XÁC ĐỊNH một số điều KIỆN THÍCH hợp để tạo môi TRƯỜNG tế bào xơ PHÔI gà một lớp và THỬ NGHIỆM NUÔI cấy VIRUS NEWCASTLE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ TRẦN HOÀI KHANH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ TẠO MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP VÀ THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY V

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ TRẦN HOÀI KHANH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ TẠO MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP VÀ THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY VIRUS NEWCASTLE

Luận văn tốt nghiệp Ngành: THÚ Y

Cần Thơ, 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: THÚ Y

Đề tài:

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ TẠO MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP VÀ THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY VIRUS NEWCASTLE

MSSV: 3042884 Lớp: Thú y K30

Cần Thơ, 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

  

Đề tài : « Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle » do sinh viên

Lê Trần Hoài Khanh thực hiện tại Phòng thí nghiệm Virus học, Bộ môn Thú

Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 05 năm 2009

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Cần Thơ, ngày tháng năm 2009

Duyệt Bộ môn Duyệt Giáo viên hướng dẫn

HỒ THỊ VIỆT THU

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009

Duyệt Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong bài luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình khoa học nào trước đây

Tác giả

Lê Trần Hoài Khanh

LỜI CẢM TẠ

Xin gởi lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng nhất đến Cha Mẹ, đấng sinh thành đã dạy dỗ và cho tôi ăn học đến ngày hôm nay, luôn động viên khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập

Qua thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học Cần Thơ, cũng như trong suốt quá trình thực hiện luận văn này, tôi đã được quý Thầy Cô tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu về chuyên ngành Thú Y mà tôi đang học

Xin chân thành cảm ơn đến:

- Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

- Cô Trần Thị Minh Châu (cố vấn học tập) đã dìu dắt chúng tôi trong 5 năm học qua

- Quý Thầy Cô bộ môn Thú Y đã tận tình giảng dạy, truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên ngành quý báu

- Tập thể lớp Thú Y K30 đã bên cạnh và giúp đỡ tôi trong những năm tháng trên giảng đường đại học

- Chị Nguyễn Thị Thu Trang - K27 Bộ môn CNSH, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh - đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt cho tôi những kiến thức về Công nghệ sinh học tế bào, virus để tôi hoàn thành luận văn này

- Chị Huỳnh Ngọc Trang đã tận tình chỉ dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong những ngày làm việc tại phòng thí nghiệm

- Các anh chị trong lớp Cao học Thú Y K14: anh Nguyễn Tiến Sĩ, chị Mai Trương Hồng Hạnh, chị Nguyễn Hải Ngân đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong phòng thí nghiệm

- Các quý đọc giả đã đọc, tham khảo luận văn này và góp ý cho tôi để hoàn chỉnh bài luận văn

Kính gởi đến Cha Mẹ, quý Thầy Cô, anh chị và bạn bè của tôi lời chúc sức khỏe, thành công và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc

Lê Trần Hoài Khanh

TÓM LƯỢC

Với mục đích xác định những điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi

gà một lớp phù hợp điều kiện nuôi cấy in vitro, sau đó nuôi cấy tăng sinh nguồn virus

Newcastle và khảo sát tác động của virus Newcastle trên môi trường tế bào, đề tài:

« Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle » được thực hiện từ tháng 1-2009 đến tháng 5-

2009 Chúng tôi thu được một số kết quả sau: 1) Với 4 nồng độ tế bào thử nghiệm: 3 x

105, 5 x 105, 7 x 105 và 10 x 105 tb/ml thì nồng độ 5 x 105 tb/ml cho hiệu quả tạo lớp tế bào đều và đồng nhất hơn so với hai nồng độ 7 x 105 và 10 x 105 tb/ml, nồng độ 3 x

105 tb/ml không tạo được lớp đơn 2) Khi so sánh 3 nồng độ thử nghiệm Glutamine:3%, 6%, 9% được bổ sung vào môi trường tăng trưởng EMEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào đã cho kết quả không có sự khác biệt về hình thái lớp đơn tế bào và thời gian tạo lớp tế bào giữa 3 nồng độ L-Glutamine này là như nhau qua 3 mốc thời điểm quan sát: 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ 3) Trong 2 loại thuốc nhuộm được chọn lựa để nhuộm tế bào đã nhiễm virus Newcastle thì Crystal violet cho hiệu quả khảo sát hình thái tế bào, quan sát bệnh lý tế bào (CPE) và tính liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50) tốt hơn Neutral red 4) Bằng phản ứng HA cho thấy có sự tăng sinh của virus Newcastle qua hai lần cấy truyền virus trên môi trường tế bào xơ phôi

L-gà và gây bệnh tích tế bào rõ ràng hơn

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Trang duyệt ii

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM TẠ iv

TÓM LƯỢC v

MỤC LỤC vi

Danh mục hình ix

Danh mục bảng x

Danh mục chữ viết tắt xi

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2

2.2 Cấu tạo của tế bào động vật 3

2.3 Đặc điểm của tế bào động vật nuôi cấy 4

2.3.1 Sự điều hòa trao đổi chất 4

2.3.2 Tính chất cơ học yếu 4

2.3.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng chậm 5

2.3.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi 5

2.3.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng 5

2.3.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ 5

2.3.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo 5

2.4 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 6

2.4.1 Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật 6

2.4.2 Các dòng tế bào nuôi cấy (Cell line) 6

2.4.3 Dụng cụ nuôi cấy tế bào 6

2.4.4 Một số môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 7

2.5 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật 8

2.5.1 Nhiệt độ ủ ấm 8

2.5.2 Chỗ bám (giá đỡ) 8

2.5.3 Môi trường nuôi cấy 8

2.5.4 Các thành phần khác trong môi trường nuôi cấy 9

2.6 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy 10

2.7 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật 10

2.8 Các pha trong nuôi cấy tế bào động vật 11

2.8.1 Pha ức chế (lag phage) 11

2.8.2 Pha phát triển (log phage) 12

2.8.3 Pha ổn định (stationary phage) 12

2.8.4 Pha suy giảm (decline phage) 12

2.9 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào 12

2.10 Nuôi cấy và thu nhận virus trên tổ chức tế bào 13

2.10.1 Lịch sử nuôi cấy và thu nhận virus 13

2.10.2 Định nghĩa và đặc tính chung của virus 13

2.10.3 Mối quan hệ giữa virus và tế bào vật chủ - sự nhân lên của virus 14

2.10.3.1 Giai đoạn virus hấp phụ trên bề mặt tế bào 14

2.10.3.2 Giai đoạn virus xâm nhập vào tế bào 14

2.10.3.3 Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virus 14

2.10.3.4 Giai đoạn lắp ráp, hình thành các hạt virus 15

2.10.3.5 Giai đoạn phóng thích virus ra bên ngoài tế bào 15

2.10.4 Nuôi cấy và thu nhận virus trên môi trường tế bào CEF 15

2.10.4.1 Nuôi cấy virus 15

2.10.4.2 Thu nhận virus 16

2.10.5 Các biểu hiện bệnh tích tế bào dưới tác động của virus trong môi trường tế bào lớp đơn 16

2.10.6 Virus Newcastle (NDV-Newcastle Disease Virus) 17

2.10.6.1 Hệ thống phân loại 17

2.10.6.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcastle 17

2.10.6.3 Tính chất sinh học của virus Newcastle 18

2.10.6.4 Sức đề kháng 18

2.10.6.5 Chẩn đoán virus Newcastle ở phòng thí nghiệm 19

2.10.6.6 Nuôi cấy virus Newcastle trong phòng thí nghiệm 19

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.1.1 Thời gian 20

3.1.2 Địa điểm 20

3.2 Vật liệu và hóa chất 20

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 20

3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 20

3.2.3 Các hoá chất và môi trường 21

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1 Xây dựng quy trình tạo môi trường tế bào xơ phôi gà (CEF) một lớp 22

3.4.1.1 Phương pháp tạo môi trường CEF một lớp 22

3.4.1.2 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm 23

3.4.1.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ L-Glutamine khi bổ sung vào môi trường tăng trưởng EMEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào 24

3.4.1.4 Quy trình tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 25

3.4.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập virus Newcastle trong môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 26

3.4.2.1 Phương pháp tạo nguồn virus Newcastle 26

3.4.3.2 Phương pháp nuôi cấy và thu nhận virus Newcastle trong môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 26

3.4.3.3 Sơ đồ quy trình nuôi cấy, tăng sinh và thu nhận virus Newcastle trên môi trường tế bào CEF 28

3.4.4 Phương pháp pha loãng và chuẩn độ virus Newcastle vào môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 29

3.4.4.1 Pha loãng virus 29

3.4.4.2 Chuẩn độ virus 29

3.4.4.3 Cách xác định chỉ số TCID 50 dựa vào CPE 29

3.4.5 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả tăng sinh NDV qua 2 lần cấy truyền trên môi trường CEF 30

3.4.6 Thí nghiệm 4: So sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red và Crystal violet trong quan sát CPE và tính chỉ số TCID 50 30

3.4.6.1 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Neutral red 30

3.4.6.2 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Crystal violet 30

3.4.6.3 Sơ đồ quy trình nhuộm tế bào bằng hai loại thuốc nhuộm Neutral red và Crystal violet 31

3.4.6.4 Bố trí thí nghiệm 32

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm 33 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ L-Glutamine khi bổ sung vào môi

trường tăng trưởng EMEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào 37

4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả tăng sinh NDV qua 2 lần cấy truyền trên môi trường CEF 40

4.4 Thí nghiệm 4: So sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red và Crystal violet trong quan sát CPE và tính chỉ số TCID 50 41

4.5 Xác định chỉ số TCID50 dựa vào CPE 43

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ CHƯƠNG 46

Phụ chương 1 Một số thao tác thí nghiệm 47

Phụ chương 2 Xử lý số liệu 52

Phụ chương 3 Một số hình ảnh thực hiện đề tài 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình của một tế bào động vật .3

Hình 2.2: Cấu tạo của trứng có phôi 10 ngày tuổi .3

Hình 2.3: Các loại dụng cụ nuôi cấy lớp đơn tế bào .7

Hình 2.4: Các loại dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào .7

Hình 2.5: Các môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà .8

Hình 2.6: Sự tạp nhiễm trong môi trường tế bào .11

Hình 2.7: Đường cong tăng trưởng của nguyên bào sợi người qua 3 lần cấy truyền .11

Hình 2.8: Vaccine Gumboro, vaccine dịch tả vịt được sản xuất từ nuôi cấy virus nhược độc trên môi trường tế bào CEF .12

Hình 2.9: Cấu trúc virus Newcastle .17

Hình 3.1: Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ tế bào thích hợp cho nuôi cấy .23

Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ L-Glutamine lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào .24

Hình 3.3: Sơ đồ quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp 25

Hình 3.4: Sơ đồ quy trình nuôi cấy, tăng sinh và thu nhận virus Newcastle trên môi trường tế bào CEF 28

Hình 3.5: Sơ đồ quy trình nhuộm tế bào bằng hai loại thuốc nhuộm Neutral Red và Crystal violet 31

Hình 3.6: Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red và Crystal violet .32

Hình 4.1: Biểu đồ thời gian trung bình tạo lớp tế bào với các mật độ nuôi cấy ban đầu .33

Hình 4.2: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 24 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) 34

Hình 4.3: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 48 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) 35

Hình 4.4: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 72 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) 35

Hình 4.5: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 96 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) 36

Hình 4.6: TN2 - Tế bào phôi gà sau 24 giờ nuôi cấy, 5x105 tb/ml (phóng đại 100 lần) 38

Hình 4.7: TN2 - Tế bào phôi gà sau 48 giờ nuôi cấy, 5x105 tb/ml (phóng đại 100 lần) 38

Hình 4.8: TN2 - Tế bào phôi gà sau 72 giờ nuôi cấy, 5x105 tb/ml (phóng đại 100 lần) 38

Hình 4.9: Kết quả xét nghiệm HA của các huyền dịch NDV qua các lần cấy truyền 40

Hình 4.10: Tế bào CEF nhiễm virus sau 7 ngày, nhuộm với 2 loại thuốc nhuộm (phóng đại 100 lần) 41

Hình 4.11: Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm virus sau 5 ngày (trạng thái tươi, phóng đại 200 lần) 42

Hình 4.12: Tế bào CEF nhiễm virus sau 7 ngày nhuộm với 2 loại thuốc nhuộm (phóng đại 200 lần) 42

của các huyền dịch NDV qua các lần cấy truyền 40 Bảng 4.4: So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi , nhuộm Neutral red và nhuộm

Crystal violet .43 Bảng 4.5: Kết quả xác định CPE để tính chỉ số TCID50 qua nhuộm Crystal violet 43

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CEF Chicken Embryo Fibroblast

MEM Minimum Essential Medium

E’MEM Eagle Minimum Essential Medium

D’MEM Dulbecco – Modified Eagle Medium

HEPES Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid

UV Ultraviolet light

CPE Cytopathic Effect

PFU Plaque Forming Unit

TCID50 Tissue Culture Infective Dose 50

PD Proportional distance

NDV Newcastle Disease Virus

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Solution

FBS Foetal Bovine Serum

CAM Chorioallantoic membrane

MTTT Môi trường tăng trưởng

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Động vật cũng như nhiều loài sinh vật đa bào khác được cấu tạo từ những loại mô khác nhau Các mô cấu tạo từ những tế bào cùng loại Như vậy, tế bào là đơn vị cấu trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống

Thuyết tế bào của Schleiden và Schwann (1838) đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào thực vật và động vật Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển và ứng dụng của tế bào với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học

Trên thế giới, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn dài tìm hướng đi về kỹ thuật, tìm môi trường tương ứng và đang bước vào giai đoạn sản xuất theo quy mô công nghiệp ở giai đoạn vừa và nhỏ Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật vẫn chưa phát triển mạnh Do vậy, việc nghiên cứu phát triển

kỹ thuật này là điều cần thiết

Tế bào phôi gà là loại tế bào dễ bám vào bề mặt dụng cụ nuôi cấy và môi trường không cần nồng độ huyết thanh cao như các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ phôi chuột, các dòng tế bào ung thư ) (Phan Kim Ngọc, 2002) Vì vậy, việc sản xuất

tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam là hoàn toàn có khả năng thực hiện được nhằm phục vụ nhiều lĩnh vực, nhiều mục đích khác nhau như: chẩn đoán các bệnh do virus gây ra, phân lập, tăng sinh nguồn virus để sản xuất vaccine gia cầm trong tình hình hiện nay, cũng như làm nền tảng cho những nghiên cứu sau này

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, với điều kiện của phòng thí nghiệm virus học,

Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

« Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle »

Mục đích của đề tài :

- Xác định những điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp như nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu, nồng độ L-Glutamine

- Phân lập, tăng sinh virus Newcastle trên môi trường tế bào

- So sánh các loại thuốc nhuộm tế bào trong quan sát bệnh lý tế bào và tính liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy

CHƯƠNG 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Nuôi cấy tế bào động vật

Năm 1838, Schleiden và Schwann công bố thuyết tế bào, đặt nền tảng cho nhiều nhà khoa học nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc ban đầu Đến năm 1885, Roux nhận xét rằng tế bào phôi gà có thể giữ ở trạng thái sống trong dung dịch muối sinh lý bên ngoài cơ thể, đây là ghi nhận đầu tiên về khả năng nuôi tế bào động vật

Sau đó năm 1907, Harrison lần đầu tiên tách thành công tế bào thần kinh ếch để làm thí nghiệm nuôi chúng ngoài cơ thể Ông đã quan sát được dưới kính hiển vi sợi thần kinh hình thành từ tế bào chất của tế bào thần kinh

Một nghiên cứu có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật thuộc về Carrel (1913), ông chứng minh tế bào có thể sống lâu ngày trong điều kiện

in vitro nếu được thường xuyên bổ sung chất dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng

Năm 1952, Gey tạo được dòng tế bào liên tục từ tế bào ung thư biểu bì của người Không lâu sau đó năm 1955, Earle lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống nhu cầu

dinh dưỡng thiết yếu của tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro và phát hiện rằng tế

bào động vật có thể phân chia được trong một hỗn hợp chứa các dinh dưỡng có phân

tử lượng nhỏ và có sự hiện diện của một lượng huyết thanh nhất định

Những nghiên cứu sau này của Puck (1956), Temin và Rubin (1958), Hayflick (1961), Ham (1965), Kohler và Milstein (1975), Sato (1976), Wigler (1977) rất thành công trong những lĩnh vực cơ bản sau (trích dẫn Nguyễn Ngọc Thanh Thảo, 2007):

- Tìm ra được nhiều môi trường thích hợp cho sự phát triển nhiều loại mô khác

nhau của người và động vật trong điều kiện in vitro

- Hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô động vật

- Tạo ra được một số đột biến có ích

Những nghiên cứu liên tục từ năm 1950 đến nay đã có ý nghĩa thực tế rất lớn trong

kỹ thuật sản xuất vaccine cho người và động vật

Nuôi cấy tế bào xơ phôi gà (CEF: Chicken Embryo Fibroblast)

Năm 1929, Fell dùng những mảnh cơ quan phát triển từ phôi gà để nghiên cứu sự phát triển của xương và khớp trong ống nghiệm

Vài năm sau, Goodpasture và cộng sự (1931) bắt đầu lưu ý khả năng dùng cho nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn từ sự phát triển của tế bào phôi gà

Trong một nghiên cứu khác của Earle và cộng sự (1943) cho rằng trong khi mô của phôi gà có thể cung cấp sự đa dạng về loại tế bào trong nuôi cấy sơ cấp thì mô của loài gặm nhấm có nhiều thuận lợi trong việc tạo dòng liên tục (trích dẫn Võ Thị Minh Thư, 2002)

2.2 Cấu tạo của tế bào động vật

Các bào quan gồm: (1) hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, (4) túi tiết, (5) mạng nội chất sần, (6) bộ máy Golgi, (7) khung tế bào, (8) mạng nội chất trơn, (9) ty thể, (10) không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể

Cấu tạo của trứng gà có phôi 10 ngày tuổi - nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào CEF

Phôi

Hình 2.2: Cấu tạo của trứng có phôi 10 ngày tuổi

2.3 Đặc điểm của tế bào động vật nuôi cấy

2.3.1 Sự điều hòa trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu trong từng tế bào Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ thể sống

Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme và hệ dịch quanh tế bào, chúng còn

bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp

Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao

đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết quả:

- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào

- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào

Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự hiểu biết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh để tính trạng đó được biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy

Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển của chính tế bào đó trong cơ thể Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in vitro là

những tác động trực tiếp Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ chịu tác động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp Do đó, mọi tác động của

môi trường đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần tạo ra sự hài hòa

trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy

2.3.2 Tính chất cơ học yếu

Tế bào động vật không có thành tế bào, chúng chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác trong mô Mặt khác, kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10 µm, lại không

có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu Do đó, trong quá trình nuôi cấy cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007)

2.3.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng chậm

Do đặc điểm di truyền ở tế bào động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2003) Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất thường thì cơ thể đó sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý

Sau một số lần cấy truyền nhất định, vài dòng tế bào sẽ ngừng phân chia và biểu hiện sự hóa già Những dòng tế bào này được gọi là dòng tế bào có hạn (finite cell line); tế bào CEF là một dòng tế bào có hạn và số lần phân chia của tế bào CEF là từ 16-18 lần (Christman, et al., 2006) Những dòng tế bào khác có thể phân chia không giới hạn (hoặc trở thành bất tử như tế bào ung thư) được gọi là dòng tế bào liên tục (continued cell line) Chúng có thể xảy ra tự phát, do sử dụng thuốc, bức xạ hay virus

có chủ định

2.3.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường (sau khi được thuần hóa) có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào giá đỡ (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007)

2.3.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng

Đây là cơ chế kìm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (Negative feed – back), là cơ chế

ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất nào đó, được thực hiện bởi chính sự gia tăng của nồng độ chất này trong môi trường Do đó, việc thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cấy là cần thiết Trong phòng thí nghiệm, cơ chế kìm hãm ngược còn có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí chết hàng loạt (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007)

2.3.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ

Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng Do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ từ virus hoặc khi những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xảy ra hiện tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai (như tế bào Hybridoma, được lai giữa tế bào bình thường có khả năng sản xuất kháng thể (a normal antibody-producing cell) và tế bào ung thư tủy (a myeloma cell)

2.3.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo

Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải được bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ được những đặc tính riêng của nó

Bằng cách sử dụng nitơ lỏng (-1960C) để trữ , tế bào động vật vẫn duy trì được đặc tính của chúng trong thời gian rất dài Phương pháp này được áp dụng nhiều ở các ngân hàng giống động vật trên thế giới

Khi sử dụng, tế bào động vật được tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản

Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trường, nhạy cảm với kim loại Trong quá trình phát triển ở môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone

2.4 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật

2.4.1 Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật

Nuôi cấy sơ cấp (Primary culture)

Nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa được tách ra từ

mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002) Việc nuôi cấy bắt đầu khi các tế bào được tách ra từ mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp

Các tế bào nuôi cấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng là thế hệ con của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau Ở giai đoạn này, tế bào có hình thái gần mô cha

mẹ nhất

Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture)

Đây là hình thức cấy truyền từ tế bào sơ cấp Tách rời các tế bào từ bình nuôi cấy bằng enzyme (tương tự enzyme dùng khi tách tế bào để nuôi cấy sơ cấp, thường sử dụng trypsine), enzyme này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất Ngay khi tế bào được tách rời, enzyme được bất hoạt nhờ môi trường nuôi cấy (có chứa huyết thanh), huyền phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới

2.4.2 Các dòng tế bào nuôi cấy (Cell line)

Dòng tế bào liên tục (Continued cell line, established cell line): là dòng tế bào

nuôi cấy qua nhiều thế hệ trong điều kiện in vitro và có thể duy trì khả năng phân bào

trong một thời gian dài mà không thay đổi đặc tính Ví dụ: tế bào Hela (tế bào ung thư

cổ tử cung người), tế bào Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)…

Dòng tế bào giới hạn (Finite cell line, temporary cell line): là dòng tế bào chỉ có

khả năng sống trong điều kiện nuôi cấy ở một thời gian giới hạn Đây là các dòng tế bào bình thường (không phải tế bào ung thư) Ví dụ: tế bào CEF (tế bào xơ phôi gà)

2.4.3 Dụng cụ nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture): thường sử dụng các đĩa microplate, đĩa

petri, bình Roux (flask) Các dụng cụ được chọn tùy vào số lượng tế bào, bản chất môi trường nuôi cấy, giá thành và thói quen của người sử dụng

Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture): nuôi trong bình có cánh quạt xoay từ

(Spinner flask) hoặc bình lắc Erlenmeyer Trong đó tế bào được giữ trạng thái huyền phù trong môi trường

2.4.4 Một số môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà

Môi trường MEM (Minimum Essential Medium): là môi trường cơ bản được bổ

sung muối Earle, các thành phần khác như amino acid không thiết yếu, L-Glutamine, vitamine đảm bảo cho sự phát triển của tế bào, cần bổ sung 5 – 10 % huyết thanh vào môi trường

Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi

trường tối thiểu do H.Eagle thiết lập, là môi trường chứa nồng độ cao các amino acid (không có L-Glutamine) và vitamine, chứa kháng sinh Kanamycin, cần bổ sung thêm

5 – 10 % huyết thanh khi nuôi cấy tế bào

Hình 2.3: Các loại dụng cụ nuôi cấy lớp đơn tế bào

Các loại đĩa microplate Bình Roux (T-flask)

(http://catalog2.corning.com/Lifesciences/images/costar_small/erlenmeyer2&spinnerflask.jpg)

Bình Erlenmeyer

Hình 2.4: Các loại dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào

Spinner flask

Môi trường D’MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium): là môi trường

E’MEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và một số vitamine cao gấp 4 lần, bổ sung thêm glucose để nuôi được nhiều loại tế bào hơn

2.5 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật

Một điều kiện thích hợp là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho phép tế bào tồn tại trong nuôi cấy Nó cho phép các tế bào ở số lượng ít tăng số lượng thông qua sự phân chia cũng như mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng như trong cơ thể Để có điều kiện sống này, cần cung cấp cho tế bào nhiệt độ thích hợp, chất bám tốt và điều kiện nuôi cấy chuẩn xác

2.5.1 Nhiệt độ ủ ấm

Nhiệt độ thích hợp là nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể vật chủ mà tế bào được tách

ra Với động vật máu lạnh, nhiệt độ thường thay đổi từ 18-250C, hầu hết động vật hữu nhũ đòi hỏi nhiệt độ từ 36-370C Phạm vi nhiệt độ này được đảm bảo bằng nhiệt kế và

tủ ấm phải được kiểm tra thường xuyên

2.5.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả năng

phát triển của tế bào Môi trường nuôi cấy chia làm hai loại:

- Môi trường tự nhiên: gồm huyết thanh động vật, nước ép bào thai và dung dịch muối đệm (như dung dịch Hanks)

Hình 2.5: Các môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà

- Môi trường tổng hợp: tổng hợp nhiều thành phần, tương đối đầy đủ dưỡng chất cho sự sống và phát triển của tế bào (như các môi trường MEM, EMEM, D’MEM) Bên cạnh những đòi hỏi dinh dưỡng cơ bản, môi trường nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH, áp suất, các khí thiết yếu (O2 và CO2) Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy gồm amino acid (cung cấp N), carbohydrate (cung cấp C), khoáng (tạo hệ đệm và duy trì áp suất thẩm thấu), vitamine (yếu tố vi lượng quan trọng trong hoạt động sống của tế bào) và protein (quan trọng nhất là các yếu tố tăng trưởng hiện diện trong huyết thanh có vai trò kích thích sự phân bào)

2.5.4 Các thành phần khác trong môi trường nuôi cấy

- L-Glutamine: cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào Glutamine được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon (Reitzer,

+ Cung cấp nhân tố tăng trưởng kích thích tế bào tăng trưởng và phân chia

+ Kích thích sự phục hồi do các tổn thương tế bào khi cấy truyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsine tránh các enzyme gây tổn thương tế bào + Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

+ Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ

Huyết thanh được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là huyết thanh bê (sử dụng nhiều nhất), huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh người (sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào của người) Tuy nhiên, huyết thanh làm tăng giá thành nuôi lên rất nhiều Ngoài ra, huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau cũng như chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt Do đó, cần chọn loại huyết thanh phù hợp

- Các chất đệm: góp phần kiểm soát và tránh sự thay đổi pH đột ngột Tùy vào từng loại tế bào, khi chúng phát triển càng nhanh thì càng sinh nhiều lactic acid làm

pH môi trường giảm, do đó cần bổ sung chất đệm Có 2 hệ đệm thường dùng: hệ đệm

CO32-/HCO3- (NaHCO3) và hệ đệm hữu cơ như HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid) Đệm NaHCO3 điều chỉnh lượng CO2 hòa tan trong môi trường, thường được sử dụng khi dùng tủ ấm kiểm soát CO2 cung cấp từ 2-10 % CO2 Đệm HEPES là loại đệm lưỡng cực, có khả năng điều chỉnh pH môi trường nuôi cấy theo cả hai hướng acid và bazơ, do đó giữ pH môi trường trong khoảng 7.0 – 7.4

Đệm không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp một hệ thống tốt để các tế bào có thể chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) giữ ổn định pH

2.6 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy

Để đánh giá trạng thái sức khỏe của tế bào nuôi cấy thường dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và thực hiện chức năng đặc biệt

- Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) dễ xác định nhưng ít sử dụng do khó đưa ra kết luận từ những quan sát trực tiếp (xem tươi), nó không thể hiện một số lượng hay đo lường chính xác nào Do đó, để xác định trạng thái tế bào, có thể nhuộm tế bào bằng các loại thuốc nhuộm để xác định vấn đề bất thường Các loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red, Crystal violet được sử dụng Chúng bắt màu các tế bào sống, Neutral red bắt màu lysosome (Finter,1969), Crystal violet bắt màu DNA, protein và các mảng

tế bào (Renault, et al., 1991)

- Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển, tỷ lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy Dựa vào đó có thể thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyết thanh…) tốt hơn cho tế bào

- Năng suất che phủ là đặc điểm dựa trên phương pháp ước lượng phần trăm tạo lớp tế bào từ các tế bào đã phát triển bám vào cơ chất che phủ diện tích nuôi cấy Số lượng các tế bào phát triển đặc trưng cho khả năng tồn tại và tỷ lệ phát triển, kích thước lớp tế bào đặc trưng cho năng suất che phủ

- Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thường khó quan sát và

đo lường nhất, được xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dịch

2.7 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật

Sự tạp nhiễm trong nuôi cấy tế bào có hai loại chính là nhiễm hóa học và nhiễm sinh học

- Nhiễm hóa học: khó phát hiện, nó gây ra bởi nhiều tác nhân như: endotoxin, ion kim loại hoặc thuốc tẩy hóa học, những chất này không thể nhìn thấy được

- Nhiễm sinh học: nấm, vi khuẩn phát triển nhanh, có thể thấy biểu hiện trong môi trường tế bào, thay đổi pH hoặc làm đục mờ môi trường nuôi cấy Tuy nhiên hai dạng khác của nhiễm sinh học là mycoplasma và virus thì không dễ phát hiện và đòi hỏi những phương pháp xác định đặc biệt

- Ngoài ra trong môi trường tế bào nuôi cấy còn lẫn các loại tế bào khác, làm dòng

tế bào không đồng nhất do trong quá trình tách và xử lý mô lẫn các mô khác trên cùng

cơ thể

Hai yêu cầu chính để tránh tạp nhiễm: 1) Đảm bảo vô trùng tốt trong phòng thí nghiệm khu vực làm việc: hạn chế ra vào vấy nhiễm, bật tia UV (Ultraviolet light) khử trùng dụng cụ và tủ nuôi cấy, 2) Môi trường, dụng cụ phải được tiệt trùng, cất giữ và sắp xếp hợp lý: môi trường nuôi cấy được lọc qua màng lọc 0,22 µm milipore filter, dụng cụ nuôi cấy phải hấp vô trùng (autoclave) trước khi sử dụng Sử dụng kháng sinh

và kháng nấm cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy tế bào có thể hạn chế phần nào

vi khuẩn, nấm

2.8 Các pha trong nuôi cấy tế bào động vật

2.8.1 Pha thích nghi (Lag phage)

Đây là pha đầu tiên, nó phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần, mật độ, trạng thái ban đầu của tế bào…Pha này xảy ra sớm, không tăng về số lượng tế bào (số lượng

tế bào có thể giảm)

Hình 2.7: Đường cong tăng trưởng của nguyên bào sợi người qua 3 lần cấy truyền

(http://enews.agu.edu.vn/uploads/imgposts/nbs13.jpg)

Môi trường tế bào bị mờ do nhiễm khuẩn Môi trường tế bào nhiễm nấm

Hình 2.6: Sự tạp nhiễm trong môi trường tế bào

(Hình ảnh được chụp tại phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và

sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần thơ)

Nếu mật độ và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dài hơn

2.8.2 Pha phát triển (Log phage)

Sau khoảng thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng Trong chẩn đoán, thường sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển)

2.8.3 Pha ổn định (Stationary phage)

Mật độ tế bào không tăng, số tế bào chết bằng tế bào sinh trưởng Sự sinh trưởng của tế bào hạn chế do: 1) Hết dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, 2) Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể ức chế sự phát triển của tế bào, 3) Tế bào đã phủ kín trên chất nền nên không còn chỗ bám và không thể sinh sản được nữa

2.8.4 Pha suy giảm (Decline phage)

Số lượng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm

2.9 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào

- Phục vụ cho các nghiên cứu về tế bào động vật: sinh lý và sinh hóa tế bào, tương tác giữa tác nhân gây bệnh và tế bào, tác dụng của thuốc đối với tế bào, tiến trình và

sự hóa già và những nghiên cứu về dinh dưỡng

- Nghiên cứu virus học: đây là ứng dụng cơ bản và sớm nhất của nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào được sử dụng rộng rãi trong định danh và phân lập virus (Isolation), cách thức virus xâm nhập và phát triển trong cơ thể

- Khả năng nhân lên của virus trong môi trường tế bào động vật được sử dụng trong điều chế vaccine, bao gồm vaccine bại liệt, dại, viêm gan siêu vi B, sởi…đối với ngành chăn nuôi, sản xuất vaccine Gumboro, đậu gà, dịch tả vịt Các chủng virus cường độc được nuôi cấy, nhân lên và cấy truyền nhiều lần trên môi trường lớp đơn tế bào phôi gà, các chủng virus trở nên nhược độc với cơ thể ký chủ, sử dụng môi trường

tế bào chứa virus nhược độc này để điều chế vaccine.Vaccine sản xuất từ tế bào có ưu điểm là độ tinh khiết và đơn vị kháng nguyên cao vì thế cho đáp ứng miễn dịch sớm

và hiệu giá kháng thể đạt được cao

Hình 2.8: Vaccine Gumboro, vaccine dịch tả vịt được sản xuất từ nuôi cấy virus

nhược độc trên môi trường tế bào CEF

- Xét nghiệm hiệu quả sử dụng của các loại thuốc: các tế bào nuôi cấy được sử dụng riêng hay kết hợp với các xét nghiệm trên cơ thể động vật để nghiên cứu hiệu quả của dược phẩm, hóa chất mới đối với sự tồn tại và phát triển của các loại tế bào khác nhau

- Nghiên cứu ung thư: các tế bào ung thư có thể phát triển trong điều kiện nuôi cấy Người ta sử dụng hóa chất, virus và phóng xạ làm biến đổi các tế bào nuôi cấy bình thường thành các tế bào ung thư, từ đó nghiên cứu những nhân tố gây ra sự biến đổi Nghiên cứu tế bào ung thư cung cấp các hệ thống xét nghiệm để xác định phương pháp và thuốc điều trị thích hợp cho từng bệnh ung thư khác nhau

- Sử dụng tế bào ở dạng mô và cơ quan thay thế

- Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy:

+ Sản xuất interferon (IFN) từ tế bào động vật Interferon do tế bào tiết ra khi bị virus tấn công có tính chất kháng virus và kháng khối u

+ Sản xuất các protein có giá trị trong y học và thương mại, bao gồm kháng thể đơn dòng, hormone, insulin…

Ngoài ra, công nghệ nuôi cấy tế bào còn ứng dụng cho các lĩnh vực chẩn đoán di truyền, kỹ thuật di truyền và liệu pháp gen

2.10 Nuôi cấy và thu nhận virus trên tổ chức tế bào

2.10.1 Lịch sử nuôi cấy và thu nhận virus

Năm 1913, ba nhà khoa học là Steinhardt, Israeli và Lambert đã chỉ ra rằng virus vaccine có thể tồn tại vài tuần trong giác mạc thỏ

Đến năm 1925, Parker và Nye cấy virus vaccine vào những mẫu thỏ thí nghiệm, sau đó nuôi chúng trong nguyên sinh chất

Kỹ thuật màng đệm cũng đã được dùng để nghiên cứu virus gây bệnh đậu mùa từ gia cầm vào năm 1931

Năm 1946, Beverrige và Burnet đã mô tả được quá trình nuôi cấy virus và những

ký sinh nội bào bắt buộc trong phôi gà

Vào năm 1947, Enders, Weller và Robbins đã làm thí nghiệm về sự tăng trưởng của virus quai bị trên mô gà và bắt đầu sử dụng penicillin trong môi trường nuôi cấy

để ngăn sự nhiễm khuẩn

Một năm sau đó (1948), Enders, Weller và Robbins chỉ ra rằng virus bại liệt có thể

được nuôi cấy in vitro mà không cần sự có mặt của mô thần kinh

2.10.2 Định nghĩa và đặc tính chung của virus

Định nghĩa: Lwoff (nhà virus học nhận giải Nobel năm 1965) đã định nghĩa: “A

virus is a virus“ (Virus là virus), để nhấn mạnh tính chất đặc biệt của virus, nó khác hẳn với bất kỳ một loại cơ thể sống nào đã biết trong giới động vật, thực vật và vi sinh vật: virus có kích thước hiển vi, ký sinh nội bào và có khả năng gây bệnh (trích dẫn Phạm Văn Kim, 2000)

Các đặc tính chung của virus:

- Virus có kính thước vô cùng nhỏ, từ hàng chục đến hàng trăm nm

- Virus không có cấu tạo tế bào như các vi sinh vật khác

- Thành phần hóa học đơn giản, bao gồm protein và nucleic acid

- Không có khả năng sinh sản trong môi trường dinh dưỡng tổng hợp

- Sống ký sinh nội bào bắt buộc

- Một số virus ký sinh tế bào động vật và thực vật có khả năng tạo tinh thể

2.10.3 Mối quan hệ giữa virus và tế bào vật chủ - sự nhân lên của virus

Virus tự nó không sinh sản như các sinh vật khác Virus cần xâm nhập vào bên trong tế bào ký chủ và chỉ đạo tế bào ký chủ tạo ra các virus mới, đây gọi là sự tái sản (Replication) của virus Quá trình này được thực hiện qua các giai đoạn (Võ Thị Minh Thư, 2002):

2.10.3.1 Giai đoạn virus hấp phụ trên bề mặt tế bào

Sự hấp phụ virus trên bề mặt tế bào có thể kéo dài từ 10-60 phút tùy theo loại virus

và hệ tế bào Sự hấp phụ virus này không được toàn vẹn do một lượng virus bị vô hoạt bởi nhiệt độ

Sự hấp phụ virus phụ thuộc vào các thụ thể (receptor) trên bề mặt tế bào, thường

có mặt khoảng 300-500 trên một tế bào vật chủ, do chúng chứa các chất hóa học đặc hiệu, có thể là mucoprotein, mucopolysaccharide, lipoprotein, glucoprotein mà chúng quyết định sự hấp phụ virus có tính chất chọn lựa Ngoài ra sự hấp phụ virus còn phụ thuộc vào lực hút tĩnh điện giữa các phân tử trên bề mặt vỏ virus và các thụ thể tế bào, nồng độ các cation (Ca2+, Mg2+) và độ pH trong môi trường

2.10.3.2 Giai đoạn virus xâm nhập vào tế bào

Ở các virus động vật, phương pháp đồng vị phóng xạ kết hợp với kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã cho thấy cơ chế xâm nhập của virus vào tế bào

Đối với Myxovirus, vỏ ngoài protein được giữ lại trên bề mặt tế bào cảm thụ và sau

đó nucleic acid xâm nhập vào tế bào Các Myxovirus chứa emzyme neuraminidase,

một số virus khác chứa enzyme phosphatase, catalase, có khả năng phá hủy màng tế bào thành từng lỗ, giữ vai trò quan trọng trong sự xâm nhập virus vào tế bào cũng như thoát ra khỏi tế bào sau này Ngoài ra, ở một số virus động vật khác còn có cơ chế xâm nhập khác gọi là ẩm bào (Pinocytosis)

2.10.3.3 Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virus

Là một ký sinh vật nội bào bắt buộc, virus tận dụng một cách tối đa nguồn vật liệu của tế bào vật chủ để tổng hợp nên những thành phần của bản thân mình, từ đó nhân lên thành nhiều bản

Trước khi tổng hợp các thành phần của virus có một giai đoạn chuẩn bị Trong giai đoạn này virus ức chế bộ máy di truyền của tế bào vật chủ và tổng hợp các enzyme đặc thù của virus Quá trình tổng hợp DNA của virus diễn ra mạnh, lúc đầu DNA của virus được thành lập nhanh chóng và chậm lại vào cuối quá trình Vật liệu để tổng hợp

DNA của virus được lấy từ nguồn tế bào chủ và tiếp sau đó là giai đoạn tổng hợp vỏ protein của virus

2.10.3.4 Giai đoạn lắp ráp, hình thành các hạt virus

Giai đoạn kết thúc sự nhân lên và tái sản của virus là sự lắp ráp các thành phần của virus tạo thành các hạt virus hoàn chỉnh (virion) và chúng thoát ra khỏi tế bào vật chủ

Ở virus Newcastle, các vật liệu mới sau khi được tổng hợp khuyếch tán từ các địa điểm tổng hợp (nhân, ribosome) đến rìa tế bào Chúng va chạm một cách ngẫu nhiên

và xảy ra sự trùng hợp giữa chúng Quá trình tự lắp ráp tạo nên các hạt virus một cách

tự phát

2.10.3.5 Giai đoạn phóng thích virus ra bên ngoài tế bào

Đây là giai đoạn kết thúc cho chu kỳ nhân lên nội bào của virus Sự phóng thích virus tiến hành một cách ồ ạt hay từ từ, theo hai cơ chế sau:

+ Cơ chế vỡ tung: dưới tác dụng phá hủy màng của các enzyme neuraminidase, lysozyme, nhân và tế bào vỡ tan Virus thoát ra ồ ạt gần như cùng một lúc khỏi tế bào

Trường hợp này thấy ở các Myxovirus

+ Cơ chế chọc thủng: màng nhân và màng tế bào bị đục thủng thành lỗ do enzyme của virus tiết ra Từ các lỗ đó, virus thoát ra từ từ từng hạt một làm cho thời gian phóng thích kéo dài, một lượng virus mới còn lưu lại trong tế bào một thời gian

2.10.4 Nuôi cấy và thu nhận virus trên môi trường tế bào CEF

2.10.4.1 Nuôi cấy virus

Virus sống ký sinh nội bào bắt buộc, do đó đặc tính chung của tất cả các loại virus

là không thể phát triển trên môi trường nhân tạo Tùy từng loại virus và đối tượng gây nhiễm của nó mà ta dùng các phương pháp nuôi cấy riêng biệt, nhưng chỉ nuôi chúng trên tổ chức tế bào sống Bao gồm:

+ Nuôi cấy trên động vật cảm thụ

+ Nuôi cấy virus trên phôi gà đang phát triển

+ Nuôi cấy virus trên tổ chức tế bào

Trong đó, nuôi cấy virus trên môi trường tế bào CEF là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi để phân lập, định danh và chuẩn độ virus Ngoài ra phương pháp này còn được dùng có hiệu quả để nghiên cứu phản ứng huyết thanh và sử dụng làm môi trường điều chế vaccine

Tách tế bào CEF từ phôi gà 9 – 10 ngày tuổi cho vào môi trường dinh dưỡng và để

ở nhiệt độ thích hợp thì tế bào sẽ sống và bắt đầu phân chia, sử dụng môi trường tế bào này để nuôi cấy virus gây bệnh cho người và động vật

Muốn có tế bào CEF một lớp trước hết dùng enzyme trypsine phá vỡ mô liên kết giữa các tế bào và tách chúng ra thành tế bào riêng rẽ dưới tác động cơ học (khuấy từ) Sau đó quay ly tâm với dung dịch muối đệm để loại hết trypsine Lấy huyền dịch tế bào đã trypsine hóa trộn với môi trường tăng trưởng (Growth medium) cho vào các

bình Roux, đĩa petri hoặc đĩa microplate Đặt chúng vào trong tủ ấm CO2 vài ngày, các tế bào sẽ mọc dính chặt vào đáy bình hay giếng và tạo thành một lớp tế bào Dùng một lượng huyễn dịch virus pha loãng trong môi trường pha loãng virus, cấy vào bình Roux, đĩa petri hay đĩa microplate sao cho vừa đủ ướt một lớp tế bào rồi đặt trở lại trong tủ ấm khoảng 45-60 phút cho virus hấp phụ lên bề mặt tế bào, sau đó đem

ra bổ sung môi trường duy trì (Maintenance medium) vào lớp tế bào

Tùy thuộc vào từng loại virus, số lượng virus được cấy và loại tế bào được cấy mà thời gian nhân lên của virus khác nhau Để phát hiện sự nhân lên của virus trong tế bào, người ta có thể dùng kính hiển vi soi ngược quan sát sự hủy hoại lớp tế bào do virus gây ra, có thể sử dụng phương pháp xem tươi hoặc nhuộm tế bào bằng các loại thuốc nhuộm bắt màu với các thành phần tế bào (Crystal violet bắt màu DNA, protein

và các mảng tế bào, Neutral red bắt màu lysosome, ) Ngoài ra, việc soi tế bào để tìm hiểu quá trình gây bệnh tế bào, tiêm dịch nuôi cấy tế bào cho động vật cảm thụ để quan sát triệu chứng bệnh tích hoặc dùng một số xét nghiệm cũng xác định được sự hiện diện, nhân lên và hoạt lực của virus trong tế bào

2.10.4.2 Thu nhận virus

Việc thu nhận virus được tiến hành sau khi virus đã nhân lên nhiều trong môi trường tế bào làm phá hủy lớp tế bào, gây ra các biểu hiện bệnh tích (CPE) trên tế bào Thông thường virus sau khi được cấy truyền trên ba lần sẽ cho hiệu quả thu hoạch virus tốt hơn

Dịch tế bào nuôi cấy có virus được đem đông ở -800C rồi giải đông, tiếp tục như thế ba lần để đảm bảo sự bong tróc hoàn toàn lớp tế bào và sự phóng thích virus ra khỏi tế bào là nhiều nhất Đem dịch tế bào - virus ly tâm bỏ cặn và sử dụng phần nước trên cho các thí nghiệm hoặc trữ đông ở -200C hoặc - 800C

2.10.5 Các biểu hiện bệnh tích tế bào dưới tác động của virus trong môi trường

tế bào lớp đơn

Với nhiều loại virus, sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoái hóa của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất đặc trưng Những biến đổi có tính chất đặc trưng gọi là hiệu ứng bệnh lý tế bào CPE (Cytopathic Effect) hoặc các ổ

tế bào bị hoại tử PFU (Plaque Forming Unit ) Mỗi ổ tế bào bị hoại tử hay mỗi vệt tan

tế bào gọi là một đơn vị hoại tử, có thể đánh giá được khối lượng virus gây nhiễm bằng số đơn vị hoại tử xuất hiện mà trước đó đã cố định virus bằng môi trường duy trì (5% FBS) có bổ sung agarose và nhuộm bằng Crystal violet (hoặc Neutral red)

Căn cứ vào CPE khi quan sát trên kính hiển vi soi ngược, có thể đánh giá được kết quả nuôi cấy virus CPE có các đặc trưng sau (Mehedi, et al., 2002):

- Tế bào co tròn (Rounding of infected cells), nguyên sinh chất mất, chỉ còn nhân

- Tạo nên sự dung bào (Cytolysis), tế bào co tròn, nguyên sinh chất mất, nhân vỡ Hình thành các ổ hoại tử tế bào (plaques)

- Tạo nên các cầu nối giữa các tế bào (Intracytoplasmic bridge connecting those clusters), giữa tế bào lành và tế bào bị nhiễm có nhiều cầu nối, tạo thành từng đám tế bào (Clustering of infected cells)

- Tạo nên các hợp bào (Syncytium): các tế bào hợp chung lại một màng có nhiều nhân, hình thành các tế bào khổng lồ (syncytia)

- Tạo các tiểu thể bao hàm (Inclusion body) trong nhân, trong nguyên sinh chất

2.10.6 Virus Newcastle (NDV-Newcastle Disease Virus)

2.10.6.1 Hệ thống phân loại

Virus thuộc họ Paramyxoviridae, giống Avulavirus, loài Newcastle disease virus Virus gây bệnh Newcastle là một Paramyxovirus và trong thời gian dài được coi là một Avian Paramyxovirus duy nhất Tuy nhiên gần đây, một loạt Avian

Paramyxovirus khác được phát hiện Có 9 serotype đã được xác định ký hiệu từ

PMV1 đến PMV9 NDV thuộc PMV1

2.10.6.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcastle

Paramyxovirus là một loại virus đa hình thái, ở dạng hình cầu có kích thước

khoảng 100-500nm, ở dạng hình sợi có kích thước chiều ngang khoảng 100nm với chiều dài thay đổi Hình thái của virus biến đổi theo nồng độ muối của môi trường sống; quan sát dưới kính hiển vi điện tử, ở trong nước mảnh virus có hình tròn và có dạng hình sợi kéo dài trong dung dịch muối

Bộ gen là một phân tử RNA, một chuỗi âm có trọng lượng phân tử khoảng 5x106dalton, chiếm 5% trọng lượng của tiểu thể virus Nucleocapsid có dạng đối xứng xoắn với đường kính 18nm và khoảng cách vòng xoắn 5-6nm, được bao bọc bởi một lớp áo ngoài (envelope)

Virus Newcastle chứa ít nhất 6 protein đặc hiệu; trong đó có hai kháng nguyên bề mặt là protein haemagglutinin-neuraminidase (HN) và protein fusion (F), bốn kháng nguyên nằm bên trong là protein polymerase (L), protein nucleocapsid (N), protein phosphoprotein (P) và protein matrix (M)

Hình 2.9: Cấu trúc virus Newcastle

2.10.6.3 Tính chất sinh học của virus Newcastle

Virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu haemagglutination (HA) Đặc tính gây ngưng kết hồng cầu là do sự liên kết giữa protein với các thụ thể có trên

bề mặt hồng cầu Tính chất này và sự ức chế đặc hiệu ngưng kết hồng cầu Haemagglutination inhibition (HI) bởi kháng huyết thanh là một công cụ quan trọng trong chẩn đoán bệnh Newcastle Hồng cầu gà thường được dùng trong phản ứng HA, nhưng virus có thể gây ngưng kết hồng cầu của các loài lưỡng thê, bò sát và chim Kháng nguyên HN có chứa haemagglutinin và neuraminidase Enzyme

neuraminidase có mặt ở tất cả các thành viên của nhóm Paramyxovirus, enzyme này

có tác dụng làm tách dần các hồng cầu đã bị ngưng kết Còn kháng nguyên F gắn liền với sự phản ứng của virus đối với các tế bào đích và kháng thể trung hòa Các kháng nguyên HN và F, khi mới tạo thành chưa có hoạt tính và nó chỉ thể hiện hoạt tính sau khi bị phân cắt bởi các protease của tế bào chủ

Virus Newcastle và các Paramyxovirus khác có thể gây dung huyết hồng cầu hoặc

dung hợp (Fusion) các tế bào khác bởi cùng một cơ chế Sự gắn virus vào thụ thể trong quá trình tái sản (Replication) được tiếp theo bởi sự dung hợp vỏ virus với màng

tế bào và điều này dẫn đến hòa nhập 2 hay nhiều tế bào tương tự như sự hình thành tế bào khổng lồ (Syncytial formation)

Khả năng gây bệnh đối với gà, phôi gà: mặc dù các chủng virus Newcastle khá đồng nhất về tính kháng nguyên nhưng lại rất khác nhau về khả năng gây bệnh Khả năng này thay đổi từ những chủng gây ra thể quá cấp với tỷ lệ chết 100% đàn gà đến những chủng hoàn toàn không gây bệnh khi chúng lan truyền trong điều kiện tự nhiên Khả năng gây bệnh lệ thuộc phần lớn vào độc lực và tính hướng của virus gây nhiễm Các yếu tố khác như tuổi, tình hình sức khỏe, trạng thái miễn dịch cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết, hoặc triệu chứng lâm sàng của gà (Nguyễn Trường Giỏi, 1999)

2.10.6.4 Sức đề kháng

Virus có sức đề kháng tương đối yếu Trong thịt thối rữa, phân, xác chết, virus không thể tồn tại quá 24 giờ Trong điều kiện khô ráo, virus có thể sống trong nhiều tháng Nhiệt độ thấp có thể bảo quản virus trong thời gian dài, ở 1 – 20C virus có thể tồn tại trong 3 tháng, ở -200C virus có thể tồn tại trong 1 năm Virus trong phôi gà bệnh được bảo quản ở trạng thái khô, lạnh có thể giữ được tính gây bệnh trong 2 năm Trong tủy xương, thịt được giữ lạnh, virus còn độc lực trong 6 tháng

Ở nhiệt độ bình thường, trong nước sinh lý virus còn sống sau 3 tháng nhưng virus

dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao

Virus dễ dàng bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng như crezyl 5%, NaOH 2% Một số hóa chất như formol làm vô hoạt virus nhưng không làm thay đổi tính kháng nguyên của virus

Sự bền với nhiệt: Spalatin và Hanson (1976) đã chứng minh có sự thay đổi về tính bền với nhiệt của các chủng virus Newcastle và tính chất này đã được áp dụng trong nghiên cứu dịch tễ học

2.10.6.5 Chẩn đoán virus Newcastle ở phòng thí nghiệm

Phân lập trên phôi gà 9-11 ngày tuổi bằng đường tiêm xoang niệu mô hay nuôi cấy virus Newcastle trên môi trường tế bào CEF

Khi phôi chết thì lấy nước trứng làm phản ứng huyết thanh học như HA, HI, phản ứng trung hòa virus, phản ứng miễn dịch huỳnh quang

2.10.6.6 Nuôi cấy virus Newcastle trong phòng thí nghiệm

+ Trên động vật

Chuột trắng thường được dùng để tiêm truyền virus Newcastle Virus được tiêm vào não chuột, sau khi virus thích nghi trên não, chuột trắng có triệu chứng bại liệt và chết nhanh chóng Não thỏ cũng được sử dụng để tiêm truyền virus Newcastle, khi đã thích nghi trên não thỏ, virus Newcastle không có khả năng gây bệnh cho gà Sau 21 lần truyền qua thỏ, những gà con mẫn cảm không mắc bệnh và được miễn dịch đối với virus cường độc

+ Trên phôi trứng

Có thể nuôi cấy tất cả những chủng virus Newcastle dễ dàng trong phôi gà Hầu hết các kỹ thuật tiêm mà người ta biết đều gây nhiễm phôi trứng, bằng cách tiêm vào xoang nhung niệu ở chỗ gần phôi nhất Sự nhân lên của virus nhanh ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thấp, tốc độ nhân lên tùy thuộc vào khả năng gây bệnh của chủng Phôi tiêm virus có bệnh tích xuất huyết đặc hiệu dưới da, ngoài ra phôi còn có bệnh tích viêm phổi nặng và dị hình thủy tinh thể, ống thần kinh

+ Trong môi trường tế bào

Trong môi trường tế bào phôi gà nuôi cấy virus Newcastle, sự thu hoạch virus tăng khi nhiệt độ tăng (36 giờ khi gây nhiễm), tốt nhất là ở nhiệt độ 420C (Hanson và Brandley, 1955)

Việc nuôi cấy virus Newcastle trên môi trường tế bào cho phép phân tích những hiện tượng nội tế bào Giai đoạn tiềm ẩn của virus trong môi trường tế bào là 2-3 giờ; sau khi gây nhiễm 1-2 giờ người ta thấy có một sự gia tăng hoạt tính kết hợp bổ thể và ngưng kết hồng cầu; sự nhân lên của virus thường đi đôi với sự phá hủy tế bào (Franklin, 1958)

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Trứng gà thả vườn mua từ các nông hộ Quận Cái Răng – TP Cần Thơ và ấp trong máy ấp đến khi có phôi 9 đến 10 ngày tuổi

Newcastle disease virus (NDV): nguồn virus Newcastle chủng cường độc

(Velogenic NDV) từ Công ty thuốc Thú y Trung ương 2 (NAVETCO)

3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ

Kéo lớn, kéo nhỏ, kẹp

Phểu lọc thủy tinh, vải gạc

Đĩa Petri đường kính 9-10 cm

Becher nhỏ 20 – 50 ml, 250ml

Ống đong các loại

Hộp xốp

Ống ly tâm falcon loại 15 ml, 50 ml

Lame và lamelle, các tube nhỏ (Eppendorf)

Đầu lọc 0,22 µm, 0,45µm (Milipore filter)

Ống nghiệm, cá từ

Pipette 1ml, 2ml, 5ml, pipetteman, micropipette, pipettet-aid

Đầu cone 100 µl, 1 ml

Đĩa nuôi cấy microplate 96 giếng, 24 giếng (Nunc A/S, Denmark)

Buồng đếm Neubauer (Haematocytometer, Marienfeld, Germany)

- Thiết bị sử dụng

Máy ảnh kỹ thuật số CANON A560

Máy ấp trứng (Dengenkiki Co., Ltd)

Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd)

Tủ ấm CO2 (CO2 Incubator, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd)

Water bath (As One, Japan)

Cân phân tích (Sartorius AG, Germany)

Máy hấp autoclave (Sturdy Industrial Co Ltd)

Máy lắc (Vortex, VELP Scientifica s.r.l, Italy)

Tủ sấy (Memmert GmbH + Co.KG)

Tủ lạnh -20oC, -80oC, 40C

Kính hiển vi soi ngược (Inverted microscope, OLYMPUS Tokyo, Japan)

Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh (Hermle Labortechnik GmbH)

Máy ly tâm Haematocrit (Micro Haematocrit Centrifuge, Kokusan Corporation Tokyo, Japan)

Máy ly tâm tube nhỏ (Ultra Centrifuge, Sigma, Japan)

Máy khuấy từ (Corning stirrer)

3.2.3 Các hoá chất và môi trường

Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý

Trypsine (Difco, USA)

EDTA (Dojindo Co., Ltd)

Đệm DPBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)

Trypan blue (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)

Neutral red (Division of the Matheson Company, Inc.)

Crystal violet (Kanto Chemical Co., Inc.)

Formalin

Môi trường MEM (Gibco BRL., Grand Land, NY, USA)

Môi trường EMEM (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)

FBS đã bất hoạt ở 56oC, 30 phút (huyết thanh bào thai bê - foetal bovine Gibco BRL., Grand Land, NY, USA)

serum-Penicillin và Streptomycin (Invitrogen, UK)

Môi trường duy trì: môi trường EMEM + 5% FBS + Glutamine 3% + HEPES 1M + NaHCO3 7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5µg/ml

Môi trường pha loãng virus: EMEM + Glutamine 3% + HEPES 1M + NaHCO37% + 100 IU/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5µg/ml