ĐÁNH GIÁ HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ SAU TIÊM PHÒNG VACCIN CÚM GIA CẦM TẠI MỘT SỐ HUYỆN CỦA TỈNH ĐỒNG NAI

Phần 1 MỞ ĐẦU Cúm gia cầm Avian influenza là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của nhiều loài bao gồm cả trên người và động vật do các phân type subtype của nhóm virus cúm type A Influenza

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ SAU TIÊM PHÒNG VACCIN CÚM GIA CẦM TẠI MỘT SỐ

HUYỆN CỦA TỈNH ĐỒNG NAI

Sinh viên thực hiện: Trịnh Khánh Hòa

MSSV : 07159005 Lớp : Dược Y 33 Ngành: Dược Thú Y Khóa : 2007-2012

-2012-MỤC LỤC

MỤC LỤC i 

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv 

DANH SÁCH CÁC HÌNH v 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi 

TÓM TẮT LUẬN VĂN vii 

Phần 1 MỞ ĐẦU 1 

Phần 2 TỔNG QUAN 3 

2.1 Bệnh cúm gia cầm 3 

2.2 Căn bệnh 4 

2.2.1 Hình thái 4 

2.2.2 Cấu trúc 5 

2.3 Miễn dịch học 6 

2.3.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể: 6 

2.3.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào 7 

2.4 Truyền nhiễm học 8 

2.4.1 Loài nhạy cảm 8 

2.4.2 Sức đề kháng 8 

2.4.3 Sự bài thải và đường truyền lây của virus 9 

2.5 Sinh bệnh học 10 

2.5.1 Cơ chế sinh bệnh 10 

2.5.2 Thời gian ủ bệnh 10 

2.5.3 Triệu chứng lâm sàng 10 

2.6 Bệnh tích 12 

2.6.1 Bệnh tích đại thể 12 

2.6.2 Bệnh tích vi thể 12 

2.7 Chẩn đoán 13 

2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 13 

2.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 13 

2.7.2.1 Chẩn đoán kháng nguyên 13 

2.7.2.2 Phát hiện kháng thể 14 

2.8 Chỉ tiêu khảo sát 15 

2.9 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 15 

Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 17 

3.2 Đối tượng nghiên cứu 17 

3.3 Nội dung nghiên cứu 17 

3.4 Vật liệu xét nghiệm 17 

3.5 Nguyên liệu xét nghiệm 17 

3.6 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 18 

3.6.1 Thiết bị 18 

3.6.2 Dụng cụ 18 

3.6.3 Hóa chất 18 

3.7 Phương pháp thực hiện 18 

3.8 Phương pháp xét nghiệm 21 

3.8.1 Các bước chuẩn bị 21 

3.8.2 Phản ứng HA (heamagglutination test) 22 

3.8.3 Phản ứng HI (Heamagglutination Inhibitory) 24 

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 

4.1 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá trị MG (phân tuýp H5) 27 

4.2 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá trị MG (phân tuýp H5) theo huyện-thị xã 28 

4.3 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá trị MG (phân tuýp H5) theo lứa tuổi 31 

4.4 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá trị MG (phân tuýp H5) theo hướng sản xuất 33 

4.5 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá

trị MG (phân tuýp H5) theo quy mô 35 

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 

5.1 Kết luận 38 

5.2 Đề nghị 39 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 

PHỤ LỤC 45 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các loại vaccine tiêm phòng bệnh cúm gia cầm 20 

Bảng 3.2 Sơ đồ cách thực hiện phản ứng HA 23 

Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và

giá trị MG (phân tuýp H5) 27 

Bảng 4.2 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm

(phân tuýp H5) theo huyện-thị xã 28 

Bảng 4.3 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và

giá trị MG (phân tuýp H5) theo lứa tuổi 31 

Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và

giá trị MG (phân tuýp H5) theo hướng sản xuất 33 

Bảng 4.5 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và

giá trị MG (phân tuýp H5) theo quy mô 35  

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái của virus cúm chụp dưới kính hiển vi điện tử 4 

Hình 2.2 Cấu trúc của virus cúm gia cầm 5 

Hình 2.3 Vòng truyền lây virus cúm (Nguồn: www.Medical Ecology.org) 8 

Hình 2.4 Một số triệu chứng trên gà mắc bệnh cúm gia cầm 11 

Hình 2.5 Một số bệnh tích trên gà do virus cúm gây ra 13   

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ARN Acide ribonucléique

FAO Food and Agriculture Organisation

IAHP Influenza A hautement pathogène

IHA Inhibition de l’hémagglutination

OIE Organisation Internationale des Epizooties (Ancienne appellation de

l'Organisation Mondiale de la Santé Animale) PBS Phosphate Buffer Saline

RT - PCR Reverse transcriptase - polymerase chain reaction

UHA Unité d’hémagglutination

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài “Đánh giá hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng cúm gia cầm tại một số

huyện của tỉnh Đồng Nai” được thực hiện trong 4 tháng (2/2012-6/2012) tại 27

trại chăn nuôi thuộc 3 huyện của tỉnh Đồng Nai (Long Khánh, Thống Nhất, Trảng Bom) Với 1070 mẫu huyết thanh được lấy tại các trại và sau đó được phân tích tại phòng Chẩn Đoán Xét Nghiệm Thú Y của tỉnh Đồng Nai

Phản ứng HI được sử dụng để phát hiện và đánh giá hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà mà chúng tôi nghiên cứu Tỷ lệ gà được bảo hộ và giá trị MG sau tiêm phòng cúm gia cầm theo các yếu tố ảnh hưởng dựa trên sự sản sinh ra kháng thể cũng được kiểm tra Chúng tôi có các kết quả sau :

- Tỷ lệ gà có kháng thể đủ bảo hộ sau khi tiêm là 95,7 % và MG = 104

- Theo huyện : Đàn gà của huyện Trảng Bom đạt tỷ lệ bảo bộ cao nhất (97,11

Phần 1

MỞ ĐẦU

Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của nhiều loài bao gồm cả trên người và động vật do các phân type (subtype) của nhóm virus

cúm type A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên

H5N1 là một phân type virus cúm gia cầm có độc lực cao xuất hiện gần đây tại các nước Châu Á, Châu Âu, Châu Phi đã được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gia cầm những năm 1996 - 2008

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm H5N1 liên tục xảy ra từ cuối năm 2003 cho đến nay đã gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho các vùng bị dịch Để chủ động khống chế, tiến tới thanh toán bệnh cúm gia cầm, nhiều biện pháp tổng hợp đã được áp dụng: giám sát sự tồn tại và lưu hành của virus, chẩn đoán sớm, tiêu hủy gia cầm mắc bệnh và nghi mắc bệnh, tiêu độc, khử trùng các cơ sở chăn nuôi bị dịch, kiểm dịch vận chuyển động vật, kiểm soát giết mổ, tăng cường các biện pháp an toàn sinh học; tuyên truyền, giáo dục người dân chủ động phòng ngừa dịch bệnh và sử dụng vaccine tiêm phòng Trong các giải pháp phòng chống dịch bệnh nêu trên thì việc

sử dụng vaccine được xem như là một biện pháp nhằm làm giảm thiệt hại do bệnh cúm gia cầm gây ra đối với ngành chăn nuôi gia cầm và cũng làm giảm nguy cơ lây nhiễm của virus H5N1 sang người

Đồng Nai là tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm phía Nam, nên có nhiều điều kiện thuận lợi cho ngành chăn nuôi nói chung, đặc biệt chăn nuôi gia cầm nói riêng (hiện nay tổng đàn gia cầm của tỉnh là trên 9 triệu con) Do vậy, để bảo vệ đàn gia cầm phục vụ cho công tác sản xuất thì việc tiêm phòng và giám sát virus cúm

gia cầm phải được thực hiện đầy đủ Hằng năm, tỉnh đã thực hiện công tác tiêm phòng cúm gia cầm định kỳ 2 lần trong năm đối với các hộ nuôi gia cầm nhỏ lẻ và giám sát định kỳ việc tiêm phòng cúm ở các trang trại chăn nuôi gà (tỷ lệ tiêm phòng đạt trên 96% tổng đàn gia cầm trong diện tiêm) Sau mỗi đợt tiêm phòng đều lấy mẫu đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch của đàn gia cầm được tiêm phòng

Việc đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn gia cầm sau khi sử dụng vaccine là một việc hết sức cần thiết, lâu dài Để từ đó có thể giúp cơ quan thú y đưa ra những chiến lược phù hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm Xuất phát từ

những lý do như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu giá

kháng thể sau tiêm phòng cúm gia cầm tại một số huyện của tỉnh Đồng Nai”

Mục tiêu

Đánh giá đáp ứng miễn dịch trên đàn gia cầm của tỉnh Đồng Nai được tiêm phòng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm bằng phản ứng HI

Phần 2 TỔNG QUAN

2.1 Bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm do virus cúm type A gây ra, là một bệnh truyền nhiễm cực kỳ nguy hiểm bởi chủng virus gây bệnh luôn biến đổi để tránh sự nhận biết, bao vây và tiêu diệt của cơ thể ký chủ Bệnh được tổ chức dịch tể thế giới (OIE) xếp vào danh mục bảng A - các bệnh nguy hiểm

Năm 412 trước công nguyên một bệnh giống như bệnh cúm đã được Hippocrate mô tả, bệnh cúm được ghi nhận đầu tiên ở Italy vào năm 1878 và được gọi là bệnh “dịch tả gà” (Fowl plague)

Năm 1984, một ổ dịch nghiêm trọng trên gà đã xảy ra ở miền Bắc nước Ý và lan truyền ra các nước khác như: Áo, Đức, Bỉ và Pháp Đến năm 1901, Centanni và Savunozzi cho rằng bệnh cúm là do một loại vi sinh vật đi qua màng lọc gây ra Năm 1902, lần đầu tiên người ta phân lập được virus cúm - đó là virus cúm type A (H7N7) đã gây dịch cúm gà ở nước Ý trước đó Đến năm 1933, virus cúm type A (H1N1) gây bệnh trên người mới được phân lập

Các ổ dịch gần đây đã được thông báo ở một số nước như: Năm 1991, bệnh cúm gia cầm do subtype H5N1 xảy ra trên gà tây tại Anh; tại Australia năm 1992 -

1994 do subtype H7N3; subtype H5N2 tại Mexico năm 1994 - 1995; H5N1 (Hồng Kông, 1997); H5N2 (Italy, 1997); H7N4 (Australia, 1997); H7N1 (Italy, 1999 - 2000); H7N3 (Chile, 2002); H7N7 (Hà Lan, 2003); H7N3 (Canada, 2004); H5N2 (Mỹ và Nam Phi, 2004); H5N1 (Trung Quốc, Hồng Kông, Indonesia, Nhật Bản, Lào, Malaysia, Hàn Quốc và Thái Lan, 2002 - 2005) (Kamps và ctv, 2006)

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm xuất hiện từ cuối tháng 12/2003, tại trại gà giống của công ty CP đóng tại xã Thủy Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây Cùng thời gian này, dịch cũng xảy ra ở hai tỉnh Tiền Giang và Long An sau đó dịch lan ra toàn quốc Tính từ thời điểm từ 12/2009 đến 4/2008 đã có 6 đợt dịch cúm gia cầm xảy ra trên cả nước (Văn Đăng Kỳ, 2008) và cho đến nay dịch cúm vẫn còn đang tiếp tục lây lan, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi của nước ta

2.2 Căn bệnh

2.2.1 Hình thái

Virus cúm gia cầm có dạng hình cầu và cũng có thể là đa hình thái, có kích

thước khoảng 80 - 120 nm Bên ngoài có các gai như gai HA có dạng hình gậy và

gai NA có hình nấm Cấu trúc bộ gen của virus bao gồm 8 phân đoạn RNA, mã hoá cho các protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS (Cox và ctv, 2000)

Hình 2.1 Hình thái của virus cúm chụp dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn :

http://www.futura-sciences.com/fr/definition/t/medecine-2/d/virus-de-la-grippe_7938/)

Đặc trưng của virus cúm type A so với cúm type B và C là có sự đa dạng rất lớn của 2 glycoprotein: Haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Các virus cúm được phân loại thành các subtype dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA

và NA Cho đến nay, người ta xác định có tất cả 16 subtype HA và 9 subtype NA hiện diện trong tự nhiên (Fouchier và ctv, 2005)

Hình 2.2 Cấu trúc của virus cúm gia cầm

(Nguồn : http://www.arnobio2.com/les_virus_de_la_grippe.pdf )

Protein NA cũng tạo ra kháng thể trung hòa ở gà và vaccine đặc hiệu NA có thể bảo hộ chống lại virus cúm độc lực cao (HPAI) (Rott và ctv, 1974; MacNulty và ctv, 1986) Kháng thể protein NA được xem là ít quan trọng hơn kháng thể protein

HA, nhưng ít nhất ở chuột sự bảo hộ cũng đã được chứng minh khi chủng vaccine DNA (bao gồm cả gen HA và NA) (Chen và ctv, 1999) Tuy nhiên, chuột được tiêm chủng gen NA chỉ làm giảm bài thải virus, trong khi chủng vaccine mang gen HA làm ngừng hoàn toàn sự bài thải virus (Johansson và ctv, 1989)

Các protein khác của virus cũng có khả năng tạo kháng thể: Kháng thể đối với protein M2 không bảo hộ hoàn toàn nhưng làm giảm lượng virus bài thải vào tạo sự bảo hộ nhất định đối với bệnh (Slepushkin và ctv, 1995; Zebedee và ctv, 1988; Frace và ctv, 1999)

Đặc biệt là các protein M1 và NP đều là các kháng nguyên quan trọng sử dụng trong các thử nghiệm chẩn đoán Các kháng nguyên này có sự bảo tồn trình tự cao, cho phép phát hiện kháng thể từ những chim nhiễm bất kỳ type virus cúm A nào

Kháng thể tiết ra trong đáp ứng miễn dịch niêm mạc rất có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự hồi phục của chim nhiễm bệnh và tạo ra sự bảo hộ cho những đợt nhiễm bệnh tiếp theo, đặc biệt đối với virus cúm độc lực trung bình (MPAI) nhiễm chủ yếu qua niêm mạc

Nghiên cứu về kháng thể thụ động, nhiều bằng chứng cho thấy kháng thể này có thể ngăn ngừa triệu chứng lâm sàng và gây chết cho gia cầm con khi thực hiện công cường độc bằng chủng virus độc lực cao (HPAI) mà tương đồng về subtype HA và NA trong vòng 2 tuần đầu sau khi gia cầm nở (Swayne và Halvorson, 2003)

2.3.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào

Cả kháng thể và các tế bào lympho T hoạt hóa đều được tạo ra trong đáp ứng miễn dịch đối với virus (Zinkernagel, 1994) Đối với virus cúm gia cầm, khi không

có sự tái sản virus, các virus cúm gia cầm làm tăng đáp ứng của các tế bào lympho ngoại biên và các thymocyte của gà khi được hoạt hóa bởi concanavalin A (Holt và ctv, 1990) theo một phương thức phụ thuộc liều lượng, dẫn đến tăng hoạt tính IL-2

ở điều kiện phòng thí nghiệm

Cơ chế tác dụng của các tế bào lympho T hỗ trợ (CD4+) và lympho T gây độc (CD8+) trong đáp ứng miễn dịch chống lại virus cúm trên gia cầm chưa được hiểu biết đầy đủ Nhiều nghiên cứu cho thấy miễn dịch đối với virus H9N2 vô hoạt trên gà có thể bảo hộ trong thời gian ngắn khi công cường độc virus cúm độc lực cao (HPAI) H5N1 nhờ miễn dịch qua trung gian tế bào nhưng lại không thể ngăn

ngừa hoàn toàn khả năng nhân lên của virus cúm trong đường tiêu hóa (Suarez và Schultz - Cherry, 2000)

2.4 Truyền nhiễm học

2.4.1 Loài nhạy cảm

Virus cúm A gây bệnh trên nhiều loài động vật (bao gồm: người, heo, ngựa, động vật có vú ở biển và các loài cầm, chim) Bệnh thường xảy ra trên gà và gà tây, nhiều loài chim hoang dã (đặc biệt là thuỷ cầm và chim biển cũng nhạy cảm với virus cúm A) Trong khi đó virus cúm B thường thấy ở hải cẩu và virus cúm C thường có ở heo

Hình 2.3 Vòng truyền lây virus cúm (Nguồn: www.Medical Ecology.org)

2.4.2 Sức đề kháng

Virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu với các tác nhân vật lý như nhiệt độ,

pH quá cao hay quá thấp Ở môi trường không đẳng trương và khô virus bị bất hoạt

Vì virus này có thành phần vỏ envelope là lipid nên bị bất hoạt bởi các chất tẩy rửa hữu cơ như desoxycholate và sodium dodecylsulfate Khi có sự hiện diện của các chất hữu cơ, virus cúm có thể bị phá hủy bởi các hoạt chất hóa học như aldehydes

(formaldehyde hay gluteraldehyde), beta - propiolactone, và binary ethylenimine

Các chất tẩy rửa hóa học cũng có thể tiêu diệt virus như phenolic, ammonium ion (gồm có chất tẩy có ammonium bậc 4) Các tác nhân oxy hóa như sodium hypochlorite, axit loãng và hydroxylamine cũng tiêu diệt được virus

Khi ở trong dịch tiết mũi, phân, virus được các chất hữu cơ bao quanh làm tăng sức đề kháng với các tác nhân lý, hóa học Ở điều kiện lạnh và ẩm virus có thể tồn tại lâu Virus ở trong dịch lỏng có thể tồn tại được 105 ngày trong mùa đông và tồn tại trong phân 30 - 35 ngày ở 4°C và 7 ngày ở 20°C

2.4.3 Sự bài thải và đường truyền lây của virus

Virus cúm gia cầm bài thải ra môi trường qua chất tiết từ miệng, mũi, kết mạc và qua phân, vì virus được nhân lên ở các cơ quan hô hấp, tiêu hóa, thận và sinh sản Khi gây bệnh cho gà 3 - 4 tuần tuổi bằng virus chủng độc lực cao (HPAI), ghi nhận sự hiện diện virus trong mẫu hầu họng (qua vết phết hầu họng khoảng

104,2–7,7 EID50/ml chất tiết đường hô hấp) và sự hiện diện virus trong mẫu phân (qua vết phết lỗ huyệt khoảng 102,5–4,5 EID50/mg phân) Đối với chủng virus cúm độc lực thấp (LPAI) thì sự bài thải virus có thấp hơn, trong mẫu hầu họng (qua vết phết hầu họng khoảng 101,1-5,5 EID50/ml chất tiết đường hô hấp) và trong mẫu phân (vết phết

lỗ huyệt khoảng 101,0-4,3 EID50/mg phân) (Swayne và Beck, 2005)

Sự lây nhiễm virus giữa các loài chim xảy ra thông qua sự tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với thú bệnh hoặc với môi trường đã bị nhiễm Virus sẽ xâm nhập vào cơ thể qua đường niêm mạc hoặc mũi

Các loài chim hoang hay thuỷ cầm bị lây nhiễm qua đường miệng do tiếp xúc với nước nhiễm virus Virus nhân lên với số lượng lớn trong đường tiêu hóa của chúng, nhưng thường không có dấu hiệu lâm sàng và virus sẽ được bài thải qua phân với nồng độ cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lây lan Mặt khác virus

có thể tồn tại hơn 3 tháng trong nước ngọt có độ kiềm nhẹ và ở nhiệt độ vừa phải

Vì vậy, các loài chim hoang dã hay thuỷ cầm là nguồn lưu trữ mầm bệnh và là mối

đe doạ nguy hiểm

Sự lây truyền virus từ trại này sang trại khác là do sự di chuyển loài cầm đã

bị nhiễm virus Vật liệu, xe tải chở thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, quần áo, giày dép, thú hoang (chuột, mèo,…) thậm chí cả con người đóng vai trò mang virus rất quan trọng, là nhân tố trung gian chủ yếu truyền lây virus từ nơi này sang nơi khác Trong trường hợp nhiễm virus độc lực cao, sự lan truyền sẽ xảy ra rất nhanh

Chim hoang và vịt đóng vai là nhân tố truyền lây virus gây bệnh thể độc lực thấp tới các đàn gia cầm và nếu như virus cứ tiếp tục lưu hành vài tháng trong quần thể gia cầm, nó có thể đột biến thành một virus gây bệnh ở thể độc lực cao Tuy nhiên đến nay chưa có bằng chứng cho thấy chim hoang là nguồn tàng trữ virus H5N1 gây bệnh thể độc lực cao cho gà

Trước đây, các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao thường bắt đầu bằng việc một virus có độc lực thấp xâm nhập vào đàn Virus độc lực thấp này thường có vật chủ tàng trữ là chim hoang Sau đó, virus lưu hành vài tháng trong quần thể gia cầm nuôi và đột biến từ chủng có khả năng gây bệnh nhẹ thành chủng có khả năng gây bệnh thể độc lực cao với tỷ lệ chết trên gia cầm lên đến 100% Vịt nuôi không có triệu chứng lâm sàng của bệnh và điều này có thể trực tiếp lây truyền virus gây bệnh thể độc lực cao vào đàn gia cầm Người ta cũng giả định là vịt có biểu hiện khỏe mạnh cũng có thể truyền virus trực tiếp sang cho heo và người

2.5 Sinh bệnh học

2.5.1 Cơ chế sinh bệnh

Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus sẽ nhân lên trên lớp tế bào niêm mạc đường hô hấp và đường tiêu hóa Tùy theo độc lực và ái lực của virus (hướng đường ruột, hô hấp, thần kinh hay đa hướng) virus theo máu và đến cơ quan hô hấp, tiêu hóa, sinh sản gây triệu chứng và bệnh tích, hoặc có thể không có biểu hiện nào

cả Trong phòng thí nghiệm, virus có thể gây bệnh trên gà, gà tây, vịt và chuột (Trần

Thanh Phong, 1996)

2.5.2 Thời gian ủ bệnh

Thời gian ủ bệnh cúm rất ngắn chỉ vài giờ đến 3 ngày sau khi virus cúm gà xâm nhập Theo ghi nhận khi dịch cúm nổ ra và chậm nhất là 14 ngày sau khi gây nhiễm thì cả đàn gà bị bệnh (Lê Văn Năm, 2004)

2.5.3 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố của virus như: Độc lực,

số lượng virus, tuổi, giới tính và các yếu tố môi trường như sức đề kháng của đàn

gà, mật độ chuồng, tiểu khí hậu chuồng nuôi (nhiệt độ, ánh sáng,…) Trên đàn gà

mắc bệnh xuất hiện các triệu chứng điển hình về đường hô hấp, tiêu hóa, sinh sản (giảm sản lượng trứng) và thần kinh (Lê Văn Năm, 2004)

Triệu chứng hô hấp thường xuất hiện đầu tiên và khá điển hình: Gia cầm mắc bệnh có biểu hiện khẹt, lắc đầu, vảy mỏ, chảy nước mũi, nước mắt, khó thở, mí mắt

bị viêm sưng mọng, mặt phù nề và đầu sưng, mào và tích bị dày lên do thủy thũng,

có rất nhiều điểm hoặc đám xuất huyết

Thịt gà bị cúm thường thâm xám, xuất huyết dưới da vùng chân là những biểu hiện đặc trưng bệnh cúm gà

Gà bị tiêu chảy nặng, phân loãng trắng hoặc trắng xanh, bệnh lây lan rất nhanh Năng suất trứng giảm rõ rệt

Các biểu hiện thần kinh thể hiện như: Con vật đi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi, nằm li bì tụm thành từng đống với nhau (Lê Văn Năm, 2004)

Ngoài ra, một số trường hợp dịch cúm gia cầm xảy ra nhưng không thấy xuất hiện các triệu chứng lâm sàng trên đàn gia cầm nhiễm bệnh (Lê Văn Năm, 2004)

Hình 2.4 Một số triệu chứng trên gà mắc bệnh cúm gia cầm

Trường hợp bệnh nặng: Nhiều trường hợp thấy trong ổ dịch cúm là gia cầm mắc bệnh chết quá nhanh, không để lại bệnh tích điển hình gì Nhưng đại bộ phận những gia cầm khác thì có biến đổi bệnh tích đại thể khá rõ: Mũi bị viêm tịt; mào tích thâm tím, sưng dày lên, xuất huyết điểm và hoại tử Khi cắt đôi mào hoặc tích thấy bên trong màu vàng xám, óng ánh như gelatin Mí mặt và mặt phù nề, đầu sưng

to Xuất huyết dưới da: chân, kẽ móng chân và một số vùng khác Xuất huyết và gây hoại tử ở gan, lách, thận Dạ dày tuyến, van hồi manh tràng, niêm mạc hậu môn xuất huyết từ cata đến fibrin rất nặng, thận sưng rất to và căng phồng Tụy teo, dòn

do mất nước, tim bơi trong màng tim xuất hiện thẩm dịch vàng và xuất huyết điểm Xuất huyết dưới da và cơ ở vùng đùi, ngực Xuất huyết mỡ bụng, mỡ bao tim, mỡ màng treo ruột luôn là bệnh tích đặc trưng Xuất huyết niêm mạc khí quản, bên trong nhiều nước dãi (Lê Văn Năm, 2004)

2.6.2 Bệnh tích vi thể

Các biến đổi đặc trưng về tổ chức học như phù nề, xung huyết, xuất huyết và thâm nhập lympho đơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, mào tích, gan, thận, mắt và thần kinh (Lê Văn Năm, 2004)

Hình 2.5 Một số bệnh tích trên gà do virus cúm gây ra 2.7 Chẩn đoán

2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng

Gà, vịt thường mắc bệnh cúm ở mọi lứa tuổi, nhưng thường gặp từ 4 đến 46 tuần tuổi Song bệnh nặng nhất ở gia cầm đang đẻ và lúc đẻ cao nhất hoặc lần đầu tiên bị bệnh cúm Bệnh nổ ra dồn dập và nhanh chóng trở thành dịch chủ yếu trong vài giờ đến vài ngày

Cần thực hiện chẩn đoán phân biệt các triệu chứng và bệnh tích với những bệnh khác như: Newcastle, viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILT), viêm phế quản truyền nhiễm (IB), bạch lỵ,… và bệnh cúm thường ghép với bệnh hô hấp do vi

môi trường chứa hàm lượng kháng sinh cao) tiêm vào xoang niệu mô của phôi gà 9 - 11 ngày tuổi Các phôi bi tạm nhiễm sẽ chết sau 24 giờ và phải được bỏ đi Số phôi sống còn lại sau 24 giờ được theo dõi đến 72 giờ Có thể lấy nước phôi từ những phôi chết trong khoảng 48 giờ và sau 48 giờ hoặc từ phôi chưa chết đến 72 giờ xác định virus Đây là khoảng thời gian mà số lượng virus (nếu có) đạt mức lý tưởng (Lê Văn Năm, 2004)

+ Kỹ thuật test nhanh: Test Directigen phát hiện kháng nguyên virus cúm trong mẫu bệnh phẩm và dịch niệu mô của phôi trứng gà đã được tiêm truyền virus Ưu điểm của test Directigen là tốn ít thời gian, thao tác đơn giản, dễ thực hiện Tuy nhiên, hạn chế của test Directigen là chỉ phát hiện được virus cúm type A mà không xác định được phân type

+ Kỹ thuật dùng kháng thể huỳnh quang phát hiện nhanh virus cúm gia cầm trong dịch niệu mô

+ Kỹ thuật dùng kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên virus trong mô bằng việc nhuộm immunoperoxidase

+ Kỹ thuật Realtime RT - PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction): Đây là một kỹ thuật tiên tiến nhằm phát hiện và xác định hệ gen của virus cúm, đặc biệt là khi trong mẫu chứa một lượng rất ít virus Do

hệ gen của virus cúm là một chuỗi RNA đơn nên cần tổng hợp một DNA bổ sung (cDNA) trước khi được nhân lên Enzyme RT (Reverse Transcriptase)

là một polymerase được dùng để tổng hợp nên cDNA Do đó, quá trình nhân

hệ gen RNA của virus cúm được gọi là RT - PCR (Cục Thú y, 2006)

2.7.2.2 Phát hiện kháng thể

Sử dụng các phản ứng huyết thanh học dùng để chứng minh sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu đối với virus cúm gia cầm 7 ngày sau khi nhiễm

Có nhiều kỹ thuật được dùng để chẩn đoán virus cúm bằng phương pháp

huyết thanh học như

+ Phản ứng ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay): Phát hiện kháng thể dựa vào việc gắn kháng nguyên đăc hiệu virus cúm ở đáy

giếng phản ứng (Kháng nguyên được gắn có thể là kháng nguyên virus cúm type A, kháng nguyên cúm H5) Kháng nguyên này sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng thể có trong mẫu huyết thanh xét nghiệm

+ Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI - haemagglutinin inhibition): Phát hiện kháng thể kháng virus cúm (phân type H5) ở gia cầm sau khi nhiễm virus cúm H5 hoặc tiêm phòng vaccine H5 Khi gặp kháng thể đặc hiệu thì kháng nguyên chuẩn sử dụng trong phản ứng sẽ kết hợp với kháng thể Sau đó, khi cho hồng cầu vào sẽ tụ lại đáy giếng của đĩa phản ứng Việc đọc kết quả sẽ dựa vào độ pha loãng cao nhất của kháng thể mà ở

đó hồng cầu bị đóng nút (tụ lại đáy giếng) Ưu đểm của phản ứng này là dễ thực hiện và cho kết quả chính xác cao

+ Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch (AGID - Agar gel immunodiffusion): Phát hiện kháng thể kháng virus cúm gia cầm type A

+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFT - Immunofluorescent test): Phát hiện kháng thể kháng một phân type NA đặc hiệu

2.9 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu

- Đánh giá kết quả tiêm phòng vaccine (theo hướng dẫn đánh giá kết quả sau tiêm phòng của Cục Thú y, 2009)

+ Mẫu huyết thanh đủ bảo hộ cho cá thể gia cầm sau khi tiêm vaccine phòng bệnh cúm là mẫu có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4log2

+ Đàn bảo hộ là đàn có ≥ 80% mẫu huyết thanh đạt hiệu giá kháng thể HI bảo hộ

+ Tỷ lệ bảo hộ: Tỷ lệ giữa số mẫu có hiệu giá kháng thể bảo hộ và số mẫu xét nghiệm

(số mẫu bảo hộ / số mẫu xét nghiệm) * 100 + Tỷ lệ gà có kháng thể đủ bảo hộ sau tiêm phòng có giá trị MG ≥ 16 (theo Chi Cục Thú Y tỉnh Đồng Nai, 2012)

+ Giá trị MG (Medica Geometrica) trung bình hình học của quần thể khảo sát dựa theo công thức sau :

Log2N = (Số lượng mẫu * Log2N ở cùng độ pha loãng)/ số lượng mẫu kiểm tra

(Bảng tra kết quả được trình bày ở phần phụ lục)

- Dùng trắc nghiệm 2 của phần mềm minitab 14 for window để so sánh tỷ

lệ bảo hộ trên đàn gia cầm khảo sát, so sánh thêm phân bố của tỷ lệ bảo hộ theo loài, qui mô chăn nuôi, lứa tuổi khác nhau Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa khi xác suất p < 0,05

Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện đề tài: Tháng 02/2012 đến 06/2012

Địa điểm thực hiện: Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm Thú y - Chi cục Thú y Đồng Nai

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Đàn gia cầm bao gồm: Gà đẻ, gà giống, gà hậu bị của các trại chăn nuôi thuộc 3 huyện (Long Khánh, Thống Nhất, Trảng Bom) của tỉnh Đồng Nai

3.3 Nội dung nghiên cứu

Xác định hiệu quả đáp ứng miễn dịch của việc tiêm vaccine phòng bệnh

3.4 Vật liệu xét nghiệm

Mẫu xét nghiệm kháng thể

Lấy mẫu huyết thanh: Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cánh của gà Người lấy máu dùng một tay cố định cánh gia cầm, tay còn lại nhổ lông bộc lộ tĩnh mạch cánh, vị trí lấy máu được sát trùng bằng cồn 70oC Tiếp theo, dùng xylanh lấy 3 - 5

ml máu, kéo pittông trong xylanh về phía sau và để máu đông trong xylanh, để nghiêng xylanh 45o và để yên trong 1 - 2 giờ, chắt lấy huyết thanh Tất cả các mẫu huyết thanh sau khi được lấy đều phải có ký hiệu để tránh nhầm lẫn Mẫu huyết thanh nếu chưa xét nghiệm ngay có thể được bảo quản lạnh ở 4oC trong vòng 1 tuần Muốn bảo quản mẫu huyết thanh lâu hơn thì giữ ở -20oC

3.5 Nguyên liệu xét nghiệm

Kháng nguyên chuẩn H5N1: AIV Antigen H5N1 (A/Ck/Scotland/H5N1/59) Kháng nguyên virus cúm gà được bất hoạt bằng β-propiolactone, kháng nguyên ở dạng đông khô Kháng nguyên này có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm VLA-Anh

Quốc (Veterinary Laboratory Agency-Weybridge New Haw, Surrey KT15 3NB

3.6.2 Dụng cụ

Xylanh, eppendorf, ống nhựa bảo quản mẫu, vỉ nhựa 96 giếng (đáy chữ V), micropipette các loại, đầu côn vô trùng các loại, găng tay, khẩu trang,…

3.6.3 Hóa chất

+ Hóa chất dùng trong phản ứng HA-HI

- Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline), pH=7,2-7,3

- Chất kháng đông EDTA 10%

- Nước cất 2 lần,…

3.7 Phương pháp thực hiện

Nội dung : Xác định hiệu quả đáp ứng miễn dịch trên đàn gia cầm

được tiêm vaccine phòng bệnh cúm gia cầm

Mục tiêu : Đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch (kháng thể bảo hộ)

sau khi tiêm phòng vaccine phòng bệnh cúm ở các trang trại chăn nuôi gà trứng, giống, hậu bị và chương trình tiêm phòng vaccine đối với đàn gia cầm nhỏ lẻ của tỉnh Đồng Nai

Trại chăn nuôi: Kiểm tra 100% các trang trại chăn nuôi gà đẻ trứng thương phẩm, gà giống và gà hậu bị Do điều kiện sản xuất thực tế giữa các trại có sự khác nhau về lứa tuổi, qui mô chăn nuôi Do vậy, số lượng mẫu lấy

sẽ dao động từ 30 - 50 mẫu/trại (dựa vào sự tính toán của phần mềm Win episcope 2.0) Khi phân tích số liệu, chúng tôi chia nhóm trại theo lứa tuổi, qui mô để có sự đánh giá về sự khác biệt giữa các nhóm trại

Hộ chăn nuôi nhỏ lẻ: Dựa trên danh sách tiêm phòng vaccine của các huyện, thị xã, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên những hộ chăn nuôi có qui mô trên 50 - 500 con Sau đó chọn ngẫu nhiên khoảng 40 hộ trong nhóm này Số lượng mẫu lấy mỗi hộ là 30 mẫu huyết thanh

+ Bước 2:

Xét nghiệm mẫu huyết thanh bằng phương pháp HA - HI nhằm xác định hiệu giá kháng thể cúm H5 sau khi tiêm phòng vaccine cúm (chúng tôi tiến hành lấy mẫu hai lần: sau 1 tháng và 4 tháng khi tiêm phòng vaccine phòng bệnh)

Bảng 3.1 Các loại vaccine tiêm phòng bệnh cúm gia cầm

0,3 ml / con Dưới da

 Tiêm 2 mũi, cách nhau

28 ngày;

 Nhắc lại sau 04 tháng; Trên 5 tuần

tuổi

0,5 ml / con Dưới da

 Tiêm 2 mũi cách nhau

0,25 ml / con Dưới da

 Tiêm 2 mũi, cách nhau

28 ngày;

 Nhắc lại sau 04 tháng;

> 35 ngày tuổi

(Theo hướng dẫn số 1181/TY-DT ngày 19/8/2006-hướng dẫn tiêm cho

gà, vịt và hướng dẫn số 814/TY-DT ngày 21/5/2009-hướng dẫn tiêm cho ngan của Cục Thú y)

(6) Lặp lại các bước 3, 4, 5 làm 3 lần Sau bước 5 của lần 3, cho thêm vào 1/2 lượng PBS tương đương với lượng hồng cầu thu được ở trên và lắc đều

(7) Dùng hematocrite để đo tỷ lệ phần trăm hồng cầu vừa thu hoạch (8) Pha hồng cầu 10%

V1*C1 = V2*C2 Trong đó: - V1, C1 là thể tích và nồng độ có được sau khi đo bằng hematocrite

- V2, C2 là thể tích và nồng độ cần dùng

(9) Pha hồng cầu 0,5%: tính tương tự như mục 8

* Xử lý mẫu huyết thanh + Đối với mẫu huyết thanh gà

(1) Cho 90 µl PBS vào tất cả các giếng từ cột 1 đến cột 12 của đĩa đáy chữ U

(2) Cho 30 µl mẫu huyết thanh gà vào các giếng theo sơ đồ xét nghiệm

(3) Dùng băng keo dán kỹ đĩa đáy chữ U có chứa mẫu huyết thanh đã được pha loãng 1/4 và đặt đĩa vào nồi ổn nhiệt ở 56oC trong vòng 45 phút Sau đó lấy đĩa ra để ở nhiệt độ phòng, rồi tiến hành các bước tiếp theo Nếu hôm sau mới tiến hành các bước tiếp theo thì giữ đĩa ở 4oC - 8oC

+ Đối với mẫu huyết thanh vịt hoặc các loài thủy cầm khác

(1) Cho 60 µl PBS vào tất cả các giếng từ cột 1 đến cột 12 của đĩa đáy chữ U

(2) Cho 30 µl mẫu huyết thanh vịt (hoặc các loài khác) vào các giếng theo sơ đồ xét nghiệm

(3) Dùng băng keo dán kỹ đĩa đáy chữ U có chứa mẫu huyết thanh đã được pha loãng 1/3 và đặt đĩa vào nồi ổn nhiệt ở 56oC trong vòng 45 phút

(4) Lấy đĩa ra để cho mẫu huyết thanh trở về nhiệt độ phòng, rồi cho thêm 30 µl hồng cầu 10% vào các giếng chứa mẫu huyết thanh Ủ đĩa 60 phút ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4oC - 8oC, rồi tiến hành các bước tiếp theo

+ Chuẩn bị hoàn nguyên kháng nguyên chuẩn H5N1

Kháng nguyên chuẩn H5N1 ở dạng đông khô sẽ được hoàn nguyên với 1 ml dung dịch PBS Dùng phản ứng HA để chuẩn độ kháng nguyên đã được hoàn nguyên này

3.8.2 Phản ứng HA (heamagglutination test)

* Nguyên lý: Kháng nguyên HA trên bề mặt của virus cúm có khả

năng kết hợp với các thụ thể trên bề mặt của hồng cầu ở một số loài gia súc, gia cầm,… gây ra sự ngưng kết hồng cầu này

* Mục đích phản ứng: Nhằm xác định nồng độ pha loãng kháng

nguyên virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu