ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG MÔN KIỂNG (Caladium bicolor(Air.) Vent)

TRUỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SHƯD NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG MÔN KIỂNG Caladium bi

TRUỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SHƯD

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG MÔN KIỂNG

(Caladium bicolor (Air.) Vent)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH

TRỒNG TRỌT

Cần Thơ, tháng 05 năm 2011

TRUỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SHƯD

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG MÔN KIỂNG

(Caladium bicolor (Air.) Vent)

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ VĂN BÉ

Cần Thơ, tháng 05 năm 2011

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG Chứng nhận luận văn tốt nghiệp với đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN

QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY MÔN KIỂNG (Caladium bicolor (Air.)

Vent)” Do sinh viên NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG thực hiện và đề nạp

Kính trình Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2011

TS Lê Văn Bé

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG Luận văn tốt ngiệp kèm theo đây, với đề tựa là “ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY MÔN KIỂNG (Caladium bicolor

(Air.) Vent)”, do NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG thực hiện và báo cáo, và đã

được Hội đồng chấm luận văn thông qua

Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức:………

Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:………

………

………

………

………

Duyệt Khoa Cần Thơ, ngày .tháng 05 năm 2011 Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD Chủ tịch Hội đồng

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Huyền Trang

iv

LỜI CẢM ƠN!

Kính dâng

Cha, mẹ đã hết lòng nuôi dạy con nên người

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

Thầy Lê Văn Bé đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài, người đã chỉ cho tôi cách mở khóa đến với thành công

Cô Lê Thị Điểu, anh Nguyễn Văn Kha, đã trực tiếp chỉ dẫn, luôn động viên

và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong thời gian qua

Thầy cố vấn học tập Trần Văn Hâu đã quan tâm dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm đại học

Quý Thầy, Cô Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt khóa học

Xin chân thành cảm ơn

Xin trân trọng ghi nhớ những chân tình, sự giúp đõ của bè bạn, tập thể lớp Trồng Trọt K33B và các bạn Phương Thư, Thành Nhân, Văn Thuấn… đã nhiệt tình giúp đỡ, luôn gắn bó, động viên, chia sẻ những khó khăn cũng như vui, buồn trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

v

QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

 Họ và tên: NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG Giới tính: Nữ

 Ngày, tháng, năm sinh: 06/08/1988 Dân tộc: Kinh

 Nơi sinh : Long Mỹ- Hậu Giang

 Chỗ ở hiện nay: số 188, Ấp 3, xã Vĩnh Thuận Đông, Huyện Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang

Người khai ký tên

Nguyễn Thị Huyền Trang

HÒA SINH TRƯỞNG VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN QUÁ TRÌNH VI

NHÂN GIỐNG CÂY MÔN KIỂNG (Caladium bicolor (Air.) Vent)” Luận văn

tốt nghiệp kỹ sư ngành Trồng Trọt, Khoa Nông Ngiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN BÉ

TÓM LƯỢC

Đề tài “Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh đến quá

trình vi nhân giống cây môn kiểng (Caladium bicolor (Air.) Vent)” được thực hiện

với mục tiêu nhằm xác định liều lượng chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho quá trình vi nhân giống loại cây này Hai thí nghiệm nhân chồi

và tạo rễ được tiến hành song song trong hai điều kiện nuôi cấy khác nhau là (1): phòng tăng trưởng với nhiệt độ 24 ± 3oC, cường độ ánh sáng từ 1000-2000 lux và (2): lồng kiếng với nhiệt độ trung bình 31 ± 3oC và cường độ ánh sáng từ 6000-

rễ/cụm chồi cũng sau 8 tuần nuôi cấy Sức sống của cây con in vitro từ ở phòng

tăng trưởng và lồng kiếng khá cao khi thuần dưỡng tại nhà lưới lần lượt là 98% và 100% sau 4 tuần thuần dưỡng Việc sử dụng ánh sáng tự nhiên ở lồng kiếng để nhân

giống cây môn kiểng in vitro thay thế cho ánh sáng đèn nhân tạo ở phòng tăng

trưởng giúp làm giảm khoảng 21% chi phí tiêu thụ điện năng trong thí nghiệm này

Từ khóa: Môn kiểng, nhân chồi, tạo rễ, in vitro

TÓM LƯỢC

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH BẢNG x

DANH SÁCH HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY MÔN KIỂNG 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của môn kiểng 3

1.2 VI NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ ARACEAE 4

1.3 CÁC GIAI ĐOẠN CỦA QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG 4

Giai đoạn 0 : chuẩn bị cây mẹ 4

Giai đoạn 1: khử trùng, tạo chồi mô nuôi cấy 4

Giai đoạn 2: Nhân chồi 6

Giai đoạn 3: Ra rễ 6

Giai đoạn 4: Thuần dưỡng 7

1.4 ƯU VÀ KHUYẾT ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG 7

1.4.1 Ưu điểm 7

1.4.2 Khuyết điểm 8

1.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG VÀ NHIỆT ĐỘ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 9

1.5.1 Ánh sáng 9

1.5.2 Nhiệt độ 10

1.6 VI NHÂN GIỐNG GIÁ THÀNH THẤP 10

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 12

2.1 PHƯƠNG TIỆN 12

2.1.1 Thời gian và địa điểm 12

2.1.2 Vật liệu thí nghiệm 12

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 12

2.1.4 Hóa chất thí nghiệm 12

2.1.5 Điều kiện phòng thí nghiệm 13

2.2 PHƯƠNG PHÁP 14

2.2.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu cấy 14

2.2.2 Giai đoạn bố trí thí nghiệm 15

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện ngoại cảnh đến khả năng nhân chồi môn kiểng 15

2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của liều lượng NAA và điều kiện ngoại cảnh đến sự thành lập rễ của cây Môn Kiểng 16

2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 MỘT SỐ GHI NHẬN TỔNG QUÁT VÀO GIAI ĐOẠN TẠO MẪU CẤY18 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA LIỀU LƯỢNG BA VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI MÔN KIỂNG 18

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA LIỀU LƯỢNG NAA VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN SỰ TẠO RỂ IN VITRO CHỒI MÔN KIỂNG 23

3.4.ƯỚC TÍNH CHI PHÍ SẢN XUẤT 29

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

4.1 KẾT LUẬN 34

4.2 ĐỀ NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

MS môi trường Murashige & Skoog (1962)

x

DANG SÁCH BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện ngoại cảnh đến sự

sinh trưởng và phát triển môn kiểng sau 8 tuần nuôi cấy

19

3.2

Ảnh hưởng của sự tương tác giữa liều lượng BA và điều

kiện ngoại cảnh đến sự gia tăng số lá/cụm môn kiểng sau 8

tuần nuôi cấy

22

3.3 Ảnh hưởng của liều lượng NAA và điều kiện ngoại cảnh đến

3.4

Ảnh hưởng của sự tương tác giữa liều lượng NAA và điều

kiện ngoại cảnh đến sự gia tăng chiều cao chồi môn kiểng

sau 8 tuần

26

3.5 Ước tính giá thành sản xuất một chồi môn kiểng (C bicolor)

xi

DANH SÁCH HÌNH

1.1 (A) Cây Môn Kiểng (Caladium bicolor (Air.) Vent) (B) và

(C): các giai đoạn phát triển của lá

4

2.1 Lồng kiếng đặt trong nhà lưới để vi nhân chồi 13 2.2 (A) Cây môn kiểng làm vật liệu nuôi cấy; (B): Củ môn kiểng

được cắt gọt để tách chồi và (C) Chồi sau khi tách và cấy

vào môi trường

14

3.1 Sự hình thành chồi môn kiểng in vitro sau 8 tuần sau khi

cấy (A) và (B): số chồi hình thành của nghiệm thức đối

chứng (0 mgBA/lít) lần lượt ở điều kiện là phòng tăng

trưởng và lồng kiếng (C) và (D) số chồi hình thành ở môi

trường MS + 0,5 mgBA/l ở phòng tăng trưởng và lồng kiếng

20

3.2 Sự hình thành rễ in vitro của chồi môn kiểng sau 8 tuần nuôi

cấy (A) và (B): Môi trường MS (0 mgNAA/lít) đặt ở phòng

tăng trưởng và lồng kiếng (C) và (D): MS + 0,1 mgNAA/lít

đặt ở phòng tăng trưởng và lồng kiếng (E) và (F): MS + 0,5

mgNAA/lít đặt ở phòng tăng trưởng và lồng kiếng (G) và

(H): MS + 1,0 mgNAA/lít đặt ở phòng tăng trưởng và lồng

kiếng

28

3.3 Cây con ở hai điều kiện nuôi cấy của lồng kiếng và phòng

tăng trưởng sau 4 tuần thuần dưỡng

29

4.1 Tóm tắt quy trình vi nhân giống cây môn kiểng (C bicolor)

sử dụng điều kiện nuôi cấy của lồng kiếng

35

MỞ ĐẦU

Trong những năm trở lại đây, khi cuộc sống của người dân ổn định hơn thì thú chơi hoa kiểng trở thành một phần không thể thiếu trong đời sống tinh thần Ngày nay, nghề trồng hoa kiểng ở đồng bằng sông Cửu Long ngày càng phát triển mạnh đặc biệt là cây kiểng lá, đa dạng về màu sắc và chủng loại

Môn kiểng (Caladium bicolor (Air.) Vent) hay còn gọi là môn đốm là một giống kiểng lá gồm rất nhiều chủng loại về màu sắc, đang được chú ý hiện nay Loại cây

này mọc tự nhiên nên không đòi hỏi khắc khe về kỹ thuật trồng và chăm sóc như những loại cây kiểng khác Môn kiểng có bộ lá rất đẹp, nhiều màu sắc, tuổi thọ của

lá dài, trưng bày được quanh năm, phù hợp với việc trang trí trong nhà và phòng làm việc Môn kiểng là loại cây thân thảo, một lá mầm và sinh sản vô tính, vì vậy việc nhân giống chủ yếu nhờ vào số lượng củ nên hệ số nhân thấp (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005) Thêm vào đó chu kỳ sinh trưởng của môn kiểng rất ngắn khoảng 5-6 tháng, nên khả năng tạo củ để làm giống còn hạn chế

Hiện nay, vi nhân giống là phương pháp hiệu quả trong công tác giống cây trồng, cải thiện năng suất của các giống cây trong nông nghiệp Do đó, nhân giống môn kiểng bằng phương pháp cấy mô sẽ mang lại hiệu quả với hệ số nhân chồi cao trong một thời gian ngắn Hơn nữa, cây con vẫn giữ được những đặc tính tốt của của cây

mẹ, sạch bệnh và độ đồng đều cao Tuy nhiên, việc đầu tư trang thiết bị cho phòng

nuôi cấy mô là rất lớn, chi phí đầu vào để sản xuất cây con in vitro khá cao mà chủ

yếu là chi trả cho chi phí tiêu thụ điện năng của đèn neon và máy điều hòa nhiệt độ Hiện nay, có nhiều nghiên cứu sử dụng ánh sáng tự nhiên từ lồng kiếng để nuôi cấy

in vitro nhiều loại cây trồng cho thấy tiết kiệm được chi phí và giảm giá thành sản

xuất cây con như vi nhân giống cây cỏ Vertiver (Võ Thành Tân, 2004), cây nghệ Hồng Đào (Nguyễn Thị Tố Uyên, 2008), cây nghệ Đen (Trần Thị Mỹ Khuê, 2010), cây Cúc ‘Đài Loan’ Vàng (Tống Hồ Nam, 2010), cây Chuối (Lê Phương Thư, 2011)

Vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ngoại

cảnh đến quy trình vi nhân giống cây môn kiểng (Caladium bicolor (Air.) Vent)”

2được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định liều lượng chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho quá trình vi nhân giống loại cây này

CHƯƠNG 1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY MÔN KIỂNG

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Môn kiểng có tên khoa học là Caladium bicolor (Air.) Vent, còn được gọi là môn

đốm hay môn trổ Thuộc họ Araceae (họ Ráy), bộ Arale (ráy), lớp phụ Monocolyledonae, chi Caladium (Võ Văn Chi, 2003)

Cây môn được trồng nhiều ở châu Á và nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, nguồn gốc của chúng còn là vấn đề cần được nghiên cứu Gần đây có nhóm tác giả thống nhất rằng nhiều dạng hoang dại và dạng trồng của cây môn có nguồn gốc tại các dãy đất kéo dài từ Đông Nam Ấn Độ và Đông Nam Á tới Papau New Guinea và

Melanesia (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005) Nhưng theo Wutoh et

al., (1992) cho rằng loại cây này có nguồn gốc từ Đông Nam Ấn Độ và Bangladesh

Sau đó, chúng được phát tán đi nhiều hướng, đến Ai Cập và lan tỏa khắp Châu Phi, hướng khác qua Đông Nam Á và Nam Thái Bình Dương

1.1.2 Đặc điểm thực vật của môn kiểng

Môn kiểng là loài thân thảo, chịu bóng và mọc khỏe, thuộc dạng thân ngầm, củ nhỏ với hình dạng gần như tròn Lá hình khiên rộng, thuôn tù có mũi ở đỉnh, có gân chân vịt, các thuỳ có gốc tròn, dính liền nhau ít hay nhiều từ cuống lá, lá có nhiều màu sắc rực rỡ từ xanh đến đỏ, hồng ,trắng (Hình 1.1) Cuống lá dài bằng 3-7 lần phiến lá Cụm hoa là bông mo, buồng ngắn hơn mo Hoa không có bao hoa, nhị dính thành nhị tụ bầu thuông, một ô, nhiều noãn, quả mọng màu trắng (Võ Văn Chi, 2003)

Hiện nay có rất nhiều giống môn kiểng được trồng trong chậu, trong vườn làm cảnh, có hơn 1000 loài đã được đặt tên nhưng ở Việt Nam chỉ có một vài loài môn kiểng (Võ Văn Chi, 2003)

Hình 1.1 (A) Cây Môn Kiểng (Caladium bicolor (Air.) Vent) (B) và (C): các giai

đoạn phát triển của lá

1.2 VI NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ ARACEAE

Một số giống môn thuộc họ Araceae đã được nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

như môn Colocasia esculenta và C antiquorum (L.) Schott (Nyman et al., 1982; Yam et al., 1991), tiểu hồng môn (Nguyễn Thị Thanh, 2007), lan thanh đốm

(Nguyễn Thị Diệu, 2007), môn cao và môn kiểng (Nguyễn Thị Mỹ Phương, 2009),

C esculenta (L.) Schott (Wagih, 1997; Juan et al., 2006)…

1.3 CÁC GIAI ĐOẠN CỦA QUÁ TRÌNH VI NHÂN GIỐNG

Theo Debegh và Zimmerman (1991), sự thành công của vi nhân giống chỉ đạt được khi hoàn thành 4 giai đoạn Việc không thực hiện một giai đoạn cũng có nghĩa là công việc vi nhân giống không thành công

Giai đoạn 0 : chuẩn bị cây mẹ

Giai đoạn này góp phần rất lớn vào sự thành công của các giai đoạn sau Do đó, cây mẹ phải sạch bệnh và đang trong giai đoan tăng trưởng mạnh thì khi nhân giống

sẽ đạt hiệu quả cao

Giai đoạn 1: khử trùng, tạo chồi mô nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là mẫu cấy sống và không bị nhiễm Có thể áp dụng biện pháp cơ học hay hóa học hoặc kết hợp giữa chúng để diệt mầm bệnh tồn tại trên mẫu cấy Đó là sự kết hợp giữa một phương pháp khử trùng bề mặt đầy đủ và

Cu2+ đôi khi cũng được sử dụng như chất diệt khuẩn

Đối với cây họ Araceae, nuôi cấy mô được xem là một phương pháp quan trọng trong việc loại trừ nguồn tạp nhiễm sống trên bề mặt và trong củ Nguồn tạp nhiễm

là nấm và vi khuẩn nói chung thì dể loại trừ Tuy nhiên, nguồn tạp nhiễm là virus thì khó hơn Do đó, cần sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nói chung hay kết hợp xử lý nhiệt, hay hóa chất hoặc kết hợp chung chúng lại với nhau để loại trừ nguồn tạp nhiễm khỏi cây trồng (Wagih, 1997)

Bộ phận của cây môn mẹ dùng để vô trùng mẫu cấy tạo mẫu cấy mô có thể là hạt

(Wagih 1997), bao phấn, đỉnh sinh trưởng (Nyman et al., 1982; Yousuf et al.,

1997), lá, đoạn thân mang mầm bên (Nguyễn Thị Thanh, 2007; Nguyễn Thị Mỹ Phương, 2009),… tùy thuộc vào loại cây và nguồn vật liệu ban đầu mà có phương pháp vô trùng mẫu cấy khác nhau và có sự thành công khác nhau

Để vô trùng mẫu cấy hạt các cây họ Araceae và các loại hạt lai giữa chúng, Wagih (1997) đã xử lý nhiệt trước khi khử trùng lại bằng 1,5% chlorine (sodium hypochloride) và Tween 20 (1 giọt/ 100ml dung dịch) trong 15 phút, sau đó rữa lại

3 lần bằng nước cất vô trùng Nhiệt độ dược sử dụng biến động từ 52-60oC trong khoảng thời gian từ 60-120 phút Hiệu quả của công thức này tương đối cao (42-

89% hạt nẩy mầm và 100% hạt nẩy mầm điều không nhiễm bệnh trong điều kiệu in

vitro) Tuy nhiên, đây là một phương pháp khó áp dụng đối với các bộ phận khác

trên cây như thân, lá, củ… vì mẫu sẽ mất khả năng sống do tổn thương nhiệt

Đối với mẫu là củ Cocoyam (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott) và taro (C

esculenta (L.) Schott), Juan et al., (2006) đã khử trùng bằng dung dịch nước rữa

chén, dung dịch cồn và thuốc tẩy (2,5%) Sau đó tách đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy Theo ông cách khử này cho hiệu quả tương đối cao

Theo Nguyễn Thị Mỹ Phương (2009), củ cây môn kiểng được khử trùng 2 lần bằng Clorox 20% trong 15 phút, sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,05% trong 30 phút cho tỷ lệ đỉnh sinh trưởng sạch là 91,7%

Giai đoạn 2: Nhân chồi

Tùy thuộc vào giống cây và chất điều hòa sinh tưởng được bổ sung mà có thể có

được những mẫu in vitro mong muốn trong một khoảng thời gian nhất định

Sự gia tăng chồi phụ thuộc nhiều vào việc sử dụng cytokinin Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô người ta thường dùng kết hợp auxin và cytokinin để tạo những dạng phát sinh hình thái mong muốn Đó là vì sự phân bố của auxin và cytokinin điều

khiển chặt chẻ tất cả các giai đoạn trong suốt quá trình phát triển của cây con in

vitro (Sean et al., 2007)

Đối với họ Araceae, Juan et al., (2006) cho rằng nhân giống theo phương pháp cổ

truyền cho hiệu quả tương đối thấp vì thời gian có một củ tương đối dài (6-8 tháng)

và cây rất dễ nhiễm bệnh

Theo Josua et al., (1992) cho rằng nhân chồi bằng cách tái sinh chồi từ mô sẹo

kết quả cho thấy NAA và BA có ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi từ callus Trong đó, việc bổ sung 1mgNAA/l và 1mg BA /l cho sự nhân chồi cao nhất (3,1 chồi và 26,5 rễ) Cũng theo nhóm tác giả này cho biết chồi tái sinh từ callus không ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi

Để nhân chồi từ mẫu là hạt, môi trường được sự dụng là MS bổ sung NAA (0,5mg/l) và BA (0,5 mg/l) và dịch trích từ củ môn (20ml/l) ở 28  20C, quang kỳ 18h/ ngày và cường độ ánh sáng 150 E/m2/s Khả năng tái sinh chồi từ hạt ở điều

kiện in vitro có thể đạt 96% (Wagih, 1997)

Đối với nguồn mẫu là đỉnh sinh trưởng, Juan et al., (2006) đề nghị nên nhân chồi

trong môi trường MS bổ sung 20% sucrose và 1 mg BA/l Phương pháp này có thể đạt 4,6-4,7 chồi/ mẫu cấy trong 4 tuần nuôi cấy

Giai đoạn 3: Ra rễ

Giai đoạn này giúp cây con phát triển hoàn chỉnh trước khi chuyển ra điều kiện bên ngoài (Debergh và Read, 1991; Altman, 2000) Ra rễ là giai đoạn rất quan trọng

của bất kỳ chương trình nhân giống in vitro nào Một số ít loài hình thành rễ bất

định trong suốt giai đoạn 3, nhưng thông thường cần phải tiến hành ra rễ trong một môi trường hoặc một phương pháp đặc biệt để kích thích ra rễ Để giảm chi phí vi nhân giống, nhiều phòng thí nghiệm không ra rễ trong ống nghiệm mà tiến hành ra

rễ bên ngoài nhà lưới (George, 1993) Debergh và Manene (1981) đã chia giai đoạn này thành 2 giai đoạn nhỏ:

3a: Kéo dài các mầm chồi đã hình thành trong giai đoạn 2 đến một kích thước phù hợp cho giai đoạn 3b

3b: Ra rễ cho những chồi giai đoạn 3a trong điều kiện in vitro hoặc extra

vitrum

Giai đoạn 4: Thuần dưỡng

Đây là giai đoạn giảm thiểu sự chết của cây con khi chuyển từ điều kiện in vitro

sang nhà lưới hoặc trồng ngoài đồng Trong giai đoạn này cần quan tâm đến các yếu

tố như nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng của nơi thuần dưỡng và tình trạng cây con

Trong điều kiện in vitro, ẩm độ trong bình nuôi cấy thường cao, quang kỳ dài,

nhiệt độ tương đối ổn định nên khi chuyển sang điều kiện nhà lưới hay ngoài đồng, cây dễ bị sốc và chết, nguyên nhân là do sự mất nước quá nhiều của cây con Sự mất nước trong giai đoạn này liên quan sự thoát hơi nước quá nhiều ở bề mặt lá và

sự hấp thu nước của rễ quá yếu, hiện tượng này liên quan đến cấu trúc hình thái và giải phẫu của lá, rễ Thuần dưỡng là một kỹ thuật cần thiết nhằm hạn chế sự chết

cây con khi chuyển từ giai đoạn in vitro sang điều kiện ngoài tự nhiên (Nguyễn Bảo

Toàn, 2005)

1.4 ƯU VÀ KHUYẾT ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG

1.4.1 Ưu điểm

Theo George (1993) vi nhân giống có các lợi điểm sau:

- Bắt đầu từ những mẫu cấy nhỏ, chỉ cần một khoảng không gian nhỏ để nuôi cấy hoặc nhân lên thành một số lượng rất lớn

- Quá trình nhân giống được thực hiện trong điều kiện vô trùng, không mang mầm bệnh Do đó cây con tạo ra không nhiễm khuẩn, nấm và các vi sinh vật khác

- Có thể tạo ra một số lượng lớn cây sạch virus

1.4.2 Khuyết điểm

Theo George (1993) thì bất lợi chủ yếu của phương pháp vi nhân giống là cần phải có kỹ năng vận hành thành công, đòi hỏi kỹ thuật cao, trang thiết bị đắt

tiền Hơn nữa kết quả nhân giống in vitro thường:

- Mặc dù phương pháp này có thể tạo ra một số lượng cây con lớn, nhưng cây con ban đầu còn nhỏ và đôi khi mang những tính trạng không mong muốn

- Để sống trong điều kiện in vitro, mẫu cấy cần được nuôi trong môi trường

chứa đường và một số nguồn carbon khác Ban đầu chúng không có khả năng tạo ra những hợp chất cần thiết hay những hợp chất hữu cơ từ quang hợp (không thể tự dưỡng) và chúng phải chịu đựng một thời gian chuyển đổi trước khi có khả năng phát triển độc lập

- Khi cây con được nuôi trong bình chứa bằng thủy tinh hay nhựa có ẩm độ tương đối cao, thường sự quang hợp tổng không đủ, cây con thường mẫn cảm, mất nhiều nước khi đưa ra môi trường bên ngoài

- Khả năng tạo ra những cây trồng bị biến dạng di truyền có thể tăng

- Đòi hỏi kỹ thuật cao và các trang thiết bị đắt tiền

1.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG VÀ NHIỆT ĐỘ ĐẾN QUÁ TRÌNH

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.5.1 Ánh sáng

Ánh sáng là nhân tố môi trường quan trọng kiểm soát sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, vì nó liên quan đến quang hợp, sự quang dưỡng và sự phát sinh hình thái Sự chiếu sáng có thể là quan trọng nhất vì nó liên quan rất nhiều đến quang hợp và hô hấp Theo George (1993) các đặc tính của ánh sáng ảnh hưởng đến sự

sinh trưởng in vitro là: độ dài sóng, cường độ sáng và thời gian chiếu sáng hay chu

kỳ sáng Mỗi thuộc tính này đều ảnh hưởng lên sự phát sinh quang hình thái và sự quang hợp Các ảnh hưởng có thể trực tiếp lên các mô được nuôi cấy, hoặc gián tiếp thông qua tác động của ánh sáng lên cây mẹ Trong trường hợp sau, sự sinh trưởng

hoặc sự phát sinh hình thái thể hiện trong điều kiện in vitro bị giảm bớt khi cây mẹ

được xử l ý ánh sáng trước khi lấy mẫu

Khi được cung cấp đầy đủ CO2 và năng lượng ánh sáng, theo l ý thuyết những chồi

có lá hoặc cây con in vitro đủ khả năng đồng hóa carbon từ quang hợp để tồn tại

dạng tự dưỡng Nếu CO2 hoặc ánh sáng dưới ngưỡng cho phép, quang hợp đạt tới điểm bù của nó, tại đây tỷ lệ chất khô tích lũy không đủ để cung cấp cho hô hấp

Nếu quá trình này xảy ra lâu dài ở điều kiện in vivo thì một phần hay cả cây trồng sẽ

chết Trong tình huống ánh sáng không đủ để đưa quang hợp lên trên điểm bù có thể đưa đến tích lũy CO2 trong bình nuôi cấy, vì tỷ lệ hô hấp vượt quá sự quang hợp (George, 1993)

* Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của chồi trong ống nghiệm

Theo Murashige (1974) thì chồi trong ống nghiệm phát triển ở cường độ sáng khoảng 1000 lux (14 – 15 µmol.m-2.s-1) Cây Limonium sinh trưởng trong điều kiện quang tự dưỡng in viro kết hợp với cường độ chiếu sáng cao (200 µmol.m-2.s-1) cho nhiều lá, hàm lượng diệp lục tố, tỷ lệ quang hợp thuần và phần trăm sống sót khi đem ra ngoài cao hơn những cây sinh trưởng trong điều kiện chiếu sáng yếu (50 và 100µmol.m-2.s-1) Cây Siningia có thể tạo chồi ở cường độ sáng từ 3000 – 10.000lux (Haramaki, 1971), cây hoa kiểng nhiệt đới cũng tạo chồi mạnh với điều kiện sáng từ

3000 – 10.000 lux (Miller và Murashige, 1976) Tùy theo loài mà yều cầu cường độ

sáng khác nhau trong giai đoạn nhân chồi Cây Gloxinia tạo chồi ở cường độ sáng khoảng 3.200 lux, nhưng khi tăng cường độ ánh sáng lên 10.700 lux thì sự sinh trưởng của chồi bị giới hạn (Haramaki, 1971)

* Ảnh hưởng của ánh sáng đối với sự thành lập rễ

Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng ánh sáng làm tăng sự thành lập rễ và sự sinh trưởng của chồi (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Một số nghiên cứu khác thì cho rằng điều kiện tối, thích hợp cho sự thành lập rễ Ánh sáng làm giảm sự ra rễ là do có sự suy giảm hàm lượng IAA nội sinh trong cây (George, 1993)

1.5.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng khác nhau lên tiến trình sinh l ý như hô hấp và quang hợp, và

từ lâu người ta đã biết nó ảnh hưởng rất lớn đến nuôi cấy mô thực vật và vi nhân giống (Altman, 2000) Trong môi trường tự nhiên, thực vật trãi qua những khoảng biến động nhiệt độ lớn, đặt biệt giữa ngày và đêm Do đó nên tập cho cây trồng quen với sự biến đổi này giúp cây trồng cải thiện sự sinh trưởng và ở những phòng tăng trưởng không sử dụng máy điều hòa thì tiết kiệm được chi phí nhiên liệu do nhiệt độ về đêm giảm (George, 1993)

1.6 VI NHÂN GIỐNG GIÁ THÀNH THẤP

Cây cấy mô luôn có giá thành cao hơn những loại cây giống khác do được nhân

giống trong môi trường phòng tăng trưởng có ánh sáng và nhiệt độ nhân tạo với một

lượng lớn điện năng được tiêu thụ vào mục đích thắp sáng và điều hoà nhiệt độ phòng tăng trưởng luôn luôn ổn định ở nhiệt độ 24 ± 3oC, 12 giờ chiếu sáng trong ngày bằng bóng đèn Đèn được sử dụng trong chiếu sáng nhân tạo là đèn huỳnh quang chỉ cung cấp nhu cầu năng lượng tối thiểu cho quang hợp, ngoài ra đèn còn tỏa ra một lượng nhiệt làm tăng thêm chi phí làm mát bằng máy điều hòa

Để làm giảm giá thành sản xuất cây cấy mô, các nhà khoa học phát triển quy trình nuôi cấy cải tiến như: Sử dụng nguồn sáng tự nhiên thay cho ánh sáng đèn (George, 1993;), sử dụng môi trường lỏng với hệ thống bình có chứa sẵn dinh dưỡng (Kodym

và Zapata-Arias, 1999; 2001) Ngoài ra, để làm giảm giá thành sản xuất cây khóm cấy mô Be và Debergh (2006) đã sử dụng môi trường tự nhiên của nhà lưới (hệ thống mở) làm giảm 20% giá thành

Trong quy trình vi nhân giống thì giai đoạn nhân chồi cần nhiều thời gian nhất Tương tự như vậy, khâu ra rễ cũng cần nhiều thời gian để cây vươn dài và hoàn chỉnh hệ thống rễ trước khi đem cây cấy mô ra ngoài Vì vây, cần một lượng lớn điện năng được tiêu thụ Nhưng hiện nay điện năng ngày càng khan hiếm, trong khi điều kiện tự nhiên của nước ta có nguồn nhiệt năng và quang năng dồi dào đón nhận

từ mặt trời ở vị trí cận xích đạo Do đó, thay đổi sự chiếu sáng nhân tạo sang sử dụng ánh sáng tự nhiên là một lựa chọn giảm chi phí đáng kể, góp phần thân thiện với môi trường, tất nhiên cây con tạo ra sẽ có giá thành thấp

Một số nghiên cứu nghiên cứu nhằm giảm giá thành sản suất như: sử dụng luân phiên ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên (Kodym và Zapata-Arias, 1999; 2001), sử

dụng ánh sáng của mái nhà (Kodym và Zapata-Arias, 2001) để nhân giống cây chuối cấy mô Lê Văn Bé et al., (2005) đã vi nhân giống cây khóm, Võ Thanh Tân

(2004) vi nhân giống cỏ Vetiver ở ĐBSCL khi sử dụng ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên của nhà lưới thay cho phòng tăng trưởng, chi phí sản xuất cây con tiết kiệm

lần lượt là 18,78% và 22% Vũ Ngọc Phượng et al., (2007) nghiên cứu về việc nhân giống lan Dendrobium Madam Cherry, Doritanopsis Sarah Jones và Catleya bằng

ánh sáng tự nhiên và cho kết quả rất tốt

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: Thực hiện từ tháng 05/2010 đến tháng 05/2011

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và nhà lưới của bộ môn sinh sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

lý-2.1.2 Vật liệu thí nghiệm

Đối tượng thí nghiệm là cây môn kiểng (Caladium bicolor (Air.) Vent) trong nhà

lưới bộ môn Sinh lý – Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Thiết bị thí nghiệm: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, cân điện tử, bếp điện từ, máy đo pH, micropipette, keo cấy mẫu (6 x 12 cm), máy đo ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ…

- Vitamin: pyridoxine, thiamine, acid nicotinic

- Chất điều hoà sinh trưởng: Benzyl adenine (BA), α-Napthalene acetic acid (NAA)

- Chất khử trùng: HgCl2 0,1% để khử trùng bề mặt mẫu vật và cồn 70% để khử trùng tay

Lồng kiếng (ngoài phòng tăng trưởng)

Lồng kiếng trong thí nghiệm này cũng giống như là phòng tăng trưởng có diện tích

10 m2, đặt tại nhà lưới bộ môn Sinh lý – Sinh hóa được bao xung quanh bằng kính

sử dụng hoàn toàn ánh sáng tự nhiên, cường độ ánh sáng dao động trong khoảng 6.000 – 8.000 lux (hình 2.1) Hệ thống giải nhiệt cho phòng là quạt hút để lấy không khí nóng ra ngoài, và một máy làm mát không khí Không khí đi vào phải qua hai màng lọc: màng lọc bụi và màng lọc ẩm Màng lọc bụi để lọc bớt bụi bảo đảm giảm thiểu bụi bẩn trong không gian thí nghệm Màng lọc ẩm có nhiệm vụ cung cấp ẩm

độ làm mát không khí trong phòng Thí nghiệm sử dụng nhiệt kế và thiết bị đo cường độ ánh sáng hai lần mỗi ngày (10 giờ sáng và 3 giờ chiều) cho thấy nhiệt độ trong lồng kính trung bình 31  3oC, cường độ ánh sáng trung bình từ 6.000 – 8.000 lux

Hình 2.1 Lồng kiếng đặt trong nhà lưới để vi nhân chồi

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu cấy

Chọn cây môn kiểng đang trong giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh, không bị sâu bệnh, khoảng 70 - 80% lá trên cây đã chuyển sang màu hồng Sau đó cắt gọt phần củ có mang chồi và rửa sạch củ để tách lấy phần chồi (hình 2.2)

)

Hình 2.2 (A) Cây môn kiểng làm vật liệu nuôi cấy; (B): Củ môn kiểng được cắt

gọt dùng để tách chồi và (C) Chồi sau khi tách và

cấy vào môi trường Phương pháp khử trùng mẫu: Mẫu được rửa dưới vòi nước sạch chảy liên tục,

sau đó mẫu được đưa vào phòng thí nghiệm và ngâm trong dung dịch nước rửa chén

Mỹ Hảo 1% trong 15 phút, tiếp theo rửa sạch dưới vòi nước 2-3 phút, sau đó ngâm mẫu trong dung dịch Javel 20% trong 20 phút và ngâm 2 lần, rửa sạch mẫu ngâm 30 phút trong HgCl2 1% Cuối cùng rửa mẫu 4 lần bằng nước cất vô trùng để tách đỉnh sinh trưởng

Chồi sau khi tách được cấy trong môi trường MS có bổ 1 mgBA/lít và được đặt trong phòng tăng trưởng có nhiệt độ 24 ± 30C, ẩm độ, áng sáng 1.000-2.000 lux Khoảng 8-10 tuần sau khi cấy, mẫu bắt đầu hình thành chồi và chồi được cấy chuyền trong môi trường tương tự để tạo lượng lớn chồi làm vật liệu cho các thí nghiệm sau

2.2.2 Giai đoạn bố trí thí nghiệm

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện ngoại cảnh đến

khả năng nhân chồi môn kiểng

Mục tiêu: Tìm môi trường với liều lượng BA và điều kiện ngoại cảnh thích hợp

nhất cho sự nhân chồi của cây môn kiểng

Vật liệu thí nghiệm: Chồi cây môn kiểng in vitro được tạo ra từ giai đoạn tạo mẫu

ban đầu, có chiều cao 50-60 mm, mang 2-3 lá Chồi được cắt bỏ rễ, lá, còn lại đoạn thân khoảng 15 mm để bố trí

Phương pháp tiến hành: Thí nghiệm được bố trí theo thể khối thức hoàn toàn ngẫu

nhiên trong hai điều kiện ngoại cảnh (lồng kiếng và phòng tăng trưởng) với các liều lượng BA (mg/lít) khác nhau

Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức, 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại một keo, mỗi keo cấy 2 cụm chồi, mỗi cụm cấy 2 chồi đơn

Nhân tố thứ nhất là điều kiện nuôi cấy khác nhau: Phòng tăng trưởng và lồng kiếng

Nhân tố thứ hai là dãy liều lượng BA + 20% nước dừa được bố trí như sau:

1/ Đối chứng 2/ 0,5 mg BA/lít 3/ 1 mg BA/lít 4/ 1,5 mg BA/lít 5/ 2 mg BA/lít

Chỉ tiêu ghi nhận: Các chỉ tiêu sinh trưởng của chồi được ghi nhận vào thời điểm 8

tuần sau khi cấy bao gồm:

- Số chồi hình thành: đếm số chồi hình thành / cụm chồi cao từ 0,5 cm

- Số lá gia tăng /cụm : lá đã xòe ra

- Chiều cao thân gia tăng/ cụm