ẢNH HƯỞNG của 1,2,3,4 TETRACHLOROBENZENE lên HOẠT ĐỘNG KHỬ yếm KHÍ TETRACHLORODIBENZO p DIOXINS của CỘNG ĐỒNG VI SINH vật TRONG bùn THUỘC VÙNG ô NHIỄM CHẤT độc màu DA CAM

i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT  NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Chứng nhận chấp thuận báo cáo luận văn tốt nghiệp với đề tài: : “Ả

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÂM TỬ LĂNG

ẢNH HƯỞNG CỦA TETRACHLOROBENZENE LÊN HOẠT ĐỘNG

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: KHOA HỌC ĐẤT

Tên đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA 1,2,3,4- TETRACHLOROBENZENE LÊN HOẠT ĐỘNG

KHỬ YẾM KHÍ

TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXINS CỦA CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT TRONG

BÙN THUỘC VÙNG Ô NHIỄM CHẤT ĐỘC MÀU

DA CAM

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS Dương Minh Viễn Lâm Tử Lăng

MSSV: 3077461 Lớp: KHĐ K33

Cần Thơ, 2011

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT



NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Chứng nhận chấp thuận báo cáo luận văn tốt nghiệp với đề tài: :

“ẢNH HƯỞNG CỦA 1,2,3,4-TETRACHLOROBENZENE LÊN HOẠT

ĐỘNG KHỬ YẾM KHÍ TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXINS CỦA

CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT TRONG BÙN THUỘC VÙNG Ô NHIỄM

CHẤT ĐỘC DA CAM”

Sinh viên thực hiện: Lâm Tử Lăng

MSSV: 3077461

Lớp Khoa Học Đất- Khóa 33 ( TT0772A1)

Nhận xét của giảng viên hướng dẫn:

Kính trình hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp thông qua Cần thơ, ngày… tháng… năm 2011 Cán bộ hướng dẫn

Ts Dương Minh Viễn

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT



NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG

Hội đồng chấm báo cáo luận văn tốt nghiệp ngành khoa học đất đã chấp thuận

báo cáo đề tài:

“ẢNH HƯỞNG CỦA 1,2,3,4-TETRACHLOROBENZENE LÊN HOẠT

ĐỘNG KHỬ YẾM KHÍ TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXINS CỦA

CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT TRONG BÙN THUỘC VÙNG Ô NHIỄM

CHẤT ĐỘC DA CAM”

Sinh viên thực hiện: Lâm Tử Lăng MSSV: 3077461

Lớp Khoa Học Đất- Khóa 33 ( TT0772A1)

Luận văn tốt nghiệp đã được Hội đồng đánh giá ở mức:

Nhận xét của Hội đồng:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2011 Chủ tịch Hội Đồng

Xét duyệt của Khoa Trưởng Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

iii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT



NHẬN XÉT CỦA BỘ MÔN

Đề tài

“ẢNH HƯỞNG CỦA 1,2,3,4-TETRACHLOROBENZENE LÊN HOẠT

ĐỘNG KHỬ YẾM KHÍ TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXINS CỦA

CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT TRONG BÙN THUỘC VÙNG Ô NHIỄM

CHẤT ĐỘC DA CAM”

Do sinh viên Lâm Tử Lăng MSSV: 3077461 Lớp Khoa Học Đất- Khóa 33

(TT0772A1) thực hiện

Ý kiến đánh giá của Bộ môn:

Cần thơ, ngày… tháng… năm 2011

Bộ môn

 Nơi sinh: Ninh Kiều- Cần Thơ

 Chỗ ở hiện nay: A4- KTT Cấp nước- Đường 30/4- Phường Xuân Khánh- Quận Ninh Kiều- TP Cần Thơ

 Họ và tên Cha: Lâm Quốc Dũng

v

LỜI CẢM TẠ



Xin kính dâng lên Cha Mẹ

Con thành kính biết ơn Cha Mẹ đã nuôi dưỡng, dạy dỗ con thành tài, là người động viên và giúp đỡ con về mọi mặt trong suốt quá trình học tập của con

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

Thầy Dương Minh Viễn đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, quan tâm giúp

đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luân văn tốt nghiệp

Thầy cố vấn học tập Trần Bá Linh, cô cố vấn học tập Châu Thị Anh Thy

đã hết lòng quan tâm, dẫn dắt, giúp đỡ em trong suốt khóa học

Xin chân thành cám ơn

Các thầy cô và các anh chị tại BM Khoa Học Đất & phòng thí nghiệm Sinh Học Đất đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và tạo điều kiện tốt để em hoàn thiện bài luận văn này

Chị Thị Tú Linh, học viên lớp Cao học Khoa Học Đất Khóa 16 đã phụ giúp và động viên tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Các bạn lớp Khoa Học Đất K33 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Trân trọng cảm ơn và kính chào!

Cần thơ, ngày… tháng… năm 2011

Lâm Tử Lăng

vi

LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam đoan đề tài luận văn tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu khoa

học của bản thân Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn tốt

nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình

nghiên cứu nào trước đây

Tác giả luận văn

Lâm Tử Lăng

vii

Lâm Tử Lăng, 2011 “ Ảnh hưởng của 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene lên hoạt

động khử yếm khí Tetrachlorodibenzo-p-dioxins của cộng đồng vi sinh vật

trong bùn thuộc vùng ô nhiễm chất độc da cam” Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn khoa học: Ts Dương Minh Viễn

TÓM LƯỢC

Hoạt động khử chlor yếm khí Polychlorinated-p-dioxins chịu ảnh hưởng của

nhiều yếu tố môi trường, trong đó có ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa chlor như 1,2,3,4-TeCB Về nguyên tắc, vi khuẩn yếm khí khử chlor của

PCDDs cũng có thể khử chlor của TeCB đề tài “Ảnh hưởng của Tetrachlorobenzene lên hoạt động khử yếm khí Tetrachlorodibenzo-p-dioxins của cộng đồng vi sinh vật trong bùn thuộc vùng ô nhiễm chất độc da cam”

1,2,3,4-được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của 1,2,3,4- TeCB lên tốc độ khử 1,2,3,4- TCDD và 2,3,7,8- TCDD và sự thay đổi cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí Dioxins khi bổ sung 1,2,3,4-TeCB

Thí nghiệm bố trí với hai mẫu bùn Đội 4- Cam Nghĩa- Quảng Trị và bùn hồ Lâm Ly- A Lưới-Thừa Thiên Huế Thí nghiệm bố trí trong các lọ ủ yếm khí, thể tích 40ml, cấy 1,2,3,4-TCDD (10μM) / 2,3,7,8-TCDD (1μM) Hai nghiệm thức,

có và không có 1,2,3,4-TeCB (58μM), được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và có 3 lặp lại Sử dụng các cộng đồng nuôi đã thể hiện hoạt động khử chlor PCDDs chuyển vào các mẫu ủ thí nghiệm (10% thể tích lọ ủ) Lấy mẫu ở thời điểm 0,1,2 và 7 tháng để khảo sát hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4-TCDD và 2,3,7,8-TCDD; đồng thời các mẫu ở 1,2 và 7 tháng sử dụng để phân tích cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí Dioxins

Qua thời gian ủ, kết quả thí nghiệm các mẫu ủ cấy 1,2,3,4-TCDD thể hiện hoạt động khử mạnh, tạo ra các sản phẩm khử 3 chlor, 2 chlor, 1 chlor và cả

Dibenzo-p-dioxin Nghiệm thức cấy 2,3,7,8-TCDD cũng cho thấy có hoạt động

khử chlor yếm khí nhưng tốc độ chậm hơn, sản phẩm tạo thành là

2,3,7-Trichlorobenzo-p-dioxin và 2-Monochlorobenzo-p-dioxin Bổ sung

1,2,3,4-TeCB vào các mẫu ủ cho thấy hoạt động khử chlor của hợp chất này với sự tạo thành sản phẩm khử 1,2,3-Trichlorobenzene Tuy nhiên chua thấy sự khác biệt

về hiệu quả khử chlor yếm khí PCDDs trong hai nghiệm thức có và không có 1,2,3,4-TeCB Thành phần cộng đồng vi khuẩn trong nghiệm thức có 1,2,3,4-TeCB và không có 1,2,3,4-TeCB không cho thấy sự khác biệt về thành phần, nhưng có sự khác biệt về mật số cộng đồng vi khuẩn

viii

DANH SÁCH HÌNH

1.2 Cơ chế tạo ra sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng

2.1 Nghiệm thức không có TeCB và có TeCB với mẫu cấy 1,2,3,4-TCDD 25

2.2 Nghiệm thức không có TeCB và có TeCB với mẫu cấy 2,3,7,8-TCDD 25

2.3 Các dung dịch trích và ống Power Bead Tubes trích DNA 26

3.1 Biểu đồ sản phẩm khử chlor yếm khí 1,2,3,4-TCDD trong mẫu bùn Đội 4 29

3.2 Sơ đồ quá trình khử 1,2,3,4-TCDD của vi khuẩn trong mẫu bùn Đội 4 25

2.2 Nghiệm thức không có TeCB và có TeCB với mẫu cấy 2,3,7,8-TCDD 25

2.3 Các dung dịch trích và ống Power Bead Tubes trích DNA 26

2.1 Nghiệm thức không có TeCB và có TeCB với mẫu cấy 1,2,3,4-TCDD 25

2.1 Nghiệm thức không có TeCB và có TeCB với mẫu cấy 1,2,3,4-TCDD 25

x

MỤC LỤC

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG

NHẬN XÉT CỦA BỘ MÔN

TÓM TẮT LỊCH SỬ BẢN THÂN

LỜI CẢM TẠ

LỜI CAM ĐOAN

TÓM LƯỢC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1- LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

1.1- SƠ LƯỢC VỀ DIOXIN 3

1.1.1- Khái niệm về Dioxin 3

1.1.2- Nguồn gốc Dioxin 4

1.1.3- Tác động đối với môi trường sinh thái 5

1.1.4- Dioxin trong môi trường đất 5

1.2- Ô NHIỄM DIOXIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 6

1.2.1- Ô nhiễm Dioxin trên thế giới 6

1.2.2- Ô nhiễm Dioxin ở Việt Nam 6

1.3- MỘT SỐ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC Ô NHIỄM DIOXIN 9

1.3.1- Phương pháp xử lý hoá học, lý học và cơ học 9

1.3.2- Phân huỷ Dioxin sinh học 10

1.4- YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG TÁC ĐỘNG LÊN SỰ PHÂN HUỶ HOẶC KHỬ CHLOR YẾM KHÍ DIOXIN 16

1.4.1- Tiến trình metane hoá 17

1.4.2- Tiến trình khử sulfate 17

1.4.3- Tiến trình acetate hoá 17

xi

1.5- MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG

VIỆC PHÂN TÍCH SINH THÁI CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT 18

1.5.1- Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR- Polymerase Chain Reaction) 18

1.5.2- Phương pháp Điện di biến tính tăng cấp (DGGE- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 20

1.6- NGUYÊN LÝ CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHỐI PHỔ (GC- MS) SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DIOXIN 22

CHƯƠNG 2- PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1- PHƯƠNG TIỆN 26

2.1.1- Thời gian và địa điểm thí nghiệm 26

2.1.2- Thiết bị thí nghiệm 26

2.1.3- Các hoá chất thí nghiệm 26

2.2- PHƯƠNG PHÁP 29

2.2.1- Khảo sát ảnh hưởng của TeCB lên tốc độ khử 1,2,3,4-TCDD của cộng đồng vi khuẩn yếm khí khử chlor trong dioxin 29

2.2.2- Khảo sát ảnh hưởng của TeCB lên tốc độ khử 2,3,7,8-TCDD của cộng đồng vi khuẩn yếm khí khử chlor trong dioxin 29

2.2.3- So sánh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí trong nghiệm thức có TeCB với nghiệm thức không có TeCB 31

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1- Khả năng khử chlor yếm khí của bùn vùng ô nhiễm chất độc màu da cam 38

3.1.1- Hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4-TCDD 38

3.1.2- Hoạt động khử chlor yếm khí 2,3,7,8-TCDD 40

3.2- Ảnh hưởng của 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene lên hoạt động khử chlor yếm khí các hợp chất PCDDs 42

3.2.1- Ảnh hưởng của 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene lên sự khử chlor yếm khí 1,2,3,4- Tetrachlorodibenzo-p- dioxin 42

3.2.2- Ảnh hưởng của 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene lên sự khử chlor yếm khí 2,3,7,8- Tetrachlorodibenzo-p- dioxin 44

3.3- Ảnh hưởng của việc bổ sung 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene lên sự thay đổi cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí các hợp chất PCDDs 46

xii

CHƯƠNG 4- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

4.1- KẾT LUẬN 50

4.2- KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ CHƯƠNG

MỞ ĐẦU

Quá trình phân hủy dioxins trong tự nhiên được thực hiện chủ yếu bởi một số loài vi khuẩn chuyên biệt thuộc nhóm hiếu khí hoặc yếm khí Trong nhiều nghiên cứu đã cho

thấy, loài Dehalococcoides có thể khử yếm khí PCDD/Fs bị chlor hoá ở mức cao hơn

bởi enzyme dehalogenase để trở thành PCDD/Fs có mức chlor hoá thấp hơn 2 và sau đó

có khả năng bị phân huỷ hiếu khí trong bước tiếp theo (Mohn và Tiedje, 1992) Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã phân lập được một số loài vi sinh vật trong đất có khả năng

phân huỷ mạnh dioxins (Wittich et al, 1992; Armengaud & Timmis, 1997; Hiraishi et

al, 2001, 2003, 2004) và xác định được sự hiện diện của nhóm Dehalococcoides trong

đất/ bùn ô nhiễm PCDD/Fs có khả năng khử chlor (Bünge et al, 2003)…

1,2,3,4- Tetrachlorobenzene (1,2,3,4- TeCB) có cấu tạo hóa học như một nhánh vòng

thơm của các chất Polychlorodibenzo-p-dioxins (PCDDs) và ít độc hơn nhiều so với

dioxins nên có thể được sử dụng như chất mồi thúc đẩy hoạt động của vi khuẩn khử chlor yếm khí PCDDs Về nguyên tắc vi khuẩn yếm khí khử chlor của PCDDs cũng

có thể khử chlor của TeCB (Tina Holscher, Helmut Gorish, Lorenz Adrian, 2003; Max

M.Häggblom et al, 2004) Vi khuẩn khử yếm khí chlor trong PCDDs và TeCB đều sử

dụng các hợp chất này như chất nhận điện tử

Quá trình khử chlor yếm khí PCDDs chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường, trong đó có ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa chlor như 1,2,3,4-TeCB Mặt khác, hàm lượng PCDDs trong đất ô nhiễm thường rất thấp, nên mật số vi khuẩn khử yếm khí chlor của PCDDs không cao Do đó bổ sung 1,2,3,4- TeCB như là biện pháp làm gia tăng mật số của chúng để giúp khử chlor được tốt hơn

Chính vì vậy đề tài “Ảnh hưởng của 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene lên hoạt động khử

yếm khí Tetrachlorodibenzo-p-dioxins của cộng đồng vi sinh vật trong bùn thuộc vùng ô nhiễm chất độc da cam” được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của 1,2,3,4-

TeCB lên tốc độ khử 1,2,3,4- TCDD và 2,3,7,8- TCDD và sự thay đổi cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí Dioxins khi bổ sung 1,2,3,4-TeCB

Dioxins là tên gọi chung của một nhóm hàng trăm các hợp chất hóa học tồn tại bền vững trong môi trường cũng như trong cơ thể con người và các sinh vật khác Tùy theo

số nguyên tử Cl và vị trí không gian của những nguyên tử này, dioxins có 75 đồng phân

(polychlorodibenzofurans) với độc tính khác nhau Dioxins còn bao gồm nhóm các PCBs (polychlorobiphenyls), là các chất tương tự dioxins, bao gồm 419 chất hóa học trong đó có 29 chất đặc biệt nguy hiểm Trong số các hợp chất dioxins, TCDDs là nhóm độc nhất Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã dùng chỉ số TEFs (Toxic Equivalance Factors) để so sánh mức độ gây độc của các hợp chất Dioxins Trong nhóm Dioxins, chất độc nhất là 2,3,7,8- TCDD (2,3,7,8- Tetrachlorodibenzo-p-dioxin), nên TCDD được làm chuẩn để so sánh trong nhóm chất Dioxins

1.1.2 Nguồn gốc Dioxins

Dioxins là tạp chất được sinh ra trong quá trình sản xuất 2,4,5-T Hàm lượng dioxins trong các chất diệt cỏ rất khác nhau, ước tính số lượng dioxins chứa trong chất diệt cỏ

mà Mỹ đã dùng trong chiến tranh Việt Nam từ 170 – 1000 kg Tại các căn cứ quân sự

cũ của Mỹ trước đây là nơi tàng trữ và nạp chất diệt cỏ lên máy bay như sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng, Phù Cát có độ tồn lưu các chất độc ở mức cao và rất cao, lên tới hàng trăm nghìn ppt Đặc biệt là các sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng hàm lượng 2,3,7,8-TCDD chiếm 90% tổng độ độc, nhiều mẫu đất 2,3,7,8-TCDD > 99% tất cả độ độc của PCDD

và PCDF Các kết quả phân tích còn phát hiện một lượng lớn 2,4,5-T, 2,4-D, dichlorphenol, trichlorophenol và một số lượng nhỏ hydrocarbon thơm đa nhân trong các mẫu đất tại khu vực nhiễm độc Ngoài ra, ô nhiễm 2,4,5-T và 2,4-D ở Việt Nam còn

từ các nguồn khác

Hình 1.2: Cơ chế tạo ra sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng

hợp chất diệt cỏ 2,4,5-T

Dioxins là sản phẩm của sự phát triển công nghiệp toàn cầu Rất nhiều ngành

có thể phát sinh dioxins Ví dụ ngành công nghiệp nhựa PVC, sơn, công nghiệp giấy, dệt, công nghiệp luyện kim, nhiệt điện, sản xuất thuốc bảo vệ thực vật v.v Mức độ phát sinh dioxins phụ thuộc vào đặc điểm ngành nghề và quy mô sản xuất Đến đầu những năm 60, lượng dioxins trên toàn thế giới phát sinh từ các hoạt động sản xuất công nghiệp lên tới hàng tấn mỗi năm Dioxins cũng phát sinh trong một số hoạt động dân sinh, ví dụ các trường hợp đốt củi,

rơm rạ, đốt rác thải v.v Dioxins được hình thành khi các hợp chất có chứa Chlor bị tác động bởi nhiệt độ cao hay được xúc tác bởi các chất vô cơ Nhiệt độ tối thích là từ

300oC cho phản ứng tạo thành Dioxins (Yasuhara, 1988; Huang, 1995)

1.1.3 Tác động của Dioxins đối với môi trường và sức khoẻ con người

Dioxins có thể tích tụ trong các mô mỡ của người và gây các loại ung thư khác nhau Ở nồng độ rất thấp, dioxins làm rối loạn chức năng hormon, hệ miễn dịch Nhiễm độc nặng có thể gây các bệnh về gan, máu, ung thư và tử vong Phụ nữ có thai khi tiếp xúc

có thể gây hỏng chức năng hệ thần kinh ở phôi và gây quái thai Chất này rất độc đối với một số động vật, động vật nhiễm dioxins giảm trọng lượng 50% và chết trong vòng 2-3 tuần Độc tính cao của nó được thể hiện bởi khả năng tích lũy trong cơ thể ở liều lượng không gây tử vong nhưng lại gây ra những tổn thương lâu dài trong các bộ phận của cơ thể dẫn đến ung thư, quái thai, đột biến gen…chỉ với hàm lượng rất nhỏ

1.1.4 Dioxins trong môi trường đất

Trong môi trường sinh thái, dioxins ít hoà tan trong nước nhưng khả năng hấp thụ vào đất lại khá cao Khi xâm nhập vào đất, dioxins kết hợp với các chất hữu cơ biến thành các phức chất không hoà tan trong nước và ít bị rửa trôi, do vậy, những lớp đất có lượng mùn cao ở khu vực nhiễm độc dioxins có khả năng tích tụ dioxins nhiều nhất Dioxins có thể chuyển rời ra khỏi những nơi tích tụ ban đầu nếu khu vực đất nhiễm dioxins bị sạt lở, và theo dòng nước cuốn đi xa, tạo thành những khu vực nhiễm độc mới

Những nghiên cứu trên cơ thể thực vật cho thấy, khi bị phun rải chất độc da cam, cơ thể thực vật sẽ có những phản ứng sinh lý, như xuất hiện nhiều

u nổi trên lá, một số thay đổi khá rõ nét về hình dáng thân, cành, lá, hoa và quả, nhiều trường hợp dẫn tới rụng lá Nếu cây không mọc lá trở lại, có nghĩa là chấm dứt sự quang hợp, dẫn đến chết cây Chất độc da cam cũng gây tiêu huỷ các chất hữu cơ trong đất, dẫn đến sự giảm sút các hoạt động của vi sinh vật trong đất, gây hậu quả phá huỷ cơ cấu thành phần thổ nhưỡng và xói mòn đất Hệ động vật cũng chịu tổn thất rất nặng nề Những cá thể loài sống sót vẫn có thể tiếp tục chết nếu ăn phải thức ăn hoặc uống phải nguồn nước bị

nhiễm độc

1.2 Ô NHIỄM DIOXINS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Ô nhiễm Dioxins trên thế giới

Năm 1963, một số nạn nhân khác tại Hà Lan cũng được cho là tử vong vì dioxins; Tai nạn tại Times Beach (Missouri-Hoa kỳ) do một công ty hóa chất bán chất phế thải có chứa TCDD; Vụ nổ vào tháng 10/1976 tại nhà máy ICMESA sản xuất TCP ở Seveso, Italia (Firestone D., 1977) là một vụ tai nạn hóa học lớn trên thế giới, vụ nổ đã tạo ra một đám mây hóa học lớn, dài 5km, rộng 700m, chứa khoảng 500kg TCP và 2kg dioxins Khoảng 2.000 người bị nhiễm độc dioxins, hơn 1.100 con vật chết do bị nhiễm tới 255 ng/g TCDD Sau vụ tai nạn, người ta đã phải chôn cách ly 3 triệu m3 đất bị nhiễm TCDD

1.2.2 Ô nhiễm Dioxins ở Việt Nam

1.2.2.1 Nguyên nhân Dioxins tồn tại ở Việt Nam

Ở miền Nam Việt Nam, chất độc màu da cam và các loại thuốc diệt cỏ khác bắt đầu được thử nghiệm bởi quân đội Hoa Kỳ vào năm 1961 và được sử dụng rộng rãi với hàm lượng cao trong chiến tranh vào các năm 1967 – 1968, rồi giảm xuống và ngừng sử dụng năm 1971 dưới tên gọi là “Chiến dịch Ranch Hand”, biến Việt Nam thành một bãi thử các chất hóa học độc hại Quân đội Mỹ đã rải xuống miền Nam Việt Nam 7 chất diệt cỏ làm trụi lá cây chính (chưa kể các loại hóa chất tác động trực tiếp vào con người) Chất da cam, một hỗn hợp của 2,4-D và 2,4,5-T (hai phần bằng nhau) Trong chiến dịch này, quân đội Mỹ đã rải 72 triệu lít chất độc diệt cỏ xuống miền Nam Việt Nam nhằm phá hủy nơi trú ẩn và nguồn lương thực của quân ta Trong đó, chất độc da cam chiếm khoảng 65% tổng lượng chất diệt cỏ được sử dụng và ước tính khoảng 366

kg 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) (Stellman et al, 2003), 27% là chất

màu trắng, 8,7% chất màu xanh và 0,6% chất màu tím Tổng số lượng dioxins Việt

Nam hứng chịu là vào khoảng 370kg Tổng số diện tích đất đai bị ảnh hưởng hóa chất

là 2,63 triệu hecta Có gần 5 triệu người Việt Nam sống trong 25.585 thôn ấp chịu ảnh hưởng độc chất màu da cam

Có hai nguồn chính gây ô nhiễm Dioxins ở Việt Nam Một là từ việc phun thuốc diệt cỏ của quân đội Hoa Kỳ Hai là tại các căn cứ quân sự của Hoa Kỳ và Đồng Minh dùng để cất trữ thuốc diệt cỏ Vào năm 1970, 7500 US gallons chất độc da cam đã bị tràn đổ ra

ngoài tại căn cứ quân sự Hoa Kỳ ở Biên Hòa (Dwernychuk, 2002- Trích từ US Army

documents, 1970) Ngoài Biên Hòa, căn cứ quân sự Hoa Kỳ ở Thung lũng A Lưới (

Thừa Thiên Huế) cũng là điểm nóng ô nhiễm Dioxins Theo Dwernychuk et al (2002),

hàm lượng độc chất TCDD trong đất tại các căn cứ quân sự trước đây của quân đội Hoa

Kỳ từ 4.2 pg/g đến 360 pg/g và đều vượt quá 85.7% tổng số I- TEQ ( International- Total Toxic Equivalents), trong khi đó hàm lượng TCDD tại các vùng được phun rải chất độc khai hoang là từ không phát hiện được cho đến 15 pg/g, chiếm 50- 80% tổng

số I- TEQ và ít hơn rất nhiều so với tại các căn cứ quân sự trước đây của quân đội Hoa

Kỳ

Về điều kiện khí hậu tự nhiên của các tỉnh miền Nam Việt Nam là khí hậu nhiệt đới ẩm, nắng nóng quanh năm, nhiệt độ trung bình 25-270C, bức xạ măt trời mạnh, đây là những điều kiện thuận lợi cho quá trình quang phân hủy các chất độc sinh thái nói chung, dioxins nói riêng trong không khí, trên bề mặt đất, lá cây, v.v… Hệ thống sông ngòi dày đặc, trung bình khoảng 1 km/km2, đa số sông ngòi là ngắn, hướng chảy ra Biển Đông, năm nào cũng có mưa to gió lớn, bão lụt; đất đai, đồng ruộng bị ngập lụt mênh mông, những đặc điểm thủy văn này làm cho đất đai bị xói mòn, cuốn theo dòng nước lan tỏa đi khắp nơi và cuối cùng là chảy ra biển, các hợp chất dioxins hấp phụ mạnh vào đất cũng theo đó mà lan tỏa đi các nơi và ra biển, nồng độ loãng dần hàng năm Đây là hai yếu tố tự nhiên có tác động đáng kể đến độ tồn lưu, sự suy giảm nồng

độ và sự di chuyển của dioxins trong môi trường miền Nam Việt Nam

1.2.2.2 Tác động đối với môi trường và sức khỏe con người

 Đối với môi trường sinh thái:

Quân đội Mỹ đã rải chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và tạp chất dioxins lên khoảng 27% tổng diện tích Việt Nam Khoảng hơn 2 triệu ha rừng đã bị tác động của chất diệt

cỏ Tác dụng tức thời của chất diệt cỏ là làm cho các loài cây rừng bị trụi hết lá, rất nhiều loài cây bị chết, môi trường và sinh cảnh bị thay đổi nhanh chóng Tại các vùng

rừng bị rải lặp đi lặp lại nhiều lần, hệ sinh thái rừng bị phá hủy hoàn toàn và cho đến nay tại những nơi này chưa có cây mọc tự nhiên như khu rừng Mã Đà (Đồng Nai), thung lũng A Lưới (Thừa Thiên Huế) v.v (Võ Quý, Đặng Duy Huỳnh và ctv, 2002) Chất diệt cỏ sau khi được phun xuống có thể tích tụ không những trong đất mà còn phân tán trong lớp nước mặt, nước ngầm, không khí, tích tụ trong thực vật, gây nhiều

sự cố và hiểm họa cho môi trường và từ đó tác động dây chuyền đến con người, động thực vật và các vi sinh vật Hậu quả là làm suy thoái hệ sinh thái tự nhiên Các chất này giết chết các động vật, thực vật, vi sinh vật và nhiều loại sinh vật khác làm cho chúng không thể phục hồi lại được, làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc quần xã và chủng loại động vật, thực vật (Hoàng Anh Cung, 1993; Dinh H, 1984)

Chất độc hóa học ngấm vào trong đất, tích tụ lại trong cơ thể thực vật nên ít bị phân hủy bởi một số yếu tố như ánh sáng mặt trời, tia cực tím, nhiệt độ Các chất này tồn tại dưới dạng hỗn hợp và các yếu tố môi trường nhiều khi chưa thuận lợi cho các quá trình phân hủy sinh học tự nhiên Hiện nay, lượng chất độc hóa học còn lại trong đất rất lớn, đặc biệt là 2,4,5-T, 2,4-D, dioxins tại các “điểm nóng”- các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng, Biên hòa và Phù Cát

 Đối với con người:

Tác hại của Dioxins trên cơ thể con người được tính bằng ppt (part per trillion- picrogram- phần tỉ của milligram) Một người khỏe mạnh, chỉ cần nhiễm vài ppt là đã ảnh hưởng đến nhiều bộ phận Thời gian bán hủy của Dioxins theo ước tính là 10-12 năm Ví dụ một người ở vùng bị rải Dioxins vào năm 1970, và bị nhiễm khoảng 200ppt, thì năm 1982 (12 năm sau), số lượng này còn khoảng 100ppt 12 năm sau nữa- năm

1994, nó còn 50ppt Đến năm 2006 vẫn còn 25ppt, vẫn đủ gây bệnh ung thư và các dị tật khác

Hiện nay, ước tính có khỏang 4.8 triệu người Việt Nam bị nhiễm chất độc da cam/ dioxins, sống tập trung tại các tỉnh dọc đường Trường Sơn và biên giới với Campuchia Hàng trăm ngàn người trong số đó đã qua đời Hàng triệu người và con cháu của họ đang phải sống trong bệnh tật, nghèo khó vì di chứng chất độc màu da cam Hàng năm, đặc biệt là ở những vùng trước đây bị xử lý chất độc da cam với cường độ lớn, hàng

ngàn trẻ sơ sinh bị khuyết tật (chậm phát triển, thừa ngón tay, ngón chân) và hàng ngàn trẻ em bị ung thư

1.2.2.3 Lược sử vùng A Lưới- Thừa Thiên Huế

Theo Dwernychuk et al, 2002, thung lũng A Lưới thuộc huyện A Lưới tỉnh Thừa Thiên

Huế, cách thành phố Huế khoảng chừng 65 km theo đường chim bay, sát với biên giới Lào - Việt Đây là một thung lũng dài khoảng 30 km, rộng 2-6 km, nằm giữa dãy Trường Sơn ở độ cao hơn 600m so với mặt nước biển Diện tích thung lũng khoảng 117.000 ha, trong đó trước năm 1945 có đến 107.000 ha rừng nguyên sinh Từ năm

1966 đến 1969, quân đội Mỹ đã thả bom và rải chất độc hoá học nhiều lần, chủ yếu là chất độc da cam Trong thời gian này không một loài thực vật nào có thể sống sót Kết thúc chiến tranh đến nay, nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đã đến nghiên cứu vùng A Lưới và coi đây là một điển hình của hệ sinh thái rừng bị phá vỡ hoàn toàn bởi chất độc hoá học Diễn thế của thảm thực vật vùng A Lưới trong 30 năm qua phần nào

có thể nói lên được hậu quả lâu dài của chất độc da cam chứa dioxins lên môi trường rừng ở đây và cả các vùng khác ở miền Nam Việt Nam có điều kiện tương tự Thung lũng A Lưới hơn 10 năm sau đó hầu như không có rừng, các thân cây gỗ to thuộc nhóm

gỗ cứng đã chết khô Phần lớn các loài cây rừng gỗ mềm hơn đã bị mục nát do nắng mưa Trên nền rừng chủ yếu là các loài thực vật bậc thấp

1.3 MỘT SỐ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC Ô NHIỄM DIOXINS

1.3.1 Phương pháp xử lý hoá học, lý học và cơ học

Do khả năng gây độc và tính trơ về mặt hóa học của Dioxins làm cho việc loai bỏ chúng ra khỏi môi trường bị ô nhiễm gặp rất nhiều khó khăn Có nhiều kỹ thuật hóa lý phổ biến như: xử lý nhiệt (Thermal remediation), giảm thiểu bằng quang năng (Photo- degradation), thủy phân bằng nước siêu tới hạn (Supercritical water using hydrolysis), khử chlor với một kim loại xúc tác (Dechlorination with a metal catalyst)

Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng cho chất thải nguy hại, rác thải, kể cả các chất độc hóa học Tuy nhiên chất độc vẫn nằm trong các hố chôn lấp không được phân hủy nên các chất này có thể là nguồn ô nhiễm tiềm tàng cho môi trường và con người

Các phương pháp vật lý như quang hóa, sử dụng các tia cực tím, hay dùng áp suất cao cũng có hiệu quả Theo các kết quả công bố cho thấy rằng sử dụng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ 20W/cm3

ở nhiệt độ 200C trong 3 ngày (Sinkkonen S., Paasivirta J., 2000)

Phương pháp dechlor hóa và oxy hóa cũng được nghiên cứu áp dụng với các chất chứa clo và cả 2,3,7,8-TCDD Phương pháp này cũng cho kết quả khá tốt, thường tạo ra những hợp chất ít chlor và ít độc hơn (Bünge et al, 2003) Nhược điểm của phương pháp hóa học là không kiểm soát được sản phẩm tạo thành, các sản phẩm này thường gây ô nhiễm thứ cấp

Tuy nhiên các phương pháp trên tỏ ra hạn chế khi áp dụng ở vùng rộng lớn Từ thập niên 70 đến nay, nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật khắc phục sự cố ô nhiễm môi trường

đã được phát triển

1.3.2 Phân hủy Dioxins sinh học

Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học có thể đi theo hai hướng chính

là làm giàu sinh học và kích thích sinh học (Nguyễn Bá Hữu, 2002) Làm giàu sinh học (Bioaugmentation) là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các địa điểm ô nhiễm Kích thích sinh học (Biostimulation) là quá trình thúc đẩy sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc thay đổi các yếu tố môi trường như pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v

1.3.2.1 Cơ chế phân hủy sinh học (hiếu khí và yếm khí)

 Sự phân hủy Dioxins ở vòng thơm (hiếu khí)

Những nghiên cứu hiện nay phát hiện ra khả năng phân hủy Dioxin của các loại vi

khuẩn hiếu khí ở những Dioxins như Dibenzo-p-dioxin (DD), Dibenzofuran

(DF)…Trong cơ chế phân hủy Dioxin của những vi khuẩn hiếu khí này, sự oxy hóa các vòng thơm của Dioxin có liên quan đến aromatic hydrocarbon dioxygenase ở tại ngay bước đầu của tiến trình phân hủy Có hai cách thức chính của sự oxy hóa các vòng

thơm của Dioxin này Một là sự oxy hóa kép ở phía bên (Lateral Dioxygenation), nơi

mà một trong các vòng thơm của Dioxin bị tác động ở vị trí 1,2 phía bên góc (đôi khi ở

vị trí 2,3 hoặc 3,4) và được chuyển thành cis- dihydrodiols (hình 1.3) Một đặc điểm

hay của cách thức oxy hóa này là tạo ra hợp chất trung gian có màu vàng Cách thức thứ hai là sự oxy hóa kép ở ngay gốc (Angular Dioxygenation), xảy ra tại vị trí 4 và 4a

ngay kề cầu nối ete (Hiraishi, 2003)

Hình 1.3: Con đường phân hủy DF với cách thức oxy kép ở hai bên (A) và oxy hóa kép ở ngay gốc (B) I, DF; II, 1,2-dihydro-dihydroxydibenzofuran; III, 2,3-dihydro-2,3-dihydroxydibenzofuran;

IV, 1,dihydroxydibenzofuran; V, oxo-4-(3’-hydroxybenzofuran-2’-yl)-but-3-enoic acid; VI, hydroxy-4-(3’-oxo-3’H-benzofuran-2’-yliden)-but-2-enoic acid; VII, salicylic acid; VIII, 4,4a- dihydro-dihydroxydibenzofuran; IX, 2,2’,3-trihydroxybiphenyl; X, 2-hydroxy-6-(2-

2-hydroxyphenyl)-6-oxo-2,4-hexadienoic acid; XI, 2-oxo-4-pentenoate (Hiraishi,2003)

 Sự loại bỏ gốc halogen ( Reductive Dehalogenation) (yếm khí)

Những nghiên cứu cho thấy một vài loài vi khuẩn kỵ khí bắt buộc và không bắt buộc có khả năng loại bỏ gốc chlor của các hợp chất thơm và các hợp chất béo Sự loại bỏ gốc

halogen yếm khí được gọi là “halorespiration” hay “dehalorespiration” Một trong những phát hiện nổi bật là loài vi khuẩn Dehalococoides sp.dòng CBDB1 có khả năng

loại bỏ gốc chlor của vòng benzene (chlorobenzene dehalorespiring) cũng có thể loại bỏ

gốc chlor của các nhóm PCDDs được chọn ( Bunge et al., 2003) Nghiên cứu này tập

trung vào sự loại bỏ chlor của PCDD/Fs bởi một loài vi khuẩn đơn độc trong điều kiện

kỵ khí Dòng CBDB1 này có khả năng chuyển 1,2,3,7,8-PeCDD và 2,3,7,8-TCDD

thành các nhóm chất Dioxins ít chlor hơn (hình 1.4) (Hiraishi, 2003)

Hình 1.4: Con đường loại bỏ Chlor của 1,2,3,4- TCDD (A) và 1,2,3,7,8- PeCDD (B) của loài

Dehaloccoides.sp dòng CBDB1

Hình 1.5: Sơ đồ phân hủy 1,2,3,4- TCDD; 1,2,3,7,8- PeCDD và các sản phẩm của chúng

1.3.2.2 Các nhóm vi khuẩn tham gia các quá trình phân hủy

Vi sinh vật phân hủy Dioxins phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng các vi sinh vật

có khả năng phân hủy Dioxins tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hướng thích nghi, bằng cách thay đổi cấu trúc di truyền để hướng đến việc phân hủy Dioxins Vi khuẩn có vai trò quan trọng trong tham gia phân hủy sinh học Dioxins trong nước và trầm tích, trong khi đó nấm sợi và xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng phân hủy Dioxins và các chất ô nhiễm trong môi trường đất

Dioxins là thành phần rất độc với con người và môi trường vì vậy trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy dioxins bởi vi

sinh vật Lyama et al đã sử dụng Bacillus midousuji để phân hủy dioxins, sau 24h nuôi cấy, Bacillus midousuji đã phân hủy 34% 2,3,7,8-TCDD và sau 48h khoảng 70% dioxins đã bị loại bỏ Theo Hong et al (2002), chủng Sphingomonas sp RW1 có khả

năng chuyển hóa 2,7-DCDD và 1,2,3,4-TCDD thành 4-chlorocatechol và tetrachlorocatechol Sau đó chủng RW1 tiếp tục chuyển hóa 3,4,5,6-tetrachlorocatechol thành 2-methyoxy-3,4,5,6-tetrachlorophenol Hai chủng

3,4,5,6-Pseudonomas sp CA10 và Terrabacter sp DBF63 đều có khả năng sử dụng từ 10-35%

2,7-DCDD và 1,2,3-TrCDD với nồng độ ban đầu là 10 ppm (Habe et al, 2001)

Nghiên cứu về sự ảnh hưởng của mẫu thay thế trên sự phân hủy 210 nhóm chất của

PCDD/Fs của Schreiner et al (1997) sử dụng nhiều dòng vi khuẩn khác nhau trong đó

có loài Sphingomonas sp.dòng DSM 7135 và Ralstonia sp.dòng DSM 6708 Kết quả

cho thấy dòng DSM 7135 đã phân hủy 31% 2,3,7,8- TCDF và 15% 2,3,7,8- TCDD sau

84 ngày ủ; dòng DSM 6708 phân hủy được 64% 2,3,7,8- TCDF và 82% 2,3,7,8-TCDD trong suốt thời gian ủ Điều này cho thấy tốc độ phân hủy Dioxins của vi khuẩn phụ thuộc vào hình dạng các nhóm chất Dioxins và tốc độ này giảm khi số lượng các gốc chlor của vòng thơm gia tăng

Ngoài vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân hủy dioxins thì vi khuẩn kị khí bắt buộc, vi khuẩn kị khí không bắt buộc cũng có khả năng chuyển hóa dioxins Vi khuẩn kị khí có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ khó phân hủy chứa chlor trong đó có dioxins Rất nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng khử chlor của các hợp chất hữu cơ chứa chlor trong môi trường hoạt động của vi khuẩn khử sắt, vi khuẩn khử sunfat, và nhóm khử halogen v.v

Trong số các vi sinh vật kị khí đã nghiên cứu trong hai thập kỷ qua thì các vi khuẩn

thuộc chi Dehalococcoides được quan tâm hơn cả bởi chúng có khả năng loại khử

chlor của rất nhiều hợp chất chứa chlor như Trichlorethylene , Vinyl Chloride,

Trichlorodibenzo-p-dioxins, Polychlorinated dibenzofurans v.v Theo Bünge et al,

2003, chủng Dehalococcoides sp 195, Dehalococcoides sp CBDB1 đã được

chứng minh là có khả năng phân hủy dioxins, chủng CBDB1 đã đề khử chlor 1,2,3,4-TeCDD (46 µM ) trong 84 ngày nuôi cấy thành 2,3-DCDD và 2-MCDD

Chủng CBDB1 sử dụng chlor trong dioxins là chất nhận điện tử, từ đó loại bỏ chlor

ra khỏi phân tử dioxins Kết quả tạo ra sản phẩm ít độc hơn là 2,7-DCDD ; 2,8-DCDD

và 2-MCDD Các hợp chất này sẽ dễ bị phân hủy sinh học bởi các vi sinh vật hiếu khí

Chủng CBDB1 còn có thể sử dụng 1,2,3,7,8-PCDD là chất có độ độc là 1 tương đương

với 2,3,7,8-TCDD

Tại Việt Nam, Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã công bố chủng FDN30 có khả năng

phân hủy hiếu khí 2,3,7,8-TCDD Đây là chủng vi nấm được phân lập từ đất nhiễm

chất độc hoá học tại Đà Nẵng Sau hai tuần, chủng này đã phân huỷ 59% dioxin chứa trong môi trường nuôi cấy

1.4 YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG TÁC ĐỘNG LÊN SỰ PHÂN HỦY HOẶC KHỬ CHLOR YẾM KHÍ DIOXINS

Có một vài thông số có ảnh hưởng đến sự tồn tại và họat động của vi sinh vật trong bất

kỳ môi trường nào Một yếu tố có ảnh hưởng lớn là chất hữu cơ, một nguồn carbon chính cho các vi sinh vật dị dưỡng trong hầu hết các môi trường Các lớp đất mặt thường chứa hàm lượng hữu cơ tương đối cao và do đó có đặc tính chứa số lượng vi khuẩn cao và họat động trao đổi chất đa dạng (Konopka và Turco, 1991) Trái lại, những vùng bão hòa và chưa bão hòa bên dưới tầng mặt thường chứa hàm lượng chất hữu cơ thấp hơn và ít đa dạng hơn nên số lượng và họat động của vi sinh vật cũng thấp hơn (Coiwell, 1989; Fredrickson và ctv, 1991; Chapelle, 1993) Ngọai lệ của quy luật này là một số vùng đất bão hòa có tốc độ dòng chảy cao thì số lượng và họat động của

vi sinh vật giống như trên tầng mặt (Konopka và Turco, 1991)

Khi thiếu oxy, vật liệu hữu cơ có thể bị khoáng hóa thành CO2 do hô hấp yếm khí, mặc

dù tiến trình này ít hiệu quả so với hô hấp hiếu khí Sự hô hấp yếm khí đòi hỏi chất nhận điện tử, sử dụng của chất này phụ thuộc vào tính khả dụng và theo sau là một chuỗi tương ứng đối với ái lực điện tử của chất nhận điện tử Chất nhận điện tử theo thứ

tự giảm dần ái lực điện tử như sau: nitrate (khử nitrate), Fe(khử Fe), sulfat (khử sulfat)

và carbonate (khử metan) Các hợp chất có gắn halogen không phân hủy háo khí thì lại

có thể phân hủy một phần hoặc hoàn tòan phân hủy trong điều kiện yếm khí Thông thường dưới điều kiện yếm khí hợp chất hữu cơ bị phân hủy bởi nhóm vi sinh vật tương tác hoặc tập đoàn vi sinh vật (consortium) Mỗi cá thể trong consortium thực hiện các phản ứng chuyên biệt khác nhau mà nó dẫn đến sự khoáng hóa hoàn toàn của hợp chất (Suflita và Sewell, 1991) Young và Häggblom (1989) đã mô tả consortium này như là chuỗi thức ăn yếm khí

Hình 1.6: Dòng điện tử trong trao đổi chất yếm khí (Max M Häggblom và ctv, 2009)

1.4.1 Tiến trình methane hoá ( Methanogenesis)

Vi khuẩn sinh methane có đặc điểm chung: Tạo khí methane là sản phẩm cuối cùng của chu trình trao đổi năng lượng và sống kỵ khí bắt buộc Nguồn cơ chất chủ yếu cho các

vi sinh vật này sử dụng là hydro, acetate, methanol, trimethylamine, dimethylsulfide,…Qúa trình sinh methane ở vi khuẩn có thể coi như quá trình hô hấp

kỵ khí, trong đó chất nhận điện tử là CO2, methyl hoặc acetate Do không có khả năng

sử dụng rộng rãi các loại cơ chất khác nhau, trong tự nhiên vi khuẩn sinh methane thường phải phụ thuộc vào các loài vi khuẩn lên men vì chúng chuyển hóa đa dạng chất hữu cơ thành các acid hữu cơ, hydro, acetate Trong đó, hydro, acetate là nguồn thức ăn trực tiếp cho vi khuẩn sinh methane, còn các acid hữu cơ- sản phẩm của quá trình lên men như propionate, butyrate thì cần phải được nhóm vi khuẩn khác chuyển hóa thành

cơ chất thích hợp rồi mới đến vi khuẩn sinh methane chuyển thành khí CH4

1.4.2 Tiến trình khử sulfate ( Sulfidogenesis)

Sulfate cũng bị khử trong điều kiện kỵ khí để cho lưu huỳnh nguyên tố hay sulfide, bao

gồm hydrosulfide, do các vi khuẩn dị dưỡng như Desulfovibrio, Escherichia và

Aerobacter Những vi khuẩn khử sulfate yếm khí là những loài dị dưỡng, sử dụng

sulfate như chất nhận hydro trong oxy hóa trao đổi chất, tương tự như vi khuẩn phản nitrate sử dụng nitrite hay nitrate Cho đến nay, người ta thừa nhận rằng sự khử sulfate xảy ra trong điều kiện kỵ khí, song cũng phát hiện thấy phản ứng này xuất hiện cả ở nơi

Organic Donors

to g en es is

M eth an og

có “vết” oxy, nitrate hay các chất nhận điện tử khác, thậm chí người ta còn thấy sự khử sulfate xảy ra cả ở tầng trên, nơi tạo thành oxy của tầng quang hợp của nhóm vi sinh vật

ưa mặn tại Baja California, Mexico (D.E Canfield và D.J Des Marais, 1991) Như vậy,

sự khử sulfate là một quá trình kỵ khí không nghiêm ngặt

1.4.3 Tiến trình acetate hóa ( Acetogenesis)

Vi khuẩn tạo acetate chuyển các acid béo (như: acid propionic và butyric) và rượu thành acetate, hydro, và CO2, những chất này sẽ được sử dụng bởi nhóm vi khuẩn tạo methane Nhóm này đòi hỏi nồng độ hydro thấp để chuyển hoá các acid béo Dưới điều kiện nồng độ hydro cục bộ cao, sự tạo thành acetate giảm và chất nền sẽ chuyển thành acid propionic, butyric và ethanol thay vì methane

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG VIỆC PHÂN TÍCH SINH THÁI CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT

1.5.1 Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR- Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985 PCR là phản ứng tổng hợp dây chuyền DNA trong ống nghiệm trên cơ sở hoạt động của những chu kỳ nối tiếp nhau với sự có mặt của 2 – 3 đoạn mồi (primer) chuyên biệt PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 – 3000bp Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ các đoạn mồi đặc hiệu (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide

Phản ứng khuếch đại DNA thường được lặp lại từ 30 – 35 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau: (1)Nhiệt độ tăng lên 94 – 960C trong thời gian 1 – 2 phút để tách sợi đôi DNA ra thành 2 sợi đơn Bước này gọi là biến tính DNA (denature), nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA (2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống

để các đoạn mồi (primer) có thể gắn vào sợi đơn DNA Bước này gọi là gắn mồi (annealing), nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt

độ biến tính 500C, thường là 45 – 600C trong thời gian 1 - phút (3)Cuối cùng, các mononucleotide tự do sẽ gắn vào đuôi 3’ của primer để nối dài theo chiều 5’- 3’ ở 68 –

720C nhờ sự xúc tác của enzyme DNA polymerase Bước này gọi là kéo dài

(elongation), nhiệt độ kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase và thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại (http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR, 2008)

Hình 1.7 : Các chu kỳ của kỹ thuật PCR

Những đoạn DNA sau khi khuếch đại sẽ được quan sát dưới tia cực tím sau khi chạy điện di trong gel agarose 0.3 – 3% có chứa dung dịch ethidium bromide (Nguyễn Thị

Lang, 2002) Trước đây người ta sử dụng DNA polymerase của E Coli cho phản ứng

PCR, nhưng enzyme này rất mẫn cảm với nhiệt độ nên dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao do

đó cần phải bổ sung enzyme này vào sau mỗi chu kỳ luân nhiệt Hiện nay các nhà

nghiên cứu sử dụng Taq-polymerase thay cho DNA polymerase của E Coli vì enzyme

này hoạt động và bền với các điều kiện nhiệt độ cao Các gen rRNA của vi khuẩn có tất

cả 3 loại gen là 16S-, 23S- và 5S-rRNA Trong đó gen 16S- có khoảng 1500 nucleotide, gen 23S- có khoảng 2900 nucleotide và gen 5S chứa khoảng 120 nucleotide (quá nhỏ) nên ít được sử dụng, chỉ có gen 16S và 23S được nghiên cứu nhiều hơn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) Đặc biệt đối với 16s-rRNA được xem là các gen đánh dấu đặc sắc, chúng được sử dụng rộng rãi và thành công trong việc xác định và phân loại vi khuẩn do các chức năng của chúng ổn định Từ đó người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết hơn và chính xác hơn (Schmid và Hartmann, 2007)

1.5.2 Phương pháp Điện di biến tính tăng cấp (DGGE- Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis ) ( Boon et al., 2002)

DGGE là kỹ thuật mới nghiên cứu về sự đa dạng vi sinh Phương pháp phân tích có

nguồn gốc từ trong y học được Muyzer et al., 1993 áp dụng vào lĩnh vực vi sinh Theo

phương pháp của Muyzer et al., 1993, phân tích DGGE dựa vào sự khuếch đại PCR của

phân đoạn 16S rRNA của mẫu vi sinh đã được ly trích DNA hoặc là những dòng vi khuẩn phân lập, DNA đã được làm biến tính thành 2 chuỗi DNA bằng nhiệt độ, urea hoặc formaldehyde Sự thay đổi điện di của những phân đoạn DNA khác nhau di chuyển trong gel polyacrylamide 8%, bằng cách sử dụng hệ thống gene Bio-rad D (Bio-Rad, Hercules, Mỹ) Mẫu sau khi chạy PCR sẽ được cho vào polyacrylamide được làm

từ dung dịch biến tính biến động từ 40- 60% Chạy điện di được thực hiện trong 16 giờ

ở 60°C và dòng điện 45V Sau khi chạy điện di, gel được nhuộm trong 20 phút bằng thuốc nhuộm ethidium bromide và TAE 0,5X Mẫu sau khi nhuộm lập tức được cho vào hệ thống có chụp hình qua máy Gel Logic 1500 Imagine System Kodak

Nguyên tắc phản ứng

Để hiểu kỹ thuật DGGE có hai điểm cơ bản cần lưu ý là: Cấu trúc của DNA thay đổi như thế nào với nhiệt độ và nồng độ gây biến tính, thứ hai là sự thay đổi cấu trúc DNA ảnh hưởng như thế nào đến sự di chuyển của DNA trong gel (Riesner., 1991) Mảng của DNA của cùng một chiều dài,nhưng với trình tự khác nhau có thể được tách ra dựa trên tính di động của DNA khi di chuyển trong gel polyacrylamide có chứa hỗn hợp của ure và formamide có thể gây biến tính DNA và một tác nhân khác là nhiệt độ được tạo

ra từ gradian Wheel Với một phân tử DNA xoắn kép vài trăm bp Khi đạt tới nhiệt độ nóng chảy ™ bắt đầu nóng chảy và sự di chuyển trong gel sẽ chậm lại so với DNA mạch đơn (Muyer, 1997) Sự khác biệt về trình tự của DNA cũng làm cho chúng tan chảy tại các vị trí khác nhau trong cùng nồng độ và sẽ dừng lại tại các vị trí khác nhau trong gel

Bằng cách so sánh tính nóng chảy của các đoạn DNA bên cạnh nồng độ gel gây biến tính có thể phát hiện được các đoạn DNA đột biến (Helm, 1990) Đặt các mẫu DNA bên cạnh nhau và cho chúng biến tính cùng nhau các nhà nghiên cứu có thể dễ dàng nhận thấy sự khác biệt nhỏ nhất trong hai mẫu hoặc đoạn DNA

 Ứng dụng

DGGE của các gen mã hóa Ribosome lần đầu tiên được mô tả bởi Gerard Muyzer trở thành kỹ thuật sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh thái sinh vật PCR khuyếch đại

DNA của vi khuẩn được tách chiết từ hỗn hợp các vi khẩn trong môi trường và sử dụng đoạn mồi cụ thể đoạn gen 16SARN cho vi sinh vật nhân chuẩn trong hỗn hợp phản ứng PCR Vì tất cả các band có kích thước tương tự nhau không thể tách rời bằng điện di trong gel, tuy nhiên DGGE sẽ cho kết quả khác nhau giữa các vi sinh vật ARNs dựa trên sự khác nhau về đặc tính biến tính của DNA

Một nghiên cứu với sản phẩm khuếch đại PCR của nhóm vi khuẩn 16s ARN và biến

tính bằng DGGE cho thấy vi khuẩn Nitrosopira chiếm ưu thế và không có sự khác biệt

về thành phần, số lượng vi khuẩn trong đất tự nhiên và đất canh tác (M A Bruns et al.,

1999)

Gen 16s ARN được ly trích từ vi khuẩn trong tự nhiên và được khuếch đại bởi Saiki et

al (1988), kết quả là trong cùng một mẫu có nhiều các sản phẩm PCR thu được từ các

vi khuẩn khác nhau và được Muyzer et al., (1993) lần đầu tiên sử dụng phương pháp

DGGE phân tích sản phẩm khuyếch đại rRNA cung cấp thông tin về sự đa dạng di truyền của các cộng đồng vi khuẩn được tìm thấy xung quanh lỗ thông hơi nhiệt

Nghiên cứu vi khuẩn sinh thái thường phải lấy mẫu tại các thời điểm khác nhau trong một thời gian dài Các kỹ thuật nhân bản gen không thích hợp cho việc phân tích nhiều mẫu khác nhau DGGE có thể đồng thời phân tích nhiều mẫu khác nhau cho thấy rõ sự thay đổi về thành phần, giống loài trong quần thể vi sinh vật khi môi trường thay đổi

(Gerard Muyzer et al, 1998) Theo một nghiên cứu của Kowalchuk et al (2000), cho thấy sự thay đổi của vi khuẩn oxi hóa amonia Nitrosomonas và Nitrosopira ở môi

trường có độ pH khác nhau trong các mẫu thu tại cồn cát tại Hà Lan Một số ứng dụng

khác như: sàng lọc gen (Felske et al., 1997), nhân bản gen (Keohavong và Thilly, 1989), phân lập vi khuẩn (Santegoeds et al., 1996)

 Hạn chế

Trong thực tế, kỹ thuật DGGE cho kết quả chính xác hơn, đáng tin cậy hơn so với kỹ thuật điện di trước đây (PCR) Một số vấn đề trong kỹ thuật này là nồng độ hóa chất sử dụng trong DGGE không thể sản xuất nhiều và rất khó để thành lập gels (Westbur.,

2001), BuchholzCleven et al (1997), đã chứng minh rằng DGGE không thể tách những

đoạn rADN khác nhau từ 2-3 nucleotide hoặc theo các điều kiện biến tính đã sử dụng

Hơn nữa, DGGE chỉ có thể phân tích những đoạn DNA lên đến khoảng 500bp Điều này giới hạn chuỗi thông tin cho suy luận phát sinh loài cũng như tạo ra các mẫu dò,

DGGE không phải lúc nào cũng có thể phân tích các đọan DNA Vallayeal et al.,

(1997), cho thấy rằng DGGE không thể phát hiện gen 16S của vi khuẩn oxy hóa metane

1.6 NGUYÊN LÝ CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHỐI PHỔ (GC/MS- GAS CHROMATOGRAPHY- MASS SPECTROMETRY)

1.6.1 Tổng quan về khối phổ

Là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất

đó, dựa trên điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:

- Khối phổ kết hợp với sắc ký khí

- Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng

- Khối phổ kết hợp điện di

Sự ion hoá: Nghiên cứu các chất bằng phương pháp khối phổ, các phân tử chất nghiên cứu phải ở dạng khí hoặc hơi, phải được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp (va chạm điện tử ,bằng trường điện từ , ion hoá học, chiếu xạ bằng các photon)

Máy khối phổ: là một thiết bị dùng cho phương pháp khối phổ, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để tìm ra thành phần của nó Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion

1.6.2 Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion, kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài

Quá trình được thực hiện trong môi trường chân không Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp suất môi trường xử lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển)

Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy vi tính

1.6.3 Khối phổ kết hợp sắc ký khí (Gas Chromatography- Mass Spectrometry)

Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ (viết tắt là GC-MS) là một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí

Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas Chromatography) và Khối phổ (Mass Spectrometry) Bộ phận sắc ký là cột sắc ký (dài 30 hoặc 60m) làm bằng hỗn hợp silica và phenyl Cột càng dài thì độ nhạy càng cao, có khả năng tách các chất có thời gian lưu gần nhau càng rõ rệt Bộ phận khối phổ là đầu dò khối phổ để dò tìm phổ của các chất cần phân tích Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picrogram (10-12

gram) Cấu tạo của GC-MS: Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng chất tinh khiết và Khối phổ (MS): ) xác định định tính và định lượng

- Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống tại cửa này Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 3000C để mẫu trở thành dạng khí

- Vỏ ngoài (oven): Phần vỏ của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt Nhiệt độ của lò này dao động từ 400C cho tới 3200C

- Cột (column): Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30 mét với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này