trước đây, bệnh thường thấy ở các tỉnh miền Trung và miền Nam, giáp biên giới Campuchia và Lào ở miền Bắc, bệnh được ghi nhận trong thời gian dài

từ những năm 1921-1963 Bệnh không xảy ra ở khu vực các tỉnh phía Bắc từ

1963-1992 Năm 1993, dịch bệnh xuất hiện ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên- Huế Năm 1995, bệnh xảy ra ở 107 huyện thuộc 26 tỉnh làm nhiều trâu, bò, lợn bị chết Diễn biến bệnh LMLM ngày càng trở nên phức tạp, hàng năm bệnh xảy ra ở diện rộng với số lượng lớn gia súc mắc bệnh [5]

Theo số liệu của Cục thú y [6]: năm 1999, trong khi vẫn chưa chấm dứt các đợt dịch từ các tỉnh miền Trung và miền Nam thì ở miền Bắc, đợt dịch mới

từ Trung Quốc tràn sang tấn công hàng loạt các tỉnh giáp biên Cao Bằng là

điểm đầu tiên, từ đó dịch lan sang các tỉnh khác Đến 10/3/2000 đ] có 58 tỉnh

bị dịch, 297.808 trâu, bò và 36.530 lợn mắc bệnh

Năm 2001, bệnh xảy ra ở 16 tỉnh, thành với 3.976 trâu bò mắc bệnh Năm 2002, bệnh xảy ra ở 26 tỉnh, thành, gây bệnh cho 10.287 trâu, bò Năm 2003, 38 tỉnh, thành có dịch, trong đó, 28 tỉnh có dịch ở trâu, bò và

28 tỉnh có dịch ở lợn, với tổng số 20.303 trâu, bò; 1.178 dê và 3.533 lợn mắc bệnh, chủ yếu ở các tỉnh: Quảng Trị, Phú Yên, Đăklăk, Khánh Hòa, Gia Lai,

Hà Giang

Theo Tô Long Thành và cộng sự [29] thì tình hình dịch bệnh LMLM trong mấy năm gần đây diễn biến hết sức phức tạp và có chiều hướng gia tăng: Năm 2004: Số tỉnh có dịch LMLM là 24 tỉnh, trong đó có 9 tỉnh do virus LMLM serotype A (phát hiện lần đầu tiên tại Ninh Thuận và Bình Định vào tháng 8/2004), 12 tỉnh do virus LMLM serotype O và 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A Nguyên nhân của việc xuất hiện virus LMLM týp A

có thể là do việc nhập lậu bò từ Campuchia

Từ đầu năm 2006 đến nay, số tỉnh có dịch LMLM là 27, trong đó 26 tỉnh

là týp O và Hà Giang là týp Asia1 (phát hiện tháng 5 năm 2006 bằng kit 3ABC và giám định) với tổng số 9.271 trâu bò và 12.461 lợn bị bệnh

2.3.2 Những nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng ở Việt Nam

* Căn bệnh

Các kết quả ghi nhận cho đến năm 1999 cho thấy có 3 týp virus gây bệnh LMLM ở Việt Nam là O, A, và Asia1 Trong đợt dịch lớn năm 1999-2000, kết quả chẩn đoán các ổ dịch đều là virus týp O có quan hệ cấu trúc gene rất gần với virus týp O gây bệnh ở Hồng Kông năm 1997 Việc biến mất týp A và Asia1 trong giai đoạn này chưa được khẳng định một cách đầy đủ để xác định rằng hai chủng này không tồn tại ở Việt Nam trong giai đoạn đó Năm 2005, týp A lại xuất hiện ở Ninh Thuận và sau đó phát hiện được ở một số tỉnh khác

ở phía Nam như Bình Định, Bình Thuận, Long An Năm 2005, virus Asia1 xuất hiện lần đầu tiên ở Khánh Hoà và sau đó là Lào Cai Tháng 5 năm 2006, virus Asia1 được phát hiện ở Hà Giang [29]

Virus LMLM týp C chưa từng được phát hiện ở Việt Nam Týp O virus LMLM ở Việt Nam gồm 2 topotype: Topotype O Cathay gây bệnh ở lợn Topotype PanAsia, gây bệnh ở trâu bò và lợn [5]

* Chẩn đoán

Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán lâm sàng bệnh LMLM có thể thực hiện trong trường hợp bệnh xảy ra tại khu vực đ] được xác định là có dịch LMLM Triệu chứng chính của bệnh là sự xuất hiện các mụn nước trong xoang miệng, quanh mũi, vành tiếp giáp

da móng chân, kẽ chân và các đầu vú Kèm theo các triệu chứng trên là hiện tượng con vật bị què do bị đau chân, gây ra khó khăn trong khi di chuyển [9]

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Trước đây, người ta sử dụng phương pháp kết hợp bổ thể dùng huyết thanh

có cả 7 serotype để khẳng định là LMLM Sau đó sử dụng phương pháp trung hoà để xác định các subtype Hiện nay người ta có thể sử dụng các phương pháp khác như ELISA để xét nghiệm [9]

Kit 3ABC ELISA cũng đ] được dùng để phân biệt kháng thể của gia súc nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể của gia súc được tiêm vacxin Một phương pháp khác là dùng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR và xác định trình tự axit nhân) để xác định subtype Do đó còn có thể xác định nguồn gốc của virus tại mỗi ổ dịch [4]

2.4 Một số kỹ thuật chẩn đoán virus lở mồm long móng Chẩn đoán huyết thanh học

Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học như phương pháp bổ thể kết hợp, huỳnh quang, ELISA, trung hoà virus v.v có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán nhanh và xác định týp huyết thanh của virus Những phương pháp này hạn chế trong việc xác định phân týp virus

Chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985 [dẫn theo [48]] Kỹ thuật này tiếp tục được hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công các máy chu kỳ nhiệt cho phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng [22] Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một

đoạn gene đặc hiệu Trong PCR thông thường, sau 20-30 vòng, có tới hàng triệu phân tử được copy từ một phân tử DNA (1 đoạn gene), có thể quan sát

được trên gel sau khi điện di và nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide

Chính vì vậy mà kỹ thuật PCR được xem như một trong những phương

pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại [22]

Đối với virus LMLM, trước khi tiến hành PCR thông thường, ARN của virus cần được chuyển thành cDNA nhờ enzym Reverse Transcriptase Phương pháp PCR như vậy thường được gọi là RT-PCR [45] RT-PCR được áp dụng rộng r]i trong chẩn đoán nhanh và định týp virus LMLM [46], [47], [49], [50], [51] Phương pháp PCR đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán phân biệt bệnh LMLM và bệnh mụn nước do virus ở lợn [41]

Nguyên lý của phản ứng PCR: dựa vào đặc điểm sao chép DNA: DNA Polymerase sử dụng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn mẫu để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung, bắt đầu từ đầu 3’OH của chuỗi oligo nucleotide (mồi hay primer) (hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT-PCR Mồi là những đoạn DNA ngắn (thường có độ dài từ 6-30 nucleotide), có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA sợi khuôn Sau đó enzyme

DNA-Polymerase sẽ có chức năng kéo dài mồi để tạo thành sợi DNA mới Tuy nhiên, để khuếch đại một trình tự DNA xác định thì ta phải có được thông tin về trình tự gene của nó đủ để tạo mồi chuyên biệt Mỗi cặp mồi gồm có một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer) Mồi càng dài khả năng tổng hợp mạch càng chính xác Mồi ngắn bắt cặp dễ nhưng kết quả kém chính xác Phải tránh có sự bổ sung giữa hai mỗi xuôi, ngược

Trong phản ứng PCR thì cả hai sợi DNA đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu như mồi được cung cấp cho cả hai sợi Các đoạn mồi

sẽ bắt cặp với hai đầu của đoạn DNA cần nhân lên sao cho sự tổng hợp sợi DNA mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi bổ sung với nó Như vậy, sau mỗi một chu kỳ của phản ứng thì số bản sao đoạn DNA cần nhân lên được tăng lên gấp đôi và điểm khởi đầu cho mồi bắt cặp lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR sau n chu kỳ được tính theo lý thuyết là 2nbản sao của phân tử DNA mạch kép

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ được lặp đi lặp lại, mỗi chu kỳ gồm ba bước sau:

Bước 1: Phân tử DNA được biến tính (Denaturation) ở 940C- 950C trong khoảng thời gian thường từ 30 giây đến 1 phút (thời gian cho bước này dài hay ngắn phụ thuộc vào cấu trúc và chiều dài đoạn DNA khuôn, máy chu kỳ nhiệt, ống tube sử dụng và thể tích cuối cùng của phản ứng) Trong quá trình biến tính, DNA sợi kép được duỗi xoắn thành 2 sợi DNA mạch đơn

Bước 2: Giai đoạn này là giai đoạn cho phép mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn hay còn gọi là giai đoạn lai (Hybridiration) Nhiệt độ để mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn thường từ 400C- 700C (nhiệt độ này tuỳ thuộc vào từng mồi khác nhau), và giai đoạn này kéo dài từ 30 giây tới 1 phút tuỳ thuộc vào những mồi và DNA sợi khuôn tương ứng

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp nên sợi DNA mới ở giai đoạn này nhiệt độ

được nâng lên 720C, đây là nhiệt độ thích hợp nhất cho DNA Polymerase hoạt

động để tổng hợp nên sợi DNA mới trên cơ sở mồi đ] được bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn Thời gian cho bước này kéo dài có thể từ 30 giây cho tới nhiều phút tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Cách tiến hành phản ứng PCR

PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tương đối dễ làm Vật liệu đầu tiên cho phản ứng PCR là DNA sợi khuôn có chứa đoạn gene cần nhân lên (lượng DNA sợi khuôn cho phản ứng PCR đòi hỏi không nhiều, khoảng 50-100ng DNA); cần có các đoạn mồi gắn (mồi xuôi và mồi ngược) đặc hiệu cho đoạn gene cần nhân lên; cần có DNA Polymerase; nguyên liệu cho quá trình tổng hợp sợi mới là các dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); ion Mg2+, một dung dịch đệm thích hợp cho phản ứng PCR Các thành phần trên được hỗn hợp với nhau theo những tỷ lệ nhất định về nồng độ, và thường thể tích cuối cùng cho một phản ứng PCR là 25àl hoặc 50àl

ứng dụng RT-PCR trong chẩn đoán và định týp virus LMLM

RT-PCR được ứng dụng rộng r]i trong định týp virus LMLM từ những năm đầu thập kỷ 90, dựa vào các cặp primer đặc hiệu týp [40] Để phát hiện virus LMLM trong bệnh phẩm (chưa cần biết thuộc týp nào), người ta dùng cặp primer cho phép nhân đoạn gene chung có mặt ở cả bảy týp virus LMLM [31] Việc xác định týp virus dựa vào mồi đặc hiệu, các mồi đặc hiệu này được thiết kế ở những đoạn DNA có trình tự chuỗi nucleotide chỉ có mặt ở týp cần xác định [32] Các nghiên cứu hoàn thiện phương pháp và nâng cao độ nhạy,

độ đặc hiệu nhằm phát hiện sự có mặt của virus ngay khi ở lượng rất nhỏ như phương pháp Nested PCR, phương pháp phối hợp ELISA-PCR [33] và real-time PCR [35]

Tại phòng thí nghiệm tham chiếu FMD-WRL, các mẫu bệnh phẩm

LMLM được phân tích nhanh bằng kỹ thuật RT- PCR và được lưu giữ cho những nghiên cứu sâu hơn sau này [53]

Ngoài ra, kỹ thuật PCR còn được ứng dụng rộng r]i trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học đến sản xuất và đời sống x] hội [22], bao gồm: Giúp tách nhanh và chính xác từng gene hoặc từng đoạn DNA riêng biệt

Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gene, xác định tính đa hình DNA, làm cơ sở cho việc phân tích các chỉ thị phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật ), phát hiện các kiểu đột biến

Giúp chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác các bệnh di truyền và nhiễm trùng (virus, vi khuẩn, nấm, ung thư )

Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm qua phát hiện các đoạn gene đặc trưng của nhiễm sắc thể giới tính vv

Phương pháp RT-PCR đ] được áp dụng vào định týp LMLM ở Việt Nam Trong số các cặp mồi đặc hiệu của phòng thí nghiệm tham chiếu virus LMLM Pirbright đ] dùng: P33/P38 (cho týp O), P33/P87 (týp A), P33/P40 (týp C) và P33/P74 (týp Asia1) [38], [57], cặp P33/P38 không nhân gene týp O phân lập tại Việt Nam [27]

2.5 Sự đa dạng sinh học của các týp virus lở mồm long móng và biến chủng

2.5.1 Bản chất RNA virus và những áp lực biến đổi

Bản chất hệ gene của virus LMLM là một sợi RNA đơn dương gồm khoảng trên 8000 bazơ Việc xác định trình tự chuỗi nucleotide của các chủng gây bệnh có ý nghĩa lớn trong phân loại, định týp và xác định quan hệ họ hàng, nguồn gốc của chủng gây bệnh

Tuy nhiên, trong thực tiễn, việc xác định trình tự chuỗi toàn bộ hệ gene

của một chủng phân lập là rất khó khăn, vì thế người ta đ] chọn đoạn D1 (160 nucleotide) của gene m] hóa cho protein cấu trúc VP1 (1 trong 4 protein capsid của virus LMLM: VP1, VP2, VP3, VP4) làm đại diện cho toàn bộ hệ gene (genome) [25]

Định týp và subtype các virus LMLM vì vậy được quy ước đơn giản dựa trên

sự sai khác giữa các chuỗi nucleotide tại vùng D1 của gene VP1 [54] (trước đây, người ta định týp virus LMLM dựa vào các đặc tính huyết thanh học)

2.5.2 Khả năng đột biến của virus LMLM

Virus LMLM có mức độ đột biến rất cao [42] Qua theo dõi nhiều năm, gần đây người ta tính được tốc độ đột biến của virus LMLM là 10-4/năm Đây

là một trong những yếu tố chính dẫn đến tính đa týp và nhiều biến chủng qua hàng nghìn năm tiến hoá

Lịch sử đ] ghi nhận, trong các ổ dịch kéo dài ở châu Âu, thường xuất hiện những biến chủng mới vào thời kỳ cuối Thực ra, những biến chủng này có nguồn gốc ngay trong ổ dịch chứ không phải đưa từ ổ dịch khác vào

Nghiên cứu về đột biến và chọn lọc các đột biến dẫn đến giả thuyết về sự xuất hiện các biến chủng là hậu quả của việc sử dụng vacxin (do áp lực miễn dịch) [43] Hiện tượng tái tổ hợp giữa các topotype tạo chủng mới cũng là một phương thức dẫn đến sự đa dạng sinh học của virus LMLM [44]

2.5.3 Đa dạng týp O virus lở mồm long móng

Trong số 7 týp virus LMLM, virus týp O là phổ biến nhất, có mặt ở hầu khắp các châu lục [52] Trong suốt 5 năm qua, tại FMD-WRL, trong tổng số mẫu bệnh phẩm LMLM nhận được từ các nước, người ta xác định được virus LMLM týp O có mặt ở trên 60% số mẫu dương tính

Còn ở Đông Nam á, những năm gần đây có một số subtype thuộc týp O lưu hành như: chủng SEA (South East Asian) được phát hiện ở Việt Nam năm

1997, Campuchia năm 1998 và Đài Loan năm 1999 Chủng ME-SA có mặt tại

Irắc, Thổ Nhĩ Kỳ Chủng virus Cathay phát hiện ở Hồng Kông năm 1982, ở Philippin năm 1996 và ở Đài Loan năm 1997 Năm 1997, chủng Cathay xuất hiện ở Việt Nam Từ năm 1998, chủng Pan-Asia bắt đầu xuất hiện và lây lan trong vùng

Đông Nam á Năm 1999, chủng này xuất hiện ở Việt Nam do lây từ Trung Quốc qua đường buôn bán động vật Chủng virus này cũng xuất hiện ở Thái Lan và Nhật Bản vào cùng thời gian đó [29]

Cho đến nay, người ta đ] xác định được 10 subtype O dựa vào sự sai khác về tính kháng nguyên [39] Phân bố của các biến chủng týp O thường có tính chất

địa lý, tên biến chủng được gọi theo vùng địa danh chúng xuất hiện (topotype): Europe-South America (Euro-SA), Middle East-South Asia (ME-SA), South-East Asia (SEA), Cathay, West Africa (WA), East Africa 1 (EA-1), East Africa

2 (EA-2), East Africa 3 (EA-3), Indonesia-1 (ISA-1), Indonesia-2 (ISA- 2)

3 Néi dung, nguyªn liÖu

vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

3.1 §èi t−îng nghiªn cøu

Virus lë måm long mãng týp O cña ViÖt Nam

3.2 §Þa ®iÓm nghiªn cøu

Bé m«n Ho¸ sinh – MiÔn dÞch vµ BÖnh lý, ViÖn Thó y

3.5 Nguyªn liÖu

3.5.1 Gièng virus lë måm long mãng, tÕ bµo BHK-21

C¸c gièng virus chuÈn týp O, A vµ Asia1 vµ chñng ph©n lËp PV02 do Bé m«n Hãa sinh- MiÔn dÞch vµ BÖnh lý - ViÖn Thó y cung cÊp

Giống tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney line 21) do Bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch và Bệnh lý, Viện Thú y cung cấp

3.5.2 Hoá chất, môi trường thí nghiệm

* Hoá chất, môi trường nuôi cấy tế bào

- Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)

- DMSO (Dimethyl Sulfoxide)

- Kháng sinh (Penicilline, Streptomycine)

- Kháng nấm (fungizone)

* Các hóa chất, sinh phẩm cho RT-PCR

+ Các chất dùng để tách RNA của virus:

- Random primers (Promega C118A)

- Primes đặc hiệu cho týp O

- First strand buffer 5x (Promega M531A)

- BSA (Promega R396A, 1mg/ml)

- dNTP mix (2.5mM mçi lo¹i)

- DTT (100mM, Promega P117A)

- Nuclease-free water (Promega P119A- 21787501)

- PCR buffer 10x

- MgCl2, 25mM, 750 µl (A351B, 15913112, Promega)

- Taq- DNA Polymerase (5 units/ml, 250units, Sigma)

+ C¸c chÊt dïng kiÓm tra s¶n phÈm PCR:

- Agarose gel 2% (agarose pha trong TBE/TAE)

- Ethidium Bromide vµ Marker

- Dung dÞch TBE/TAE Buffer 1x

- DNA marker

* C¸c hãa chÊt cÇn thiÕt cho chiÕt t¸ch DNA:

+ Agarose gel 2% (pha trong dung dÞch TAE)

+ TAE Buffer

+ Maker

+ Ethidium Bromide

+ Dung dÞch TE

+ DNA extraction Kit

* Ho¸ chÊt dïng cho biÕn n¹p tÕ bµo

+ M«i tr−êng LB: (Tryptone, Yeast Extract, Nacl, Ampicillin)

+ Th¹ch LB (m«i tr−êng LB + Agarose)

+ X-gal (40µg/ µl), IPTG (100mM)

+ TOPO TA Cloning Kit

+ Các loại hoá chất thông thường phòng thí nghiệm khác

3.5.3 Dụng cụ, máy móc, thiết bị

- Chai nuôi tế bào (T25, T75, T150)

- Buồng cấy vô trùng

- Tủ ấm 370 C thường và tủ ấm 370 C có 5% CO2

- Bể ấm có lắc (Water bath)

- Nồi hấp tiệt trùng

- Các loại tủ lạnh 40 C, -300 C, -800 C

- Máy lắc gia nhiệt

- Máy chạy PCR: Autorisierter Thermocycler

- Máy chạy điện di (Mini Gel Migration Trough- Cosmo Bio Co.Ltd)

- Máy đọc và chụp ảnh gel: Imaging Analyzer (ChemiDoc Bio- Rad)

- Máy hút chân không

- Máy ly tâm bàn Eppendorf 5415R

- Máy ly tâm lạnh Eppendorf

- Máy Vortex Genie 2

- Các loại máy móc, vật liệu thông thường phòng thí nghiệm khác