ỨNG DỤNG MỘT SỐ CHỈ SỐ PK/PD TRONG DỰ BÁO HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN CỦA CIPROFLOXACIN TẠI KHOA HỒI SỨC TÍCH CỰC, BỆNH VIỆN BẠCH MAI

Phương pháp nghiên cứu trong dự báo hiệu quả điều trị của ciprofloxacin thông qua các chỉ số PK/PD 26 Chương 3.. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích AUC Diện tích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN TỨ SƠN

ỨNG DỤNG MỘT SỐ CHỈ SỐ PK/PD TRONG

DỰ BÁO HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN

CỦA CIPROFLOXACIN TẠI KHOA

HỒI SỨC TÍCH CỰC, BỆNH VIỆN BẠCH MAI

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN TỨ SƠN

ỨNG DỤNG MỘT SỐ CHỈ SỐ PK/PD TRONG

DỰ BÁO HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN

CỦA CIPROFLOXACIN TẠI KHOA

HỒI SỨC TÍCH CỰC, BỆNH VIỆN BẠCH MAI

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ- DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 60.73.05

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Liên Hương

HÀ NỘI 2011

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Nguyễn Thị Liên Hương, Trưởng Bộ môn Dược Lâm Sàng trường

Đại học Dược Hà Nội Người thầy đã trực tiếp tận tình hướng dẫn em trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Em gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới:

PGS.TS Nguyễn Gia Bình – Trưởng khoa Hồi sức tích cực Bệnh viện

Bạch Mai đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện luận văn tại bệnh viện

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

Các đồng nghiệp trong bộ môn Dược lâm sàng: Đã tạo điều kiện tốt

nhất trong suốt quá trình tôi học tập, giúp đỡ nhiệt tình, động viên và

cho tôi lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

- Đội ngũ các anh chị em bác sỹ, điều dưỡng và y tá của khoa Hồi sức tích cực, Khoa Chống độc bệnh viện Bạch Mai Các dược sỹ khoa Dược bệnh viện Bạch Mai

- TS Phạm Thanh Hà (BM Hóa phân tích), TS Nguyễn Trần Linh (bộ môn Bào Chế) , các em sinh viên làm khóa luận tốt nghiệp ở bộ môn Dược lâm sàng

Đã giúp đỡ nhiệt tình, cho tôi lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành đề tài này

Xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo Sau đại học

trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ động viên, cổ vũ tôi trong suốt quá

trình học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 17 tháng 10 năm 2011 Học viên

Nguyễn Tứ Sơn

MỤC LỤC

Trang Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

1.1 Đại cương về ciprofloxacin 3

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng ciprofloxacin

trong huyết tương người

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

18

18

21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng 24

ciprofloxacin trong huyết tương người

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong dự báo hiệu quả điều trị của

ciprofloxacin thông qua các chỉ số PK/PD

26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng ciprofloxacin

trong huyết tương bằng HPLC

3.2 Kết quả thông số dược động của ciprofloxacin 43

3.2.2 Kết quả các thông số dược động học của ciprofloxacin 45

3.3 Kết quả chỉ số PK/PD dự báo hiệu quả điều trị của ciprofloxacin 50 3.3.1 Kết quả chỉ số PK/PD của ciprofloxacin trên bệnh nhân nghiên cứu

3.3.2 Kết quả dự báo hiệu quả điều trị nhiễm khuản dựa trên chỉ số PK/PD

của ciprofloxacin trên bệnh nhân nghiên cứu

50

53

4.1 Phương pháp định lượng ciprofloxacin 55

4.2 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 58

4.3 Thông số dược động học của ciprofloxacin 60

4.4 Chỉ số PK/PD của ciprofloxacin trong dự báo hiệu quả điều trị

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết

tắt

Chú thích

AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ theo thời gian

(Area under the curve)

CIP Ciprofloxacin

Cl Hệ số thanh thải (Clearance)

CLSI Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (Clinical Laboratory and

Standards Institute)

Cpeak Nồng độ đỉnh của thuốc trong máu

EUCAST Ủy ban châu âu về thử nghiệm độ nhạy cảm của kháng sinh

(European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography)

HQC Mẫu kiểm chứng ở nồng độ cao (High quality control)

Ke Hằng số tốc độ thải trừ

LLOQ Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quatification)

LQC Mẫu kiểm chứng ở nồng độ thấp (Low quality control)

MIC Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimal inhibitory

concentration)

MQC Mẫu kiểm chứng ở nồng độ trung bình (Medium quality control)

PD Dược lực học (Pharmacodynamic)

PK Dược động học (Pharmacokinetic)

t1/2 Thời gian bán thải

TLTK Tài liệu tham khảo

Vd Thể tích phân bố (Volume of distribution)

2 Bảng 1.2: Kết quả một số nghiên cứu PK/PD của ciprofloxacin 16

3 Bảng 1.3: Tổng kết một số nghiên cứu phân tích ciprofloxacin bằng

HPLC

20

4 Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ ciprofloxacin pha

trong huyết tương

34

5 Bảng 3.2: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 36

6 Bảng 3.3 :Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày 38

7 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày 39

8

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ ổn định của ciprofloxacin sau 3 chu kỳ

đông – rã đông huyết tương

40

9 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ ổn định trong quá trình xử lý 41

10 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ ổn định dài ngày 42

11 Bảng 3.8: Đặc điểm chung bệnh nhân nghiên cứu 43

12 Bảng 3.9 Đặc điểm bệnh lý nhóm bệnh nhân nghiên cứu 44

13 Bảng 3.10 Kết quả nồng độ trung bình tại các thời điểm trên bệnh nhân 46

14 Bảng 3.11 Các thông số động học ban đầu của ciprofloxacin 49

15 Bảng 3.12 Kết quả thông số AUC

16 Bảng 3.13 Kết quả các thông số PK/PD của ciprofloxacin 50

17 Bảng 3.14 Phần trăm đạt yêu cầu về tỷ lệ AUC0-24/MIC ≥ 125

và Cpeak/MIC ≥ 10 tại các mức MIC khác nhau

53

18 Bảng 4.1 Tỷ lệ số bệnh nhân đạt yêu cầu về chỉ số PK/PD trong một số

nghiên cứu

65

19 Bảng 4.2 Điểm gẫy giá trị MIC quy định mức nhạy – trung gian –

kháng đối với ciprofloxacin theo tiêu chuẩn của CLSI và EUCAST

66

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

3 Hình 3.2: Sắc đồ huyết tương có ciprofloxacin (0,2 mg/L) 33

4 Hình 3.3: Sắc đồ huyết tương bệnh nhân tại thời điểm 0,5h

sau khi truyền CIP

33

5 Hình 3.4 : Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ

ciprofloxacin chuẩn pha trong huyết tương

35

6 Hình 3.5 Tương quan giữa Y (calc) và Y (obs) trong mô hình 1

ngăn (trái) và 2 ngăn (phải)

47

7 Hình 3.6 Tương quan giữa Y (calc) và WRes trong mô hình 1

ngăn (trái) và 2 ngăn (phải)

47

8 Hình 3.7 Tương quan giữa Y (calc) và Res trong mô hình 1

ngăn (trái) và 2 ngăn (phải)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ciprofloxacin là một kháng sinh thế hệ hai trong nhóm fluoroquinolon được sử dụng từ năm 1981 tới nay Với hoạt tính mạnh, phổ tác dụng rộng, ciprofloxacin được chỉ định rộng rãi trong điều trị nhiều loại nhiễm khuẩn đặc biệt là nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm gây ra [22] Tuy nhiên cùng với sự gia tăng kháng thuốc của vi khuẩn, việc lựa chọn và quyết định chế độ liều của một kháng sinh nói chung và ciprofloxacin nói riêng cần có cơ sở vững chắc hơn dựa trên mối liên quan giữa dược động học và dược lực học (PK/PD) của thuốc

Nghiên cứu về PK/PD là một lĩnh vực khá mới trên thế giới Các nghiên cứu về PK/PD của ciprofloxacin chủ yếu thực hiện trên mô hình in vitro và động vật thí nghiệm, các dữ liệu trên người còn hạn chế Tuy nhiên, các công bố gần đây trên người đã cho thấy vai trò của các chỉ số PK/PD của ciprofloxacin trong dự báo hiệu quả điều trị và nguy cơ kháng thuốc của vi khuẩn, đặc biệt trên các bệnh nhân nặng [50],[48],[36] Ở Việt Nam đã có một

số nghiên cứu dựa trên chỉ số PK/PD đánh giá hiệu quả điều trị của kháng sinh nhóm carbapenem và aminoglycosid [2],[6],[8], tuy nhiên chưa thấy công bố nghiên cứu về chỉ số này của ciprofloxacin

Theo một khảo sát gần đây tại khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Bạch Mai, ciprofloxacin đang được dùng phổ biến với liều mức liều từ 400mg tới 800mg/24h (chiếm 94,4%) cho bệnh nhân tại khoa hồi sức [7] Trong khi tại đây chủ yếu là các bệnh nhân nặng với các thông số dược động học biến động lớn Mặt khác, các công bố trên thế giới cho thấy mức liều 400mg mỗi 12 giờ không đảm bảo hiệu quả tối ưu trên bệnh nhân nặng [14] Với mức liều đang dùng tại khoa, các chỉ số PK/PD liên quan chặt chẽ với hiệu quả của thuốc liệu đã đạt yêu cầu hay chưa vẫn là một băn khoăn của các nhà chuyên môn

Bên cạnh đó, để tính được các chỉ số PK/PD phải xác định được các thông số dược động học của ciprofloxacin Từ đó, yêu cầu phải có một phương pháp định lượng nồng độ ciprofloxacin trong huyết tương người đạt các tiêu chuẩn của phương pháp phân tích trong dịch sinh học Tuy nhiên ở Việt Nam chưa thấy có công bố chính thức nào về phương pháp phân tích ciprofloxacin trong huyết tương người

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi thực hiện đề tài:

“Ứng dụng một số chỉ số PK/PD trong dự báo hiệu quả điều trị nhiễm khuẩn của ciprofloxacin tại khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Bạch Mai ”

với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng ciprofloxacin trong huyết tương người

2 Tính được các thông số dược động học của ciprofloxacin trên bệnh nhân tại khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Bạch Mai

3 Ứng dụng được chỉ số Cpeak/MIC và AUC0-24/MIC của ciprofloxacin để

dự báo hiệu quả điều trị nhiễm khuẩn trên bệnh nhân tại khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Bạch Mai

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CIPROFLOXACIN

1.1.1 Dược động học của ciprofloxacin

Ciprofloxacin có thể được dùng đường uống hoặc truyền tĩnh mạch chậm trong 60 phút Các dạng bào chế đường uống phổ biến của ciprofloxacin là viên nén chứa ciprofloxacin hydroclorid, viên nén giải phóng kéo dài (extended-release) chứa ciprofloxacin dạng base và dạng muối hydroclorid, dạng hỗn dịch uống Ciprofloxacin đường tĩnh mạch thường bào chế dạng muối lactat [5],[11] Dưới đây trình bày một số đặc điểm dược động học của ciprofloxacin

1.1.1.1 Hấp thu: với đường uống, ciprofloxacin hấp thu nhanh và dễ dàng

qua đường tiêu hóa với sinh khả dụng khoảng 70-80% Sinh khả dụng của

hỗn dịch uống ciprofloxacin trên trẻ em khoảng 60% Sau khi uống liều đơn 500mg, nồng độ đỉnh của ciprofloxacin trong huyết tương khoảng 2,4 mcg/ml sau 1 đến 2 giờ [11], [42] Nồng độ đỉnh và diện tích dưới đường cong nồng

độ theo thời gian (AUC) tăng tỷ lệ với liều uống từ 250-1000 mg và không bị ảnh hưởng bởi giới tính Nồng độ đỉnh và AUC của ciprofloxacin trên người cao tuổi cao hơn một chút so với người trẻ tuổi [11] Ảnh hưởng của thức ăn và/hoặc sữa lên hấp thu ciprofloxacin qua đường tiêu hóa thay đổi tùy vào dạng bào chế của thuốc [11] Thức ăn làm chậm hấp thu ciprofloxacin dạng viên nén nhưng lượng thuốc hấp thu ảnh hưởng không đáng kể Dùng đồng thời các sản phẩm sữa hay thực phẩm có chứa nhiều canxi sẽ làm giảm hấp thu ciprofloxacin qua đường tiêu hóa Các thuốc có chứa các ion kim loại như Mg2+, Al3+, Ca2+,Fe2+ sẽ làm giảm hấp thu ciprofloxacin nếu dùng đồng thời theo đường uống do tại thành phức chelat với thuốc [11],[42]

Với đường tĩnh mạch, sau khi truyền tĩnh mạch 60 phút liều đơn 200 hoặc 400 mg ciprofloxacin, nồng độ đỉnh trong huyết tương tương ứng là 2,1

và 4,6 mcg/ml Người trưởng thành dùng ciprofloxacin liều 400mg mỗi 12 giờ sẽ đạt được nồng độ ciprofloxacin ở trạng thái cân bằng là 4,56 mg/L và nồng độ đáy khoảng 0,2mg/L [11]

1.1.1.2 Phân bố: ciprofloxacin phân bố rộng khắp vào các mô và dịch cơ thể

Nồng độ thuốc trong mô thường cao hơn trong huyết thanh, đặc biệt trong nhu mô, cơ, tuyến tiền liệt và mật [11],[5] Tỷ lệ liên kết protein khoảng 20-40% Ở người khỏe mạnh, thể tích phân bố biểu kiến của ciprofloxacin khoảng 2-3,5 L/kg và ở trạng thái cân bằng khoảng 1,7-2,7 L/kg [11],[42], trong khi ở người cao tuổi khoảng 3,5 -3,6 L/kg [11] Ciprofloxacin qua được hàng rào máu não nhưng nồng độ chỉ bằng 10% nồng độ trong huyết tương khi màng não không viêm Ciprofloxacin đi qua được nhau thai, phân bố được vào dịch màng ối và bài tiết qua sữa mẹ [5],[42]

1.1.1.3 Chuyển hóa: ciprofloxacin chuyển hóa một phần qua gan Có ít nhất

4 chất chuyển hóa đã được xác định là desethyl-eneciprofloxacin,

sulfociprofloxacin, oxociprofloxacin, N-formylciprofloxacin, các chất này có

hoạt lực kháng khuẩn yếu hơn ciprofloxacin [11],[42]

1.1.1.4 Thải trừ: khoảng 40 - 50% liều uống đào thải dưới dạng không đổi

qua nước tiểu nhờ lọc ở cầu thận và bài tiết ở ống thận Khoảng 75% liều truyền tĩnh mạch đào thải dưới dạng không đổi qua nước tiểu và 15% theo phân Chất chuyển hóa oxociprofloxacin thải trừ chủ yếu qua nước tiểu trong khi sulfociprofloxacin thải trừ chủ yếu qua phân Ciprofloxacin được thải trừ qua nước tiểu thông qua vận chuyển chủ động và lọc qua cầu thận [42] Các đường đào thải khác là chuyển hóa ở gan, bài xuất qua mật, và thải qua niêm mạc vào trong lòng ruột (đây là cơ chế đào thải bù trừ ở người bệnh bị suy thận nặng) [5],[42] Thời gian bán thải của ciprofloxacin từ 3 đến 5 giờ, kéo dài hơn ở người suy thận và xơ gan nặng Có ít thông tin liên quan tới ảnh hưởng của suy chức năng gan lên thải trừ ciprofloxacin [42] Đa số các nghiên cứu đều cho thấy dược động học của ciprofloxacin không bị ảnh hưởng đáng kể bởi chứng xơ nang Chỉ có một lượng nhỏ ciprofloxacin bị loại trừ bằng thẩm phân máu hay thẩm phân màng bụng [11],[42]

1.1.2 Phổ tác dụng của Ciprofloxacin

Tương tự các kháng sinh cùng nhóm fluoroquinolon, ciprofloxacin là kháng sinh diệt khuẩn có phổ tác dụng rộng [11],[42] Thuốc có tác dụng trên các chủng Gram âm tốt hơn so với các chủng Gram dương Một số nghiên cứu in vitro cho thấy hoạt tính của ciprofloxacin tương đương hoặc mạnh hơn

so với ofloxacin và gấp khoảng 2 lần so với norfloxacin trên phần lớn các chủng nhạy cảm [11]

Các vi khuẩn hiếu khí Gram âm nhạy cảm với ciprofloxacin in vitro

bao gồm: các họ trực khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae), Klepsiella,

Proteus, Salmonella, Shigella, Providensia và Yersinia spp Ciprofloxacin

cũng có tác dụng trên trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa), lậu cầu (Neisesseria gonorrhoeae), H Influenzae, Moraxella catarrhalis và N

Meningitidis

Trên các vi khuẩn Gram dương hiếu khí, ciprofloxacin có tác dụng trên

tụ cầu gồm chủng không sinh hoặc sinh betalactamase, tụ cầu kháng meticilin

(MRSA) Liên cầu, đặc biệt là Streptococcus pneumonia ít nhạy cảm với

ciprofloxacin [11],[42]

Ciprofloxacin không có tác dụng trên phần lớn các vi khuẩn kỵ khí như

Bacteroides fragilis và Clostridium difficile [5],[42]

Ciprofloxacin cũng có tác dụng trên Mycobacteria, Mycoplasma,

Ricketsias, Chlamydia trachomatis Tuy nhiên trong điều trị lao, ciprofloxacin

không được khuyên dùng do hoạt lực yếu hơn các thuốc điều trị ưu tiên line) và các thuốc fluoroquinolon khác như moxifloxacin hay levofloxacin ciprofloxacin không có tác dụng diệt nấm [11],[42]

(first-1.1.3 Chỉ định của ciprofloxacin

Với hoạt tính phổ rộng ciprofloxacin được dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy cảm như bệnh than, nhiễm khuẩn đường mật, nhiễm khuẩn xương khớp, đợt cấp của xơ nang, nhiễm khuẩn tai-mũi-họng (bao gồm viêm tai ngoài, tai giữa và viêm xoang), viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn tiêu hóa do vi khuẩn tả, lỵ, thương hàn, nhiễm khuẩn đường tiết niệu bao gồm cả trường hợp viêm tuyến tiền liệt mạn tính do vi khuẩn, nhiễm trùng do côn trùng đốt Ciprofloxacin cũng được dùng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn da, mô mềm, nhiễm khuẩn hô hấp (bao gồm trường hợp do

pseudomonas, không dùng cho nhiễm Streptococcus pneumoniae như viêm

phổi do phế cầu) [5],[11],[42]

Trong dự phòng nhiễm khuẩn, ciprofloxacin được dùng để dự phòng viêm màng não do não mô cầu và dự phòng phẫu thuật Ciprofloxacin cũng được dùng ngoài điều trị nhiễm khuẩn mắt, mũi [42]

1.2 CHỈ SỐ PK/PD CỦA CIPROFLOXACIN ĐỂ TỐI ƯU HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ

1.2.1 Chỉ số PK/PD của kháng sinh và ứng dụng

1.2.1.1 Một số khái niệm liên quan tới dược lực học của kháng sinh

Dược lực học (pharmacodynamic-PD) là khái niệm phản ánh mối liên quan giữa lượng thuốc trong huyết thanh, mô và dịch cơ thể với tác dụng và độc tính của thuốc Đối với kháng sinh, dược lực học tập trung vào mối liên quan nồng độ và tác dụng kháng khuẩn Trong đó, hai khái niệm nồng độ kìm khuẩn tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) thông thường vẫn được sử dụng để đo lường tác dụng diệt khuẩn, tuy nhiên không cung cấp thông tin về tác dụng diệt khuẩn theo thời gian [36]

Một khái niệm cũng được sử dụng trong đo lường tác dụng kháng khuẩn là “tác dụng hậu kháng sinh- post-antibiotic effect” Đây là thuật ngữ

mô tả sự duy trì ức chế phát triển của vi khuẩn sau khi tiếp xúc với kháng sinh Tác dụng hậu kháng sinh phản ánh thời gian cần thiết để vi khuẩn hồi phục sau khi chịu tác dụng của kháng sinh và phát triển lại bình thường Tùy theo loại kháng sinh, tác dụng hậu kháng sinh có thể kéo dài mức độ khác nhau: kéo dài - trung bình - ngắn hoặc không có [10],[36]

1.2.1.2 Phân loại kháng sinh theo đặc tính dược lực học

Theo đặc tính dược lực học kháng sinh được phân thành 3 loại (bảng 1.1):

- Kháng sinh diệt khuẩn phụ thuộc nồng độ và có tác dụng hậu kháng sinh trung bình tới kéo dài: nhóm kháng sinh này có hiệu quả và tốc độ diệt khuẩn

càng cao khi nồng độ thuốc càng tăng Tác dụng hậu kháng sinh kéo dài cho phép việc dùng kháng sinh này liều cao và không phải lặp lại liều thường

xuyên Kháng sinh thuộc nhóm này là aminoglycosid, fluoroquinolon, daptomycin, ketonid, metronidazol và amphotericin B Mục tiêu điều trị là tối

đa hóa nồng độ thuốc trong máu

- Kháng sinh diệt khuẩn phụ thuộc thời gian và có tác dụng hậu kháng sinh

ngắn hoặc không có: các kháng sinh này có hiệu quả diệt khuẩn phụ thuộc

vào khoảng thời gian vi khuẩn tiếp xúc với thuốc ở nồng độ cao hơn MIC Nồng độ tối ưu là khoảng 4-5 lần MIC, nồng độ trên giá trị này không diệt khuẩn nhanh hoặc nhiều hơn Mục tiêu cho chế độ liều của kháng sinh loại này là tối ưu hóa khoảng thời gian thuốc tiếp xúc với vi khuẩn Kháng sinh thuộc nhóm này bao gồm beta-lactam và flucytosin

- Kháng sinh diệt khuẩn phụ thuộc thời gian và có tác dụng hậu kháng sinh

kéo dài: nhóm kháng sinh này có khả năng ngăn cản sự phát triển trở lại của

vi khuẩn trong suốt khoảng thời gian giữa các lần đưa thuốc Đặc tính dược lực học này quan sát thấy trên các kháng sinh macrolid, clindamycin, glycopeptid, tetracyclin, glycopeptid Mục tiêu chế độ liều là tối ưu hóa liều kháng sinh để đảm bảo có tác dụng diệt khuẩn trong một khoảng thời gian nhất định giữa các lần đưa thuốc Sau khoảng thời gian này, liều ban đầu cũng phải đảm bảo duy trì được tác dụng hậu kháng sinh đủ để ngăn cản sự tái phát triển của vi khuẩn trong khoảng thời gian còn lại trước khi đưa liều tiếp theo [36]

1.2.1.3 Chỉ số dược động học/dược lực học (PK/PD) của kháng sinh

Chỉ số PK/PD của kháng sinh được thiết lập trên cơ sở dựa vào nồng độ thuốc trong huyết tương (giá trị đầu vào của dược động học) và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (giá trị đầu vào của dược lực học) Việc gắn các thông số dược động học với MIC cho ba chỉ số PK/PD cơ bản đánh giá tác dụng của kháng sinh là:

- T>MIC: thời gian nồng độ kháng sinh duy trì ở mức cao hơn MIC

- Cpeak/MIC: Tỷ lệ giữa nồng độ đỉnh của kháng sinh và MIC

- AUC0-24/MIC: Tỷ lệ diện tích dưới đường cong nồng độ theo thời gian trong 24 giờ và MIC (hình 1.1) [19],[48]

mic

auc

time>MIC

peak c

Bảng 1.1 Các loại kháng sinh

và chỉ số PK/PD dự báo hiệu quả tương ứng

Loại kháng sinh Kháng sinh

trong cùng loại

Chỉ số PK/PD tương quan với hiệu quả

Kháng sinh diệt khuẩn phụ

thuộc nồng độ và có tác dụng

hậu kháng sinh trung bình tới

kéo dài

Aminoglycosid, fluoroquinolon, daptomycin, ketonid, metronidazol và amphotericin B

Cpeak/MIC

và AUC0-24/MIC

Kháng sinh diệt khuẩn phụ

thuộc thời gian và có tác dụng

hậu kháng sinh ngắn hoặc

không có

Beta-lactam, flucytosin

T>MIC

Kháng sinh diệt khuẩn phụ

thuộc thời gian và có tác dụng

hậu kháng sinh kéo dài

macrolid,clindamycin, glycopeptid, tetracyclin, glycopeptid

AUC0-24/MIC

Giá trị tối ưu của chỉ số PK/PD khác nhau đối với từng kháng sinh và từng loại vi khuẩn gây bệnh Việc xác định các giá trị này đối với từng nhóm kháng sinh có thể được tiến hành nghiên cứu trên mô hình in vitro, mô hình động vật thực nghiệm và trên người Kết quả chỉ số PK/PD từ nghiên cứu trên

mô hình động vật cũng có thể dùng để dự báo được hoạt lực của kháng sinh khi dùng trên người [10],[36]

1.2.1.4 Ứng dụng chỉ số dược động học/dược lực học

Chỉ số PK/PD đã được nghiên cứu để tối ưu hóa hiệu quả điều trị của kháng sinh Mặt khác, chỉ số PK/PD của kháng sinh cũng được coi là mục tiêu để hạn chế vi khuẩn kháng thuốc Thông thường độ lớn của chỉ số PK/PD cho mục tiêu hạn chế kháng thuốc lớn hơn yêu cầu đảm bảo hiệu quả điều trị nhưng thay đổi tùy vào loại vi khuẩn

Nghiên cứu dược động học/dược lực học kháng sinh có vai trò quan trọng trong các lĩnh vực: thiết lập chế độ liều mới tối ưu hơn cho một thuốc kháng sinh cụ thể, phát triển thuốc kháng sinh mới và công thức mới, thiết lập giá trị điểm gẫy (break-point) của sự nhạy cảm với kháng sinh và thiết lập hướng dẫn điều trị nhiễm khuẩn theo kinh nghiệm [36]

1.2.2 Chỉ số PK/PD của kháng sinh nhóm fluoroquinolon

Các nghiên cứu PK/PD đã tập trung vào xác định mối tương quan giữa chỉ số với hiệu quả điều trị Độ lớn của hai chỉ số Cpeak/MIC và AUC0-

24/MIC tối ưu tùy thuộc vào mỗi loại vi khuẩn và từng loại kháng sinh trong nhóm [13] Các nghiên cứu được thực hiện in vitro, trên mô hình động vật hoặc trên bệnh nhân [10],[36],[48]

1.2.2.1 Chỉ số PK/PD của kháng sinh nhóm fluoroquinolon trong dự báo hiệu quả điều trị

- Với vi khuẩn Gram dương:

Hai chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram dương thường được dùng trong nghiên cứu là PK/PD của kháng sinh nhóm fluoroquinolon

là phế cầu (Streptococcus pneumoniae) và tụ cầu vàng (Streptococcus

aureus) Nghiên cứu trên động vật cho thấy khi tỷ lệ AUC 0-24/MIC của thuốc dạng tự do lớn hơn các giá trị từ 25 tới 34 (tùy loại kháng sinh fluoroquinolon) thì tỷ lệ sống sót đạt trên 90% Tỷ lệ này cũng liên quan tới

sự giảm 99% lượng vi khuẩn Giá trị AUC0-24/MIC dạng thuốc tự do cần thiết

để có hiệu quả trên S aureus cao hơn so với S pneumoniae Chỉ số này phải đạt trên 60 để tỷ lệ động vật nhiễm S aureus sống sót trên 90% [36]

Kết quả chỉ số PK/PD để có đáp ứng tốt trên người cũng tương tự trên

mô hình động vật [10],[36],[48] Tác giả Ambrose và cộng sự [9] đã đánh giá

mối quan hệ giữa tỷ lệ AUC 0-24/MIC của thuốc dạng tự do của gatifloxacin

và levofloxacin trên chủng S pneumoniae với sự đáp ứng của bệnh nhân về vi

khuẩn học trong hai thử nghiệm pha ba được thiết kế ngẫu nhiên và mù đôi

Kết quả cho thấy tỷ lệ AUC 0-24/MIC của thuốc dạng tự do lớn hơn 33,7 có tương ứng với 100% số bệnh nhân có đáp ứng dương tính với phác đồ điều trị, trong khi các bệnh nhân có tỷ lệ này thấp hơn 33,7 chỉ có 64% đáp ứng với phác đồ Một nghiên cứu khác được thực hiện trên 121 bệnh nhân nhiễm

trùng đường hô hấp được dùng các kháng sinh fluoroquinolon khác nhau

Theo đó, các bệnh nhân có tỷ lệ AUC 0-24/MIC của thuốc dạng tự do lớn hơn hoặc bằng 34 có sác xuất thành công trong điều trị cao nhất (92,6%) trong khi

tỷ lệ thấp hơn 34 chỉ có sác xuất là 66,7% (p=0,01) Tỷ lệ bệnh nhân có đáp ứng tốt trên lâm sàng với levofloxacin cũng quan sát thấy khi Cpeak/MIC > 12,2 [10]

- Với vi khuẩn Gram âm:

Vi khuẩn Gram âm, hiếu khí là phổ tác dụng chính của các fluoroquinolon [11], [42] Tương tự với vi khuẩn Gram dương, các chỉ số PK/PD của fluoroquinolon cũng liên quan chặt chẽ với hiệu quả diệt nhóm vi

khuẩn này Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) thường được

chọn đại diện cho các vi khuẩn trong nhóm Gram âm trong nghiên cứu chỉ số PK/PD của nhóm fluoroquinolon Một kết quả quan trọng trong nghiên cứu

với chủng Gram âm in vitro là tỷ lệ AUC0-24/MIC của thuốc dạng tự do cần thiết để có một tác dụng diệt khuẩn không khác nhau với các MIC khác nhau [36] Khi đạt được giá trị AUC 0-24/MIC cần thiết, tốc độ diệt khuẩn trên các

vi khuẩn Gram âm lớn hơn Gram dương[40] Với vi khuẩn Gram âm tỷ lệ AUC 0-24/MIC thông thường có hai điểm gãy (break - point) Với AUC 0-

24/MIC < 50, nhóm fluoroquinolon mới chỉ thể hiện tác dụng kìm khuẩn (không thay đổi mật độ vi khuẩn trong nghiên cứu) Khi tỷ lệ AUC 0-24/MIC trên 100 thì tỷ lệ sống sót của chuột thực nghiệm lớn hơn 90% và giảm 99% mật độ vi khuẩn tại ổ nhiễm khuẩn [36],[40]

Một trong những dữ liệu đầu tiên về PK/PD của nhóm fluoroquinolon tiến hành trên các bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện được A Forrest và cộng

sự công bố năm 1993 [25] Nghiên cứu đã chứng minh AUC0-24/MIC là thông

số có tính chất dự báo quan trọng nhất với đáp ứng về mặt lâm sàng và vi khuẩn học đối với ciprofloxacin (p<0,003) Theo đó, AUC0-24/MIC của toàn

bộ lượng thuốc lớn hơn 125 cho hiệu quả lâm sàng rõ rệt Do ciprofloxacin gắn protein huyết tương khoảng 40% nên giá trị tương ứng AUC0-24/MIC dạng thuốc tự do là khoảng 75 Giá trị Cpeak/MIC để đạt hiệu quả tối ưu trong khoảng 8-12 [25],[47]

Một nghiên cứu khác trên các bệnh nhân viêm phổi bệnh viện điều trị bằng levofloxacin cũng cho thấy tỷ lệ AUC0-24/MIC có tương quan chặt với đáp ứng điều trị Kết quả cho thấy, AUC0-24/MIC của toàn bộ lượng thuốc lớn hơn hoặc bằng 87 tương quan với tác dụng diệt vi khuẩn G(-) cao (p<0,01) Như vậy với tỷ lệ liên kết protein huyết tương khoảng 29%, giá trị AUC0-

24/MIC của thuốc dạng tự do là khoảng 62 Có 90% bệnh nhân có đáp ứng vi sinh dương tính với phác đồ điều trị khi tỷ lệ AUC0-24/MIC của thuốc dạng tự

do lớn hơn hoặc bằng 62 Trong khi đó, nếu tỷ lệ này dưới 62 chỉ có 43% bệnh nhân đáp ứng với phác đồ [20]

1.2.2.2 Chỉ số PK/PD của kháng sinh nhóm fluoroquinolon trong hạn chế kháng thuốc

Chỉ số PK/PD của ciprofloxacin ngoài sử dụng như công cụ dự báo hiệu quả điều trị còn là chỉ số quan trọng trong hạn chế sự xuất hiện kháng thuốc của vi khuẩn Mô hình trên động vật đã cho thấy để hạn chế sự mở rộng

các chủng P aeruginosa đột biến kháng thuốc, giá trị AUC0-24/MIC của levofloxacin dạng tự do phải lớn hơn 110 Trong khi với garenoxacin, tỷ lệ này ít nhất phải là 88,3 để có tác dụng diệt các chủng nhạy cảm và ngăn sự

phát triển trở lại của các chủng kháng của K pneumonia trên động vật thực

nghiệm Dữ liệu trên lâm sàng về nghiên cứu PK/PD đánh giá sự kháng thuốc không nhiều [36] Thomas và cộng sự đã phân tích mối liên quan giữa sự gia

tăng kháng ciprofloxacin của P.aeruginosa với chỉ số AUC0-24/MIC Khi tỷ lệ này nhỏ hơn 100 có liên quan tới sự xuất hiện của 82,4% chủng đề kháng so

với 9% khi lớn hơn 100 [43] Giá trị Cpeak/MIC trong khoảng từ 8-12 cũng ngăn chặn sự gia tăng kháng thuốc của vi khuẩn [18],[14],[50]

Như vậy, Cpeak/MIC và AUC0-24/MIC là hai chỉ số PK/PD tốt nhất để

dự báo hiệu quả điều trị của fluoroquinolon Trong đó chỉ số AUC0-24/MIC được ghi nhận có tương quan chặt chẽ hơn với hiệu quả điều trị của các fluoroquinolon và được dùng làm chỉ số chính trong dự báo tác dụng diệt khuẩn của nhóm này Tuy nhiên, giá trị Cpeak/MIC cũng đóng vai trò quan trọng Với giá trị Cpeak càng cao nồng độ thuốc tự do trong máu càng cao, tốc độ diệt khuẩn càng lớn Ngoài ra chỉ số Cpeak/MIC cũng liên quan chặt chẽ tới sự ức chế vi khuẩn kháng thuốc [38],[48],[36]

1.2.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ số PK/PD của ciprofloxacin trong dự báo hiệu quả điều trị nhiễm khuẩn

1.2.3.1 Nghiên cứu ngoài nước

Là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon, ciprofloxacin mang đầy đủ tính chất của một kháng sinh có hoạt tính diệt khuẩn phụ thuộc nồng độ và có chỉ số PK/PD để tối ưu hóa hiệu quả điều trị là AUC0-24/MIC và Cpeak/MIC Các vấn đề quan trọng liên quan tới chỉ số PK/PD của ciprofloxacin trong dự báo hiệu quả điều trị trên lâm sàng như: độ lớn cần thiết các chỉ số PK/PD, chủng vi khuẩn trên bệnh nhân và MIC của chúng, loại bệnh nhiễm khuẩn và liều ciprofloxacin Các tiêu chí này xuyên suốt các nghiên cứu ứng dụng PK/PD của ciprofloxacin trên lâm sàng

Tiên phong trong lĩnh vực này trên lâm sàng là nghiên cứu của A Forrest và cộng sự [25] về mối tương quan giữa chỉ số PK/PD của ciprofloxacin với hiệu quả điều trị Nghiên cứu đã cung cấp những giá trị làm

cơ sở cho một loạt các nghiên cứu tiếp theo ứng dụng PK/PD của ciprofloxacin trong lâm sàng Trong nghiên cứu của Forrest,74 bệnh nhân nặng được đưa vào nghiên cứu với đa số (78%) nhiễm trùng bệnh viện và

83% nhiễm Gram âm (trong đó 41% nhiễm P.aeruginosa) Nghiên cứu này

dựa trên phân tích dược động học/dược lực học của quần thể để đưa ra mối quan hệ giữa nồng độ kháng sinh ciprofloxacin với tác dụng cả về lâm sàng

và vi khuẩn học Với AUC0-24/MIC <125, thời gian trung bình để diệt khuẩn hoàn toàn là 32 ngày, so với 6,6 ngày của AUC0-24/MIC trong khảng 125-250

và 1,9 ngày của AUC0-24/MIC >250 Tỷ lệ đáp ứng tốt với điều trị khi AUC

0-24/MIC >125 là 80% so với 42% khi AUC0-24/MIC <125 (p<0,005) Nghiên cứu này kết luận chỉ số AUC0-24/MIC dưới 125 sẽ cho khả năng thất bại điều trị cao, không đủ tác dụng lên vi khuẩn gây bệnh để có hiệu quả trên lâm sàng Chỉ số này trong khoảng 125-250 là giá trị có thể chấp nhận được để điều trị nhiễm khuẩn Mức giá trị tối ưu là trong khoảng 250-500 Nghiên cứu trong một khoảng liều rộng từ 200mg/24h tới 1200mg/24h, các tác giả có cơ

sở khuyến cáo tăng liều để đạt được giá trị AUC0-24/MIC tối ưu [25]

Từ cơ sở nghiên cứu PK/PD của nhóm fluoroquinolon trên các chủng Gram âm, đặt biệt kết quả từ nghiên cứu [25], một số công bố gần đây đã lựa chọn ngưỡng giá trị AUC0-24/MIC ≥ 125 và Cpeak/MIC ≥ 10 để dự báo hiệu quả điều trị của ciprofloxacin cũng như bàn luận các kết quả phân tích trên các chủng Gram âm [18],[37],[14],[34] Tuy nhiên nghiên cứu được thực hiện bởi Zelenitsky S và cộng sự [51] đã khuyến cáo chọn mục tiêu AUC0-24/MIC cao (>250) để tối ưu hóa cho các nhiễm khuẩn nặng tại bệnh viện

Mức liều ciprofloxacin được đưa vào nghiên cứu dao động khá rộng từ mức 200mg x 2 lần/ngày tới 400mg x 3 lần/ngày Tuy nhiên chủ yếu là mức liều được xếp ở mức trung bình là 400mg x 2 lần /ngày với 88,6% số bệnh nhân dùng trong nghiên cứu [18] và toàn bộ bệnh nhân trong thiết kế của Arthur R.H và cộng sự [14] Trong đó, thiết kế của Saengsuwan P và cộng sự với mục đích so sánh chỉ số đạt được với hai mức liều 400mg x 2 lần và 400mg x 3 lần/ngày [39]

Các bệnh nhân đưa vào nghiên cứu chỉ số PK/PD của ciprofloxacin đều

là các bệnh nhân nặng và chủ yếu là nhiễm khuẩn bệnh viện, đang điều trị tại các khoa Hồi sức tích cực Nhóm vi khuẩn các nghiên cứu hướng tới là nhóm Gram âm phù hợp với chỉ định của ciprofloxacin Trong đó nghiên cứu [39]

và [51] tập trung vào chỉ số PK/PD của ciprofloxacin trên bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram âm gây ra Bảng dưới đây trình bày tóm tắt kết quả giá trị PK/PD thu được ở một số nghiên cứu công bố gần đây

Bảng 1.2: Kết quả một số nghiên cứu PK/PD của ciprofloxacin

MIC=0,125, với MIC=0,25; 0,5; 1,0; 2,0 tỷ lệ đạt lần lượt là 84%, 31%, 3%, 0%

-Ngưỡng Cpeak/MIC≥10: 100% đạt khi MIC=0,125, với MIC=0,25; 0,5; 1,0; 2,0 tỷ lệ đạt lần lượt là 97%, 69%, 25%, 0%

82,6(±74) lần lượt với MIC=1,0mg/L và

MIC=0,5mg/L

-Cpeak/MIC trung bình là 5,4(±2,3); Có 10,8% đạt Cpeak/MIC≥8 khi MIC=1,0mg/L và 69,6% đạt khi MIC=0,5mg/L

[34]-2008

(19 BN)

P aeruginosa 300mg/12h AUC 0-24 /MIC là 37,2±41,6 ở nhóm thất bại

72,03±28,51 và 144,07±57,02 tương ứng với MIC=1 mg/L và 0,5mg/L

109,32±39,37 và 218,63±78,75 tương ứng với MIC=1 mg/L và 0,5mg/L

Từ các kết quả trên, các tác giả đều thống nhất với mức liều 400 mg x 2 lần/ngày hoặc thấp hơn sẽ cho kết quả các tỷ lệ AUC0-24/MIC và Cpeak/MIC không đạt yêu cầu trong phần lớn các trường hợp [18],[14], kể cả các bệnh nhân có thể được chữa khỏi như trong nghiên cứu của Matsuo K và cộng sự [34] Cũng từ kết quả này, liều lượng là vấn đề được quan tâm nhất trong các bàn luận của các nghiên cứu Mức liều 1200 mg/24h được khuyến cáo nên sử dụng trong điều trị các nhiễm khuẩn bệnh viện [14],[34],[37] Tác giả Arthur R.H đã khuyến cáo nên khởi đầu với mức liều 1200 mg/24h cho bệnh nhân điều trị tích cực trong liệu pháp điều trị theo kinh nghiệm Nghiên cứu này cũng đề xuất dùng chế độ 600mg/lần để có thể đạt được chỉ số Cpeak/MIC tối

ưu [14] Nghiên cứu [37] và [14] đề xuất không nên giảm liều cho bệnh nhân suy thận có mức lọc cầu thận ≥ 30ml/phút do nguy cơ tạo nồng độ thấp dẫn tới giảm hiệu quả và kháng thuốc Việc cá thể hóa điều trị thông qua định lượng ciprofloxacin trong huyết tương để điều chỉnh liều thích hợp cũng được một số nghiên cứu chọn làm giải pháp trong điều trị bệnh nhân nặng [18],[14],[34],[37]

1.2.3.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam đã có một số tác giả đã sử dụng chỉ số PK/PD để đánh giá hiệu quả điều trị cũng như đề xuất quy trình giám sát nồng độ thuốc trên nhóm kháng sinh như carbapenem, aminoglycosid [2],[6],[8] Khi khảo sát nồng độ của amikacin-một kháng sinh có tính chất phụ thuộc nồng độ như

ciprofloxacin trong máu bệnh nhân, Thu Vân và cộng sự đã cho thấy tỷ lệ đạt nồng độ đỉnh và Cpeak/MIC theo yêu cầu rất thấp, chỉ có 10% nồng độ nằm trong khoảng được cân nhắc [8] Các kết quả cho thấy việc giám sát tích cực nồng độ thuốc kháng sinh aminoglycosid trong máu bệnh nhân là cần thiết để tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm tác dụng bất lợi, đặt biệt trên các bệnh nhân nặng [6],[8]

Chưa có nghiên cứu công bố về chỉ số PK/PD của ciprofloxacin và việc dùng chỉ số kháng sinh này để dự báo hiệu quả điều trị Ciprofloxacin mới được tổng hợp ở khía cạnh khảo sát đưa ra hình ảnh sử dụng thuốc Một khảo sát gần đây tại khoa Hồi sức tích cực công bố mức liều dùng của ciprofloxacin khá thấp với 54,9% dùng liều 400mg/24h hoặc thấp hơn [7] Điều này đặt ra câu hỏi liệu có đạt được chỉ số PK/PD cần thiết cho hiệu quả tối ưu của ciprofloxacin hay không? Dẫn tới yêu cầu cần phải có nghiên cứu

về chỉ số này của ciprofloxacin trên người Việt Nam

1.3 PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG CIPROFLOXACIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng ciprofloxacin trong huyết tương người

Để xác định được các chỉ số PK/PD cần phải định lượng chính xác nồng độ thuốc trong huyết tương, từ đó tính toán được các thông số dược động học Do đó yêu cầu cần phải có phương pháp định lượng ciprofloxacin

thỏa mãn các tiêu chí cần thiết Ciprofloxacin có thể được định lượng bằng

các phương pháp như chuẩn độ acid-base, phương pháp sinh học, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [4],[15] Trong đó HPLC là phương pháp được khuyến cáo phổ biến nhất và được áp dụng nhiều nhất trong định lượng ciprofloxacin, đặc biệt trong dịch sinh học [49] Ưu điểm của phương pháp này là cho độ chính xác và đặc hiệu cao Ngoài ra phương pháp này còn xác định được hoạt

tính sinh học không chỉ của ciprofloxacin mà cả các chất chuyển hóa của nó [11]

Ciprofloxacin cũng như các fluoroquinolon khác là các amino acid yếu

có tính chất lưỡng tính do nhóm amino có khả năng bị proton hóa (pKa= 8,74 đối với nhóm nitrogen của vòng piperazinyl) và nhóm carboxyl có khả năng cho proton (pKa = 6,09 đối với nhóm COOH) Do đó, chúng có thể tồn tại ở các dạng: cation, anion, phân tử trung tính, ion lưỡng cực Tại pH đẳng điện

là 7,4, ciprofloxacin tồn tại chủ yếu ở dạng ion lưỡng cực Khi tồn tại ở dạng ion lưỡng cực trong môi trường pH base nhẹ, ciprofloxacin dễ bị mất hoạt tính nhất bởi ánh sáng Ở pH 3,0 đến 4,0, nhóm - COOH không được ion hóa

và nhóm nitrogen có tính base bị proton hóa hoàn toàn, khi đó, thuốc đạt ổn định cao nhất [44]

Do tính chất lưỡng tính, ciprofloxacin và các fluoroquinolon thường ở dạng ion trong một khoảng pH rộng, đây là lý do sự phân tách trong hệ sắc ký pha đảo gặp khó khăn Những khó khăn chủ yếu có thể gặp phải là:

+ Chất phân tích liên kết mạnh với nhóm silanol, gây nên hiện tượng pic kéo đuôi hoặc bị rửa giải quá sớm với hiệu lực thấp

+ Độ tìm lại (hiệu suất chiết) thấp khi chiết xuất vào pha hữu cơ

+ Khả năng hòa tan của dạng ion lưỡng cực của ciprofloxacin trong nước rất kém [45]

Tác giả Witte B.D và cộng sự trong nghiên cứu phân tích về các yếu tố ảnh hưởng tới định lượng ciprofloxacin bằng HPLC nhấn mạnh 3 yếu tố chính Yếu tố thứ nhất là thành phần dung dịch gốc: nếu có chứa methanol có thể dẫn tới ester hóa nhóm carboxylic trong môi trường acid sẽ tạo ra hai pic trên sắc đồ Yếu tố thứ hai là pH: tác giả khuyến cáo sử dụng pH 3-4 sẽ cho kết quả phân tích tốt Và yếu tố thứ ba là hệ pha tĩnh với khuyến cáo loại cột thích hợp cho phân tích tốt ciprofloxacin bằng HPLC là cột C18 [49]

Bảng 1.3 trình bày các nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong huyết tương người đã được công bố

Bảng 1.3: Tổng kết một số nghiên cứu phân tích ciprofloxacin bằng HPLC

C18 Kết tủa protein bằng acid percloric

C18 Kết tủa protein bằng acetonitril

Levofloxacin C8 Kết tủa protein

bằng HClO4 và MeOH

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Mẫu sinh học thường có nhiều tạp chất, lượng mẫu ít và nồng độ các chất phân tích thường thấp, do vậy các phương pháp phân tích sinh học cần phải được thẩm định trước khi áp dụng đưa vào phân tích mẫu Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học (Bioanalytical method validation) là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học thông thường bao gồm các tiêu chí: tính chọn lọc, tính tuyến tính thông qua đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác và độ ổn định [24]

- Tính chọn lọc (selectivity)

Tính chọn lọc (selectivity) của một phương pháp phân tích là khả năng

phân biệt và định lượng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có trong mẫu phân tích Mẫu có chất phân tích và mẫu thử phải được tiến hành trong cùng điều kiện phân tích để loại trừ xác định bất kỳ chất gây nhiễu nào đến chất cần phân tích [24]

- Đường chuẩn, khoảng tuyến tính (linearity range)

Đường chuẩn biểu diễn mỗi quan hệ giữa đáp ứng pic với nồng độ đã biết của chất cần phân tích trong dịch sinh học Khoảng tuyến tính là khoảng

từ nồng độ thấp nhất đến cao nhất trong 1 đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Yêu cầu của khoảng này là phải đủ rộng để chứa nồng độ chất cần phân tích Đường chuẩn phải có ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một dịch sinh học [24]

- Độ đúng (accuracy)

Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả

phân tích với giá trị (nồng độ) thực của mẫu đã biết Độ đúng phải được đo ở

tối thiểu tại ba nồng độ trong khoảng nồng độ khảo sát là mẫu kiểm chứng ở nồng độ thấp (LQC), mẫu kiểm chứng ở nồng độ trung bình (MQC), và mẫu

kiểm chứng ở nồng độ cao (HQC) Mỗi nồng độ tiến hành đo tối thiểu 5 mẫu [24]

- Độ chính xác (precision)

Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất Độ chính xác được đo ở ít nhất ba nồng độ trong khoảng nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ tối thiểu 5 mẫu, tương

tự như độ đúng Chỉ số thường dùng nhất là độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) [24]

- Độ ổn định (stability)

Độ ổn định của chất phân tích phải được khảo sát cả trong dung dịch chuẩn gốc và trong mẫu sinh học, trong điều kiện và thời gian bảo quản dài, trong quá trình xử lý mẫu và lấy mẫu Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử Độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông – rã đông

+ Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

+ Độ ổn định trong thời gian bảo quản dài [24]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Bệnh nhân nghiên cứu

Bệnh nhân (BN) nghiên cứu là BN tại khoa Hồi sức tích cực - Bệnh viện Bạch Mai, trong thời gian từ tháng 06/2011 tới tháng 09/2011 thỏa mãn các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ sau:

2.1.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

 Bệnh nhân được chỉ định dùng Ciprofloxacin đường truyền tĩnh mạch với liều 400 mg x 2 lần/ngày

 Bệnh nhân đồng ý tuân thủ protocol nghiên cứu

2.1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

 Bệnh nhân đang tiến hành lọc máu

 Bệnh nhân suy thận nặng (Clcr ≤ 30ml/phút)

2.1.1.3 Số lượng bệnh nhân (cỡ mẫu)

Nghiên cứu trên toàn bộ bệnh nhân thỏa mãn các tiêu chuẩn lựa chọn

và loại trừ trong thời gian nghiên cứu, tổng số bệnh nhân thu được là 25 bệnh nhân

2.1.2 Thuốc nghiên cứu

Thuốc nghiên cứu là Ciprobay, dùng đường truyền tĩnh mạch Mức liều nghiên cứu là liều 400mg x 2 lần/ngày

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Máy móc, thiết bị:

 Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100 series

 Máy li tâm: Hettich EBA 20

 Máy lắc siêu âm: Bandelin SONOREX

 Cân phân tích: Presia XT 220A

 Tủ lạnh sâu - 400C: Sanyo

 Máy đo pH510: CyberScan (EUTECH)

 Các dụng cụ thí nghiệm khác: Bộ lọc, pipet định mức tự động, các dụng cụ thủy tinh thí nghiệm

2.2.2 Hóa chất thí nghiệm:

 Ciprofloxacin.HCl (Chất đối chiếu quốc gia-Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương)

 Hóa chất có tiêu chuẩn phù hợp dùng cho HPLC

 Huyết tương người (Viện huyết học truyền máu trung ương)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng

ciprofloxacin trong huyết tương người

2.3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng ciprofloxacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tổng quan tài liệu, từ đó tiến hành khảo sát và lựa chọn phương pháp phù hợp tách chiết ciprofloxacin ra khỏi huyết tương và xây dựng chương trình sắc ký thích hợp Trong đó định hướng tiến hành phương pháp kết tủa huyết tương bằng dung môi thích hợp Thử các điều kiện sắc ký khác nhau: chọn cột, các hệ pha động, tỷ lệ, lưu lượng dòng, thể tích tiêm, bước sóng hấp thụ cực đại để phân tích Từ đó chọn điều kiện sắc ký thích hợp định lượng ciprofloxacin trong huyết tương người

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp vừa xây dựng theo các tiêu chí trong hướng dẫn của FDA [24] bao gồm các tiêu chí sau:

- Tính chọn lọc của phương pháp: Đạt tiêu chuẩn về tính chọn lọc, quy trình

phân tích phải có khả năng phát hiện và phân biệt ciprofloxacin với các tạp

chất có trong mẫu huyết tương Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của ciprofloxacin không vượt quá 20% đáp ứng của mẫu chuẩn

ở nồng độ giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: Đường chuẩn phải có hệ số tương

quan lớn hơn 0,98 và có ít nhất 75% số điểm trong đường chuẩn bao gồm cả mẫu có nồng độ cao nhất nằm trong khoảng từ 85 tới 115% Điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20% Trong một nghiên cứu có thiết kế tương tự, Arthur R.H và cộng sự đã công bố nồng độ ciprofloxacin tối

đa trung bình trong huyết tương khoảng 7,0 mg/L [14] Vì vậy, trong khuôn khổ đề tài này, ciprofloxacin được khảo sát trong khoảng nồng độ 0,2 – 10,0 mg/L để có thể định lượng được nồng độ ciprofloxacin trong huyết tương bệnh nhân có sự dao động về nồng độ

- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): Nồng độ được coi LLOQ nếu trên sắc đồ

mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho pic ciprofloxacin tách biệt với các pic tạp, có độ đúng trong khoảng từ 80 tới 120%, độ lặp lại với RSD < 20%

- Độ đúng: Xác định bằng cách định lượng tại ba nồng độ: mẫu kiểm chứng ở

nồng độ thấp (LQC), mẫu kiểm chứng ở nồng độ trung bình (MQC), mẫu kiểm chứng ở nồng độ cao (HQC) (mỗi nồng độ làm ít nhất 5 mẫu độc lập)

Độ đúng của phương pháp được tính bằng cách so sánh giá trị trung bình của các lần định lượng ở mỗi nồng độ so với giá trị thực Độ đúng tại mỗi nồng độ thực phải nằm trong khoảng 85-115%

- Độ chính xác trong ngày và khác ngày: Xác định độ chính xác (hay độ lặp

lại) bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ kiểm chứng được phân tích trong cùng ngày Giá trị này không được vượt quá 15% Tiến hành tương tự như xác định độ chính xác trong ngày Tính RSD của kết quả định lượng cho mỗi mẫu kiểm chứng (QC) trong ít nhất 3 ngày phân tích RSD phải không quá 15%

- Độ ổn định:

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông-rã đông: Bảo quản các mẫu ở -350C, sau đó lấy ra để rã đông ở nhiệt độ phòng Sau khi đã tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại tủ đông trong 12-24h Lặp lại chu kỳ đông-rã đông thêm 2 lần như vậy Tiến hành phân tích mẫu sau lần rã đông thứ 3 Kết quả định lượng ciprofloxacin sau 3 chu kỳ đông-rã đông phải tương đương với lượng ciprofloxacin trong mẫu phân tích ngay sau một lần rã đông

+ Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu: Rã đông mẫu huyết tương có CIP, sau đó để thêm ở nhiệt độ phòng 4 giờ Tiến hành định lượng mẫu này so sánh kết quả với nồng độ ciprofloxacin có trong mẫu được tách chiết ngay sau

rã đông Kết quả phải sai khác không có ý nghĩa thống kê

+ Độ ổn định dài ngày: Bảo quản mẫu trong điều kiện -350C Phân tích mẫu ciprofloxacin tại các thời điểm ban đầu, sau 7 ngày và sau 18 ngày So sánh

kết quả các lần định lượng, yêu cầu khác nhau không có ý nghĩa thống kê

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong dự báo hiệu quả điều trị thông qua các chỉ số PK/PD

2.3.2.1 Thiết kế và quy trình nghiên cứu

- Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả, tiến cứu

- Quy trình nghiên cứu:

- Bệnh nhân đủ điều kiện được tiến hành thu các thông tin liên quan bằng phiếu thu thông tin (phụ lục 1)

- Sau khi bệnh nhân được cho dùng ciprofloxacin liều 400mgx2/ngày, 3 liều liên tiếp, lấy máu ở liều thứ 4 tại các thời điểm: 0h (ngay trước khi truyền thuốc); 0,5h; 1,0h (thời điểm kết thúc truyền thuốc); 1,5h; 2h; 4h; 8h; 12h sau khi bắt đầu truyền thuốc

- Cách lấy mẫu: tiến hành lấy mẫu vào các thời điểm như trên thông qua một kim luồn được đặt trên tĩnh mạch không phải là vị trí đưa thuốc

- Thể tích máu lấy: 3 ml máu tĩnh mạch

- Xử lý mẫu: mẫu máu được chuyển vào ống nghiệm đã tráng heparin sẵn để chống đông và được bảo quản kín trong bình đá trước khi ly tâm Trong vòng

15 phút sau khi lấy, mẫu được ly tâm trong 15 phút với tốc độ 6000 vòng/phút

để tách huyết tương Lấy chính xác 1,5 ml huyết tương chuyển sang ống nghiệm nhựa đã mã hóa thông tin BN, bảo quản mẫu huyết tương bệnh nhân

ở nhiệt độ - 350C đến khi định lượng

2.3.2.2 Mô tả các đặc điểm bệnh nhân

Các đặc điểm bệnh nhân được thu thập trực tiếp từ bệnh án bệnh nhân ở khoa sau khi lấy mẫu, sử dụng phương pháp thống kê mô tả để mô tả đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu trên các chỉ tiêu:

- Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân: tuổi, giới tính

- Đặc điểm chức năng thận bệnh nhân: thông qua tính hệ số thanh thải creatinin (Clearance creatinin) bằng công thức Cockroft & Gault [3]

Clcr = [(140- tuổi) x cân nặng] / [( Nồng độ creatinin huyết thanh)x0,813]

Trong đó nam giới nhân hệ số 1,0 ; nữ giới nhân hệ số 0,85

Phân loại chức năng thận theo các mức bình thường (Clcr ≥ 80ml/phút), suy thận nhẹ (50 ml/phút < Clcr < 80ml/phút), suy thận vừa (30 ml/phút ≤Clcr≤ 50 ml/phút) [3]

- Đặc điểm bệnh lý, yếu tố nguy cơ gây nhiễm khuẩn và kết quả xét nghiệm vi sinh

2.3.2.3 Định lượng ciprofloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

Sử dụng phương pháp định lượng đã được xây dựng và thẩm định (mục 2.3.1) để định lượng ciprofloxacin trong huyết tương bệnh nhân

2.3.2.4 Xác định các thông số dược động học của ciprofloxacin

Sử dụng kết quả nồng độ thuốc trong huyết tương tính toán các thông

số dược động học theo trình tự sau:

- Chọn mô hình dược động học phù hợp với diễn biến nồng độ ciprofloxacin theo quy trình sau: nhập số liệu nồng độ của ciprofloxacin vào phần mềm Kinetica 5.0 Thử sự phù hợp với 2 mô hình dược động học 1 ngăn và 2 ngăn với chế độ liều lặp lại Chọn cách tính với “population” với cả hai mô hình

So sánh mức độ phân bố trong các đồ thị Y (calc)-Y (obs), Res – Y(obs), Wres – Y (calc) Giá trị các thông số AIC, BIC và OBJ Mô hình phù hợp hơn

là mô hình có các giá trị nồng độ phân bố đều hơn ở hai bên đường thẳng tham chiếu (reference line) và có giá trị AIC, BIC và OBJ thấp hơn

- Dùng cách tính với “population” trong phần mềm Kinetica 5.0 để tính các thông số dược động học cho từng cá thể với giá trị các thông số dược động học ban đầu được đặt như nhau Các giá trị ban đầu được chọn dựa trên các công bố trước đó Cho phần mềm chạy các bước lặp để tính các thông số thể tích phân bố (Vd), hằng số tốc độ thải trừ (Kel) theo mô hình phù hợp ở trên

Áp dụng công thức sau để tính các thông số dược động học còn lại [3] :

+ Độ thanh thải tổng : Cl = Vd x Kel

+ Thời gian bán thải: t1/2= ln 2/ Kel

+ AUC0-24 = Liều 24 giờ/Cl

- Nồng độ Cpeak được xác định là nồng độ cao nhất thu được sau khi kết thúc

CLSI và EUCAST đang được áp dụng tại các bệnh viện hiện nay [17],[23] Các giá trị MIC được sử dụng là: 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg/L

- Tính các tỷ số Cpeak/MIC và AUC0-24/MIC với từng giá trị MIC giả định ở trên

- Quy ước: Bệnh nhân có dự báo hiệu quả điều trị tốt nếu đạt:

AUC0-24/MIC ≥ 125 và Cpeak/MIC ≥ 10

- Với từng giá trị MIC giả định ở trên, xác định phần trăm số bệnh nhân có dự báo hiệu quả điều trị tốt

2.3.3 Xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm Kinetica 5.0 để tính các thông số dược động học

- Sử dụng phần mềm SPSS 15.0 để xử lý thống kê các kết quả nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CIPROFLOXACIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng ciprofloxacin trong huyết tương

3.1.1.1 Lựa chọn phương pháp chiết ciprofloxacin từ huyết tương

Tham khảo các công trình thẩm định ciprofloxacin đã được công bố (bảng 1.2), nghiên cứu chọn phương pháp xử lý mẫu là dùng tác nhân tủa protein Thử với các tác nhân tủa đã được đề xuất trong các nghiên cứu như acetonitril với tỷ lệ acetonitril : Huyết tương = 1:1, acetonitril + HClO4 có thêm CHCl3, H3PO4 và HClO4(20%) Kết quả cho thấy phương pháp kết tủa bằng H3PO4 và HClO4 (20%) cho thời gian tiến hành nhanh chóng, đơn giản

và có đáp ứng tốt với phân tích ciprofloxacin Quy trình kết tủa protein được tiến hành như sau :

Lấy 0,95 ml huyết tương và 0,05 mL dung dịch có chứa ciprofloxacin nồng độ nhất định, cho vào ống nghiệm này 20 L H3PO4 đặc + 200 L HClO4 nồng độ 20%, lắc xoáy (vortex) trong 45 giây và ly tâm 6000 vòng /phút x 15 phút Lớp dịch trong phía trên được hút bằng xi lanh rồi lọc qua màng lọc 0,45 mcm trước khi cho vào lọ để tiêm vào hệ sắc ký

3.1.1.2 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký

+ Xác định cột sắc ký

Tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan và phân tích về phương pháp HPLC định lượng CIP, xác định điều kiện để phù hợp với phòng thí nghiệm Nghiên cứu đã lựa chọn loại cột sắc ký Zorbax SB-C18 (4,6 x150 mm; 5m) dựa vào tính thuận tiện, thời gian lưu, hình dạng pic và khả năng tách phù hợp

+ Xác định pha động

Hệ pha động phổ biến nhất được Dược điển Anh, Mỹ, Việt Nam khuyên dùng trong định lượng ciprofloxacin là hệ pha động gồm đệm phosphat và acetonitril Tuy nhiên tùy theo các điều kiện khác nhau cần phải điều chỉnh tỷ lệ và pH khác nhau cho phù hợp Tiến hành khảo sát các hệ pha động gồm đệm phosphat ở pH 3 và 4 (khoảng pH tối ưu được đề xuất) và acetonitril với các tỷ lệ khác nhau Nghiên cứu đã lựa chọn được hệ pha động

là acetonitril : đệm phosphat (pH3) tỷ lệ 13 :87 Để khắc phục các khó khăn

trong quá trình phân tích ciprofloxacin bằng HPLC (hiện tượng pic kéo đuôi, chất phân tích bị rửa giải quá sớm, độ tìm lại thấp [45]) cho thêm vào hệ pha động Tetrabutylammonium dihydrosulfat (TBA.H2SO4) hòa tan cùng đệm phosphat (nồng độ TBA 0,05 M sau khi hòa tan) Hệ pha động này đảm bảo tách tốt ciprofloxacin cho hình dạng pic đẹp và thời gian lưu hợp lý (khoảng

5,7 phút)

- Xác định tốc độ dòng

Tiến hành khảo sát pha động với các tốc độ dòng: 1,5 mL/ phút; 1,2 mL/phút; 1,0 mL/phút Kết quả thực nghiệm cho thấy tốc độ dòng 1,0 mL/ phút cho thời gian lưu, độ phân giải phù hợp nhất

- Lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ mẫu ciprofloxacin trong pha động, kết quả cho thấy ciprofloxacin hấp thụ cực đại tại bước sóng 278nm (phụ lục)

Tóm lại: Từ các kết quả khảo sát, các điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:

- Pha tĩnh : Cột Zorbax SB-C18 (4,6x150mm; kích thước hạt 5m)

- Pha động : Acetonitril : Đệm phosphat pH 3,0 (0,05M TBA.H2SO4)=13:87

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

- Detector: UV với bước sóng   278 nm

- Thể tích tiêm mẫu: 50 L

- Thời gian phân tích cho một mẫu là: 7 phút

Điều kiện sắc ký trên cho phép tách pic ciprofloxacin ra khỏi các tạp chất trong huyết tương, pic thu được có hình dạng cân đối Thời gian phân tích một mẫu khoảng 7 phút là thuận lợi để có thể định lượng nhiều mẫu trong cùng một ngày

3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng ciprofloxacin trong huyết tương người bằng HPLC

3.1.2.1 Tính chọn lọc

Xử lý mẫu và phân tích mẫu theo qui trình đã chọn Tiến hành sắc ký với các mẫu (mẫu trắng, mẫu chuẩn) Ghi lại sắc đồ và so sánh sắc đồ giữa mẫu huyết tương trắng không có ciprofloxacin với sắc đồ mẫu HT trắng có ciprofloxacin (hình 3.1, 3.2, 3.3)

Hình 3.1: Sắc đồ mẫu huyết tương trắng