Nghiên cứu mức độ ô nhiễm vi khuẩn E.coli trong thịt lợn tại Thành Phố Lạng Sơn

Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn phân lập được .... Để góp phần giúp các nhà chức trách xây dựng các chiến lược giảm thiểu ô nhiễm vi sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NÔNG ĐẠI THẾ

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ Ô NHIỄM

VI KHUẨN E.COLI TRONG THỊT LỢN

TẠI THÀNH PHỐ LẠNG SƠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NÔNG ĐẠI THẾ

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ Ô NHIỄM

VI KHUẨN E.COLI TRONG THỊT LỢN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự cộng tác giúp đỡ của TS Nguyễn Thị Ngân và Viện Khoa học Sự sống - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nông Đại Thế

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn, với sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể Nhân dịp hoàn thành luận văn tốt nghiệp, cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn và cảm

ơn chân thành tới:

Giáo viên hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Ngân đã trực tiếp hướng dẫn,

chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa

và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo công tác tại Phòng thí nghiệm

Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Lạng Sơn đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này

Thái Nguyên, ngày 12 tháng 11 năm 2016

Học viên

Nông Đại Thế

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Ngộ độc thực phẩm 4

1.2 Tầm quan trọng của vệ sinh an toàn thực phẩm 5

1.3 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E coli 5

1.3.1 Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hóa 6

1.3.2 Triệu chứng trúng độc 9

1.3.3 Biện pháp phòng ngừa ngộ độc 9

1.4 Hiểu biết về vi sinh vật và hệ vi sinh vật ô nhiễm thịt 9

1.4.1 Hệ vi sinh vật ô nhiễm thịt 9

1.4.2 Các yếu tố liên quan đến sự nhiễm khuẩn vào thịt 11

1.5 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt 14

1.5.1 Thịt tươi 14

1.5.2 Các dạng hư hỏng của thịt 15

1.5.3 Ô nhiễm thực phẩm nguồn gốc động vật 15

1.5.4 Ô nhiễm thực phẩm do vi sinh vật 16

1.5.5 Ô nhiễm thịt tươi do vi khuẩn 16

1.5.6 Ý nghĩa của ô nhiễm thịt về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí 17

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 17

1.6.1 Nghiên cứu ở Việt Nam 17

1.6.2 Nghiên cứu trên thế giới 18

Chương 2 NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 20

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.3 Vật liệu nghiên cứu 20

2.4 Nội dung nghiên cứu 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 21

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm 21

2.5.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn tươi 21

2.5.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn trong thịt lợn tươi 23

2.5.4 Quy định kỹ thuật đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi 24

2.5.5 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn phân lập được 25

2.5.6 Phương pháp xác phương pháp định gen quy định sản sinh độc tố đường ruột của chủng vi khuẩn 25

2.5.7 Xác định gen VT1, VT2 của các chủng E coli bằng phản ứng PCR 26

2.5.8 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn phân lập được 28

2.5.9 Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn 28

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Lạng Sơn 32

3.2 Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn tươi 35

3.3 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn tươi 37

3.4 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn tươi theo thời gian sau giết mổ 39

3.5 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn tươi theo tháng cùng thời gian sau giết mổ 43

3.6 Xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trong thịt lợn tươi theo mùa vụ

cùng thời gian sau giết mổ 45

3.7 Nghiên cứu đặc tính sinh học, đặc tính hóa học của vi khuẩn phân lập được 47

3.8 Xác định serotype của các chủng phân lập được 49

3.9 Kết quả tách DNA tổng số của vi khuẩn 51

3.10 Xác định gen quy định sản sinh độc tố đường ruột của chủng vi khuẩn phân lập được 53

3.11 Xác định gen mã hóa độc tố đường ruột bằng PCR 54

3.12 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn E coli phân lập được 54

3.13 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn phân lập được 56

3.14 Đề xuất biện pháp phòng, khống chế ngộ độc thực phẩm do ô nhiễm vi khuẩn E coli 60

3.14.1 Giải pháp ngắn hạn 60

3.14.2 Giải pháp lâu dài 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

Kết luận 63

Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA ĐỀ TÀI 69

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

CFU Colony Forming Unit

E coli Escherichia coli

FDA Food and Drug Administration

(Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm) ISO International Organization for Standardization

(Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế)

LAMP Loop Mediated Isothermal Aplification

(Vòng lặp trung gian đẳng nhiệt Aplification) NĐTP Ngộ độc thực phẩm

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TCVS Tiêu chuẩn vệ sinh

VKHK Vi khuẩn hiếu khí

WHO World Health Organization

(Tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Độc lực của các chủng E coli 8

Bảng 1.2: Đánh giá kết quả cảm quan thịt 14

Bảng 1.3: Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hóa học 15

Bảng 2.1: Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi TCVN 7046: 2002 24

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Lạng Sơn 34

Bảng 3.2: Kết quả xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn tươi 35

Bảng 3.3: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn tươi 37

Bảng 3.4: Kết quả xác định vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn tươi theo thời gian sau giết mổ 40

Bảng 3.5: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn tươi theo tháng cùng thời gian sau giết mổ 43

Bảng 3.6: Kết quả xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn tươi theo mùa vụ cùng thời gian sau giết mổ 46

Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học, đặc tính hóa học của vi khuẩn phân lập được 48

Bảng 3.8: Kết quả xác định serotype của các chủng phân lập được 50

Bảng 3.9: Kết quả đo OD của 5 chủng vi khuẩn 51

Bảng 3.10: Kết quả xác định gen quy định sản sinh độc tố đường ruột của chủng vi khuẩn phân lập được 53

Bảng 3.11: Kết quả xác định gen mã hóa độc tố đường ruột bằng PCR 54

Bảng 3.12: Kết quả xác định độc lực của các chủng E coli phân lập được 55

Bảng 3.13: Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh hóa dược của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 58

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập tổng số vi khuẩn hiếu khí 23

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập E coli từ thịt 24

Hình 3.2 Biểu đồ xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn tươi 36

Hình 3.3 Biểu đồ định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn tươi 38

Hình 3.4 Biểu đồ xác định vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn tươi theo thời gian sau giết mổ 41

Hình 3.5 Vẽ Biểu đồ xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli trong thịt lợn tươi theo tháng cùng thời gian sau giết mổ 45

Hình 3.6 Biểu đồ xác định chỉ tiêu vi khuẩn E coli nhiễm trên thịt lợn tươi theo mùa vụ cùng thời gian sau giết mổ 46

Hình 3.7 Kết quả tách DNA tổng số vi khuẩn E.coli 52

Hình 3.8 Kết quả PCR xác định độc tố đường ruột 53

Hình 3.9 Biểu đồ xác định tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của một số chủng vi khuẩn E coli phân lập được 59

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây vấn đề bảo đảm chất lượng và an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của nhiều quốc gia trên thế giới Sự phát triển kinh

tế mạnh mẽ song song với quá trình đô thị hóa ngày càng một phát triển, cũng như

sự mở rộng giao thương quốc tế hàng hóa từ một nước có thể nhập và được tiêu dùng ở nhiều nước khác nhau trên thế giới, ngược lại một nước có thể nhập hàng hoá từ nhiều nước khác Với phương tiện giao thông hiện đại, thế giới như được thu nhỏ lại Do vậy sự mất an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) ở nơi này có thể lan truyền sang nơi khác rất nhanh ATVSTP là vấn đề bức xúc hàng đầu và đóng vai trò quan trọng trong đời sống cộng đồng, đặc biệt trong giai đoạn hiện nay thực phẩm an toàn có đóng góp to lớn đối với việc cải thiện sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống con người cũng như về lâu dài đối với sự phát triển của giống nòi (Bộ Y tế, 2009 [2], 2010 [3])

Ở nước ta hiện nay ngộ độc thực phẩm đang là vấn đề được xã hội quan tâm Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm - Bộ Y tế (2009) [4], (2010) [5], (2011) [6], (2012) [7], (2013) [8], (2014) [9], (2015) [10], (6/2016) [11]: năm

2009 cả nước đã xảy ra 152 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.212 người mắc và 35 người chết Năm 2010, số vụ ngộ độc trên cả nước tăng lên 175 vụ với 5.664 người mắc và 51 người chết Năm 2011, số vụ NĐTP có xu hướng giảm nhẹ còn

148 vụ với 4.700 người mắc và 27 người chết Tuy nhiên đến năm 2012, tình trạng NĐTP có xu hướng tăng trở lại, cả nước xảy ra 168 vụ NĐTP với 5.541 người mắc và 34 người chết Năm 2013, xảy ra 163 vụ NĐTP trên cả nước với 5.439 người mắc và 28 người tử vong Năm 2014 xảy ra 189 vụ ghi nhận 5.037 người mắc và 43 người tử vong Năm 2015 toàn quốc ghi nhận 171 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.965 người mắc và 23 trường hợp tử vong Trong 6 tháng đầu năm

2016 trên địa bàn cả nước xảy ra 53 vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng làm 2.187 người bị ngộ độc và 04 trường hợp tử vong Tình trạng mất an toàn thực phẩm ngày càng cao, nhất là ở các bếp ăn tập thể như trường học, bệnh viện, khu công nghiệp, nơi tập trung đông người

Khi gia súc khoẻ mạnh trong đường tiêu hoá có nhiều loại vi khuẩn, phân gia súc có thể chứa từ 107- 1012 vi khuẩn/gam, bao gồm nhiều loại vi khuẩn hiểu khí và yếm khí khác nhau Theo Hồ Văn Nam và Nguyễn Thị Đào Nguyên (1997), phân

lợn khoẻ có tỷ lệ phân lập một số vi khuẩn rất cao như Salmonella (40-80%) và còn tìm thấy Staphylococcus, Streptocococcus Ngoài ra vi khuẩn còn tồn tại trên da

của động vật, nếu không vệ sinh tắm rửa trước khi giết mổ sẽ không thể loại bỏ phần lớn vi sinh vật trên bề mặt ngoài Theo Tô Liên Thu (1999) [30] nghiên cứu sự

ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm có nguồn gốc động vật trên thị trường Hà Nội Ngành chăn nuôi lợn của tỉnh Lạng Sơn trong mấy năm gần đây phát triển mạnh đã cung cấp một lượng lớn thịt cho thị trường thành phố và các vùng lân cận, góp phần không nhỏ vào sự tăng trưởng kinh tế của tỉnh Tuy nhiên việc giết mổ và bán các sản phẩm thịt mới chỉ dừng lại ở quy mô tư nhân, chưa có lò mổ đủ tiêu chuẩn Vì vậy trên địa bàn thành phố vẫn xảy ra các vụ ngộ độc thực phẩm, có thể

do nhiều nguyên nhân nhưng nguyên nhân chủ yếu là vi sinh vật

Để góp phần giúp các nhà chức trách xây dựng các chiến lược giảm thiểu ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, đảm bảo cung cấp thực

phẩm an toàn cho người tiêu dùng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu mức độ ô nhiễm vi khuẩn E.coli trong thịt tại thành phố Lạng Sơn”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Lạng Sơn

- Xác định mức độ nhiễm khuẩn E coli trong thịt lợn tươi

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E coli phân lập được

- Giải pháp phòng và khống chế ngộ độc thực phẩm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp các dữ liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn

E coli phân lập được trong thịt lợn tươi tại thành phố Lạng Sơn

Xác định mối tương quan giữa đặc điểm giết mổ, phân phối thịt lợn đến nguy

cơ gây ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E coli

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xác định được tình hình giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y đối với sản phẩm thịt

lợn tươi tại thành phố Lạng Sơn; tình hình nhiễm khuẩn E.coli phân lập được trong

thịt lợn tươi tại thành phố Lạng Sơn

Cơ sở thực tiễn để đề xuất biện pháp phòng, chống hiệu quả ngộ độc thực phẩm do nhiễm khuẩn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ngộ độc thực phẩm

Theo Lã Quý Đôn và cs (2008) [14], ngộ độc thực phẩm là do thức ăn bị ô nhiễm bẩn mà tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, nấm mốc, ký sinh trùng, siêu vi trùng, thường là do vi khuẩn

Bệnh này thường xảy ra một cách đột ngột, hàng loạt (nhưng không phải là dịch), có những triệu chứng của một bệnh cấp tính Biểu hiện bệnh thường là nôn mửa, tiêu chảy (riêng trường hợp nhiễm độc tố của vi khuẩn độc thịt thì bị táo bón)

và các triệu chứng khác đặc hiệu cho từng loại ngộ độc như: chóng mặt, sốt, đau bụng và có thể dẫn đến tử vong

Ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh có thể chia làm 3 loại:

- Ngộ độc do độc tố đã được sinh ra trong thực phẩm Các vi sinh vật như:

Staphylococcus aureus , Bacillus cereus, Clostridium botulinum… trong khi phát

triển trên thực phẩm đã sinh ra các hợp chất gây ngộ độc cho người ăn phải chúng Trong trường hợp này, thời gian ủ bệnh rất ngắn và các triệu chứng thường là đau bụng, nôn ói

- Nhiễm khuẩn không xâm nhập là trường hợp các vi khuẩn nhiễm vào thức

ăn, sau khi được ăn vào chúng vẫn còn sống sót đến ruột non và phát triển bên trong lòng ruột Tại đây, chúng sinh ra các độc tố có tác dụng cục bộ trong ruột, gây đau

bụng và tiêu chảy Các vi khuẩn dạng này thường là Vibrio cholera gây bệnh tả, một vài dòng E coli, Clostridium perfringens

- Nhiễm khuẩn xâm nhập cũng do các vi khuẩn nhiễm vào thức ăn và vẫn còn sống sót đến ruột non, nhưng tại đây chúng xâm nhập vào các tế bào thành ruột

Vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào ruột non, gây viêm ruột cục bộ dẫn đến triệu chứng nóng sốt, ớn lạnh và tiêu chảy Các vi khuẩn như Shigella, một số dòng

E coli sau khi xâm nhập vào các tế bào ruột non gây nên các ổ ung nhọt và các vết loét trong ruột dẫn đến hội chứng tả lỵ, trong phân có máu, nhớt và mủ Một số

chủng Shigella lại sinh ra độc tố thần kinh gây triệu chứng tê liệt và có thể dẫn đến

tử vong

1.2 Tầm quan trọng của vệ sinh an toàn thực phẩm

Thực phẩm là nguồn cung cấp dinh dưỡng hàng ngày cho cơ thể, giúp cơ thể khỏe mạnh, chống lại các nguy cơ của bệnh tật đang có mặt ở khắp nơi trong môi trường; giúp người ta hoạt động và làm việc Như vậy nếu nguồn thực phẩm không hợp vệ sinh, sức khỏe của con người sẽ bị đe dọa

Vệ sinh an toàn thực phẩm có tầm quan trọng lớn đối với sức khỏe, bệnh tật Trước mắt thực phẩm là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của cơ thể, đảm bảo sức khỏe con người nhưng đồng thời cũng là nguồn có thể lây bệnh nếu không đảm bảo vệ sinh Không có thực phẩm nào được coi là có giá trị dinh dưỡng nếu nó không đảm bảo vệ sinh Về lâu dài thực phẩm không những có tác động thường xuyên đối với sức khỏe mỗi con người mà còn ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống của dân tộc Sử dụng các thực phẩm không đảm bảo vệ sinh trước mắt có thể

bị ngộ độc cấp tính với các triệu chứng ồ ạt, dễ nhận thấy, nhưng vấn đề nguy hiểm hơn nữa là sự tích lũy dần các chất độc hại ở một số cơ quan trong cơ thể sau một thời gian mới phát bệnh hoặc có thể gây các dị tật, dị dạng cho thế hệ mai sau

Vệ sinh an toàn thực phẩm có tác động đến kinh tế và xã hội Đối với nước ta cũng như nhiều nước đang phát triển, lương thực thực phẩm là một loại sản phẩm chiến lược, ngoài ý nghĩa kinh tế còn có ý nghĩa chính trị, xã hội rất quan trọng Vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm tăng lợi thế cạnh tranh trên thị trường quốc tế Để cạnh tranh trên thị trường quốc tế, thực phẩm không những cần đạt được sản xuất, chế biến, bảo quản phòng tránh ô nhiễm các loại vi sinh vật mà còn không được chứa các chất hóa học tổng hợp hay tự nhiên vượt quá mức quy định cho phép của tiêu chuẩn quốc tế hoặc quốc gia, gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng

Tóm lại, hơn lúc nào hết chúng ta cần giữ gìn vệ sinh khi ăn uống: thức ăn đã được nấu chín, sạch sẽ, an toàn nhằm đảm bảo sức khỏe cho mọi người, mọi nhà

1.3 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E coli

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do nguyên liệu chế biến hay thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn Một trong những loại ngộ độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn

1.3.1 Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hóa

Trực khuẩn ruột già E coli còn có tên gọi Bacterium coli commune (vi khuẩn

thường trú trong ruột già của động vật máu nóng) được Escherich phân lập tỷ lệ phân trẻ em năm 1885 (Bestchinger H.U, 1992) [42]

Tỷ lệ ruột già vi khuẩn E coli thường xuyên được bài xuất ra ngoài môi trường Do vậy chỉ số E coli trong nước là một tiêu chuẩn để đánh giá mức độ ô

nhiễm về mặt vi sinh của nguồn nước đó

E coli là nguyên nhân chính gây ra một số bện ở người và động vật

* Hình thái và tính chất bắt mầu

E coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, chúng di động được nhờ có lông, vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô đường kính ngang tế bào dưới 1µm, chiều dài thay đổi, kích thước trung bình tỷ lệ 0,3-0,6 x 2-3µm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970) [24]

Vi khuẩn bắt mầu Gram âm có thể bắt mầu đều hoặc sẫm ở hai đầu Nhuộm vi khuẩn

tỷ lệ khuẩn lạc nhầy có thể thấy giáp mô, khi soi tươi không nhìn thấy được Khi quan sát dưới kính hiển vi điển tử , một số chủng nhất định có mang cấu trúc fimbriae hay còn gọi là yếu tố bám dính (Nguyễn Thị Liên Hương, 2010 [19]

* Tính chất nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí tùy tiện Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 370C, pH thích hợp là 7,4; Nhưng vi khuẩn cũng có thể phát triển được ở môi trường có pH từ 5,5 - 8,0 (Nguyễn Như Thanh và cs 2001 [29]

- Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, môi trường đục, cặn màu tro lắng

xuống đáy, có mùi Indol (mùi phân thối) do phản ứng Indol dương tính

- Môi trường thạch thường: Vi khuẩn phát triển, sau 24h tạo thành những

khuẩn lạc dạng S, hơi hồng, tròn trơn nhẵn, đường kính 2-3mm, màu xám nhạt Nuôi lâu khuẩn lạc trở thành mầu tro nhạt, mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả khuẩn lạc dạng R (nhám, xù xì) và khuẩn lạc dạng M (nhầy)

- Môi trường thạch MacConkey: Hình thành khuẩn lạc dạng S, màu đỏ cánh

sen (do lên men đường lactoza sản sinh axit), xung quanh có vùng mờ sương (do lên men đường lactoza sinh hơi)

- Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh

- Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc dạng S hoặc dạng M (nhầy), có thể dung

huyết hoặc không

- H2S âm tính.; Indol dương tính; VP âm tính; MR dương tính; Ureaza âm tính; Citrate âm tính; Sữa tươi: đông tụ sau 24h/370C

- Nghiệm pháp IMVIC xác định vi khuẩn: Indol, MR, VP, Citrate

Thể bệnh E coli gây bệnh cho gia súc gia cầm ở mỗi lứa tuổi khác nhau cũng

sẽ khác nhau, cả về yếu tố gây bệnh của vi khuẩn, triệu chứng lâm sàng, tình trạng bệnh Chẳng hạn: gây bệnh cho lợn dưới 1 tuần tuổi gồm các thể; thể bệnh tiêu chảy chết từ 90-100%; thể nhiễm trùng huyệt; thể viêm màng não, kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F18 Gây bệnh sau cai sữa, thể bệnh phù đầu, triệu chứng thần kinh, chết đột ngột, kháng nguyên O139, O141, yếu tố bám dính F107

Vi khuẩn E coli gây bệnh ở người như tiêu chảy, NĐTP do ăn phải thịt

nhiễm khuẩn, sản sinh độc tố gây bệnh các triệu chứng điển hình và thể bệnh do

E coli gây ra là viêm dạ dày ruột, vêm đường tiết niệu sinh dục, viêm màng não,

nhiễm trùng máu, nhiễm độc huyết có 5 chủng E coli gây bệnh

E coli (EAEC) Chỉ tìm thấy ở người

Vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh hai loại độc tố: độc tố chịu nhiệt (Heat

Stable Toxin-ST) và độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin-ST) Những chủng

E coli sản sinh ra độc tố là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở người trong đó độc tố chịu nhiệt chịu được nhiệt độ 1200C trong thời gian 1h và nó bền vững ở nhiệt độ thấp (bảo quản ở 200C), nhưng chúng bị phá hủy nhanh chóng khi được hấp cao áp Còn độc tố không chịu nhiệt bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong thời gian 15 phút Những Serotype có khả năng gây ngộ độc thức ăn gồm O26, O56, O86,,O111,

O119, O125, O126, O127, O157 H7 (Hoàng Thu Thủy 1991) [34]

Được coi như là nhân tố chỉ điểm trong ATVSTP mặc dầu có xuất hiện trên thực phẩm đặc biệt là thịt tươi sống, nhưng lại không liên quan trực tiêp đến sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi thực phẩm đã bị nhiễm với số lượng lớn chứng tỏ mối nguy hại về khả năng chứa các loại vi khuẩn gây bệnh Do đó với các loại thực phẩm tươi sống, nhất là các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật, việc xác định tổng số là việc rất quan trọng và bắt buộc Đây là một trong những tiêu chuẩn cần thiết để đánh giá tình trạng ATVSTP

1.3.2 Triệu chứng trúng độc

Thời kỳ ủ bệnh 2-20 giờ người ngộ độc thấy đau bụng dữ dội, đi phân lỏng nhiều lần trong ngày, ít khi nôn mửa Thân nhiệt có thể hơi sốt Trường hợp nặng bệnh nhân có thể sốt cao, người mệt mỏi, chân tay co quắp đổ mồ hôi Thời gian khỏi bệnh vài ngày Nguyên nhân là do nhiễm vào cơ thể với số lượng lớn và cơ thể đang suy yếu

1.3.3 Biện pháp phòng ngừa ngộ độc

Vi khuẩn gây tiêu chảy thường theo phân ra ngoài do đó dễ gây thành dịch Do

đó cần phải nấu chín kỹ thức ăn và kiểm tra nghiêm ngặt quy trình chế biến thực phẩm

1.4 Hiểu biết về vi sinh vật và hệ vi sinh vật ô nhiễm thịt

1.4.1 Hệ vi sinh vật ô nhiễm thịt

Thịt gia súc, gia cầm giàu dinh dưỡng là môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển, mà trong đó đa số là vi sinh vật có hại bao gồm: vi khuẩn gây thối rữa, các bào tử nấm mốc, các bào tử nấm men

Vi sinh vật thường nhiễm nhiều trên bề mặt thịt và phát triển làm cho số lượng dần tăng lên, đặc biệt là những miếng thịt giữ trong điều kiện nóng làm cho

vi sinh vật tăng nhanh gây cho thịt chóng hư hỏng

Một số vi sinh vật có hại trong thịt thường gặp:

1.4.1.1 Vi khuẩn Brucella

* Cấu tạo và phân loại

Brucella là vi khuẩn Gram âm có dạng hình que, không di động, kích thước 0,5 ÷ 0,7 × 0,6÷1,5µm

Các gene của Brucella nằm trên hai nhiễm sắc thể dạng vòng kích thước 2,1

và 1,2 MB Tỷ lệ các bazơ nitơ G và C chiếm khoảng 57% Có độ tương đồng lớn

(tới 90%) trong bộ gene của Brucella gây bệnh trên các động vật khác nhau

Các loại Brucella bao gồm B melitensis gây bệnh cho cừu; B canis nhiễm ở chó; B neotomae gây bệnh ở chuột hoang Gần đây người ta tìm thấy B cetaceae nhiễm các loài giáp xác và B pinnipediae có khả năng gây bệnh cho các động vật

có vú sống dưới nước B melitensis, B abortus, B suis và B canis đã được chứng

minh là có khả năng gây bệnh cho người

Brucella thuộc lớp Proteobacteria và ký sinh nội bào tùy tiện

* Tác hại

Gây bệnh Brucellocis Bệnh còn có các tên khác như: sốt Malta, sốt làn sóng, bệnh của Bang (gọi tắt là bệnh Bang)

Triệu chứng: một trong những triệu chứng điển hình của bệnh là lúc sốt lúc không

Động vật và người có thể bị nhiễm vi khuẩn Brucella qua các con đường:

- Tiếp xúc trực tiếp với gia súc mắc bệnh hay các cơ quan, phủ tạng của gia súc mắc bệnh

- Vi khuẩn có mặt ở trong sữa của gia súc cái mắc bệnh, sữa không được hấp khử trùng đúng quy cách là chất chứa mầm bệnh và dễ làm lây lan bệnh

- Các chất thải từ các lò mổ có thể trở thành nguồn lưu trữ mầm bệnh

- Bãi chăn thả, nước, cỏ dự trữ và nhiều loại thức ăn gia súc cũng là nơi có thể có mầm bệnh khu trú Khi đã xâm nhập vào vật chủ qua đường tiêu hóa, vi khuẩn sẽ xâm nhập và cư trú tại các hạch bạch huyết cục bộ trong thời kỳ ủ bệnh Thời kỳ ủ bệnh hay thời kỳ nung bệnh (từ khi vi khuẩn xâm nhập đến khi có thể phát hiện bệnh) có thể kéo dài 2 tuần, có khi đến hai tháng hoặc lâu hơn Chính vì vậy các cá thể mang vi khuẩn (mang mầm bệnh) nhưng chưa phát bệnh là một trong những yếu tố làm phức tạp thêm cho công việc phòng, chống bệnh

Sau khi xâm nhập vào máu, vi khuẩn sẽ có mặt tại các cơ quan như tử cung, bầu vú, nhau thai (đối với gia súc mang thai) và các hạch bạch huyết

Đối với đại gia súc triệu chứng thường thấy là sảy thai Các triệu chứng thường không biểu hiện rõ ở các con cái mang thai và thường có một khoảng thời gian không phát hiện được kháng thể chống vi khuẩn trong máu kể từ khi bị nhiễm đến khi phát hiện triệu chứng của bệnh

Brucella có khả năng xâm nhập qua da của người nên tiếp xúc với gia súc hay các vật phẩm mang trùng cũng là nguy cơ nhiễm bệnh với người

1.4.1.2 Salmonella

* Đặc điểm - cấu tạo

Là trực khuẩn gram (-) hiếu khí và kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, có tiên

mao (trừ S.gallinarum)

Kích thước tế bào 0,5÷3 µm, phát triển tốt ở nhiệt độ 370C, pH tối ưu cho chúng là vùng trung tính nhưng khoảng pH phát triển lại rất rộng (pH = 4 - 9) Nếu

pH thấp, oxi có tác dụng tốt với chúng

Không có khả năng phát triển ở nồng độ muối cao

Không lên men lactose, ONPG - urease, sucrose, saclicin Chúng sử dụng axit amin như một nguồn nitơ

Salmonella phát triển mạnh trong môi trường Mac conkey, EMB, thạch Brilliant green và tạo ra 2 loại khuẩn lạc:

- Khuẩn lạc S: nhẵn tròn, hơi lồi, bóng

- Khuẩn lạc R: gồ ghề, không đều, mặt dẹp, khô

Salmonella hiện diện tự nhiên trong ruột, trong phân của các loài động vật như lợn, bò, gia cầm, rùa, rắn, các loài bò sát

* Tác hại

Salmonella là thủ phạm của 15% các trường hợp ngộ độc thực phẩm

1.4.2 Các yếu tố liên quan đến sự nhiễm khuẩn vào thịt

1.4.2.1 Nhiệt độ và thời gian

Dựa theo nhiệt độ sinh trưởng tối thích có thể chia vi sinh vật thành các nhóm:

- Nhóm ưa lạnh: có thể phát triển tốt ở nhiệt độ 0 - 200C Ví dụ giống như vi

khuẩn Pseudomonas và một số loài nấm men, nấm mốc

- Nhóm ưa ẩm: có thể phát triển tốt ở nhiệt độ 20 - 450C, phần lớn các vi

khuẩn đều thuộc nhóm này như Staphylococcus aureus

- Nhóm ưa nóng: phát triển ở nhiệt độ cao, khoảng 45 - 650C, như

Clostridiumbotulinum

Đây là yếu tố quan trọng, khi nhiệt độ tăng tốc độ hoạt động của vi sinh vật cũng tăng đáng kể Nhiều loại vi sinh vật phát triển trong nhiệt độ từ 0 - 650C, tuy nhiên có loại phát triển tốt ở nhiệt độ -2 - 70C Có loại có thể sống trong 10h ở nhiệt

độ - 250C Có loài có thể sống trong 5h30’ ở 1000C, 2h30’ ở 2000C, nếu thịt khô Nói chung hầu hết các vi sinh vật đều chậm phát triển khi nhiệt độ giảm xuống thấp như nấm mốc, nấm men có thể sống ở - 50C và chết ở 100C Tóm lại đa số các vi sinh vật ở nhiệt độ 25- 350C có tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, trên và dưới nhiệt độ đó sẽ phát triển chậm lại Vì vậy sự kết hợp giữa nhiệt độ và thời gian đóng

vai trò quan trọng bậc nhất trong việc đảm bảo an toàn chất lượng thịt Quá trình làm lạnh có thể ngăn chặn sự phát triển của một số vi sinh vật nhưng không thể tiêu diệt chúng Để có thể tiêu diệt được vi sinh vật bằng nhiệt cần thiết phải có sự kết hợp giữa nhiệt độ và thời gian

- Thịt từ súc vật có sừng sống ở vùng nhiệt đới có thể bảo quản tốt ở nhiệt độ -150C hơn là thịt cùng loại sống ở vùng ôn đới

- Thịt lợn, bò, cừu đóng gói và bảo quản ở nhiệt độ 3-70C sẽ bị hỏng do

Achrommobacter, Pseudemonas

- Khi bảo quản đông lạnh thịt đã nhiễm vi sinh vật trước đó, tuy vi sinh vật bị

ức chế nhưng các enzym do chúng tiết ra vẫn hoạt động gây hư hỏng thịt ngay cả khi bảo quản ở nhiệt độ - 300C

- Thời gian: nguyên liệu thịt để càng lâu ngoài môi trường thì vi sinh vật càng phát triển

1.4.2.2 Độ ẩm

- Hoạt tính nước: aw = áp suất hơi của dung dịch/áp suất hơi của dung môi nguyên chất

- Độ ẩm cân bằng tương đối ERH = aw x 100

Theo số liệu nghiên cứu cho thấy khi bảo quản lượng vi sinh vật có trong thịt phụ thuộc vào độ ẩm như sau:

Nhiệt độ

bảo quản

Thời gian bảo quản

Trên bề mặt khô (TB VSV/g)

Bề mặt ướt (TB VSV/g)

Sau 72h 4.000.000 Bắt đầu có mùi ôi

Độ ẩm của môi trường bảo quản quan trọng với cả hoạt độ của nước aw trong thực phẩm và sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt khi aw của thực phẩm ở 0,60 thì điều quan trọng đối với thực phẩm là thực phẩm này cần được tàng trữ trong điều kiện R.H (độ ẩm tương đối) mà tại đó thực phẩm không nhận ẩm từ môi trường xung

quanh và dẫn đến sự tăng hoạt độ của nước trên bề mặt bên trong thực phẩm đến điểm mà sự phát triển của vi sinh vật có thể xảy ra Nhiệt độ càng cao thì độ ẩm càng thấp Tuy nhiên nấm men có thể phát triển mạnh mẽ vì chúng có thể sống ở điều kiện hoạt độ nước thấp đến aw = 0,62 Nấm men có thể phát triển mạnh trên thịt muối là nhờ một số loài có thể chịu được hoạt độ nước thấp nhất

CO2 thì có thể hạn chế được vi sinh vật Các yếu tố bên ngoài đối với thực phẩm là tính chất của môi trường bảo quản, chúng ảnh hưởng đến cả thực phẩm và hệ vi sinh vật trong thực phẩm

- Nồng đồ CO2 khi vượt quá giới hạn có thể làm giảm độ pH của dung dịch, dẫn đến ngăn chặn sự sinh trưởng của vi sinh vật Bảo quản thịt ở không khí có CO2

cao hạn chế được vi khuẩn Gram âm, dẫn tới một quần thể chiếm ưu thế bởi các

Lactobacillus

1.4.2.4 pH

- Độ pH của thực phẩm cũng là một trong các tiêu chí quan trọng

- Trong thịt có sự biến đổi của pH:

+ Mới mổ: pH: 7,2 - 7,4

+ Quá trình toan hóa: pH giảm tới 5,8 - 5,2 do sự tích tụ của axit lactic và H3PO4

- Thịt hư hỏng: pH lại tăng đến trung tính hay kiềm yếu (tùy mức độ) Nếu

pH thấp sẽ thích hợp hơn cho sự sinh trưởng của nấm men và nấm sợi Nếu pH trung tính hay kiềm như trong thịt thì vi khuẩn chiếm ưu thế Sự phá hỏng của thịt phụ thuộc vào cơ chất chính có mặt trong đó

- Phần lớn các vi sinh vật phát triển mạnh ở pH gần trung tính Các sản phẩm thịt nói chung có pH nằm trong vùng từ 4,8 - 6,8 Nhìn chung vi sinh vật phát triển chậm hơn và ít hiệu quả hơn ở pH tử 5,0 trở xuống Vi khuẩn bị kìm hãm ở pH < 5,5 nhưng sự phát triển của nấm men có khả năng chịu được pH axit lại tăng

1.5 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt

1.5.1 Thịt tươi

Thịt tươi là phần thân thịt của gia súc, gia cầm mới được mổ ra và chưa bị biến chất bởi men của bản thân nó và của vi sinh vật, làm thay đổi cảm quan và hình thành những chất có hại Thịt là một trong những sản phẩm của động vật có giá trị dinh dưỡng cao cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển và hoạt động sống của con người Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, nó phụ thuộc vào các yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy và chế độ chăm sóc nuôi dưỡng Nhưng thành phần hóa học của thịt bao gồm:

+ pH của thịt tươi tối đa 6-6,5%

Ngoài các thành phần trên thịt còn có thành phần khoáng, vitamin, các loại men và các chất dinh dưỡng khác cần thiết cho con người Đánh giá cảm quan với thịt tươi, Nguyễn Vĩnh Phước (1976) [25] và trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I- Cục Thú y (1998) [41] cho biết (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Đánh giá kết quả cảm quan thịt

1 Trạng thái

bên ngoài Hơi khô, màu hơi nhạt Khô, có khi ướt nhớt, màu sẫm

2 Vết cắt Hơi ướt, màu hồng Ướt nhớt, màu thẫm

3 Độ

đàn hồi

Rắn chắc, đàn hồi cao, ấn ngón tay vào thịt tạo vết lõm, nhấc tay ra không để lại vết

Hơi nhão, nhão, ấn ngón tay vào

để lại vết nhẹ (thịt kém tươi), vết hằn sâu không mất (thịt ôi)

4 Mỡ

Màu sáng, độ rắn và mùi vị tự nhiên của thịt tươi, không có mùi lạ

Màu tối, độ rắn giảm, có vị ôi

5 Gân Gân trong, bám chặt vào thành

6 Tủy Tủy trong, bám chặt vào thành

ống xương Đục, co lại, không đầy ống xương

Cũng theo Nguyễn Vĩnh Phước (1976) [25]; thịt tươi được đánh giá bằng các phản ứng sinh hóa học dựa theo các tiêu chuẩn sau:

Bảng 1.3: Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hóa học Tiêu chuẩn Thịt tươi Thịt kém tươi Thịt ôi

pH của nước thịt ngâm 5,4 - 6,4 6,5 - 6,7 Trên 6,7 Hàm lượng NH3 (mg) Dưới 1,26 1,27 - 1,68 Trên 1,68 Phản ứng CuSO4 làm

sa lắng Protit

Nước thịt trong hoặc hơi đục

Nước thịt vẩn đục hoặc có hạt

Nước thịt đục, có cặn, sánh như keo

Phản ứng tìm Peroxydaza

(thử Benzidin)

Nước thịt ngâm, lọc có màu xanh lá

mạ, sau mấy phút chuyển màu nâu

Nước thịt ngâm, lọc không có hoặc lâu mới có màu xanh lá mạ

Nước thịt ngâm, lọc không biến đổi màu sắc

Phản ứng Nestler

tìm NH3

Nước thịt ngâm, lọc không màu

Nước thịt ngâm, lọc

có màu vàng nhạt

Nước thịt ngâm, lọc có màu vàng

vỏ chanh Phản ứng tìm H2S

(dùng axetat chì)

Giấy lọc giữ nguyên màu

Giấy lọc có màu nâu nhạt

Giấy lọc có màu nâu sẫm hoặc đen

1.5.2 Các dạng hư hỏng của thịt

Sau khi giết mổ thịt còn mới nên chưa bị biến chất, thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hư hỏng trong các trường hợp như giữ thịt lâu chưa kịp tiêu thụ hoặc cất giữ để sử dụng dần trong các điều kiện bảo quả không đúng cách lúc này thịt sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn trong thịt và các vi sinh vật xâm nhiễm vào thịt dẫn đến ôi thiu, hư hỏng hình thành những chất có hại

Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường thấy là: thịt nhớt, thối rữa, lên men chua, có các chất mầu trên bề mặt thịt, thịt mốc (Lương Đức Phẩm, 2000) [22]

loại vi sinh vật phát triển trên bề mặt của thịt như: Streptococcus, Clostridium,

E coli, Bacillus vì vậy thực phẩm dễ dàng bị ôi thiu bởi sự xâm nhiễm của vi khuẩn

1.5.4 Ô nhiễm thực phẩm do vi sinh vật

Ô nhiễm thực phẩm có nguồn gốc vi sinh vật hiện đang là vấn đề đáng lo ngại của loài người hiện nay Thực phẩm dễ bị ô nhiễm bởi vi sinh vật (virus, vi khuẩn, protozoa ) Trong không khí, dụng cụ giết mổ, chế biến thực phẩm đều có thể bị vi sinh vật bám dính trên bề mặt, chúng dễ dàng xâm nhiễm vào thực phẩm qua nhiều con đường khác nhau Đặc biệt nguồn thực phẩm tươi sống như thịt lợn,

bò, gà, thịt vịt dễ bị ô nhiễm bởi các vi khuẩn gây bệnh Đây là môi trường thuận lợi để chúng phát triển tăng sinh khối và dễ dàng sinh nội độc tố hoặc ngoại độc tố gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng hàng ngày

1.5.5 Ô nhiễm thịt tươi do vi khuẩn

* Ô nhiễm do vi khuẩn từ người và động vật

Trên một cơ thể sống nói chung đều là nơi trú ngụ của rất nhiều loài vi khuẩn nhất là trên da và niêm mạc của các xoang tự nhiên thông với bên ngoài và đường

tiêu hóa những giống vi khuẩn chủ yếu là Staphylococcus, Salmonella, E coli,

Aerobacter, Cl.perfringens (Lương Đức Phẩm 2000) [22], những vi khuẩn này thải

ra ngoài và chúng xâm nhiễm vào thịt qua nhiều con đường khác nhau

* Ô nhiễm do vi khuẩn từ không khí

Không khí trong khu vực chuồng nuôi, sân bãi, nhà xưởng có thể tồn tại một số lượng vi khuẩn lớn, độ ẩm không khí càng cao thì số lượng vi sinh vật càng lớn Bên ngoài và bên trong khu vực chuồng nuôi, lò giết mổ có thể tìm thấy các

loại vi khuẩn: Salmonella

* Ô nhiễm vi khuẩn trong quá trình giết mổ chế biến bảo quản và lưu thông phân phối

Trong quá trình giết mổ không thực hiện nghiêm ngặt quy trình vệ sinh nên thịt dễ bị ô nhiễm, ngoài ra trong quá trình sơ chế sản phẩm (cạo lông, pha chế, lọc da ) thịt cũng dễ bị nhiễm vi khuẩn từ bề mặt của con vật

Trên bề mặt thịt vi sinh vật sinh sản, phát triển và lan dần vào bên trong làm hư hỏng thịt Tuy nhiên thời gian gây ôi thiu hư hỏng thịt còn phụ thuộc vào

phẩm chất và chủng loại thịt, các chủng vi sinh vật và điều kiện môi trường (ẩm

độ, nhiệt độ )

1.5.6 Ý nghĩa của ô nhiễm thịt về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí

Thuật ngữ "vi khuẩn hiếu khí" (VKHK) trong vệ sinh thực phẩm được hiểu

là bao gồm cả VKHK và vi khuẩn kỵ khí tùy tiện Sự phân chia vi khuẩn thành hai nhóm dựa trên cơ sở nhiệt độ phát triển giữa chúng Hệ vi sinh vật có mặt trong thịt được chia thành hai nhóm dựa theo nhiệt độ của chúng

- Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 370C và chúng ngừng phát triển ở 10C

- Nhóm vi khuẩn ưa lạnh chúng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp hơn cho thấy rằng vi khuẩn ưa lạnh có thể phát triển ở nhiệt độ 0-300C và nhiệt độ tối ưu

là 10-150C

Xác định tổng số VKHK trong thực phẩm được sử dụng như một nhân tố chỉ tiêu về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian chế biến, vận chuyển và bảo quản thực phẩm Nó được coi là phương pháp tốt nhất để ước lượng vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

1.6.1 Nghiên cứu ở Việt Nam

Tại Việt Nam việc đảm bảo ATVSTP là một trong những vấn đề hàng đầu được Đảng và Nhà nước quan tâm Tuy nhiên đây là một trong những thách thức cho những nhà quản lý Đặc biệt là sự ô nhiễm vi sinh vật vào các loại thịt tươi, thịt

đã được chế biến sẵn bán tại các chợ rất phổ biến, song bên cạnh đó thì các điều kiện vệ sinh về trang thiết bị bầy bán, dụng cụ chế biến chưa đảm bảo, kiến thức về ATVSTP đối với người trực tiếp chế biến còn nhiều hạn chế

Quy trình từ chăn nuôi đến sản xuất chế biến lưu thông và tiêu dùng nhiều mặt hàng thực phẩm của Việt Nam được các chuyên gia WHO khẳng định là chưa

an toàn và chưa sạch

Một số công trình nghiên cứu của nhóm tác giả trong nước về vấn đề này đã

phản ảnh lên điều đó: Trần Thị Hạnh (2004) [16] nghiên cứu tình hình ô nhiễm E

coli và Salmonella trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật trên địa bàn thành

phố Hà Nội và kết quả phân lập vi khuẩn; Tô Liên Thu (2005) [31], đã nghiên cứu

tình trạng ô nhiễm một số vi khuẩn vào thịt sau giết mổ của Hà Nội và một số phương pháp làm giảm sự nhiễm khuẩn trên thịt; Trần Hương Giang và Huỳnh Thị

Mỹ Lệ (2012) [15], xác định tỷ lệ nhiễm và độc lực của vi khuẩn Escherichia coli

phân lập được từ thịt (lợn, bò, gà) ở một số huyện ngoại thành Hà Nội; Hoàng Phú Hiệp và Lê Quang Huấn (2012) [18], phát triển kỹ thuật LAMP (Loop Mediated Isothermal Aplification) cho việc phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn

lệ nhiễm và độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập được từ thịt (lợn, bò, gà)

ở một số huyện ngoại thành Hà Nội qua kiểm tra 90 mẫu thịt (lợn, bò, gà) lấy tại 11 chợ ở một số huyện ngoại thành Hà Nội (huyện Gia Lâm, Đông Anh và Sóc Sơn) hồi tháng 02/2012 cho thấy tỷ lệ các mẫu thịt đạt tiêu chuẩn vệ sinh (TCVS) khi kiểm tra là khác nhau giữa các loại thịt và giữa các chợ Cụ thể, tỷ lệ mẫu thịt bò và thịt lợn không đạt TCVS ở chỉ tiêu là 53,33%, cao nhất là thịt gà (60,0%) Toàn bộ 100% chủng phân lập được có độc lực cao, đều gây chết chuột bạch trong phòng thí nghiệm trong vòng 24-72 giờ Trong số các chủng phân lập được, có 3 chủng thuộc

về serotype O26, O55, O157 có thể gây nguy hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng Kết quả này góp phần cảnh báo cho người tiêu dùng cẩn trọng trong sử dụng thịt trên thị trường

1.6.2 Nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay ATVSTP vẫn là mối quan ngại mang tính toàn cầu, ngay cả đối với các nước phát triển có trình độ công nghệ tiên tiến và hệ thống quản lý chất lượng rất khoa học nhưng tỷ lệ ngộ độc thực phẩm vẫn rất cao Có rất nhiều nguyên nhân

để dẫn đến thực phẩm bị ô nhiễm và gây ngộ độc thực phẩm trong đó phải kể đến

sự góp mặt của vi sinh vật, độc tố vi sinh vật, nấm mốc, độc tố nấm mốc, hóa chất hiện đang được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm Ở Mỹ một quốc gia có hơn

200 triệu dân, kinh tế phát triển vào bậc nhất thế giới, khoa học kỹ thuật cũng được xếp vào tốp trong những nước đứng đầu, song hàng năm nước Mỹ vẫn có hơn 70 triệu ca bị ngộ độc thực phẩm Tại Úc, về kinh tế xã hội, khoa học kỹ thuật cũng được xếp vào mức khá trong nhóm các nước phát triển, tuy vậy hàng năm theo thống kê vẫn có trên 4 triệu người bị ngộ độc thực phẩm

Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease

Control and Prevention -CDC) ước tính rằng có tới 76 triệu trường hợp bị bệnh do

thực phẩm hay ngộ độc thực phẩm xảy ra hàng năm ở Mỹ Các bệnh do thực phẩm

đã được xác định như là bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc được gây ra bởi những tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể thông qua ăn uống thực phẩm bị ô nhiễm Mọi người đều có nguy cơ mắc bệnh từ thực phẩm, mức độ tùy thuộc vào sức khỏe, tuổi tác và điều kiện sống của họ Vi khuẩn gây bệnh là yếu tố dẫn đầu trong các nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm ở con người Thực phẩm có thể bị ô nhiễm bởi các

loại vi khuẩn như: Salmonella, Listenia, Shigella hoặc Campylobacter

Ngày 02/7/2011, nhà chức trách Pháp xác nhận nước này đã có trường hợp tử

vong đầu tiên do khuẩn E coli, chủng vi khuẩn gây dịch tả đang hoành hành tại châu

Âu với các triệu chứng của bệnh tăng urê huyết- huyết khó đông (HUS), triệu chứng

mà hầu hết các bệnh nhân của dịch tả do vi khuẩn đều gặp phải Tiếp sau đó 07 trường hợp khác vẫn đang phải điều trị tại bệnh viện sau khi phát hiện chứng HUS Qua xét nghiệm, những trường hợp này đều được xác nhận đã nhiễm chủng "O104" - cùng chủng vi khuẩn với trường hợp đã tử vong ngày 02/7/2011 nói trên Dịch nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn bùng phát ở châu Âu đã xuất hiện ở 14 nước, cướp đi sinh mạng của ít nhất 50 người và khiến hơn 3.400 người bị lây nhiễm

Ca ngộ độc thực phẩm xảy ra ở Sakai Nhật Bản năm 1996 đã làm 6.500 người phải vào viện làm 07 người thiệt mạng (Lê Minh Sơn 2003) [27]

Hàng loạt các vụ NĐTP đã được ghi nhận trên toàn thế giới trong thời gian vừa qua, điều này đã minh họa bức tranh về sức khỏe cộng đồng và mức độ ảnh hưởng của bệnh này đối với toàn cầu

Chương 2 NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Các mẫu thịt lợn lấy tại một số chợ tại thành phố Lạng Sơn

- Vi khuẩn E coli

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2015 - 8/2016

+ Địa điểm lấy mẫu tại ba chợ: Giếng Vuông, Đông Kinh, Chi Lăng của thành phố Lạng Sơn

+ Địa điểm phân tích mẫu: Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên

2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu thịt tươi được lấy tại các chợ trên địa bàn thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn

- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và giám định

tổng số VKHK

Môi trường được sử dụng là những môi trường chế biến sẵn dạng tổng hợp khi dùng pha theo công thức hướng dẫn

+ Môi trường Plate Count Agar: Dùng để đếm tổng số VKHK

+ Môi trường thạch Macconkey: Dùng để phân lập vi khuẩn

+ Môi trường thạch máu: Dùng để phân lập và thử khả năng dung huyết của

vi khuẩn

+ Môi trường Nutrient Broth, thuốc khử kovac: Dùng để kiểm tra đặc tính

sinh Indol của vi khuẩn

+ Nước muối sinh lý 0,9% dùng để pha loãng mẫu

- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que cấy, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, bông cồn, túi nilon, cối, chày sứ và các dụng cụ thí nghiệm khác

- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng khỏe mạnh 18 - 20 gram

2.4 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Lạng Sơn

- Xác định mức độ nhiễm khuẩn E coli trong thịt lợn tươi

- Nghiên cứu đặc tính sinh học, đặc tính hóa học của vi khuẩn E coli phân

lập được

- Xác định serotype của các chủng E coli phân lập được; Các gen mã hóa sản

sinh độc tố đường ruột; độc lực của chủng vi khuẩn phân lập được và khả năng mẫn cảm kháng sinh

- Giải pháp phòng và khống chế ngộ độc thực phẩm

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này chúng tôi áp dụng phương pháp nghiên cứu thường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO)

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

Lấy mẫu thịt lợn tươi theo TCVN 4833-1:2002; TCVN 4833-2:2002 [38]

2.5.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn tươi

Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt lợn tươi áp dụng theo TCVN 5667: 1992 [40]

* Nguyên tắc

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy láng, đếm vi khuẩn trên môi trường Plate count Agar (PCA) có pH = 7,0±0,2; ủ hiếu khí ở 370C trong thời gian 24h Số lượng vi khuẩn hiếu khí có trong 1 gam mẫu theo số khuẩn lạc đếm được tỷ lệ đĩa thạch nuôi cấy theo các nồng độ khác nhau

* Môi trường và hóa chất

- Môi trường, sử dụng môi trường Plate count Agar (PCA) có pH = 7,0 ± 0,2, môi trường được pha chế theo tỷ lệ 225 gram/1000 ml nước cất Cho môi trường vào trong bình thủy tinh vô trùng, hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 15 phút, sau đó để môi trường nguội ở 450C, đổ ra các đĩa Petri trong buồng nuôi cấy vô trùng bên cạnh ngọn lửa đèn cồn

- Dung dịch muối sinh lý 0,9% dùng để pha loãng dung dịch này được chứa trong các bình có thể tích 500 ml hoặc 1.000 ml, hấp khử trùng và được phân phối thành các thể tích chính xác 9 ml và các ống nghiệm vô trùng

Đối với mẫu dạng lỏng, hút 10ml dịch cho vào bình tam giác chứa sẵn 90ml nước muối sinh lý 0,9% Sau khi đồng nhất mẫu, dung dịch thu được có độ pha loãng 10-1 so với ban đầu

- Nuôi cấy: Mẫu kiểm nghiệm nuôi cấy ít nhất 2 đậm độ liên tiếp, mỗi đậm

độ cấy vào 2 đĩa thạch và phải dùng que cấy riêng Dùng pipetman với đầu hút vô trùng lấy 0,2ml dung dịch mẫu pha loãng ở các nồng độ khác nhau rồi nhỏ lên mặt thạch, láng đều sao cho dung dịch nuôi cấy phân bố đều trên mặt thạch Sau đó cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong thời gian 24h rồi đọc kết quả

Chọn những đĩa có tỷ lệ 15-300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 độ pha loãng liên tiếp Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý: Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu chênh lệch giữa các giá trị của 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 thì tính (N - Số khuẩn lạc VKHK cho 1 gram thịt) bằng cách tính trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức sau:

- Trong đó:

+ N: Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1gram thịt

+ C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

+ n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2

+ d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ 1

+V: Thể tích chất nuôi cấy được sử dụng trên mỗi đĩa

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập tổng số vi khuẩn hiếu khí

2.5.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn trong thịt lợn tươi

Áp dụng theo TCVN 5155: 1990 [39]

- Đồng nhất và pha loãng mẫu: Cân 10 gram thịt tươi (không lấy mỡ) nghiền nát trong cối sứ, nghiền tiếp bằng máy xay thịt, cho vào bình tam giác 100ml, bổ sung 90ml dịch dinh dưỡng Nutrient Broth, được độ pha loãng 10-1 Ly tâm 3000 vòng/phút trong 30 phút, tiếp tục pha loãng đến đậm độ không còn khả năng dương tính (10-6, 10-7)

- Cấy dàn trên thạch MacConkey, mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa thạch khác nhau, bồi dưỡng 370C/24h

Đếm số khuẩn lạc nghi (dạng S, bề mặt vồng, rìa gọn, tròn, màu đỏ cánh sen, xung quanh có vùng mờ sương) Chỉ những đĩa thạch sau khi cấy 370C/24h (với 0,1ml dịch nuôi cấy) có ít nhất 30 khuẩn lạc và không quá 300 mới được chấp nhận Tính kết quả theo Quinn P J [47]

- Trên mỗi đĩa thạch, chọn ít nhất 5 khuẩn lạc đồng nhất nghi đem giám định đặc tính sinh vật hoá học: Kiểm tra hình thái, kích thước (0,3-0,6 x 2-3µm), tính chất bắt màu Gram(-), phản ứng sinh Indol 450C(+), H2S, urease(-), MR dương tính, VP(-), Citrate(-) Giám định serotype kháng nguyên O Xác định khả năng sản sinh độc tố, độc lực…

Độ đồng nhất

Pha loãng mẫu 10-1,10-2,10-3

Cấy láng mẫu trên Plate Count Ager

Đếm khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập E coli từ thịt

2.5.4 Quy định kỹ thuật đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi

Quy định lý thuật áp dụng đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt lợn tươi được

áp dụng theo TCVN 7046: 2002 [37]

Bảng 2.1: Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi TCVN 7046: 2002

tối đa

1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1gram sản phẩm 106

3 Salmonella , số vi khuẩn trong 25 gram sản phẩm 0

4 Bacillus cereus , số vi khuẩn trong 1gram sản phẩm 102

5 Staphylococcus aureus , số vi khuẩn trong 1gram sản phẩm 102

6 Clostridium perfringens , số vi khuẩn trong 1gram sản phẩm 10

7 Clostridium botulinum, số vi khuẩn trong 1gram sản phẩm 0

Đồng nhất và pha loãng mẫu

MacConkey ở 370C/24h Thạch máu ở 370C/24h

TSI ở 370C/24h

Nutrien Broth 440C/24h

BHI ở 370C/24h Nhuộm Gram Kháng sinh đồ

Tiêm động vật thí nghiệm Kết luận E coli

2.5.5 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn phân lập được

Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập được the Quinn P J [47]

* Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)

Cách pha:

+ Cân 27 gam môi trường vào 1.000 ml nước cất

+ Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn

Sau đó tiến hành tiêm phúc mạc chuột bạch với liều lượng 0,5ml canh trùng/con Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm Khi chuột chết, tiến hành mổ khám bệnh tích và phân lập vi khuẩn và nuôi cấy lại trên môi trường MacConkey

2.5.6 Phương pháp xác phương pháp định gen quy định sản sinh độc tố đường ruột của chủng vi khuẩn

Bước 3: là giai đoạn kéo dài (elongation), thường nhiệt độ 720C

Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lập đi lập lại nhiều lần, sau mỗi lần lập lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA của lần trước Số chu kỳ thường theo kinh nghiệm và có thể trong khoảng 25 đến 30 chu kỳ, tùy theo lượng mẫu DNA lúc bắt đầu và độ nhạy mong muốn

* Phân tích kết quả PCR

Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tùy vào mục đích mà người ta sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau để phân tích sản phẩm của phản ứng PCR như đọc trình tự sản phẩm PCR, tạo dòng sản phẩm PCR Tuy nhiên, công việc đầu tiên sau khi thực hiện phản ứng PCR là phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di

Sau khi điện di các DNA trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào các base của các nucleotide và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV

Để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một "yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử" (molecular weight marker- MWN) hay còn gọi DNA ladder (thang chuẩn)

2.5.7 Xác định gen VT1, VT2 của các chủng E coli bằng phản ứng PCR

Phương pháp PCR dùng để xác định một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn được thực hiện với một số cải tiến về phương pháp và thực hiện quy trình phản ứng Có thể tóm tắt như sau:

- ADN đích: Là một lượng nhỏ khuẩn lạc của chủng cần xác định mọc trên

đĩa thạch máu ở 370C từ 18 - 24 giờ

- Chủng vi khuẩn E coli chuẩn quốc tế, dùng làm đối chứng dương (đã được

kiểm định chắc chắn có mang gen quy định các yếu tố độc lực), hoặc đối chứng âm (không mang gen quy định các yếu tố độc lực)

- Các cặp mồi phản ứng PCR: các hãng Life technologies (Gibco, BRL) sản

xuất và được bảo quản ở nhiệt độ -200C Trình tự nucleotide của các cặp mồi

Gen đích Primers Chuỗi primers (5’-3’) Kích thước sản

phẩm (bp)

VT1 VT1 - F 5’- CAG TTA ATG TGG TGG CGA AG -3’ 894

VT1 - R 5’- CTG CTA ATA GTT CTG CGC ATG -3’

5 DNA khuôn của các chủng vi khuẩn cần kiểm tra 2,0

Sản phẩm PCR được quan sát dưới đèn UV (300 nm) và ảnh được chụp bằng hệ thống Gel Doc 2000 (Bio - Rad)

2.5.8 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn phân lập được

Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn phân lập được the Quinn.P.J [47]

* Nguyên lý chung

Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy

* Mục đích

Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn

2.5.9 Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn

* Phương pháp nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số:

DNA tổng số của vi khuẩn được tách chiết bằng kit tách DNA của hãng Thermo theo hướng dẫn của bộ kit

- Kiểm tra kết quả

- Xác định nồng độ DNA bằng quang phổ kế

Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm các base purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan sau:

- 1O.D ở 260nm đối với sợi đôi DNA = 50 ng/µl

- 1O.D ở 260nm đối với sợi đơn DNA = 20-33 ng/µl

- 1O.D ở 280nm đối với RNA = 40 ng/µl

Ở bước sóng 280 nm sẽ thể hiện nồng độ protein trong mẫu

DNA và RNA tinh sạch có tỉ lệ OD260/OD280 từ 1.8-2.0

Việc nhiễm protein sẽ làm tỷ lệ trên thấp hơn, nhiễm chloroform sẽ làm tỉ lệ trên cao hơn và giảm độ chính xác của lượng DNA

* Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị cuvet

- Lấy cuvet ra khỏi dung dịch bảo vệ Rửa sạch bằng nước cất 2 lần

Bước 2: Chuẩn bị blank

- Lấy 2 ml nước khử ion cho vào 1 cuvet

Bước 3: Bố trí dãy pha loãng

- Lấy 2 ml nước khử ion cho vào 3 cuvet khác, sắp theo thứ tự 1,2,3

- Lấy 20 µl DNA cho vào cuvet thứ nhất, trộn đều bằng pipet

- Lấy 20 µl từ cuvet thứ nhất cho sang cuvet thứ 2, trộn đều

- Lấy 20 µl từ cuvet thứ hai cho sang cuvet thứ 3, trộn đều

Bước 4: Đo OD bằng máy

- Chọn chế độ đo OD 260/280

- Đưa cuvet blank vào, chuẩn hóa

- Lần lượt đưa cuvet 1,2,3 vào và đo OD, ghi lại kết quả

Bước 5: Tính toán và kết luận

- Từ số liệu thu được, tính toán nồng độ DNA trong dung dịch gốc bằng cách nhân với 1000

- Kết luận về độ sạch của DNA dựa trên chỉ số OD260/280

Nồng độ DNA sẽ là: OD 260 * 50 ng/µl * độ pha

* Phương pháp điện di

Nguyên lý

Dựa vào đặc tính cấu trúc của axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển

về cực dương của điện trường

Gel agarose được đổ bằng cách đun agarose trong dung dịch đệm thích hợp cho đến khi có màu trắng trong và cho đặc lại bằng cách đổ vào khuôn và để nguội Khi đặc lại agarose tạo nên mạng lưới mà kích thước của nó phụ thuộc nồng độ agarose và dung dịch đệm

Khi nằm trong gel có pH>7 DNA sẽ tích điện âm, dưới tác dụng của điện trường thì DNA sẽ chạy về phía anode Vận tốc di chuyển của DNA phụ thuộc vào các thông số sau:

- Kích thước DNA: kích thước càng lớn thì DNA di chuyển càng chậm và ngược lại

- Nồng độ agarose: tùy kích thước DNA muốn phân tích mà ta chọn nồng độ agarose thích hợp Kích thước DNA càng nhỏ thì nồng độ agarose phải càng lớn

- Cấu trúc DNA: với cùng kích thước, tùy kiến trúc: siêu xoắn, vòng hay thẳng mà tốc độ di chuyển của DNA khác nhau Tốc độ di chuyển cũng phụ thuộc vào dung dịch đệm và lượng ethidium bromide Ở đây chúng ta không nghiên cứu

kỹ về vấn đề này

- Cường độ dòng điện: Độ phân ly của gel agarose giảm khi cường độ dòng điện tăng cao Cường độ điện trường không được lớn hơn 5V/cm (tính từ khoảng cách 2 điện cực)

- Thành phần base và nhiệt độ: trong trường hợp nồng độ agarose thấp hơn 0.5% thì phải điện di ở 40C nếu không thành phần các base sẽ ảnh hưởng đến sự chuyển động của các DNA

- Ethidium bromide: ethidium bromide ảnh hưởng đến 15% tốc độ di chuyển của các của các đoạn DNA thẳng

- Dung dịch đệm điện di: dung dịch đệm ảnh hưởng đến DNA trong gel Trường hợp nồng độ dung dịch đệm quá cao gel sẽ bị chảy và DNA bị biến tính