Nghiên Cứu Cố Định LIPASE Và Tính Chất Của ENZYME Cố Định

Lipase được cố định nhằm làm tăng độ bền, khả năng tái sử dụng và dễ dàng phân tách khỏi sản phẩm so với enzyme tự do.. Đề tài “Nghiên cứu cố định lipase và tính chất của enzyme cố định”

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH LIPASE VÀ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH

SVTH: LÊ ANH DŨNG MSSV: 60700417

GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM

Tp Hồ Chí Minh, tháng 01/ 2012

BK

TP.HCM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH LIPASE VÀ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH

SVTH: LÊ ANH DŨNG MSSV: 60700417

GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM

Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 / 2012

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Tp HCM, tháng 12 năm 2011 Giáo viên hướng dẫn

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

Tp HCM, tháng 01 năm 2012 Giáo viên phản biện

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin cảm ơn Tiến sĩ Trần Bích Lam, người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức quí báu cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến các thầy cô Khoa Kỹ thuật Hóa học, đặc biệt các Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Thực Phẩm đã truyền đạt kiến thức chuyên ngành cũng như kiến thức xã hội và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập ở trường

Tôi xin cảm ơn quý Thầy Cô trong hội đồng chấm luận văn đã dành thời gian quý báu để đọc và đưa ra các nhận xét giúp tôi hoàn thiện hơn về luận văn này Con xin cảm ơn ba mẹ và gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho con, động viên, khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè đã cùng tôi chia sẻ, động viên tôi trong thời gian thực hiện Luận văn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Lê Anh Dũng

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất béo Enzyme này chiếm một vị trí nổi bật trong các loại xúc tác sinh học do khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như tổng hợp hữu cơ, chất tẩy rửa và dinh dưỡng Lipase được cố định nhằm làm tăng độ bền, khả năng tái sử dụng và

dễ dàng phân tách khỏi sản phẩm so với enzyme tự do Các nghiên cứu trên thế giới đã cố định thành công enzyme lipase lên rất nhiều loại chất mang khác nhau

Đề tài “Nghiên cứu cố định lipase và tính chất của enzyme cố định” sử dụng các loại chất mang có nguồn gốc trong nước để cố định lipase nhằm so sánh tính chất của enzyme cố định so với các nghiên cứu khác

Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm:

 Chọn vật liệu để cố định enzyme lipase

 Tối ưu hóa quá trình cố định enzyme lipase trên vật liệu này

 Khảo sát tính chất của enzyme lipase sau khi cố định và so sánh với enzyme tự do

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH xi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Lipase 2

1.1.1 Giới thiệu về lipase 2

1.1.2 Đặc điểm của lipase 2

1.1.3 Tính đặc hiệu của lipase 3

1.2 Cố định lipase 4

1.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định 4

1.2.2 Đặc điểm của enzyme cố định 5

1.2.3 Ưu nhược điểm của enzyme cố định 6

1.2.4 Các phương pháp cố định enzyme lipase 6

1.2.5 Các nghiên cứu gần đây về cố định enzyme lipase 8

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu 22

2.1.1 Enzyme lipase 22

2.1.2 Chitosan 22

2.1.3 Natri alginate 24

2.1.4 Dầu olive 27

2.2 Thiết bị 28

2.3 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định hoạt tính riêng của lipase tự do 29

2.3.2 Thí nghiệm 2: Chọn vật liệu cố định lipase 30

2.3.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa quá trình cố định enzyme 32

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tính chất của lipase cố định 33

2.4 Các phương pháp phân tích 36

2.4.1 Đo pH 36

2.4.2 Đo độ hấp thu 36

2.4.3 Xác định hàm lượng protein 38

2.4.4 Xác định hoạt tính riêng của enzyme lipase 40

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 41

2.5.1 Phương pháp xử lý số liệu của phân tích ANOVA 41

2.5.2 Tính hệ số tương quan R bằng Excel 42

2.5.3 Tối ưu hóa bằng phần mềm Modde 5.0 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

3.1 Xác định hoạt tính enzyme tự do 43

3.2 Vật liệu cố định lipase 43

3.3 Tối ưu hóa quá trình cố định 45

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Na-alginate đến quá trình cố định lipase 45 3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl 2 đến quá trình cố định lipase 49

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình cố định lipase 50

3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tự do đến quá trình cố định lipase 52 3.3.5 Sử dụng quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa quá trình cố định 53

3.4 Khảo sát tính chất của lipase cố định 57

3.4.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của lipase 57

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase 58

3.4.3 Động học phản ứng thủy phân 60

3.4.4 Khả năng tái sử dụng của lipase cố định 64

3.4.5 Phương pháp bảo quản của lipase cố định 66

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

4.1 Kết luận 69

4.2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 77

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme lipase 22

Bảng 2.2: Đặc điểm kỹ thuật của enzyme lipase 22

Bảng 2.3: Các thông số của dầu olive 28

Bảng 2.4: Phương pháp pha loãng dung dịch protein chuẩn 39

Bảng 3.1:Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định trên các loại chất mang khác nhau 43

Bảng 3.2: Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định ở các giá trị nồng độ Na-alginate khác nhau 46

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định 49

Bảng 3.4: Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định ở các thời gian ủ khác nhau 51

Bảng 3.5: Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định ở các nồng độ lipase tự do khác nhau 52

Bảng 3.6: Các thông số để xây dựng phương trình hồi quy trong tối ưu hóa 54 Bảng 3.7: Kết quả các giá trị trong phương trình hồi quy 54

Bảng 3.8: Giá trị Vmax và Km của lipase tự do và cố định 62

Bảng 3.9: Giá trị Km và Vmax của lipase tự do và lipase cố định 64

Bảng P.1: Độ hấp thu tại các nồng độ protein khác nhau 77

Bảng P.2: Độ hấp thu tại các nồng độ protein khác nhau 77

Bảng P.3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính của lipase cố định 79 Bảng P.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase cố định 79

Bảng P.5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của lipase cố định 79 Bảng P.6: Các thông số của lipase cố định để xác định các hệ số trong phương trình Lineweaver – Burk 79

Bảng P.7: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính của lipase tự do 80

Bảng P.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase cố định 80 Bảng P.9: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của lipase tự do 80 Bảng P.10: Các thông số của lipase tự do để xác định các hệ số trong phương

trình Lineweaver – Burk 80

Bảng P.11: Hoạt tính của lipase cố định qua các lần tái sử dụng 81

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc nắp của lipase từ Candida rugosa 3

Hình 1.2: Giản đồ mô tả việc cố định lipase trên polypropylene được xử lý

chất mang không có từ tính và có từ tính 21

Hình 2.1: Cấu tạo phân tử chitin và chitosan 23 Hình 2.2: Cấu trúc của alginate 25 Hình 2.3: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến khả năng thủy phân của

lipase 27

Hình 2.4: Sơ đồ nghiên cứu chung 29 Hình 2.5: Cơ chế của phản ứng Bradford 38 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính

lipase cố định trên các loại chất mang khác nhau 44

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính

lipase cố định theo nồng độ Na-alginate 46

Hình 3.3: Cơ chế khuếch tán (tạo gel từ bên ngoài) 47 Hình 3.4: Cơ chế tạo gel từ bên trong 47 Hình 3.5: Sự liên kết của Ca2+ với các mạch alginate theo thuyết “vỉ trứng” 48

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính

lipase cố định theo nồng độ CaCl2 49

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính

lipase cố định theo thời gian ủ 51

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính

lipase cố định theo nồng độ lipase tự do 52

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy trên hệ trục không gian ba

chiều 55

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme lipase và nồng

độ Na-alginate đến hiệu suất cố định 55

Hình 3.11:Enzyme lipase sau khi cố định lên Na-alginate 56 Hình 3.12:Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của lipase 57 Hình 3.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của lipase tự do và lipase cố định

lipase tự do và lipase cố định trên -carrageenan 64

Hình 3.19: Đồ thị biểu diễn hiệu quá tái sử dụng của lipase cố định 64 Hình 3.20: Độ bền của lipase cố định trên sol-gel theo các phương pháp khác

nhau qua các lần tái sử dụng 66

Hình P.1: Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ protein 77 Hình P.2: Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ protein 78

LỜI MỞ ĐẦU

Xúc tác sinh học đang nổi lên thành một công cụ quan trọng trong quá trình tổng hợp ở quy mô công nghiệp các loại hóa chất, dược phẩm và thành phần thực phẩm Ít nhất 134 quá trình chuyển hóa sinh học đã được phát triển trên quy mô công nghiệp (Won, 2005) Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu sâu rộng trong khoa học cũng như trong công nghiệp nhưng số lượng ứng dụng của xúc tác sinh học vẫn còn khá khiêm tốn Điều này có thể do một số hạn chế của xúc tác sinh học như tính sẵn có, phạm vi cơ chất và độ bền hoạt động

Độ bền của enzyme sử dụng trong các quá trình công nghiệp đã tăng lên đáng

kể trong những năm qua nhờ áp dụng công nghệ gene, cố định, cải tiến quy trình

Cố định enzyme là phương pháp thông dụng nhất để đưa những tính chất mong muốn của xúc tác dị thể vào xúc tác sinh học Bên cạnh làm tăng độ bền, enzyme

cố định còn có thêm những tính chất ưu việt như khả năng tái sử dụng, dễ dàng phân tách khỏi cơ chất và sản phẩm

Lipase (EC 3.1.1.3) là tên gọi của một họ enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất béo Tuy nhiên, trong điều kiện thích hợp nó còn xúc tác phản ứng chuyển ester, alcoholysis và phản ứng ester hóa Việc cố định lipase đang trở thành phương pháp phổ biến để tránh những yếu tố bất lợi của enzyme tự do mặc dù lipase cố định cũng bị giảm hoạt tính so với enzyme tự do Do đó chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để cố định lipase và khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến phản ứng thủy phân của enzyme cố định

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Lipase

1.1.1 Giới thiệu về lipase

Lipase (ester triacylglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) là một enzyme quan trọng trong việc thủy phân chất béo và giải phóng các acid béo tự do, diacylglycerol, monoacylglycerol và glycerol Lipase có ở hầu hết mọi cơ thể sống, tế bào và có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, hấp thu và vận chuyển lipid Lipase từ vi khuẩn và nấm có thể ứng dụng làm chất xúc tác sinh học trong công nghiệp vì cường lực xúc tác mạnh và dễ sản xuất bằng con đường lên men

và dễ thu nhận từ canh trường Vì thế, hầu hết enzyme từ vi sinh vật có thể dùng cho mục đích thương mại

Ở động thực vật bậc cao, lipase cũng được nghiên cứu khá nhiều Lipase tụy heo đã được sử dụng làm enzyme kỹ thuật Lipase từ động vật hữu nhũ được ứng dụng nhiều trong ngành y để chữa trị các căn bệnh về trao đổi chất hoặc trực tiếp tạo thành thuốc (Muller & Petry, 2004) Enzyme từ thực vật như đu đủ, dứa và đặc biệt là trong hạt đang nảy mầm được ứng dụng làm chất xúc tác sinh học vì chúng thể hiện tính chọn lọc đối với acid béo (Mukherjee & Hills, 1994)

Với sự đa dạng về nguồn gốc, sự phân bố và chức năng của chúng trong tế bào mà các thông số lý hóa của lipase là rất khác nhau Chính nhờ sự khác biệt này mà lipase có những khoảng tối thích khác nhau và tính đặc hiệu khác nhau cho những ứng dụng đa dạng trong công nghiệp Nhiều cố gắng nhằm tăng cường lực xúc tác của lipase bằng nhiều cách bao gồm tìm nguồn lipase mới, ứng dụng những thành công trong công nghệ gene và trong kỹ thuật gây đột biến gene lên những vi sinh vật đã biết

1.1.2 Đặc điểm của lipase

Cấu trúc lập thể của lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990 (Brady; Winkler, D'Arcy, & Hunziker), những nghiên cứu cho thấy vùng hoạt động của enzyme lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu trúc di động, tạm gọi là

cái “nắp” Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang hoạt động khi cái “nắp” từ trạng thái đóng sang mở (Brzozowski, 1991; Grochulski, 1994) Cơ chế đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung tâm hoạt động của lipase thông suốt và có liên kết với lipid

Hình 1.1: Cấu trúc nắp của lipase từ Candida rugosa

(a) Trạng thái đóng nắp; (b) Trạng thái mở Phần bôi đen là nắp

(Polaina & MacCabe, 2007)

Nhiệt độ tối thích của lipase là rất rộng, thường từ 30 – 60oC, tùy thuộc vào nguồn thu nhận lipase Những vi sinh vật sống trong những môi trường khắc nghiệt tạo ra lipase có nhiệt độ tối thích cao trên 70oC (như lipase từ Bacillus

thermocatenulatus) hoặc những lipase có hoạt tính cao ở nhiệt độ thấp (lipase từ

vi khuẩn vùng cực)

Hầu hết những lipase dùng làm chất xúc tác sinh học đều hoạt động ở pH trung tính hay kiềm, trong nhiều trường hợp có pH tối ưu là 9,0 (lipase từ

Pseudomonas và Bacillus) Lipase acid ít thông dụng hơn có thể hoạt động ở pH

dưới 3,0 Nhiều lipase từ loài Bacillus có pH hoạt động rộng (Gupta, Gupta, &

Rathi, 2004)

1.1.3 Tính đặc hiệu của lipase

Khả năng ứng dụng của lipase dùng làm xúc tác sinh học đều dựa vào tính chọn lọc và đặc hiệu rất tinh tế của nó Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc có thể là chọn lọc vị trí không gian, ví dụ như vị trí nhóm phân tử cơ chất của liên kết ester bị thủy phân hoặc hình thành; cũng có thể là chọn lọc hóa học, ví dụ như khả năng nhận biết cơ chất; và chọn lọc đồng phân lập thể

Hầu hết lipase thông dụng có tính đặc hiệu vị trí nhóm hydroxyl 1, 3 (sn-1,3; tương ứng các alcohol bậc 1) trong mạch glycerol, mặc khác cũng có lipase có tính đặc hiệu cho vị trí sn-2 cho phép việc thủy phân hoàn toàn triglyceride thành acid béo và glycerol

Về tính chọn lọc đối với acid béo, lipase có thể chuyển hóa ester với mạch có

độ dài trung bình đến dài (C4 đến C18, có thể lên đến C22) nhưng với hiệu quả khác nhau Ngay cả những enzyme từ cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau ở tính chất này Một số lipase lại có thể chọn lọc acid béo không no như

lipase từ Geotrichum candidum với tính đặc hiệu với cơ chất chứa acid béo

không no (Δ-9) dạng cis Lipase tụy và một số lipase từ vi sinh vật thể hiện hoạt tính trên các acid béo không no nhiều nối đôi (polyunsaturated fatty acid, PUFA) Những lipase thủy phân chất béo với những tính đặc hiệu khác nhau có thể ứng dụng riêng lẻ hoặc kết hợp để đạt được mục đích công nghệ mong muốn, như tạo ra những triglyceride cấu trúc trong việc tăng giá trị dinh dưỡng, bơ cacao thay thế, và dầu ăn với hàm lượng PUFA cao (Polaina & MacCabe, 2007) Trong lĩnh vực sản xuất thuốc, lipase cũng đang được ứng dụng để acyl hóa chọn lọc các phân tử như carbohydrate, amino acid, peptide (Le, 2003)

Một tính chất quan trọng khác của lipase, nhất là trong công nghiệp sản xuất hóa chất, thuốc và trong một số sản phẩm nông nghiệp, chính là tính chọn lọc với đồng phân lập thể Tính chất này cho phép lipase xúc tác đặc hiệu cho phản ứng với từng loại đồng phân quang học và phản ứng chọn lọc hỗn hợp racemic Lipase được ứng dụng trong quá trình sản xuất trên nhắm vào các alcohol có đồng phân quang học, ester acid carboxylic, các hydroxy acid, diester, lactone, amine, diamine, aminoalcohol, dẫn xuất của amino acid (Schmidt, 2001)

1.2 Cố định lipase

1.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định

Enzyme cố định (hay enzyme không tan) được hiểu theo 2 nghĩa (Nguyễn Đức Lượng, 2004):

 Nghĩa hẹp: Enzyme cố định là những enzyme được đưa vào pha riêng, có

thể tách riêng được với pha dung dịch tự do Pha enzyme không hòa tan

trong nước và gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

 Nghĩa rộng: Enzyme cố định bao gồm cả enzyme đã được cố định vào

chất mang, enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học, có gắn kết vào chất mang, cho phép sử dụng lại nhiều lần Enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này mà enzyme từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan

1.2.2 Đặc điểm của enzyme cố định

 Enzyme cố định có hoạt độ riêng thấp hơn hoạt độ riêng của enzyme hòa tan

- Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi gắn enzyme vào chất mang

có điện tích khác với điện tích enzyme, cấu trúc không gian của enzyme có sự thay đổi nhất định, làm cho sự tương tác của enzyme với

cơ chất chậm lại, phản ứng xảy ra yếu hơn

- Do enzyme bị nhốt vào trong khuôn gel: lúc đó gel sẽ bao lấy phân tử enzyme tạo thành một vật cản đối với cơ chất của enzyme, nên sự tiếp xúc giữa trung tâm hoạt động enzyme với cơ chất sẽ gặp khó khăn hơn

so với enzyme tự do

 Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten Tuy nhiên, trong phản ứng giữa cơ chất với enzyme cố định có những sai khác nhất định:

- Có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang

- Hiện tượng cản trở khuếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản ứng làm giảm tốc độ phản ứng

 Enzyme cố định có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại vì chúng được bảo vệ trong chất mang

 Enzyme cố định có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc acid

so với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại

 Enzyme cố định có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme hòa tan cùng loại

 Có thể tái sử dụng enzyme cố định nhiều lần

1.2.3 Ưu nhược điểm của enzyme cố định

 Ưu điểm:

- Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài

- Enzyme cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme, do đó nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm

- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzyme ra khỏi dung dịch cơ chất

- Enzyme cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzyme tự do

- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục

 Nhược điểm:

- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme

- Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quá trình cố định

Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzyme cố định mang lại Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzyme cũng như ứng dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp

1.2.4 Các phương pháp cố định enzyme lipase (Murty, Bhat, & Muniswaran, 2002; Nguyễn Đức Lượng, 2004)

1.2.4.1 Phương pháp nhốt enzyme (entrapment)

 Nguyên tắc: Enzyme được nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer

tự nhiên như polysaccharide, protein, polymer tổng hợp như polyacrilamide Sử dụng phương pháp này, enzyme được tự do trong dung dịch nhưng bị hạn chế di chuyển do cấu trúc lưới của gel

 Ưu điểm: Có thể cố định được nhiều enzyme lên 1 chất mang

 Nhược điểm:

- Kích thước lỗ gel lớn làm thất thoát enzyme ra ngoài

- Chất mang có thể làm cản trở cơ chất nên enzyme cố định chỉ dùng để thủy phân những cơ chất có khối lượng phân tử thấp

1.2.4.2 Phương pháp vi bao (microencapsulation)

 Nguyên tắc: Phương pháp này có nguyên tắc tương tự phương pháp nhốt Tuy nhiên chất mang của enzyme trong phương pháp này chủ yếu là các màng membrane có kích thước lỗ từ 10 – 100 μm

 Ưu điểm:

- Kích thước lỗ nhỏ nên protein enzyme không thể đi qua màng Còn cơ chất và sản phẩm nhỏ dễ dàng đi qua màng

- Có thể cố định nhiều enzyme để sử dụng cho 1 quá trình nhất định

 Nhược điểm: Chỉ sử dụng để thủy phân cơ chất khối lượng nhỏ

1.2.4.4 Phương pháp liên kết đồng hóa trị (covalent binding)

 Nguyên tắc: Dựa trên sự hình thành liên kết đồng hóa trị giữa chất mang

và các nhóm chức của những amino acid còn lại trên bề mặt enzyme Thông thường chất mang sẽ được hoạt hóa trước bằng hóa chất để nhóm chức của chúng trở nên ái điện tử (electrophilic) mạnh Sau đó nhóm chức này được cho phản ứng với các nhóm chức ái nhân (nucleophilic) của enzyme

 Ưu điểm: Liên kết tạo thành là liên kết mạnh nên enzyme cố định khá bền

 Nhược điểm: Đắt tiền, hiệu suất thấp do cấu hình không gian và hoạt tính enzyme bị ảnh hưởng bởi liên kết đồng hóa trị

1.2.4.5 Phương pháp liên kết ion (ionic binding)

 Nguyên tắc: Sử dụng các tương tác điện (như liên kết ion và liên kết hydro) giữa các nhóm mang điện khác nhau của chất mang và enzyme

 Ưu điểm và nhược điểm: Tương tự như phương pháp hấp phụ, tuy nhiên cấu hình enzyme bị ảnh hưởng bởi phương pháp này cao hơn phương pháp hấp phụ và thấp hơn phương pháp liên kết đồng hóa trị

1.2.4.6 Phương pháp cross-linking

 Nguyên tắc: Liên kết các enzyme tự do lại với nhau để tạo ra một cấu trúc không gian 3 chiều Liên kết này được tạo thành bằng các chất có 2 hay nhiều nhóm chức như glutaraldehyde

 Nhược điểm: Hiệu suất cố định rất thấp, độ bền và tính chất cơ học thấp

1.2.5 Các nghiên cứu gần đây về cố định enzyme lipase

1.2.5.1 Phương pháp nhốt enzyme

a Phương pháp nhốt enzyme trong gel

Một trong những loại gel phổ biến để cố định lipase là -carrageenan carrageenan có thể dễ dàng chuyển thành trạng thái gel khi có mặt ion kim loại, amine, amino acid và dung môi hữu cơ hòa tan trong nước Desai, Daveb, & Devi (2004) đã tiến hành thí nghiệm nhốt lipase trong gel -carrageenan bằng cách nhỏ -carrageenan vào polyethyleneimine (PEI) trong môi trường đệm kali phosphate có pH 7 Điều kiện tối ưu cho quá trình cố định: nồng độ lipase 10mg/ml, nồng độ PEI 2% w/v, nồng độ -carrageenan 3% w/v, thời gian cố định 2h

-Jegannathan, Chan, & Ravindra (2009) cũng tiến hành nhốt lipase trong gel carrageenan nhưng lại nhỏ -carrageenan vào dung dịch KCl Các thông số của quá trình cố định: nồng độ lipase 1g/ml, nồng độ KCl 2% Sau khi cố định, tính chất vật lý và độ bền của enzyme tăng: bền trong pH = 6 – 9, bền nhiệt đến 50oC

-và bền trong một số dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, iso-propanol, hexane và n-heptane Hoạt tính sau khi tái sử dụng 6 lần là khá cao, còn lại 72,3% so với ban đầu

n-Một số tác giả cũng thực hiện việc nhốt lipase trong hạt gel với chất mang khác, chẳng hạn như alginate Knezevic và cộng sự (2002) đã tạo gel bằng cách nhỏ hỗn hợp Na-alginate và lipase vào trong dung dịch CaCl2 bằng thiết bị electrostatic droplet generator tạo ra hạt có đường kính nhỏ hơn 1mm Kết quả cho ra điều kiện tối ưu là: điện thế 4,9kV, kích thước đầu kim 21 gauge, nồng độ Na-alginate 2% (w/v), kích thước hạt gel 0,65mm

Matsumoto & Ohashi (2003) đã tiến hành thí nghiệm khả năng chịu nhiệt của lipase cố định trong các chất mang khác nhau Các tác giả sử dụng enzyme cố định trong gel Ca-alginate, vi bao trong calcium silicate và trong hạt acrylic Kết quả cho thấy hoạt tính của lipase cố định trên gel alginate là cao nhất khi nhiệt độ nhỏ hơn 60oC (gel alginate > hạt acrylic >calcium silicate > tự do) Nhưng kết quả lại khác khi tăng nhiệt độ hơn 60oC, calcium silicate ≈ hạt acrylic > gel alginate ≈ tự do

Kế thừa những kết quả trên, Cheirsilp, Jeamjounkhaw, & H-Kittikun (2009) nghiên cứu tối ưu hóa việc cố định lipase trên alginate để thu nhận monoacylglycerol (MAG) một cách tối ưu Điều kiện tối ưu của quá trình cố định lipase là: nồng độ alginate 2% (w/v), nồng độ CaCl2 100mM, nồng độ lipase 30U/ml, hạt gel có kích thước 2,03mm Để hạn chế sự thất thoát enzyme, hạt gel được phủ lên một lớp silicate Điều này giúp khả năng tái sử dụng của lipase cố định hiệu quả hơn Tiếp theo, các tác giả thực hiện tối ưu quá trình thu nhận monoacylglycerol Kết quả thu được: tỉ lệ mol glycerol:dầu cọ là 10:1, không bổ sung nước, lượng lipase cố định là 27 U và dung dịch 50% (w/v) dầu cọ trong 2-methyl-2-butanol sẽ cho lượng MAG nhiều nhất Trong khi đó dung dịch 10% (w/v) dầu cọ trong 2-methyl-2-butanol sẽ thủy phân tốt nhất triacylglycerol (100%) thành 54% monoacylglycerol, 9% diacylglycerol và 37% acid béo tự do sau 4 giờ

Cũng có một số thí nghiệm so sánh hiệu quả nhốt lipase trên gel alginate với gel chitosan và gel agarose Betiger & Steven (2002) đã tiến hành thí nghiệm xác định khả năng cố định, sự giải phóng và hoạt tính của lipase được cố định trên các loại polymer khác nhau Các hạt agarose có sự trương nở không theo mong muốn trong việc giải phóng lipase, và polymer này không thích hợp cho các

nghiên cứu tiếp theo Alginate hay chitosan được tạo thành hạt gel khi nhỏ vào dung dịch CaCl2 hay dung dịch tripolyphosphate (TPP) Sau đó chúng được đem sấy thăng hoa Kết quả thu được cho thấy hạt alginate giải phóng enzyme nhiều hơn hạt chitosan Tuy nhiên, hiệu suất cố định lipase trong chitosan cũng như trong alginate khác nhau là gần như nhau, 43 – 50% Hoạt tính của lipase cố định trên alginate (240  33 và 220  26 U/ml lần lượt cho không có và có sấy thăng hoa) thấp hơn chitosan (1110  51 và 1150  11 U/ml) Từ đó kết luận rằng hạt chitosan có hiệu quả hơn trong việc nhốt lipase hơn hạt alginate

Sau đó, Alsarra, Neau, & Howard (2004) đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hạt gel chitosan Ảnh hưởng của pH, nồng độ tripolyphosphate (TPP),

và độ mạnh của lực ion trong môi trường tạo gel đến hiệu suất cố định, mức độ giải phóng và hoạt tính của lipase cố định trong hạt hydrogel chitosan được khảo

sát Dung dịch lipase từ Candida rugosa được chuẩn bị trong chitosan 1,5%

(w/v) và acid acetic 1% (v/v) sau đó được nhỏ vào dung dịch TPP Theo kết quả thì pH và nồng độ TPP có ảnh hưởng đến các yếu tố nêu trên trong khi lực ion lại không ảnh hưởng Hoạt tính lipase cố định giảm không đáng kể sau 5 lần tái sử dụng Theo phân tích thống kê, thời gian tối ưu cho hiệu quả cố định và hoạt tính của lipase, đồng thời giảm tối thiểu lượng enzyme thất thoát là 36h trong đệm Tris

Kim và cộng sự (2011) nhốt lipase trong các chất mang hydrogel cellulose- biopolymer Lipase lần lượt được nhốt vào các chất mang khác nhau như cellulose, cellulose-carrageenan, cellulose-chitosan, cellulose-agarose và cellulose-agar Hoạt tính enzyme trên các chất mang đó lần lượt là 35; 9,6; 39,7; 41,4 và 52,6% so với enzyme tự do Từ đó ta nhận thấy cellulose-biopolymer là những chất mang phù hợp cho quá trình cố định lipase, ngoại trừ cellulose-carrageenan

b Phương pháp nhốt enzyme trong sol-gel

Yilmaz, Sezgin, & Yilmaz (2010) đã tiến hành nhốt lipase lên chất mang gel trơ về mặt hóa học với sự có mặt của sporopollenin hoặc sporopollenin được hoạt hóa(sporopollenin được xem như là phụ gia) Chất mang sol-gel được tổng

sol-hợp từ phản ứng trùng ngưng giữa tetraethoxysilane với octyltriethoxysilane Kết quả cho thấy chất mang có sporopollenin thì lượng enzyme cố định được ít hơn sporopollenin được hoạt hóa, nhưng hoạt tính enzyme cố định lại cao hơn Từ đó kết luận hiệu quả cố định trên sporopollenin tốt hơn trên sporopollenin được hoạt hóa Lipase sau khi cố định bền với pH acid (pHopt = 5) so với lipase tự do (pHopt

= 7) Nhiệt độ tối ưu của lipase tự do, cố định trên sporopollenin và trên sporopollenin được hoạt hóa lần lượt là 35, 40, 45oC Như vậy thì lipase sau khi

cố định chịu được khoảng nhiệt độ rộng hơn và chịu được nhiệt độ trong khoảng thời gian dài so với lipase tự do Một tính chất quan trọng khác là khả năng tái sừ dụng của lipase, sau 8 lần sử dụng hoạt tính của lipase nhốt trong sporopollenin

và trong sporopollenin được hoạt hóa còn 28 và 26% so với ban đầu Người ta cũng nhận thấy hoạt tính của lipase trên sporopollenin được hoạt hóa và sporopollenin còn lại sau 50 ngày bảo quản là khá cao, 95 và 93% Trong lúc đó của lipase tự do chỉ còn 15% sau 12 ngày

Và Uyanik, Sen, & Yilmaz (2011) cũng tiến hành thí nghiệm trên cùng một chất mang như trên, nhưng lại bổ sung calix(aza)crowns như là chất phụ gia mới Phần trăm hoạt tính enzyme và khả năng thủy phân của lipase cố định cao hơn hơn lipase tự do pH tối ưu của lipase sau khi cố định vẫn giống như tự do, nhưng

ở môi trường pH acid thì hoạt tính của lipase cố định cao hơn tự do và ngược lại khi ở pH kiềm Nhiệt độ tối ưu của lipase tự do dịch chuyển từ 35oC thành 45oC sau khi cố định Ngoài ra, lipase cố định vẫn còn giữ được 18% hoạt tính sau 6 lần tái sử dụng

c Phương pháp nhốt enzyme trong photo-crosslinkable

Moniera, Wei, & Sarhan (2010) nghiên cứu cố định lipase trên chất mang photo-crosslinkable chitosan Chitosan được đem phản ứng với -cyano-4-hydroxycinnamic acid với sự có mặt của chất hoạt hóa N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) để tạo thành chất mang chitosan--cyano-4-hydroxycinnamated (chitosan-ACHCA) Chitosan-ACHCA trộn với dung dịch lipase, khuấy đều ở nhiệt độ thấp Sau đó đổ 1 lớp mỏng vào đĩa petri và để khô trong bình đá ở điều kiện chân không rồi được chiếu UV Kết quả thu được khá

tốt, hoạt tính tương đối của enzyme sau khi cố định đạt 98,6% so với ban đầu Các điều kiện tối thích của lipase sau khi cố định là: nhiệt độ 40oC, pH = 8 và chịu được khoảng pH rộng Ngoài ra, hoạt tính của nó giảm rất chậm sau 6 lần tái

sử dụng

1.2.5.2 Phương pháp vi bao enzyme

Người ta thường vi bao lipase trên các chất mang như polyvinyl alcohol (PVA), carboxymethycellulose (CMC) hay hỗn hợp PVA:CMC Dalla-Vecchia

và cộng sự (2005) đã tiến hành vi bao lipase trên cả 3 chất mang này dưới dạng

lớp film mỏng, đồng thời đã chọn được lipase từ Rhyzopus oryzae (ROL) và tỉ lệ

lipase/chất mang bằng 50 mg/0,5g là phù hợp nhất Dưới tác dụng của nhiệt độ (25 – 50oC), khả năng ester hóa của lipase sau khi cố định đạt 99%, trong khi đó, lipase tự do chỉ đạt 6 – 33% Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ cũng được khảo sát Khả năng ester hóa của lipase sau khi cố định cũng cao hơn hẳn lipase tự do Không những vậy, hoạt tính của lipase được cố định chỉ mất sau 10 lần tái sử dụng cũng như sau 80 ngày bảo quản Trong khi đó, lipase tự do mất hoạt tính chỉ sau 35 ngày bảo quản Từ đó, ta có thể kết luận các polymer như PVA, CMC

và PVA:CMC có thể dùng làm chất mang để cố định lipase một cách hiệu quả Bên cạnh đó, Dhake và cộng sự (2011) cũng tiến hành vi bao lipase từ

Rhyzopus oryzae dưới dạng film mỏng với chất mang được tạo ra từ

hydroxylpropyl methyl cellulose (HPMC) và PVA để tổng hợp được citronellol ester khi có mặt CO2 siêu tới hạn (Sc-CO2) Với mục đích thực hiện phản ứng chuyển ester, các thông số như tỉ lệ khối lượng, mức độ acyl hóa, thời gian, nhiệt

độ, nồng độ enzyme, áp suất và co-solvent được tối ưu Kết quả thu được: có sự tăng lượng citronellol ester khi dùng lipase cố định (91%), gấp 8 lần so với lipase

tự do (11%) trong Sc-CO2 Việc phát triển của các phương pháp trong lĩnh vực xúc tác sinh học cho phép sử dụng lượng xúc tác thấp (1,5% w/v), nhiệt độ phản ứng thấp 45o

C, áp suất thấp 8MPa so với những nghiên cứu trước Phương pháp

cố định đã làm tăng đáng kể độ bền của enzyme dưới tác dụng của Sc-CO2 Ngoài ra, lipase cố định vẫn có hiệu quả thủy phân sau 3 lần tái sử dụng

Một số tác giả cũng tiến hành vi bao lipase trong hệ sợi thay vì vi bao enzyme

trên màng Wang & Hsieh (2008) đã cố định lipase từ Candida rugosa vào sợi có

đường kính từ 100 – 500 nm bằng cách trộn dung dịch lipase và polyvinyl alcohol (PVA) rồi áp dụng kĩ thuật electrospinning Lượng enzyme cố định được

là trên 50%, đồng thời hoạt tính của lipase cố định trên các sợi nano không đổi so với lipase tự do Điều này chứng tỏ không hề có ảnh hưởng bất lợi của dòng điện cao thế cũng như của PVA đến cấu trúc phân tử của enzyme Quan trọng hơn là lipase sau khi cố định có thể chịu được nhiệt độ và ẩm cao Ngoài ra, các tác giả cũng có nghiên cứu thêm việc tạo hỗn hợp lipase/PVA không tan trong nước khi tạo liên kết ngang với glutaraldehyde trong ethanol Tuy nhiên việc tạo liên kết ngang này lại làm giảm hoạt tính của lipase cố định

1.2.5.3 Phương pháp hấp phụ

Forde, Vakurov, & Gibson (2010) đã thực hiện cố định lipase lên các loại mesoporous silicate (MPS) khác nhau Lipase được biến đổi hóa học (sử dụngethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGNHS), glutaraldehyde hoặc citraconic anhydride)và enzyme thông thường được cố định lên 3 loại chất mang khác nhau, SBA-15-MPS, CNS-MPS và MCM-MPS bằng phương pháp hấp phụ Trước tiên, chất mang được xử lý bằng dung dịch 95% methanol/5% HCl (v/v)

để loại bỏ các chất hoạt động bề mặt và xử lý bằng siêu âm Sau đó, chất mang được trộn với enzyme ở 4o

C trong 16 giờ để xảy ra sự cố định bằng hấp phụ Kết quả thí nghiệm cho thấy phương pháp cố định hiệu quả nhất là xử lý lipase bằng EGNHS và cố định lên CNS-MPS Điều này cũng cho thấy lipase cố định tốt hơn trên silicate có kích thước lỗ lớn

Cũng trên vật liệu SBA-15, Li và cộng sự (2009) tiến hành cố định lipase từ

Porcine pancreas Sự cố định diễn ra hiệu quả nhất ở pH 6 và thời gian cố định

là 3 giờ Hoạt tính lipase cố định cao nhất ở pH 7, giống với lipase tự do Tuy nhiên, do không xử lý chất mang nên sau 5 lần tái sử dụng, hoạt tính chỉ còn 40%, chứng tỏ liên kết hydro tạo ra giữa các nhóm hydroxyl của chất mang và lipase là khá yếu

Cũng sử dụng silica aerogel có kích thước lỗ lớn để cố định enzyme lipase, Gao, Wang, & Wang (2009) thu được kết quả khá khả quan Lượng enzyme lipase hấp phụ được là 67,42 mg/g cơ chất, hoạt tính của enzyme cố định đạt 19,87 U/mg protein (bằng 56,44 % so với enzyme tự do)

Manzano & Igarzabal (2011) cố định enzyme lipase lên hydrogel được tạo ra bởi N-acryloyl-tris(hydroxymethyl) aminomethane (NAT), 2-aminoethyl methacrylate (AEMA) và N,N’-methylenebisacrylamide (BIS) Sau khi cho lipase tiếp xúc và hấp phụ lên chất mang, lượng enzyme không liên kết với chất mang bằng 0 Nghiên cứu cũng cho thấy độ dài liên kết giữa enzyme chất mang càng lớn thì khả năng tiếp xúc và thủy phân chất béo càng cao

Deng, Xu, & Dai (2005) sử dụng membrane từ polypropylene (PPHFMM) được xử lý hóa học nhằm nâng cao tính ưa nước và sự hòa hợp sinh học để cố

định lipase (Hình 1.2) Lipase cố định lên PPHFMM bằng hấp phụ và enzyme cố

định được sử dụng để thủy phân dầu olive Sau 10 lần thủy phân hoạt tính của enzyme cố định vẫn còn 82% so với ban đầu

Hình 1.2: Giản đồ mô tả việc cố định lipase trên polypropylene được xử lý bằng

poly(α-allylglucoside) (Deng, Xu, & Dai, 2005)

Kharrat & Ali (2011) thực hiện cố định lipase lên silica aerogel bằng hấp phụ vật lý Phản ứng cố định diễn ra ở 4oC trong 1 giờ Enzyme sau khi cố định vẫn giữ giá trị nhiệt độ và pH tối thích như enzyme tự do Tuy nhiên lipase cố định thể hiện độ bền nhiệt cũng như khoảng pH hoạt động cao hơn so với lipase tự do

Đặc biệt, khả năng biến đổi butyl oleate của enzyme cố định đạt 80%, cao hơn cả enzyme tự do

Hernandez, Garcia-Galan, & Fernandez-Lafuente (2011) đã sử dụng hạt styrene–divinylbenzene thương mại (Diaion HP20LX và MCI GEL CHP20P) để

cố định enzyme lipase MCI GEL CHP20P thể hiện tính chất tốt hơn so với Diaion HP20LX: khả năng cố định enzyme cao (110 mg enzyme/g cơ chất), hoạt tính lipase cố định trên MCI GEL CHP20P cũng cao hơn đối với tất cả các loại

cơ chất Ngoài ra, lipase cố định trên MCI GEL CHP20P có hoạt tính cao hơn 3 –

8 lần và bền nhiệt hơn 2 – 3 lần so với sản phẩm thương mại Novozym 435 Karimpi, Melo, & D'Souza (2011) sử dụng màng cotton được xử lý bằng polyethylenimine (PEI) để cố định enzyme lipase Điểm đặc biệt của phương pháp này là enzyme và PEI hấp phụ thành nhiều lớp liên tục trên màng cotton Hoạt tính của enzyme cố định tăng dần theo số lớp cố định và đạt 13 U/cm2 ở lớp thứ 5 Tuy nhiên, độ tăng hoạt tính giữa 4 lớp cố định và 5 lớp cố định chỉ là1 U/cm2 (giữa 1 lớp và 2 lớp độ tăng hoạt tính là 2,1 U/cm2) Do đó không nên cố định quá nhiều lớp lipase lên coton vì hiệu quả không cao

Gao, Wang, & Wang (2010) đã cố định lipase lên silica aerogel kị nước Chất mang được xử lý để tạo ra nhiều nhóm methyl trên bề mặt nhằm hấp phụ lipase tốt hơn Phương pháp cố định tối ưu là cho enzyme tiếp xúc với chất mang trong dung dịch đệm pH 7, sau đó enzyme sẽ được hoạt hóa bằng n-butanol Ngoài ra,

để hạn chế enzyme tự do thoát ra trong quá trình phản ứng, enzyme cố định được cho tiếp xúc với n-octane nhằm tạo ra lớp màng bao bọc enzyme Kết quả cố định theo phương pháp này khá cao so với các phương pháp hấp phụ khác: chất mang có khả năng hấp phụ 413 mg protein/g chất mang, hoạt tính enzyme cố định tăng 50% so với không sử dụng n-butanol hoạt hóa enzyme, lượng enzyme thất thoát trong phản ứng giảm 30 – 40% so với không sử dụng n-octane

Yucel (2012) sử dụng một phụ phẩm của ngành công nghiệp sản xuất dầu là

bã olive để cố định enzyme lipase Bã olive được trích ly bằng hexane, để khô và nghiền nhỏ, sau đó được phản ứng với glutaraldehyde Bột xử lý bằng glutaraldehyde được dùng để cố định lipase với các thông số tối ưu: nồng độ enzyme 9% v/v, pH 7,5 và nồng độ dung dịch đệm 65 mM Hoạt tính tối ưu của

enzyme đạt 6,21 μmol p-nitrophenylpalmitate/mg enzyme trong 1 phút Enzyme

cố định vẫn giữ 80% hoạt tính sau 10 lần sử dụng

1.2.5.4 Liên kết đồng hóa trị

Moreno và cộng sự (1997) đã cố định lipase lên aganose hoặc silica bằng cách trộn chất mang đã hoạt hóa với enzyme tự do để tạo các liên kết đồng hóa trị ở điều kiện pH 8 và 4 – 6o

C theo phương pháp ở Hình 1.3 và Hình 1.4 Hiệu suất

cố định lên cả hai chất mang là như nhau (33 – 40%) Tuy nhiên, hoạt tính còn lại của enzyme cố định trên aganose cao hơn cố định trên SiO2 (70 – 75% so với 40 – 50%) Khả năng thủy phân của enzyme cố định trên aganose cũng cao hơn so với trên SiO2

Hình 1.3: Phương pháp tosyl hóa để cố định enzyme lipase trên agarnose

(Moreno, Arroyo, Hernhiz, & Sinisterra, 1997)

Hình 1.4: Phương pháp trichorotriazine hóa để cố định enzyme lipase trên SiO2

(Moreno, Arroyo, Hernhiz, & Sinisterra, 1997)

Rodrigues, Godoy, & Volpato (2009) cũng thực hiện cố định enzyme lipase

từ Thermomyces lanuginosus lên agarnose Tuy nhiên họ hoạt hóa agarnose bằng

glyoxyl Liên kết đồng hóa trị được tạo ra giữa nhóm aldehyde của chất mang và nhóm Lys trên bề mặt enzyme ở pH 10 Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc biến đổi hóa học enzyme nhằm tạo ra nhiều liên kết đồng hóa trị hơn đã giúp enzyme cố định tăng độ bền nhiệt gấp 5 lần so với enzyme cố định không được

biến đổi hóa học Một nghiên cứu khác, cố định lipase từ Bacillus

thermocatenulatus lên glyoxyl agarnose cũng đưa ra kết quả tương tự (Bolivara,

Gallego, & Mateo, 2009)

Huang, Yu, & Xu (2008) cố định enzyme lipase bằng cách liên kết nó lên membrane dạng sợi Nhóm hydroxyl trên bề mặt sợi được hoạt hóa bằng epichlorohydrin, cyanuricchloride hoặc p-benzoquynone Sau đó lipase từ

Candida rugosa được cố định lên sợi này bằng liên kết đồng hóa trị Kết quả cho

thấy sử dụng epichlorohydrin làm chất hoạt hóa là thu được hoạt tính enzyme cố định cao nhất (17 U/mg so với 42 U/mg của enzyme tự do) Hiệu suất cố định cũng như độ bền về hoạt tính của enzyme cố định cũng có kết quả tốt nhất khi sử dụng epichlorohydrin làm chất hoạt hóa nhóm hydroxyl của sợi

Chang, Shaw, & Yang (2008) sử dụng một polymer là poly(-glutamic acid) (-PGA) làm chất mang để cố định lipase -PGA được hoạt hóa bằng carbodiimide(N-(3-dimethylami-nopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride , EDC) Chất mang sau đó được sấy khô và rửa bằng n-hexane rồi cho vào dung dịch enzyme tự do Quá trình cố định đạt tối ưu ở điều kiện: thời gian cố định 2,3 giờ, nhiệt độ 13,3oC và tỉ lệ enzyme/chất mang là 0,41 (w/w) Hoạt tính cao nhất đạt được là 1196 U/mg protein (hoạt tính của enzyme tự do là 30000 U/g)

Bai và cộng sự (2006) sử dụng silica có kích thước lỗ lớn (relative larger pore,

LPS) LPS được xử lý theo 2 phương pháp khác nhau để cố định lipase (Hình

1.5) Enzyme sau khi cố định không chỉ bền nhiệt và có thể tái sử dụng nhiều lần

mà hoạt tính còn lại cũng rất cao (69% cho LPS-1 và 76% cho LPS-2) Ngoài ra enzyme cố định trên LPS thể hiện tính chất tốt hơn so với trên vật liệu có lỗ nhỏ (small porous material, MSC)

Hình 1.5: Phương pháp cố định lipase lên LPS (Bai, Li, Yang, & Y, 2006)

Trong khi đó, Pahujani và cộng sự (2008) lại cố định enzyme lên một vật liệu không có lỗ là Nylon-6 Nylon-6 được thủy phân một phần bằng HCl 6N, sau đó rửa sạch với nước và cho phản ứng với glutaraldehyde 2,5% Nylon-6 được xử lý bằng glutaraldehyde sẽ được cho tiếp xúc với lipase ở 4oC trong 12 giờ Kết quả cho thấy hoạt tính của enzyme cố định đạt cao nhất ở 55oC và pH 7,5 Lipase cố định vẫn còn 88% hoạt tính sau 2 giờ ở 55o

C và 85% hoạt tính sau 8 lần sử dụng Hoạt tính lipase giảm thấp nhất khi hoạt động trong n-hexane và cao nhất trong n-heptane (tương ứng đạt 10,8% và 156% so với trong đệm) Ngoài ra, chất béo

mạch dài bị enzyme cố định thủy phân hiệu quả hơn chất béo mạch ngắn Nghiên cứu cho thấy lipase bền trong dung môi hữu cơ hơn so với trong nước Có thể do dung môi hữu cơ giữ cho liên kết giữa lipase và nước không bị phá vỡ, giúp enzyme giữ được cấu trúc ba chiều của nó Trong khi dung môi phân cực lấy nước khỏi phân tử lipase

Silva và cộng sự (2011) sử dụng chitosan và phức chitosan-alginate làm chất mang để cố định enzyme lipase Các chất mang này được hoạt hóa bằng nhiều

phương pháp khác nhau như được thể hiện ở Hình 1.6 Các phương pháp này

đều thể hiện khả năng cố định lipase tốt, tương đương enzyme cố định thương mại Trong đó hoạt tính cao nhất đạt được là 422,44 ± 50 U/g (hoạt tính của sản phẩm thương mại là 529,72 ± 11,7 U/g) khi cố định với chất mang chitosan được hoạt hóa theo phương pháp (D) Ngoài ra, enzyme cố định bằng phương pháp này cũng thể hiện sự bền nhiệt và khả năng tái sử dụng ngang bằng với sản phẩm Novozym 435 Tuy nhiên phương pháp (D) có một nhược điểm là lượng enzyme

cố định được thấp (1,8 mg protein/g chất mang)

Hình 1.6: Các phương pháp hoạt hóa chất mang

(A): hoạt hóa với glutaraldehyd;(B): hoạt hóa với glycidol;(C): hoạt hóa với glycidol, glutaraldehyde và EDA; (D): hoạt hóa với glycidol, EDA và glutaraldehyde Glu: glutaraldehyde; GOX: glyoxyl; GDL: glycidol; EDA: ethylenediamine (Silva, Macedo, Rodrigues, & Giordano, 2011)

Rodrigues, Mendes, & Adriano (2008) đã sử dụng chitosan và agarnose làm chất mang để cố định lipase Các tác giả đã khảo sát nhiều phương pháp khác nhau để hoạt hóa các chất mang này Kết quả thu được hoạt tính lipase cao nhất

là 2716 U/g sản phẩm sau 5 giờ cố định trên agarose hoạt hóa bằng glutaraldehyde Độ bền nhiệt của lipase khi cố định trên agarose-glutaraldehyde gấp 21 lần enzyme tự do Độ ổn định của lipase tăng theo thời gian cố định chứng tỏ có nhiều liên kết đồng hóa trị tạo ra giữa mỗi phân tử enzyme và chất mang

Brigida & Pinheiro (2007) đã nghiên cứu cố định lipase lên xơ dừa Vỏ dừa khô được nghiền nhỏ (kích thước 32 – 35 mesh), rửa sạch bằng nước cất và sấy khô Sau đó nó được hoạt hóa qua 4 bước với các hóa chất: acid nitric, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, acid sulphuric và sodium periodate Sau khi xử

lý, xơ dừa được rửa sạch và sấy chân không rồi được cho phản ứng để tạo liên kết đồng hóa trị với lipase Thông số tối ưu cho quá trình cố định là: thời gian cố định 2 giờ, pH 7 hoặc 10 Enzyme cố định ở pH 10 (CALB-10) thể hiện độ bền nhiệt ở 60oC gấp 363 lần enzyme thường và gấp 5,4 lần enzyme cố định ở pH 7 (CALB-7) Tuy nhiên CALB-7 lại thể hiện hoạt tính tốt hơn ở 5oC

Chaubey và cộng sự (2009) cố định lipase lên vật liệu không có từ tính (loại A) và có từ tính (loại B) được tạo ra bằng phản ứng copolymer hóa giữa 3-aminopropyltriethoxysilane và tetraethylorthosilicate Enzyme được cố định lên chất mang theo 3 phương pháp: nhốt lipase trong copolymer (loại 1), tạo liên kết đồng hóa trị giữa lipase với copolymer đã được hoạt hóa bằng glutaraldehyde

(loại 2) và kết hợp nhốt và liên kết đồng hóa trị (loại 3) (Hình 1.7) Kết quả hoạt

tính của từng loại như sau: A1: 30 U/g, A2: 50 U/g, A3: 75 U/g, B1: 35 U/g, B2:

70 U/g, B3: 90 U/g Lipase cố định bền vững trong pH 5 – 9 và nhiệt độ lên đến

70oC trong khi enzyme tự do không bền trong điều kiện này Khả năng tái sử dụng của các loại lipase cố định này cũng rất cao, vẫn giữ được 75 – 95% hoạt tính sau 15 lần sử dụng Ngoài ra, lipase cố định cũng thể hiện khả năng phản ứng chọn lọc đối với đồng phân quang học Như vây, lipase cố định trên vật liệu

có từ tính (loại B3) không chỉ có hoạt tính cao mà còn dễ dang phân tách khỏi cơ chất trong quá trình sử dụng

Hình 1.7: Phương pháp cố định enzyme lipase (ABL) bằng liên kết đồng hóa trị

lên chất mang không có từ tính (loại A) và có từ tính (loại B)

(Chaubey, Parshad, & Taneja, 2009)

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Enzyme lipase

Enzyme lipase mua từ Novo Nordisk, Đan Mạch với các tính chất được nêu ở bảng 2.1 và bảng 2.2

Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme lipase

Loại enzyme Lipopan F BG

Hoạt tính enzyme 25 KLU/g

Aspergillus oryzae (sản xuất bằng cách lên men chìm vi

sinh vật đã bị biến đổi gen Protein enzyme được phân tách

và tinh sạch khỏi hệ cơ chất) Nhiệt độ bảo quản 0 – 25oC

Bảng 2.2: Đặc điểm kỹ thuật của enzyme lipase

2.1.2 Chitosan (Dutta, Dutta, & Tripathi, 2004)

2.1.2.1 Giới thiệu về chitosan

Chitosan là một polysaccharide gồm các phân tử D-(1,4) glucosamin Chitosan là một thành phần quan trọng trong vỏ của động vật giáp xác, bộ xương ngoài của côn trùng và thành tế bào của nấm Nó có tác dụng tạo khung vững

chắc và ổn định Chitosan là dẫn xuất quan trọng của chitin, thu nhận bằng cách khử nhóm acetyl của chitin khi xử lý với dung dịch KOH hay NaOH đặc Vì vậy chitosan là một polymer đồng trùng hợp của N-acetyl-D-glucosamin và D-glucosamin, chứa tối đa 30% nhóm acetyl

Công thức hóa học của chitosan là (C6H11NO4)n với n = 700 – 4500

Chitosan có hai chỉ số quan trọng là mức độ deacetyl hóa và trọng lượng phân

tử trung bình Độ deacetyl hóa là độ chuyển hóa chitin thành chitosan Thông thường chitosan có mức độ deacetyl hóa từ 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan

có độ acetyl hóa khoảng 45 – 55% tan tốt trong nước, gọi là chitin tan Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan là một đại lượng có ý nghĩa thống kê, nó được xác định thông qua độ nhớt dung dịch chitosan, có giá trị biến đổi từ 10000 – 500000 tùy theo mỗi loại chitosan khác nhau Hai chỉ số này ảnh hưởng trực tiếp đến các tính chất hóa lý, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chitosan

Hình 2.1: Cấu tạo phân tử chitin (a) và chitosan (b)

2.1.2.2 Tính chất của chitosan

 Chitosan có tác dụng kháng khuẩn rất tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây

bệnh như E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, và có tác dụng diệt nấm, nhất là nấm Candida albicans

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chitosan có nguồn gốc từ Đại học Thủy Sản Nha Trang với các thông số hóa lý:

- Độ ẩm: 15,92%

- Độ tro: 2,0672%

- Chỉ số deacetyl hóa: (Chỉ số DD) 75%

- Phân tử lượng trung bình: 5,187 × 104 đvC

2.1.3 Natri alginate (McHugh, 1987)

2.1.3.1 Giới thiệu về alginate

Acid alginic là một loại polysaccharide đặc biệt có nhiều ở các loại rong nâu

như Ascophyllum, Fucus, Laminaria, Macrocosystys, Sargassum Acid alginic

trập trung nhiều ở thành tế bào và chiếm khoảng 18 – 40% chất khô Năm 1883, Stanford là người đầu tiên phát hiện ra “algin” nhưng đến 1986 Krefting mới tách chiết được dạng tinh khiết Những năm sau này thuật ngữ “algin” thường được sử dụng để chỉ các muối calcium, magnesium, sắt của acid alginic Tiếp sau đó có nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc của chúng Năm 1970, Chapman đã đúc kết và đưa ra công thức chung của acid alginic là (C6H8O6)n

Alginate là tên gọi khác của “algin”, đó là một polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ 2 gốc monomer là -D-mannuroinic acid (M) và -L-guluronic acid (G) bởi các liên kết 1-4 glycoside Cấu tạo phân tử alginate gồm 3 block(Haug, 1967):

 Block homopolymannuroinate: các gốc -D-mannuroinic acid liên kết với nhau

 Block homopolyguluronate: các gốc -L-guluronic acid liên kết với nhau

 Block alternating: hỗn hợp các monomer trên liên kết với nhau

Chuỗi polyguluronate có dạng gấp nếp, còn chuỗi polymannuroinate có dạng phẳng Do vậy chúng sẽ có những tính chất khác nhau khi kết hợp với các ion đa hóa trị Chiều dài sự phân bố của block sắp xếp một các ngẫu nhiên tùy thuộc vào từng loài rong, giai đoạn trưởng thành, các bộ phận và môi trường sống của rong Điều này làm cho alginate rất đa dạng và có tính chất khác nhau

Hình 2.2: Cấu trúc của alginate

a)Monomer của alginate; b) Block homopolyguluronate;

c) Block homopolymannuroinate; d) Block alternating;

e) Sự bố trí của các block trong phân tử alginate (McHugh, 1987)

Để đặc trưng cho thành phần hóa học của alginate, người ta có thể xác định tỉ

lệ mol M/G và sự phân bố được biểu hiện bởi tần suất của các khúc đôi, khúc ba:

FMM, FGG, FMG, FGM, FMMM, FMMG, FGMM, FGMG, FGGG, FGGM, FMGM

2.1.3.2 Tính chất của alginate

 Độ nhớt: Dung dịch alginate có độ nhớt rất cao khi còn ở trong vách tế bào, nhưng khi được tách chiết thì độ nhớt của dung dịch alginate giảm đi đáng kể, và phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp chiết tách Khi kết hợp với các cation hóa trị 1 như Na+, K+, NH4… alginate tan trong nước, tạo

thành một dung dịch có độ nhớt cao Có nhiều yếu tố ảnh hưởng độ nhớt của dung dịch alginate:

- Alginate có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt dung dịch càng cao Trong sản xuất, người ta có thể điều chỉnh khối lượng phân tử thông qua chỉ số polymer hóa (Degree of Polymerization– DP)

để tạo ra alginate có độ nhớt từ 10 – 1000 mPa.s (ở dung dịch 1%), với chỉ số DP từ 100 – 1000 đơn vị

- Khi nồng độ dung dịch alginate tăng thì độ nhớt cũng tăng

- Nhiệt độ cũng gây ảnh hưởng đến độ nhớt Khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt giảm với mức độ 2,5 %/oC Khi đun nóng dung dịch trên 50o

C trong một khoảng thời gian dài, thì xảy ra quá trình depolymer hóa làm giảm độ nhớt Do vậy khi đun nóng, rồi làm nguội thì độ nhớt sẽ giảm

đi một ít Tuy nhiên, khi hạ nhiệt độ đến điểm động đặc, sau đó rã đông thì độ nhớt vẫn không đổi

- pH: Ở pH < 5, nhóm COO- bị proton hóa thành COOH, làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi, giúp chúng tiến lại gần nhau tạo liên kết hydro làm tăng độ nhớt Nếu tiếp tục giảm pH xuống 3 – 4 thì chúng sẽ tạo gel, nhưng khi có mặt Ca+ thì chúng có thể tạo gel ở pH = 5 Độ nhớt không bị ảnh hưởng nhiều khi pH = 5 – 11 Khi pH giảm nhanh từ

6 – 2 thì xảy ra quá trình kết tủa alginic acid Khi pH > 11 thì xảy ra quá trình depolymer hóa làm giảm pH do liên kết glucoside dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm Bên cạnh đó, những tác nhân mang gốc tự

do cũng có tác dụng oxy hóa làm giảm độ nhớt dung dịch alginate

- Ca2+: khi nồng độ Ca2+ rất thấp thì sẽ làm tăng độ nhớt dung dịch, nhưng khi có lượng lớn Ca2+

sẽ hình thành gel Do vậy, không cần tăng nồng độ alginate hay khối lượng phân tử, mà chỉ cần một lượng nhỏ

Ca2+ thì độ nhớt sẽ tăng Alginate có Ca2+ khi khuấy sẽ làm giảm độ nhớt hơn so với alginate không có Ca2+

 Khả năng tạo gel: Một trong những tính chất quan trọng nhất của alginate

là khả năng tạo gel dưới những điều kiện nhất định Khi cho kết hợp với các ion hóa trị cao, thường sử dụng nhất là Ca2+, sẽ làm xuất hiện các cầu nối giữa các mạch phân tử trong alginate và tạo gel Gel này được hình thành ở nhiệt độ nhỏ hơn 100oC

Loại alginate sử dụng trong luận văn này có nguồn gốc từ rong mơ thuộc

giống Sargassum do Đại học Thủy sản Nha Trang cung cấp với các tính

chất:

- Chế phẩm dạng rắn, độ ẩm 20,05%

- Độ nhớt của dung dịch alginate 2% ở 25oC là 423,6 cP

2.1.4 Dầu olive (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Dầu olive được sản xuất và tiêu thụ rất phổ biến trên thế giới, đặc biệt là các quốc gia vùng Địa Trung Hải Dầu olive thu được từ quá trình tách ép phần thịt

quả olive Olea eruopaea (L.) (họ Oleaceaeai) Trong thành phần dầu olive chứa

hơn 80% acid oleic, tuy nhiên tỉ lệ acid béo không bão hòa mạch dài rất thấp Điểm đặc biệt của dầu olive là sự thay đổi lớn thành phần acid béo trong dầu theo vùng trồng nguyên liệu Một số dầu olive từ giống nguyên liệu tốt có thể sử dụng trực tiếp mà không cần qua công đoạn tinh luyện (virgin state) Ngoài ra, tùy thuộc vào quá trình tách ép, chất lượng dầu olive thay đổi khác nhau, có thể chia làm 3 nhóm theo hàm lượng acid béo: Hàm lượng acid béo tối đa 1%; hàm lượng acid béo tối đa 1,5% và hàm lượng acid béo tối đa 3,5%

Chúng tôi sử dụng dầu olive trong luận văn này vì khả năng thủy phân dầu

olive của enzymelipase là tốt nhất so với các loại dầu khác (Hình 2.3)

Hình 2.3: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến khả năng thủy phân của lipase

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)