Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ identifiler từ quần thể người dân tộc dao ứng dụng trong giám định AND

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT HÀ ĐẠI DƯƠNG KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN CỦA 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC DAO ỨNG DỤNG TRONG GIÁM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HÀ ĐẠI DƯƠNG

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN CỦA 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC DAO ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2017

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HÀ ĐẠI DƯƠNG

Tên đề tài:

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN CỦA 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN

TỘC DAO ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Người hướng dẫn: Đại tá PGS TS Nguyễn Văn Hà

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn này tôi xin gửi tới đồng chí Đại tá.PGS.TS

Nguyễn Văn Hà - Phó Giám đốc Trung tâm giám định Sinh học pháp lý - Viện

Khoa học hình sự - Bộ Công an với lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành, người đã nhiệt tình hướng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và tập thể cán bộ chiến sỹ Trung tâm giám định sinh học pháp lý - Viện Khoa học hình sự đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia học tập thực nghiệm tại phòng thí nghiệm để hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt nam nói chung, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật nói riêng đã tham gia tổ chức, quản lý, giảng dạy lớp cao học K19 hướng dẫn, trang bị kiến thức cho tôi là cơ sở tạo tiền đề giúp tôi hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ và động viên tinh thần, giúp tôi vượt qua những khó khăn, trở ngại trong quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với sự giúp đỡ nhiệt tình, quý báu đó!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Hà Đại Dương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 3

3 Bố cục của luận văn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về người dân tộc Dao ở Việt Nam 4

1.2 Giám định gen trong khoa học hình sự 6

1.2.1 Lịch sử ra đời của giám định gen 6

1.2.2 Khái quát trình tự STR (Sort Tandem Repeats) 8

1.2.3 Phân loại chỉ thị STR và sử dụng STR trong giám định gen 9

1.2.4 Các locus STR trong bộ kit Identifler 9

1.2.5 Ưu điểm và hạn chế của bộ kit Identifiler trong công tác giám định 11

1.3 Xây dựng cơ sở dữ liệu gen người phục vụ công tác giám định 11

1.3.1 Mục đích xây dựng cơ sở dữ liệu gen 11

1.3.2 Quy trình xây dựng cơ sở dữ liệu gen 12

1.3.3 Số lượng mẫu tính toán tần suất alen 13

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định gen 13

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Thu mẫu 16

2.2.2 Phân tích mẫu 17

2.2.3 Xử lý số liệu thống kê và tính tần suất các locus gen 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN 22

3.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen 22

3.3 Kết quả xử lý số liệu thống kê 25

3.3.1 Kết quả tính toán tần suất các alen 25

3.3.2 Kết quả quan sát kiểu gen ở từng locus và tính toán chỉ số kiểm định 2 28

3.3.3 So sánh chỉ số kiểm định 2 giữa tính toán (2 tt) với lý thuyết (2 lt) và đánh giá sự phù hợp với định luật Hardy - Weinberg 35

3.3.4 So sánh tần suất alen của người Dao với một số dân tộc 36

3.4 Một số ví dụ về ứng dụng kết quả của đề tài trong công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an 48

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC MỘT SỐ KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

ADN - Axit Deoxyribo Nucleic

ARN - Axít ribonucleic

VNTR - Variable Number of Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn

STR - Short Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn

ID - Identifiler/Identify definition

PCR - Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

FTA - Giấy thu mẫu máu phục vụ giám định ADN

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Sơ đồ các bước chính xây dựng cơ sở dữ liệu gen 12

Hình 3.1 Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D96 23

Hình 3.2 Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D39 24

Hình 3.3 Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D68 25

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các locus STR và đơn vị lặp trong bộ kit Identifiler 10

Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN 22

Bảng 3.2: Tần suất xuất hiện của các alen trên 15 locus hệ Identifiler với quần thể người dân tộc Dao……….27

Bảng 3.3: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D8S1179 28

Bảng 3.4: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D21S11 28

Bảng 3.5: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D7S820 29

Bảng 3.6: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus CSF1PO 29

Bảng 3.7: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D3S1358 30

Bảng 3.8: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus TH01 30

Bảng 3.9: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D13S317 30

Bảng 3.10: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D16S539 31

Bảng 3.11: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus TPOX 31

Bảng 3.12: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D16S539 32

Bảng 3.13: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus vWA 32

Bảng 3.14: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D19S433 33

Bảng 3.15: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D18S51 33

Bảng 3.16: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus FGA 34

Bảng 3.17: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D18S51 34

Bảng 3.18: So sánh 2 TT và 2 LT 35

Bảng 3.19: Tần suất alen (%) của các locus gen hệ Identifiler của dân tộc Dao, Kinh và người gốc Mỹ [17] 36

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Viện Khoa học hình sự được thành lập vào ngày 19 tháng 5 năm 1978 theo Quyết định 78/QĐ-BNV do Bộ trưởng Bộ Nội vụ Trần Quốc Hoàn ký Trải qua gần 40 năm xây dựng và trưởng thành, Viện đã trở thành một cơ quan đầu ngành của lực lượng kỹ thuật hình sự trong cả nước Cho đến nay, Viện Khoa học hình sự đã hình thành được đội ngũ giám định viên có chuyên môn nghiệp

vụ, đã làm chủ được nhiều trang thiết bị máy móc hiện đại, đảm bảo công tác giám định chính xác khách quan Trong các lĩnh vực giám định kỹ thuật hình sự

và pháp y của Viện Khoa học hình sự, thì giám định gen là một trong những lĩnh vực giám định đã tạo dựng được nhiều “tiếng vang” nhất trong công tác phòng, chống tội phạm giữ gìn an ninh chính trị, trật tự an toàn xã hội Từ tháng 4 năm

1999, Viện Khoa học hình sự đã triển khai lĩnh vực giám định gen với toàn bộ quy trình được chuyển giao từ Viện Khoa học hình sự bang Victoria - Úc, ban đầu sử dụng hệ NinePlex II (gồm 09 locus) Đến năm 2006 Viện Khoa học hình

sự đã đưa vào ứng dụng hệ Identifiler (gồm 15 locus STR) trong giám định gen

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung, giám định gen nói riêng, những kết luận giám định gen từ những dấu vết sinh vật như: máu, tinh dịch, lông tóc… là những dấu vết quan trọng thường xuất hiện ở hầu hết các vụ

án, nhất là những vụ án hình sự nghiêm trọng như giết người, hiếp dâm…trở thành nguồn chứng cứ vật chất vô cùng quan trọng để đấu tranh với tội phạm Tuy nhiên, từ thực tiễn cho thấy, kết luận giám định gen thường là so sánh kiểu gen phân tích từ các dấu vết tại hiện trường với đối tượng hay nạn nhân hoặc xác định quan hệ huyết thống cha, mẹ đẻ - con đẻ Nếu như các kiểu gen phân tích từ các dấu vết hiện trường không trùng với đối tượng hay nạn nhân, hoặc kiểu gen của người con không phù hợp di truyền với bố mẹ giả định thì có thể kết luận loại trừ ngay Nhưng khi các kiểu gen phân tích được đưa ra so sánh hoàn toàn phù hợp, thì bài toán đặt ra là khả năng có một người nào khác trong

quần thể cũng có kiểu gen đó hoặc cũng có sự phù hợp di truyền với người con

đó không? Thực tế, chúng ta không thể có một cơ sở dữ liệu gen đầy đủ từng người trong một quần thể, do đó việc khảo sát một số lượng người nhất định đại diện cho quần thể là cơ sở khoa học để ước lượng được tần suất kiểu gen

Nhận được sự quan tâm, chỉ đạo của Chính phủ, Bộ Công an, Viện Khoa học hình sự đang xây dựng cơ sở dữ liệu gen của các quần thể dân tộc người trong khắp cả nước, đặc biệt là những nơi có nhiều tội phạm nguy hiểm, diễn biến phạm tội phức tạp để phục vụ công tác giám định và xây dựng Tàng thư gen Đến nay, Viện đã xây dựng được một trung tâm dữ liệu gen với số lượng hàng chục nghìn mẫu, với các quần thể người: Kinh, Khmer, Mông, Tày Tuy nhiên, chưa có dữ liệu của người Dao

Người Dao ở Việt Nam có dân số 751.067 người, cư trú tại 61 trên tổng

số 63 tỉnh, thành phố Người Dao cư trú tập trung tại các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta Thời gian gần đây những khu vực người Dao sinh sống thường là các điểm phức tạp về an ninh chính trị, trật tự an toàn xã hội, thường xuyên có những đối tượng phạm tội chính trị, tội phạm là người nước ngoài, tội phạm ma túy kết cấu với người dân tộc Dao để thực hiện các hành vi phạm tội như gây rối trật tự, buôn bán phụ nữ trẻ em, buôn bán sử dụng ma túy Số vụ việc cần giám định ADN liên quan tới người dân tộc Dao có chiều hướng gia tăng Nên việc thu thập các thông tin về dân số trong đó có dữ liệu gen phục vụ quản lý nhân khẩu, phòng chống tội phạm là công việc rất cần thiết Hiện nay chưa có đề tài nào nghiên cứu về ADN của người Dao phục vụ giám định gen

Chính vì những lí do trên, tôi chọn đề tài nghiên cứu “Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể người dân tộc Dao ứng dụng trong giám định ADN” làm đề tài luận văn

Thạc sỹ Đề tài được hoàn thiện sẽ đóng góp cơ sở khoa học vào công tác giám định gen và bổ sung dữ liệu người Dao vào cơ sở dữ liệu gen mà Viện Khoa học hình sự đang xây dựng

2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài hướng tới mục tiêu:

- Khảo sát tần suất alen ở 15 locus gen (hệ Identifiler) từ 120 người thuộc dân tộc Dao khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống với nhau, sinh sống ở khu vực các tỉnh vùng núi phía bắc Việt Nam Các tần suất này được kiểm định phù hợp ngẫu nhiên theo định luật cân bằng Hardy - Weinberg, đảm bảo tính chính xác, khách quan để sử dụng trong kết luận giám định Ngoài ra, đề tài còn hướng tới mục tiêu bổ sung dữ liệu gen của người Dao vào trong hệ thống dữ liệu gen các dân tộc của Viện Khoa học hình sự

- Ứng dụng bảng tần suất xây dựng được vào việc tính toán tần suất alen trong các vụ án cụ thể mà mẫu thu được từ người Dao

3 Bố cục của luận văn

Luận văn được trình bày theo quy định tiêu chuẩn luận văn Thạc sỹ của

Bộ Giáo dục đào tạo Ngoài phần mở đầu, kết luận, các danh mục tài liệu tham khảo và phụ lục, luận văn được cấu trúc gồm 3 chương:

- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về người dân tộc Dao ở Việt Nam

Người Dao ở Việt Nam có dân số 751.067 người, cư trú tại 61 trên tổng

số 63 tỉnh, thành phố Người Dao cư trú tập trung tại các tỉnh: Hà Giang (109.708 người, chiếm 15,1% dân số toàn tỉnh và 14,6% Việt Nam), Tuyên Quang (90.618 người, chiếm 12,5% dân số toàn tỉnh và chiếm 12,1% tổng số người Dao tại Việt Nam), Lào Cai (88.379 người, chiếm 14,4% dân số toàn tỉnh

và 11,8% tổng số người Dao tại Việt Nam), Yên Bái (83.888 người, chiếm 11,3% dân số toàn tỉnh và 11,2% tổng dân số người Dao tại Việt Nam), Quảng Ninh (59.156 người, chiếm 5,2% dân số toàn tỉnh), Bắc Kạn (51.801 người, chiếm 17,6% dân số toàn tỉnh), Lai Châu (48.745 người, chiếm 13,2% dân số toàn tỉnh), Lạng Sơn (25.666 người), Thái Nguyên (25.360 người) [1]

Tết: Tết cổ truyền của người Dao diễn ra cùng dịp với Tết Nguyên đán của người Việt, thường sớm hơn nửa tháng và kết thúc tương tự Vào những ngày giáp Tết (tháng 12 âm lịch), dân bản tập trung tại nhà trưởng bản hoặc một nhà nào đó theo phiên để cùng nhau tiến hành "Tết Nhảy" Trong một năm, theo phong tục của người Dao có 3 cái Tết quan trọng là tết Thanh minh, rằm tháng Bảy và Tết năm cùng nhưng quan trọng nhất vẫn là Tết năm cùng Vì đây là dịp báo cáo với ông bà tổ tiên về một năm lao động của gia đình, dòng họ

Lịch sử: Người Dao có nguồn gốc xa xưa ở đảo Hải Nam (Trung Quốc) gồm 7 nhóm Người Dao ở Việt Nam và ở Lào Cai có 3 nhóm: Dao Tuyển, Dao Nga Hoàng và Dao Làn Tẻn (còn gọi là Dao Chàm) họ bắt đầu di cư sang Việt Nam vào thời Lê (vào khoảng cuối thế kỷ 17) Để đến được đất Việt, sống ở vùng núi như ngày nay, người Dao đã phải trải qua cuộc hành trình muôn phần gian khổ vượt biển, vượt núi, vượt sông Điều này phản ánh rõ trong nhiều phong tục, nghi lễ của người Dao và được ghi lại rất tỉ mỉ trong sách cổ Người

Dao di cư sang Việt Nam theo nhiều đợt từ đảo Hải Nam, qua Phòng Thành, tới Bắc Giang Tới đây, họ di chuyển theo các hướng khác nhau là:

- Theo sông Lô tới Hà Giang hình thành nên người Dao áo dài

- Theo sông Chảy tới Lào Cai, hậu duệ ngày nay gọi là Dao Tuyển

- Nhóm ở lại vùng Nga Hoàng thuộc Yên Lập, Yên Phúc một thời gian, sau đó di chuyển tới Văn Chấn (Yên Bái), rồi Văn Bàn (Lào Cai) là tổ tiên người Dao quần chẹt ngày nay

Văn hóa: Dân tộc Dao có một nền văn hóa rất phong phú và đậm đà bản

sắc thể hiện qua nhiều phong tục, nhiều điệu múa đẹp, nhiều bài hát hay, kho tàng truyện cổ tích, thần thoại, ngụ ngôn, ca dao, thành ngữ, chiêm tinh, tướng

số, câu đố Nhưng cũng giống các dân tộc thiểu số khác chủ yếu tồn tại dưới dạng truyền khẩu, vốn này ngày nay cũng bị mai một, thất truyền với những lý

do khách quan cũng như chủ quan

Hoạt động sản xuất: Người Dao sống chủ yếu bằng nghề trồng trọt trên

nương và ruộng nước Ngoài lúa họ còn trồng màu Nông cụ sản xuất thô sơ nhưng kỹ thuật canh tác đã có nhiều tiến bộ Một số nghề thủ công đã phát triển như dệt vải, rèn, mộc, làm giấy, ép dầu Họ nuôi nhiều lợn, gà, nhưng chủ yếu dùng trong những ngày ma chay, cưới xin, lễ tết Nhà ở có 3 loại khác nhau: nhà sàn, nhà nửa sàn nửa đất, nhà đất (nhà trệt) Đàn ông Dao trước đây để tóc dài búi sau gáy, hoặc để chỏm tóc trên đỉnh đầu Ngày nay, hầu hết đã cắt tóc ngắn

Y phục thường gồm quần và áo ngắn, áo dài Trang phục của phụ nữ phong phú hơn, giữ được nhiều nét trang trí hoa văn truyền thống Phụ nữ Dao để tóc dài

Cô dâu trong ngày cưới đội mũ Dưới chế độ cũ, cưới xin gồm nhiều nghi lễ phức tạp Có hai hình thức ở rể: có thời hạn và vĩnh viễn Tuy nhiên phổ biến là sau lễ cưới, vợ về nhà chồng Ma chay phản ánh nhiều tục lệ xa xưa Ở một vài vùng có tục hoả táng cho người chết từ 12 tuổi trở lên Người Dao có nhiều tín ngưỡng về thần linh, ma quỷ, có một số tục lệ thờ cúng phức tạp và tốn kém Người Dao có quan hệ họ hàng chặt chẽ và thông qua tên đệm để xác định dòng

họ, vai vế của người đó trong quan hệ dòng họ Người Dao có nền văn hóa và lịch sử lâu đời Mặc dù cơ sở kinh tế nói chung còn thấp kém, nhưng tri thức dân gian rất phong phú, đặc biệt là y học dân tộc cổ truyền Tiếng nói thuộc nhóm ngôn ngữ Hmông - Dao, không có văn tự riêng mà sử dụng chữ Hán đã được Dao hoá, gọi là chữ Nôm Dao

Như vậy, người Dao tuy là dân tộc thiểu số nhưng phân bố rộng rãi cư trú tại 61 trên tổng số 63 tỉnh, thành phố Người Dao cư trú chủ yếu ở biên giới Việt

- Trung, Việt - Lào và một số tỉnh trung du và ven biển Bắc Bộ Việt Nam gần đây có một nhóm nhỏ chuyển vào sinh sống ở khu vực Tây Nguyên Cụ thể, ở tại các miền rừng núi phía bắc (Hà Giang, Tuyên Quang, Lào Cai, Yên Bái, Cao Bằng, Bắc Kạn, Lai Châu…) đến một số tỉnh trung du như (Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Thái Nguyên…) và miền biển như Quảng Ninh Đây là các tỉnh nằm dọc biên giới Việt - Trung

1.2 Giám định gen trong khoa học hình sự

Giám định gen là nghiên cứu, phân tích ADN so sánh từ các dấu vết, vật

chứng có nguồn gốc sinh vật bằng kỹ thuật gen Hiện nay Viện KHHS mới chỉ thực hiện giám định ADN người Thông qua phân tích ADN để xác định truy nguyên, nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm tung tích nạn nhân, người mất tích trong các vụ cháy, vụ tai nạn, thảm họa… hoặc xác định quan hệ huyết thống [7]

1.2.1 Lịch sử ra đời của giám định gen

Thuật ngữ “DNA fingerprinting” hay “DNA typing” được mô tả lần đầu tiên vào năm 1985 bởi nhà di truyền học là tiến sỹ Alec Jeffreys Ông đã phát hiện ra rằng trong chuỗi ADN có các trình tự bazơnitơ lặp lại nhiều lần và số lượng các trình tự lặp lại này khác nhau với từng cá thể Bằng cách phát triển kỹ thuật để kiểm tra sự biến đổi độ dài của các trình tự ADN lặp lại này, Tiến sỹ Jeffreys đã thực hiện các thí nghiệm để nhận dạng người [29]

Các vùng trình tự ADN lặp lại này gọi là VNTRs (viết tắt của cụm từ

variable number of tandem repeats) Các vùng VNTRs được Jeffreys sử dụng kỹ thuật đa hình độ dài giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP)

để phân tích Ông đã sử dụng một enzyme giới hạn để cắt các vùng ADN xung quanh VNTR Phương pháp RFLP lần đầu tiên được sử dụng để truy nguyên tội phạm trong vụ án xảy ra tại nước Anh: vụ hai cô gái là Lynda Mann và Dawn Ashworth bị tấn công tình dục và sau đó đều bị sát hại vào năm 1986 Cả hai vụ giết người này xảy ra gần ngôi làng Narborough ở Leicestershire, Anh Một người đàn ông ở địa phương đã bị nghi ngờ giết chết một trong hai cô gái, nhưng khi phân tích kiểu gen từ mẫu máu của ông này với kiểu gen phân tích được từ mẫu tinh dịch của nghi phạm để lại trên hai nạn nhân thì không trùng khớp Đây là lần đầu tiên một phân tích ADN đã chứng minh được một người

vô tội Sau đó, người ta đã thu thập một lượng mẫu lớn từ những người đàn ông sống trong 3 làng gần đó, nhưng cũng không có người nào trùng khớp Một năm sau, một phụ nữ đã tố giác một người đàn ông tên là Colin Pitchfork đã thực hiện vụ án, cảnh sát đã thu mẫu máu của người này và phân tích ADN thì thấy trùng khớp với mẫu tinh dịch để lại trên hai nạn nhân kia Người này đã bị kết tội Kể từ đó, việc giám định gen để truy nguyên con người trong các vụ án hình

sự được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm khoa học hình sự trên thế giới [28,29]

Tuy nhiên kỹ thuật phân tích vùng VNTRs có nhiều hạn chế, đó là thời gian phân tích lâu (từ 6 - 8 tuần), nhiều công đoạn, chỉ phân tích được từng locus đơn lẻ mà không phân tích được các locus cùng lúc (multiplex), không phân tích được khi gặp các dấu vết ít, dấu vết bị biến tính

Các hạn chế này được khắc phục bởi kỹ thuật phân tích các đoạn lặp ngắn song song (Short Tandem Repeat - STR) Khi phân tích STR, có thể phân tích nhiều locus cùng lúc, có tính đa hình và khả năng truy nguyên cá thể cao, thời gian phân tích ngắn (chỉ 4-8 tiếng) và phân tích được các dấu vết ít, dấu vết bị

phân hủy, dấu vết bị lẫn (mixture) Chính vì vậy kỹ thuật phân tích STR trở nên phổ biến và là công cụ hữu ích cho giám định gen hình sự Đây cũng là cơ sở để các hãng thương mại có thể sản xuất nhiều bộ kit phân tích gen có độ nhậy, chính xác và có khả năng tự động hóa các quy trình phân tích

Trong những năm gần đây, đã có những nghiên cứu ứng dụng các công nghệ kỹ thuật mới trong phân tích ADN hình sự, như kỹ thuật Next-Generation Sequencing (NGS) đang được nghiên cứu của công ty Illumina (miseq)

Tuy nhiên, kỹ thuật phân tích STR bằng công nghệ điện di mao dẫn CE vẫn được sử dụng rộng rãi cho các phòng thí nghiệm giám định gen hình sự trên thế giới, trong đó có Viện Khoa học hình sự Việt Nam Viện KHHS -Việt Nam được trang bị nhiều bộ kit thương mại như: bộ kit Identifler, Identifiler plus, Identifiler Direct, Globalfiler, Yfiler và Yfiler plus Các bộ kit này được sử dụng tại các phòng thí nghiệm tiên tiến như ở FBI (Mỹ) hay Interpol Các hệ thống cơ

sở dữ liệu gen lớn đều sử dụng các chỉ thị di truyền (marker) cơ bản có trong các

bộ kit này để xây dựng

1.2.2 Khái quát trình tự STR (Sort Tandem Repeats)

Bộ gen người có đến 99,7% là giống nhau, chỉ có 0,3% còn lại là khác nhau giữa các cá thể Trong đó người ta phát hiện thấy có rất nhiều trình tự ADN lặp lại nằm rải rác khắp bộ gen người Các đoạn lặp lại này thường nằm giữa trình tự gen, kích thước khác nhau và không ảnh hưởng đến biểu hiện kiểu hình của cá thể [28]

Bộ gen Eukaryote có đầy đủ chuỗi ADN lặp đi lặp lại, những chuỗi này

có kích thước, chiều dài của đơn vị lặp đặc trưng Các trình tự lặp có thể chứa vài trăm đến vài nghìn nucleotide Các vùng này được phát hiện thấy xung quanh tâm động của nhiễm sắc thể [28] Đơn vị lặp là một trình tự bazơ có độ dài trung bình gọi là các “minisatellite” hoặc VNTRs từ khoảng 8 đến 100 bp

Có những trình tự ADN có các đơn vị lặp từ 2 đến 7 bp được gọi là các

“microsatellites” hay các chuỗi lặp đơn giản (SSRs) hoặc là các đoạn lặp ngắn phổ biến STR (Short Tandem Repeats) STR là chỉ thị di truyền phổ biến vì chúng dễ dàng được khuếch đại bởi những cặp mồi đặc hiệu Do số lần lặp lại STR khác nhau giữa từng cá thể nên có tính đa hình cao và có hiệu quả cho việc truy nguyên cá thể

Thực tế thì trong 0,3% bộ gen người kể trên có tới hơn một triệu trình tự

STR, nằm rải rác trong toàn bộ hệ gen [28]

Các trình tự STR được đặt tên theo độ dài đơn vị lặp lại Dinucleotide có hai nucleotide lặp lại, trinucleotides có ba nucleotide trong đơn vị lặp, tetranucleotide có bốn, pentanucleotide có 5 và hexanucleotide có sáu nucleotide Các trình tự STR không chỉ khác nhau về độ dài, số lần lặp lại mà còn khác nhau về cách thức lặp [25, 26, 27, 28, 29]

1.2.3 Phân loại chỉ thị STR và sử dụng STR trong giám định gen

Giám định gen truy nguyên cá thể phải sử dụng các chỉ thị di truyền STR

có tính đa hình cao nhất hoặc có thể kết hợp nhiều các chỉ thị di truyền với nhau

Vì kích thước của các trình tự STR nhỏ (khoảng 100 ÷ 400 bp) nên dễ dàng khuếch đại, kể cả từ các dấu vết hình sự với lượng ít hoặc bị phân hủy Trong giám định gen hình sự, người ta thường sử dụng các trình tự STR có đơn vị lặp tetranucleotide hơn là dinucleotide và trinucleotides do hiện tượng “stutter” thường ít hơn 15% với alen thật khi thực hiện phản ứng khuếch đại với trình tự STR có đơn vị lặp là tetranucleotide Trình tự STR được đặt tên dựa vào cấu trúc của chuỗi là đơn vị và số đơn vị lặp lại [28]

1.2.4 Các locus STR trong bộ kit Identifler

Các công ty thương mại như Applied Biosystems và the Promega đã phát triển mạnh mẽ những bộ kít sử dụng các STR có độ nhạy cao, có khả năng phân tích nhiều locus gen cùng lúc, đã đáp ứng được những ưu cầu thực tiễn của giám định gen ADN hình sự Những bộ kit này được các tổ chức khoa học hình sự của thế giới chứng nhận

Năm 1996, phòng thí nghiệm FBI của Mỹ thiết lập một bộ STR cốt lõi để đưa vào cơ sở dữ liệu quốc gia Quá trình nghiên cứu, họ đã chọn ra 13 locus STR gồm: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1189, D13S317, D16S539, D18S51 và D21S11 để thành lập một cơ sở dữ liệu gen CODIS [28]

Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đã ứng dụng bộ kit Identifler (gồm 15 locus STR và 1 locus giới tính) vào công tác giám định gen Qua quá trình đánh giá nội bộ và thực tiễn nhận thấy bộ kit đã đáp ứng tốt cho công tác giám định gen tại Việt Nam

Bảng 1.1 Các locus STR và đơn vị lặp trong bộ kit Identifiler

Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen

Y: p11.2

D5S818 5q21-31 AGAT 4 - 29

1.2.5 Ưu điểm và hạn chế của bộ kit Identifiler trong công tác giám định

Quá trình ứng dụng bộ kit Identifiler vào công tác giám định gen tại Trung tâm giám định Sinh học pháp lý, chúng tôi nhận thấy bộ kit đã đáp ứng được các yêu cầu đặt ra đối với giám định gen phục vụ công tác điều tra các vụ việc hình sự, cũng như phục vụ giải quyết các vụ án dân sự Bộ kít có những ưu điểm và hạn chế sau:

a Ưu điểm

- Thời gian phân tích nhanh (từ 4 - 8 tiếng)

- Thao tác đơn giản, ít các bước, hạn chế nhiễm

- Độ nhạy cao, có khả năng phân tích được từ dấu vết it, dấu vết bị phân hủy mạnh cho kết quả đáng tin cậy

- Có khả năng truy nguyên được cá thể, phù hợp khi phân tích gen tại các quần thể người của Việt Nam

- Được sử dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, tiêu chuẩn hóa định tên alen, nên thuận lợi trong trao đổi thông tin tội phạm trên toàn cầu

b Hạn chế

- Không đánh giá được khi gặp trường hợp đột biến gen

- Có nhiều khả năng nhiễm khi thao tác

- Giá thành cao

1.3 Xây dựng cơ sở dữ liệu gen người phục vụ công tác giám định

1.3.1 Mục đích xây dựng cơ sở dữ liệu gen

Để đánh giá mức độ hiếm hoặc phổ biến của alen thì phải thu thập dữ liệu

từ nhóm người đại diện cho quần thể Từ dữ liệu của nhóm người đại diện này

dự đoán được độ tin cậy của tần suất alen và tần suất kiểu gen trong toàn bộ quần thể Muốn vậy, trong thu mẫu nghiên cứu phải đạt được độ tin cậy về cả số

lượng mẫu và cả sự đại diện của mẫu Mục tiêu chính của xây dựng cơ sở dữ liệu gen là tìm được những alen có mức độ phổ biến, hoặc những alen biến thể hoặc alen hiếm [27, 28]

1.3.2 Quy trình xây dựng cơ sở dữ liệu gen

Hình 1.1 Sơ đồ các bước chính xây dựng cơ sở dữ liệu gen

Các phòng thí nghiệm phải lựa chọn quần thể tạo trong cơ sở dữ liệu, quyết định số mẫu được lựa chọn Các mẫu được chọn là những người khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống với nhau và đại diện cho quần thể nghiên cứu

Mẫu sau khi thu thập được phân tích ADN bằng các bộ kit thương mại có tiêu chuẩn định danh alen thống nhất ở các cơ sở dữ liệu gen Sau đó tính toán tần suất alen bằng phương pháp đếm Tần suất alen được kiểm định cân bằng

Thông thường thu mẫu máu trên FTA card (120 mẫu)

Quyết định số lượng mẫu và nhóm dân

tôc nghiên cứu

Sử dụng cơ sở dữ liệu để ước lượng

tần suất kiểu gen quan sát được

Hardy - Weinberg, thông thường tần suất alen được so sánh với các quần thể khác [28]

1.3.3 Số lượng mẫu tính toán tần suất alen

Hầu hết các cơ sở dữ liệu gen STR đã công bố với số lượng mẫu từ 100 đến 200 người Năm 1992, trong một bài báo tựa đề tiếng anh “Sample size requirement for addressing the population genetic issues of forensic use of DNA Typing” Ranajit Chakraborty nhận định từ 100 đến 150 người của mỗi quần thể

là đủ cho ước lượng tần suất alen trong quần thể Một số nghiên cứu khác cho rằng chỉ cần 100 đến 120 người là đủ để ước lượng tần suất, việc tăng thêm mẫu nghiên cứu chỉ tăng thêm khả năng quan sát alen hiếm [28] Thông thường các phòng thí nghiệm lấy số lượng mẫu nghiên cứu là 200 người Tuy nhiên đây cũng là số lượng được áp dụng phổ biến chứ không phải là một số lượng chính xác bản chất thống kê [30]

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định gen

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tổ chức Cảnh sát hình sự quốc tế (Interpol) có hiệp hội giám định ADN và rất nhiều quốc gia đã có phòng thí nghiệm giám định ADN hình sự Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉ tiêu chất lượng trang thiết

bị máy móc cũng như con người và đều phải có các nghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần suất các alen trong hệ locus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truy nguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống Để đảm bảo tính chính xác, các phòng thí nghiệm giám định gen thường dùng hệ thống phân tích 15 locus gen như hệ Identifiler hoặc hệ Power Plex 16

Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ đã khảo sát và sử dụng tần suất dữ liệu ADN theo hệ Identifiler của nhiều chủng tộc người khác nhau: 191 người gốc

Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng và

357 người Mỹ gốc Phi [17, 20]

Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia), tại mỗi quốc gia khác nhau lại có những khảo sát khác nhau về tần suất các alen theo hệ Identifiler của cộng đồng người Eurasia tại quốc gia đó: 384 người tại Nga, 300 người tại Hy Lạp, 139 người tại Rumani [34]

Tại Singapore, Cảnh sát Singapore sử dụng tần suất các alen theo hệ Identifiler của dân tộc người Hoa, dân tộc người Mã Lai, dân tộc người Ấn Độ

để phục vụ công tác giám định [7]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2000, đề tài cấp Bộ "Nghiên cứu, khảo sát và xây dựng tần suất các

alen của các gen trong hệ NinePlex II (9 locus gen) trên đối tượng người Kinh"

được triển khai và năm 2002 được nghiệm thu, kết quả là bảng tần suất các alen của người Kinh được sử dụng hiệu quả trong các bản kết luận giám định truy nguyên cá thể, xác định quan hệ huyết thống giúp các cơ quan tố tụng giải quyết có hiệu quả rất nhiều vụ việc [7]

Năm 2004, Việt Nam đã thông báo bảng tần suất các alen của các locus gen

hệ Nineplex II trên đối tượng người Kinh cho Interpol, đây là một cột mốc đánh dấu sự phối hợp toàn cầu trong đấu tranh phòng chống tội phạm dựa vào lĩnh vực giám định ADN

Trường Đại học Y Hà Nội phối hợp với Viện Kỹ thuật hóa sinh và tài liệu

nghiệp vụ đã tiến hành “Khảo sát tần suất của 3 locus D5S818, D7S820 và

D13S317 trên đối tượng người Mường” bằng các bộ kit phân tích ADN theo công

nghệ điện di nhuộm bạc

Năm 2008, Viện Khoa học hình sự đã triển khai đề tài cấp Bộ "Khảo sát

tần suất các alen theo hệ Identifiler (ID) trên đối tượng người Kinh" Đề tài tiến

hành khảo sát số mẫu là 170 cá thể người Kinh và kết quả đã được triển khai ứng dụng trong công tác giám định ADN Đây là cơ sở khoa học và cơ sở pháp

lý vững chắc để đưa ra các bản kết luận giám định về truy nguyên cá thể và xác

định huyết thống phục vụ tố tụng hình sự và dân sự đối với những vụ án, vụ việc

có liên quan đến người dân tộc Kinh [11]

Năm 2014 Viện KHHS cũng đã triển khai đề tài cấp bộ “ Khảo sát tần suất

các alen trong các locus gen (AND) hệ Identifiler của dân tộc H’Mông phục vụ cho công tác giám định gen ở Việt Nam”

Đến năm 2016 Viện KHHS tiếp tục triển khai đề tài cấp Bộ “Khảo sát và xây

dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể

người dân tộc Khmer ứng dụng trong giám định ADN”

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Thu 120 mẫu máu của 120 cá thể người Dao

- Phân tích mẫu bao gồm các bước tách chiết ADN, định lượng ADN, nhân bội ADN, điện di trên máy điện di mao quản, kết quả lập được bảng kiểu gen của các mẫu nghiên cứu

- Xử lý số liệu thống kê, kiểm định tần suất kiểu gen giữa kết quả thực tế

và tính toán lý thuyết với độ tin cậy p = 0,05 Tính toán và đưa ra bảng tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler cho 120 cá thể người Dao

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận văn sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau

- Phương pháp điều tra khảo sát thực tế, thu mẫu đại diện, đảm bảo các điều kiện theo định luật Hardy - Weinberg

- Phương pháp thực nghiệm khoa học: phân tích kiểu gen 120 cá thể theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự

- Phương pháp thống kê số liệu sinh học để tính tần suất các alen trong

hệ Identifiler của dân tộc Dao

Luận văn sử dụng các kỹ thuật sau

- Thu mẫu máu: dùng kim chích đầu ngón tay và thấm lên giấy FTA

- Kỹ thuật tách chiết ADN sử dụng dung dịch chelex 100 nồng độ 5%

- Kỹ thuật PCR định lượng ADN bằng phương pháp đo Realtime PCR với

bộ kít Quantifiler

- Kỹ thuật PCR với bộ kít Identifiler

- Kỹ thuật điện di mao quản

2.2.1 Thu mẫu

Thu mẫu máu của 120 cá thể người Dao theo nguyên tắc ngẫu nhiên, không có quan hệ họ hàng huyết thống với nhau:

- Thu mẫu ngẫu nhiên ở nhiều địa phương khác nhau

- Kiểm tra giấy tờ tùy thân (chứng minh thư nhân dân, giấy khai sinh )

- Hỏi trực tiếp người được thu mẫu

- Dùng kim chích đầu ngón tay và thấm trực tiếp vào giấy FTA

- Mẫu thu phải đảm bảo chất lượng, không bị lẫn, nhiễm, để khô tự nhiên,

đóng gói riêng rẽ, ghi ký hiệu cho mẫu từ D1 đến D120

2.2.2 Phân tích mẫu

2.2.2.1 Quy trình phân tích ADN

Chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu máu thu được theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự, gồm các bước sau:

Tách chiết ADN (phương pháp vô cơ)

Định lượng ADN (phương pháp Realtime PCR)

Nhân bội ADN (PCR) (bộ Kit Identifiler)

Điện di mao quản (Máy ABI-3130)

Phân tích kết quả (Phần mềm GenmapperID v3.2)

2.2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

a Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN

6 Các đầu típ 10µl, 200µl và 1000µl cùng pipet tương ứng

b Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN

1 Quantifiler Human DNA quantification Kit (hãng Applied Biosystems)

2 Optical plate 96 well

3 Optical seal

4 Máy định lượng Realtime PCR Eco hãng Illumina

5 Các loại đầu típ 10 µl, 200 µl và 1000 µl cùng pipet tương ứng

c Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di

1 Máy giải trình tự Applied Biosystems 3130

2 Máy PCR 9700 96 well Applied biosystems

3 Kit Identifiler của hãng Applied biosystems

Thành phần phản ứng nhân bội sử dụng bộ kit Identifiler:

2.2.3 Xử lý số liệu thống kê và tính tần suất các locus gen

2.2.3.1 Cơ sở lý thuyết

Năm 1908, Hardy một nhà toán học Anh và Weinberg, một bác sĩ người Đức đã độc lập cùng tìm ra một điều lý thú Điều ấy đã trở thành hòn đá tảng của ngành di truyền học quần thể và được gọi là định luật Hardy - Weinberg [15] Định luật phát biểu như sau: Trong những điều kiện nhất định, một quần thể lớn có hôn phối ngẫu nhiên tần suất gen và tần suất kiểu gen không thay đổi qua các thế hệ Nếu trong quần thể có hai alen A1 và A2 có tần suất là p và q, sẽ

có 3 kiểu gen ứng với tần suất: p2; 2pq; q2 Thế hệ con cái của chúng cũng sẽ có gen A1 với tần suất là p và gen A2 với tần suất là q Ngoài ra 3 kiểu gen cũng có tần suất như thế hệ cha mẹ, nghĩa là:

p2 +2pq + q2 = 1 Đây là trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg Trạng thái cân bằng này xảy ra trong những điều kiện:

- Có hôn phối ngẫu nhiên nghĩa là mọi cá thể đều có cùng khả năng hôn phối với một cá thể bất kỳ thuộc giới tính khác

- Không có những áp lực tiến hóa như đột biến, chọn lọc, dòng gen…tác động vào quần thể

- Các kiểu gen có cùng độ thụ tinh và cùng sức sống

Để số liệu nghiên cứu về các locus gen sử dụng được cho những ứng dụng

cụ thể, điều cần thiết đầu tiên là cần đánh giá xem mẫu nghiên cứu với locus gen

được phân tích có đảm bảo rằng cấu trúc di truyền của mẫu (tần số tương đối của các alen và tần số các kiểu gen) là ổn định hay không qua các thế hệ, nghĩa

là mẫu có tuân theo định luật Hardy - Weinberg hay không [9, 13]

Do đó cần kiểm tra sự phù hợp giữa mẫu với quần thể cân bằng lý thuyết thông qua đánh giá chênh lệch giữa tần số quan sát thực tế với phân bố lý thuyết của các kiểu gen của mỗi locus gen được nghiên cứu có sai khác nhau hay

không? [3, 34]

2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Kiểm định sự phù hợp phân bố tần số kiểu gen giữa mẫu khảo sát và quần thể lý thuyết dựa vào tiêu chuẩn Khi bình phương 2 [2, 34]

Đánh giá sự phù hợp giữa số liệu thực nghiệm và giả thuyết lý thuyết theo phương pháp kiểm định 2 ta dùng chỉ số sau :

(2.1) Trong đó : * k là số lớp của dãy số liệu thực nghiệm

* nij là số kiểu gen AiAj quan sát được trong một locus gen

* Eij là số kiểu gen AiAj tính toán theo lý thuyết Eij = npi2

Tra giá trị 2 lý thuyết trên bảng theo hệ số tự do:

k(k-1)/2 (2.3)

Quy tắc kiểm định 2 là trong một locus gen số lượng kiểu gen quan sát dưới 5, thì phải kết hợp các alen bên cạnh để tăng số lượng quan sát cao hơn 5

để tính toán

2.2.3.3 Các bước tính toán thống kê và kiểm định

- 120 kiểu gen của 120 cá thể người Dao được thống kê tần số kiểu gen, tần số alen

- Tính tần suất các alen của mỗi locus theo số liệu thu được trong nghiên cứu

- Xác định số kiểu gen thực tế của mẫu khảo sát (số lượng kiểu gen AiAj

cho từng locus )

- Xác định số kiểu gen lý thuyết Eij (số lượng kiểu gen AiAj cho từng locus được giả thiết tuân theo định luật cân bằng Hardy - Weinberg)

- Tính chỉ số kiểm định 2 theo công thức

- Xác định khi bình phương tiêu chuẩn (α) theo mức xác suất p=0.05 (tra bảng)

- So sánh giá trị khi bình phương tính được với khi bình phương tiêu chuẩn: Nếu khi bình phương tính được nhỏ hơn 2

tiêu chuẩn thì phân bố thực tế phù hợp với phân bố lý thuyết, nghĩa là mẫu phù hợp với quần thể lý thuyết [2,

3, 4, 13, 10]

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN

- Thu ngẫu nhiên được 120 mẫu máu của 120 người Dao trên giấy thu

mẫu FTA và bảo quản theo quy định tại phòng thí nghiệm ADN của Viện Khoa học hình sự (có danh sách ở phần phụ lục) Người được thu mẫu được xác minh

lý lịch, nhân thân đều là người dân tộc Dao Điều này tăng độ tin cậy cho việc thu mẫu ngẫu nhiên và đại diện

- Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN từ các mẫu máu trên theo

phương pháp vô cơ, định lượng ADN theo phương pháp Realtime PCR Do điều kiện thu mẫu tương đối tương đồng về các mặt khách quan như cán bộ thu mẫu, vật liệu thu mẫu và thời gian thu - bảo quản mẫu và cùng sử dụng máy đục lỗ (Punching) để lấy mẫu tách chiết ADN với kích thước lỗ giống nhau nên chúng tôi chỉ tiến hành định lượng trên 10 mẫu ngẫu nhiên từ 120 mẫu máu thu trên thẻ FTA và cho kết quả như sau:

Kết quả định lượng ADN thu được như sau:

Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN

Theo đó chúng tôi ước tính nồng độ ADN trung bình tách chiết từ 120 mẫu là 9,25 ng/µl Đủ điều kiện ADN đầu vào để thực hiện phản ứng PCR

3.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen

Chúng tôi đã thực hiện 120 phản ứng PCR với bộ kit Identifiler (thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt theo nhà sản xuất) từ 120 mẫu Sau khi thực hiện phản ứng PCR với 120 mẫu bằng bộ kít Identifiler sản phẩm PCR được tiến

hành điện di trên máy giải trình tự ADN ABI 3130 và phân tích kiểu gen bằng phần mềm GenemaperID v3.2

Kết quả chúng tôi đã thu được 120 bảng kiểu gen khác nhau của 120 mẫu

Hình 3.1 Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D96

Hình 3.2 Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D39

Hình 3.3 Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D68

3.3 Kết quả xử lý số liệu thống kê

3.3.1 Kết quả tính toán tần suất các alen

Từ 120 kiểu gen hệ Identifiler, chúng tôi đã đếm được tổng số 3600 alen, gồm 45 loại alen (từ 5 đến 34.2) với tần suất và số loại alen ở từng locus gen là khác nhau

Bảng 3.2 Tần suất xuất hiện của các alen trên 15 locus hệ Identifiler với quần thể người dân tộc Dao

3.3.2 Kết quả quan sát kiểu gen ở từng locus và tính toán chỉ số kiểm định 2

Quan sát và đếm các kiểu gen ở từng cá thể người dân tộc Dao được khảo sát với từng locus riêng biệt, chúng tôi thu được số lượng các kiểu gen như sau: