CHẨN đoán BỆNH VIÊM não NHẬT bản TRONG hội CHỨNG rối LOẠN SINH sản tại TRẠI CHĂN NUÔI HEO tập TRUNG ở VĨNH LONG và AN GIANG

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRONG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẬP TRUNG Ở VĨNH LONG VÀ AN GIANG” Mục tiêu của đề tài: X

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

PHẠM MINH THƯ

CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRONG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẬP TRUNG Ở VĨNH LONG VÀ AN GIANG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ THÚ Y

Cần Thơ, tháng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

PHẠM MINH THƯ

CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRONG

HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẬP

TRUNG Ở VĨNH LONG VÀ AN GIANG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ THÚ Y

Giáo Viên Hướng Dẫn ThS Hồ Thị Việt Thu

Cần Thơ, tháng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Cần Thơ, ngày tháng năm 2007 Cần Thơ, ngày tháng năm 2007

Duyệt Bộ môn Duyệt Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2007 Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CẢM TẠ

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu



Xin chân thành cảm ơn:

Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Quý Thầy, Cô Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình dạy dỗ em trong suốt thời gian học tại trường

Các anh, chị trong Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, các cô, chú, anh chị ở các trại heo đã tận tình giúp đỡ tôi trong việc tiến hành thí nghiệm

Các bạn lớp Thú Y K28 đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin kính gởi đến quý Thầy, Cô, người thân và bạn bè tôi lời chúc sức khỏe, và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

TRANG TỰA i

TRANG DUYỆT ii

LỜI CẢM TẠ iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

TÓM LƯỢC viii

CHƯƠNG I : ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG II: CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) 2

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

2.2.1 Tình hình nghiên cứư ngoài nước .2

2.2.2 Tình hình nghiên cứư trong nước 2

2.3 Tác nhân gây bệnh 3

2.3.1 Phân loại virut 3

2.3.2 Đặc điểm hình thái 3

2.3.3 Sức đề kháng 4

2.3.1 Đặc tính nuôi cấy 4

2.3.5 Đặc tính kháng nguyên của virut VNNB 5

2.3.6 Đặc tính ngưng kết hồng cầu 5

2.4 Dịch tể 5

2.4.1 Phân bố địa lý 5

2.4.2 Phân bố bệnh theo mùa 5

2.4.3 Nhân tố trung gian truyền bệnh 5

2.4.4 Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên 6

2.4.5 Sinh bệnh học 6

2.5 Miễn dịch học 7

2.6 Triệu chứng và bệnh tích 8

2.6.1 Triệu chứng 8

2.6.2 Bệnh tích 8

2.7 Các phương pháp chẩn đoán 9

2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 9

2.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 9

2.7.3 Xét nghiệm huyết thanh học 11

2.8 Phòng và trị bệnh… .13

2.8.1 Trị bệnh…… .13

2.8.2 Phòng bệnh 13

CHƯƠNG III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.1.1 Thời gian… .14

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 14

3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi 14

3.2 Phương tiện và phương pháp tiến hành thí nghiệm 14

3.2.1 Vật tư và thiết bị 14

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.3 Các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm 15

3.3 Xử lý số liệu ……… .23

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 24

4.1 Tình hình chăn nuôi trại tập trung 24

4.1.1 Điều kiện môi trường xung quanh 24

4.1.2 Chuồng trại…… 25

4.1.3 Biện pháp phòng trừ muỗi 25

4.1.4 Vệ sinh chuồng trại 25

4.1.5 Tiêm phòng vaccine 26

4.2 Kết quả chẩn đoán bệnh VNNB trong hội chứng RLSS 27

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 31

5.1 Kết luận……… .31

5.2 Đề nghị ……… 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO ………… 32

PHỤ CHƯƠNG……… .38

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BHK_21 : tế bào thận chuột đất vàng

dNTP : deoxyNucleic Acid DXN : Dịch xoang ngực ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 : Mối liên hệ giữa độ dài từ gáy đến khấu đuôi 7 Bảng 3.1 : Cặp mồi dùng trong phản ứng RT_PCR 22 Bảng 3.2 : Thành phần cho 1 phản ứng RT_PCR ( kit Titan-one-tube,Roche) 22 Bảng 4.1 : Qui trình tiêm phòng 26 Bảng 4.2 : Kết quả kiểm tra kháng thể kháng virut VNNB ở heo nái

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình cấu trúc hạt virut Flavivirus 3

Hình 2.2: Cấu trúc của virut VNNB 4

Hình 2.3: Muỗi Culex triaeniorhynchus 6

Hình 2.4: Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên 6

Hình 3.1: Kết quả phản ứng HI 18

Hình 3.2:Các mẫu huyết thanh sau khi cho cơ chất 20

Hình 3.3:Các mẫu huyết thanh sau khi ngừng phản ứng bằng H2SO4 20

Hình 4.1: Điều kiện môi trường xung quanh trại Phước Thọ_Vĩnh Long 24

Hình 4.2: Điều kiện môi trường xung quanh trại Vĩnh Khánh_An Giang 25

Hình 4.3: Tỷ lệ nái dương tính với xét nghiệm ƯCNKHC và MAC_ELISA 28

Hình 4.4: Tỷ lệ nhiễm virut VNNB trên nái sẩy thai và nái đẻ thai chết heo con chết ……… .28

Hình 4.5: Heo con có triệu chứng thền kinh 29

Hình 4.6: Tích nước dưới da 29

Hình 4.7: Tích nước xoang ngực 29

Hình 4.8: Ứ nước ở não………… .29

Hình 4.9: Tỷ lệ nhiễm virut trên DXN của thai chết lưu, thai sẩy và heo con yếu ớt, có triệu chứng thần kinh chưu bú sữa đầu 30

Hình 4.10: Kết quả phát hiện đoạn RNA đặc hiệu của virut VNNB bằng kỹ thuật RT_PCR……… 31

Hình 4.11 : Tỷ lệ mẫu dương tính với xét nghiệm RT _PCR 32

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TÓM LƯỢC

Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho người và động vật Trong đó heo, chim cư trú là ổ chứa virut quan trọng nhất và muỗi là vectơ truyền bệnh Qua trung gian muỗi, bệnh đã lây truyền sang người và gây tử vong với tỷ lệ rất cao Heo bị nhiễm bệnh không có biểu hiện bệnh lý nhưng đối với nái mang thai bị nhiễm, sẽ gây rối loạn sinh sản với những biểu hiện như: đẻ thai khô, thai chết, heo con yếu ớt có biểu hiện thần kinh Ngoài heo ra thì tất cả các loài động vật khác đều mẫn cảm vời bệnh như: trâu, bò, dê ,cừu…

Nhằm khẳng định virut VNNB là một trong những nguyên nhân gây rối loạn sinh sản trên heo nái tại các trại chăn nuôi heo tập trung ở Vĩnh Long và

An Giang Đề tài “Chẩn đoán viêm não Nhật Bản trong hội chứng rối loạn sinh sản tại trại chăn nuôi heo tập trung ở Vĩnh Long và An Giang” được

thực hiện trong thời gian từ 4/2006 _ 7/2007 gồm có:

- 82 mẫu huyết thanh bao gồm 28 mẫu của heo nái có hiện tượng sẩy thai;

54 mẫu của nái đẻ thai chết hoặc heo con chết

- 52 mẫu dịch xoang ngực gồm có 50 mẫu dịch xoang ngực thai chết lưu,

2 mẫu dịch xoang ngực thai sẩy; 7 mẫu huyết thanh

- 60 mẫu não gồm có 9 mẫu não heo con, 2 mẫu não của thai sẩy, 49 mẫu não của thai chết lưu

Chúng tôi thu được kết quả:

- Tỷ lệ nái dương tính với xét nghiệm HI là 82,99% và dương tính với xét nghiệm MAC_ELISA là 1,22%

- Tỷ lệdương tính với xét nghiệm HI của dịch xoang ngực của thai chết và huyết thanh của heo con chưa bú sữa đầu là 22,03 %

- Bằng kỹ thuật RT_PCR đã phát hiện ra hệ gen của virut trên thai bệnh và heo con chưa bú sữa đầu là 8,33%

Qua kết quả trên đã khẳng định được virut viêm não Nhật Bản là một trong những nguyên nhân gây rối loạn sinh sản trên heo và làm giảm năng suất sinh sản của heo nái

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG I

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh VNNB là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho người và động vật

Trong đó heo và chim cư trú là ổ chứa virut quan trọng và muỗi Culex là trung

gian truyền bệnh, bệnh có thể lây sang người đặc biệt là trẻ em với tỷ lệ tử vong rất cao.Theo tổ chức y tế thế giới thì hằng năm có đến 50.000 người mắc bệnh, nhưng có đến 10.000 người tử vong Bệnh gây rối loạn sinh sản trên nái mang thai với những biểu hiện như: đẻ thai khô, thai chết với nhiều kích thước khác nhau, heo con sinh ra yếu ớt có triệu chứng thần kinh

Hiện nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc trị, vaccine phòng bệnh trên heo chưa được sử dụng Việc kiểm soát nhân tố truyền bệnh là muỗi gặp nhiều khó khăn Đặc biệt là đối với vùng ĐBSCL nơi có diện tích trồng

lúa lớn đây là điều kiện thuận lợi cho muỗi Culex sinh sống và ngành chăn

nuôi heo đang phát triển Vì vậy bệnh viêm não Nhật Bản không những là mối

đe dọa cho con người mà còn gây thiệt hại cho nền kinh tế của người chăn nuôi rất lớn

Để có biện pháp phòng bệnh hiệu quả và kịp thời thì việc tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh và có biện pháp chẩn đoán bệnh viêm não Nhật Bản một cách

chính xác hơn là điều hết sức cần thiết Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài:

“CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRONG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẬP TRUNG Ở VĨNH LONG VÀ AN GIANG”

Mục tiêu của đề tài:

Xác định vai trò của virut viêm não Nhật Bản trong hội chứng rối loạn sinh sản trên heo bằng chẩn đoán huyết thanh học đẻ phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virut viêm não Nhật Bản trên nái có biểu hiện rối loạn sinh sản, thai bệnh, heo con chưa bú sữa đầu và bằng kỹ thuật RT_PCR phát hiện đoạn gen đặc hiệu của virut

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG II

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não nhật bản (Japanese encephalitis)

Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm cấp tính do virut gây ra và muỗi là vectơ truyền bệnh Hầu hết các loài gia súc đều mẫn cảm với bệnh bao gồm ngựa, bò, cừu, ngỗng,heo Những động vật khác như: thỏ, chuột, bồ câu (Chang và ctv, 1984), chó, vịt, gà (Huang, 1982), chim hoang (Kaul, 1976) và một số loài bò sát (Doi, 1983).Trong đó heo được coi là động vật cảm nhiễm nhất Bệnh gây ra rối loạn sinh sản đối với nái mang thai Heo nái bị nhiễm bệnh trong thời gian mang thai không có triệu chứng lâm sàng tuy nhiên có những hiện tượng bất thường như: thai khô có những kích thước khác nhau, heo con chết trước khi sinh với những biểu hiện phù thủng ở da và não, heo con sinh ra yếu ớt và có những triệu chứng thần kinh (Chu và Joo, 1933)

Nhân tố trung gian truyền bệnh chủ yếu là loài muỗi Culex Ở Việt Nam là

Culex triaenniorhynchus (Đỗ Quang Hà và ctv, 1964) Ở Mã Lai và Singapo

là Culex gelidus, Culex vishnui, Culex psedovishnui…Ngoài ra còn có các loài muỗi khác cũng truyền bệnh như Aedes sinensis, Aedes sinensis, Adees

japanica. Muỗi cái có thể truyền virut từ đời mẹ sang đời con

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Mùa hè năm 1693 ở , ở một làng bên bờ biển Thái Bình Dương của Nhật Bản đã xảy ra ổ dịch trên người và ngựa Sau này được xác định là bệnh VNNB

Bệnh lần đầu tiên được mô tả trên người ở Nhật Bản năm 1871, sau đó bệnh luôn tái diễn có định kỳ, những trận dịch lớn được ghi nhận vào năm

1940_1941, A.K.Sublatze, P.A.Pettiseva phân lập virut VNNB ở Liên Xô

cũ và xác định ký chủ trung gian truyền bệnh là các giống muỗi Culex và

Acdes

1942 Sabin và đồng nghiệp đã sản xuất vaccine đông khô và vaccine bất hoạt bằng formol từ huyễn dịch não chuột 10% đã gây nhiễm với chủng Nakayama

4/1979, theo báo cáo WHO bệnh VNNB gây nguy hiểm cho người và gây bệnh thiệt hại nghiêm trọng cho heo sơ sinh

2.2.2Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 1956, Caubet và P Netter viện Pesteur Nha Trang qua kết quả xét nghiệm huyết thanh học đã kết luận là 20% người Việt Nam tiếp xúc với virut VNNB

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Năm 1964, virut được phân lập từ 23 mẫu não của trẻ em dưới 12 tuổi có hội chứng viêm não; từ 28 mẫu máu của trẻ em dưới 10 tuổi được chẩn đoán lâm sàng là viêm màng não, viêm não, tăng lâm ba cầu; từ 23 não của 14 loài chim hoang dã; ngoài ra 16 trường hợp được phân lập từ muỗi Từ những chứng cứ trên tác giả đã khẳng định được sự lưu hành virut VNNB ở miền Bắc

và sự tồn tại của virut trong các ổ chứa virut trong tự nhiên (Đỗ Quang Hà và Đoàn Xuân Mượn)

Từ năm 1978-1995, các trung tâm nghiên cứu đã phân lập được 29 chủng virút VNNB, trong đó có 10 chủng trong máu bệnh nhân, 7 chủng từ não tủy bệnh nhân và 12 chủng từ muỗi ở các địa phương ngoại thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp, Sông Bé, Đồng Nai, Long An (Hạ Bá Khiêm, 1998)

Năm 2001, Nguyễn Đa Phúc_Chi cục Thú Y Vĩnh Long, qua kết quả kiểm tra huyết thanh học tỷ lệ nhiễm virut VNNB trên heo tại các hộ nuôi cá thể (81,11%) cao hơn trại nuôi heo tập trung (65%) ( Nguyễn Đa Phúc, 2001) Nghiên cứu điều tra huyết thanh học trên đàn heo sinh sản tại các trại chăn nuôi tập trung tỉnh Cần Thơ, kết quả tỷ lệ dương tính là 72,64 % và nhóm dương tính có tỷ lệ rối loạn sinh sản là 45,88% cao hơn nhóm heo âm tính 22,22% (Lê Thị Thu, 2005)

2.3 Tác nhân gây bệnh 2.3.1 Phân loại virut

Virut VNNB là một loại Flavivirus, được xếp vào họ Togavividae thuộc nhóm B của Arbovirrus Nhưng hiện nay virút này được xếp vào chi

Flavivirus , là chi duy nhất của họ Flavividae Chi Flavivirus có trên 60 loại

nhưng chỉ có 3 loại là có ý nghĩa trong thú y là: virut gây bệnh VNNB, virut gây bệnh Louping và virut gây bệnh Weselsbron

3432 gốc acid amin Virut có 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc Những protein cấu trúc bao gồm glycoprotein E của vỏ (54kD), protein không

có glycosylate M vỏ (8kD) và protein capsid C (14kD) Protein vỏ E có chứa epitope gây đáp ứng kháng thể trung hòa Protein E có ít nhất là 8 epitope, một

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

epitope ở vị trí quyết định trên protein biểu thị tính đặc hiệu của virút (Kimura – Kuroda và Yasui, 1986) Glycoprotein E trên bề mặt hạt virút tham gia chủ yếu vào việc nhận diện thụ thể của tế bào, gây cảm ứng tạo kháng thể trung hòa, gây đáp ứng miễn dịch tế bào và là kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu Những protein không cấu trúc NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5

Hình 2.2 Cấu trúc của virut VNNB (http://www.ias.ac.in/meetings/annmeet/70am_talks/svrati/img44.html) 2.3.3 Sức đề kháng

Virut chịu đựng kém với nhiệt độ: ở 60oC virut bị bất hoạt sau 10 phút, ở

70oC virut bị bất hoạt sau 5 phút Ở nhiệt độ -70oC thì giữ nguyên độc lực Ngoài ra virut còn dễ dàng bất hoạt bởi các chất sát trùng như: ether, chloroform, sodium desoxycholate cũng như các loại enzyme phân giải protein hoặt lipid Virut sống thích hợp ở pH=8,5

Virut tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh ở -20oC và ngoài ra còn là loại gây nhiễm với môi trường nuôi cấy

2.3.4 Đặc tính nuôi cấy

Virut có thể nhân lên nhanh chóng trên nhiều loại tế bào một lớp nguyên phát cũng như một số dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật có vú bao gồm tế bào thận khỉ (tế bào Vero), tế bào thận chuột đất vàng con ( tế bào BHK) –21,

và từ muỗi Aedes Ngoài ra virut cũng có thể nhân lên ở tế bào sợi phôi gà,

màng nhung niệu của phôi gà và chuột bạch

Virut từ mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên các dòng tế bào cảm nhiễm như C6/36, vero, BHK-21 Phương pháp này kém nhạy hơn là phương pháp tiêm trực tiếp vào muỗi sống Nhưng có ưu điểm là dễ thực hiện hơn, rẻ tiền

và cùng lúc làm được nhiều bệnh phẩm

 Sự nhân lên của virut VNNB trong tế bào

• Sự hấp phụ và xâm nhập Virut sẽ tiếp xúc với tế bào vật chủ tương ứng tại thụ thể đặc biệt trên bề mặt tế bào Trong quá trình này các men lizozim có tác dụng hoà tan peptidolican ở một bộ phận của thành tế bào Sau đó xâm nhập vào màng tế bào, vỏ ngoài của virut sẽ được phân hủy để giải phóng nucleocapxit

Phiên mã RNA: vì virut VNNB có nhân là sợi RNA dương làm 2 chức năng: vừa làm khuôn tổng hợp sợi RNA âm, vừa làm chức năng RNA thông tin

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

• Sinh tổng hợp protein Protein của virut được tổng hợp của mạng lưới nội chất hạt Protein cấu trúc và phi cấu trúc được tổng hợp với tỷ lệ không đổi do được phiên mã từ một sợi RNA thông tin duy nhất

• Lắp ráp các nuleosit và vỏ bọc Khi các protein capsit và acid nucleoic của virut đã được tích lũy phong phú trong tế bào vật chủ thì sẽ bắt đầu quá trình lắp ráp Các protein capsit sẽ liên kết với RNA của virut tạo thành nucleotid, Tiếp theo, virut tiếp nhận một phần màng của tế bào chất vật chủ bao bọc lấy lõi nucleocapit khi virut đi qua màng tế bào chất của vật chủ

• Sự phóng thích Sau khi lắp ráp thành virut hoàn chỉnh, chúng đến màng tế bào, thoát khỏi

và tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác

2.3.5 Đặc tính kháng nguyên của virut VNNB

Virút viêm não Nhật Bản có 3 loại kháng nguyên: protein màng V1 (hoặc M) là nucleoprotein, protein lõi V2 (hoặc C) chính là RNA và protein vỏ V3 (hoặc E) là glycoprotein Trong đó protein kháng nguyên vỏ ngoài E nằm trên bề mặt của hạt virút đóng vai trò quan trọng nhất trong bước đầu tiên của phản ứng virut và vật chủ , tạo ra kháng thể miễn dịch bảo vệ cơ thể (kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và kháng thể trung hòa) (Kobayashi và ctv, 1985)

2.3.6 Đặc tính ngưng kết hồng cầu

Virut VNNB có khả năng ngưng kết hồng cầu gà, ngỗng, bồ câu, cừu, chuột lang, thỏ Nhưng tốt nhất là hồng cầu gà con một ngày tuổi (Kobayashi

và ctv, 1984)

Yếu tố pH có ảnh hưởng tới ngưng kết hồng cầu:

- Kháng nguyên chế từ não pH tối ưu là 6,3- 6,5

- Kháng nguyên chế từ nuôi cấy tế bào pH tối ưu là 6,0- 6,2

2.4 Dịch tể 2.4.1 Phân bố địa lý

Bệnh có chất dịch hoặc dưới dạng địa phương gần như mỗi quốc gia Châu

Á Bệnh thường có tính chất mùa và phổ biến ở vùng Siberia, Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Philippines, Viêt Nam, Thái Lan, Mã Lai, Singapore, Indonesia, Miến Điện, Srilanke và Ấn Độ (Hana và ctv,1996)

2.4.2 Phân bố bệnh theo mùa

Ở vùng ôn đới bệnh có tính chất dịch với phần lớn ca bệnh tập trung vào một vài tháng mùa hè hoặc gió mùa Trong những vùng nhiệt đới, bệnh có tính chất địa phương với số ca bệnh thấp rãi rác suốt năm

2.4.3 Nhân tố trung gian truyền bệnh

Nhân tố truyền bệnh chính là muỗi và đây là vectơ duy nhất truyền bệnh

cho người, đặc biệt là vai trò của giống muỗi Culex như Culex

Tritaeniorhynchus, Culex Gelidus, Culex Vishnu…Muỗi hút máu động vật heo, chim trong giai đoạn nhiễm trùng huyết Virut sinh sản nhanh chóng trong vectơ muỗi và còn có khả năng truyền cho thế hệ sau

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Sự phát triển của muỗi chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ, ẩm độ và lượng mưa

Ở Việt Nam, mật độ muỗi vào mùa hẻ là thời tiết thích hợp cho muỗi phát triển và đặc biệt là vùng nông thôn

Hình 2.3 Muỗi Culex tritaeniorhynchus

( http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/jencphalitis) 2.4.4 Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên

Virut được duy trì và truyền bệnh qua chu trình bao gồm: nhân tố trung gian truyền bệnh là muỗi; ký chủ khuyếch đại là chim di trú và heo; ký chủ cuối cùng là động vật hữu nhũ Sự tồn tại củ virut chủ yếu dựa vào những động vật cảm nhiễm với virut nhưng không có triệu chứng lâm sàng

Heo và chim được xem là động vật cảm nhiễm nhất và là nguồn chứa virut quan trọng để truyền cho muỗi Những động vật khác trâu, bò, dê, cừu, cũng cảm nhiễm với virut VNNB nhưng ở mức độ thấp

Hình 2.4 Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên

(http:// www.envisiict.org/sreenl.html ) 2.4.5 Sinh bệnh học

Cách thức lan truyền chính là thông qua vết muỗi cắn có chứa virut VNNB Muỗi tiết nước bọt khi hút máu và truyền nước bọt bị nhiễm vào máu

Ở động vật khuyếch đại ( Heo, chim) có khoảng 10.000 virut trong một lần muỗi đốt với lượng virut này thì muỗi hút máu dễ dàng truyền bệnh sang người cũng như những động vật khác (Huỳnh Phương Liên,1998)

Trong tự nhiên heo bị nhiễm do muỗi mang virut đốt, sau thời gian gây nhiễm virut huyết sơ tán khoảng 12 giờ đến vài ngày, virut phát tán ra tới các

mô như mô mạch gan, lách, mô cơ…Virut truyền đến hệ thần kinh trung ương qua đường dịch não tuỷ, tế bào nội mô, đại thực bào, lâm ba cầu nhiễm virut hoặc qua đường máu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Đối với nái mang thai, bào thai có thể bị nhiễm do heo mẹ bị nhiễm virut truyền qua nhau thai Thí nghiệm, tiêm truyền virut vào tĩnh mạch heo nái, có thể tìm thấy virut trong bào thai sau 7 ngày Tuy nhiên việc truyền virut qua nhau thai còn tuỳ thuộc vào tuổi của bào thai và dòng virut Sự truyền virut qua nhau thai và gây bệnh rõ ràng nhất khi heo nái nhiễm ở giai đoạn giữa của thai kỳ Hiện tượng thai chết và thai khô có liên quan đến heo nái bị nhiễm virut trong giai đoạn từ 40_50 của thai kỳ Đối với heo nái bị nhiễm virut sau ngày 85 của thai kỳ thì heo con sinh ra ít bị ảnh hưởng (Sugimori và ctv, 1974) Thai chết được cho là có liên quan đến việc không kiểm soát được sự nhân lên của virut và sau đó phá huỷ các tế bào sống của bào thai

Heo con nhạy cảm nhất, heo đực giống nhiễm bệnh là nguồn lây lan mạnh, virut được phóng thích cùng với tinh dịch vào cơ quan sinh dục cái, virut qua nhanh màng bào thai và xuất hiện trong các cơ quan nội tạng của phôi thai, gan, lách, cơ… trong giai đoạn này thường là ngày thứ 40-80 của thai kỳ (Orasa,A và ctv, 1977)

Heo con cai sữa và heo trưởng thành virut không gây bệnh lý và triệu chứng lâm sàng ( Nguyễn Đa Phúc, 2003)

2.5 Miễn dịch học

Trong miễn dịch đặc hiệu, sau khi bị nhiễm virut, ta có thể phát hiện được kháng IgG và IgM Kháng thể IgM được tạo ra rất sớm nhưng lại giảm rất nhanh, chỉ tồn tại khoảng 2 tuần ( Burke và ctv, 1985) và thường ứng dụng trong chẩn đoán Còn kháng thể IgG tồn tại lâu dài sau khi nhiễm virut huyết

và tồn tại đến 3 năm

Khi heo nái mang thai bị nhiễm virut, virut sẽ phát triển trong máu 2-4 ngày, kháng thể được sinh ra từ 1-4 tuần sau khi nhiễm Vì vậy thai trong giai đoạn từ 40-70 ngày tuổi sẽ bị ảnh hưởng Còn thai ở trong giai đoạn từ 85-110 ngày tuổi, thai đã có khả năng tạo miễn dịch nên nếu nái bị nhiễm trong giai đoạn này thai vẫn phát triển bình thường Việc xác định tuổi của thai dựa vào mối liên hệ giữa độ dài từ gáy đến khấu đuôi (Straw, 1986)

Bảng 2.1 : Mối liên hệ giữa độ dài từ gáy đến khấu đuôi Kích thước từ gáy đến khấu đuôi của

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.6 Triệu chứng và bệnh tích 2.6.1 Triệu chứng

 Trên heo

Có thể thấy một vài triệu chứng lâm sàng ở heo con nhiễm virut VNNB như: nhiệt độ tăng lên 39oC trong 3 ngày, biếng ăn, bồn chồn, run và co giật (Kyoguko và ctv, 1986)

Heo trưởng thành và heo nái bị nhiễm, triệu chứng không đặt trưng Tuy nhiên có một số biểu hiện khác thường ở các lứa đẻ của heo nái mang thai bị nhiễm bệnh như: trong lứa có nhiều thai khô, heo con yếu ớt với triệu chứng thần kinh như run co giật rồi chết Thai khô có nhiều kích cỡ khác nhau; thai chết còn có thể thấy phù thủng dưới da, heo con yếu ớt, run, ứ nước dưới da, ở não (Shimuzi và ctv,1954), có triệu chứng thần kinh và chết sau một vài ngày

Sự sẩy thai không phải là biểu hiện đặt trưng của sự viêm nhiễm bên trong tử cung

Heo đực bị nhiễm có thể bị viêm dịch hoàn, thủy thủng, mào tinh cứng và

có thể giảm tính dục và thải virut qua tinh dịch Các heo nọc này giảm thể tích tinh dịch, số lượng tinh trùng và có nhiều tinh trùng bị dị dạng Trong phần lớn trường hợp việc giảm sút chỉ tạm thời và sau đó sẽ phục hồi hoàn toàn nhưng trong một số trường hợp nghiêm trọng có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản

 Trên ngựa

Thời gian nung bệnh 7-10 ngày.Con vật có triệu chứng sốt 40oC_41.5oC

Khi bị nhiễm, ngựa bỏ ăn, khó nuốt, xuất huyết lấm chấm ở niêm mạc hoặc da

và niêm mạc bị vàng Những triệu chứng thần kinh như mất điều hoà, loạn choạng, cổ cứng tạm thời và bại liệt (Hồ Thị Việt Thu,2006) Bệnh thường dẫn đến chết sau 15 đến 20 ngày, cũng có trường hợp thú lành bệnh nhưng thường

2.6.2 Bệnh tích

 Bệnh tích đại thể

Heo nái bị nhiễm không có bệnh tích không được ghi nhận Tuy nhiên một

số bệnh lý được ghi nhận ở các lứa đẻ bất thường của heo nái bị nhiễm bệnh như: chết thai hoặc heo con sinh ra yếu ớt do viêm não tích dịch, phù thủng dưới da, tràn dịch xoang ngực, xuất huyết điểm ở màng tương, hoại tử điểm ở gan và lách, sung huyết màng não hoặc tuỷ sống ( Burns, 1950) hơn nữa vỏ não cực mỏng trong một vài trường hợp viêm não tích dịch (Shimiju và ctv, 1954)

 Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể quan trọng thể hiện ở hệ thống thần kinh trung ương bao gồm: viêm não không mưng mủ với điểm đặc trưng là sự xâm nhập xung

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

quanh mạch của các loại tế bào: Đơn nhân lớn, tế bào lympho, tế bào plasma, bào tương và tế bào thần kinh đệm thoái hoá, viêm màng não

Ở heo nọc, bệnh tích vi thể là ứ nước, viêm với sự xâm nhiễm ở của nhiều

tế bào ở mô kẻ của mào tinh và màng bao dịch hoàn Thường thấy những biến đổi thoái hoá ở biểu mô ống sinh tinh

2.7 Các phương pháp chẩn đoán 2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào dịch tể học: Vùng bị bệnh đe doạ, mùa, mật độ muỗi Triệu chứng bệnh: heo nái thường sẩy thai, thai khô, heo con yếu ớt có những triệu chứng thần kinh trong ổ đẻ có những triệu chứng bình thường

Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh gây rối loạn sinh sản khác như: bệnh

do porcine parvoviris, bệnh Aujeszki, bệnh do toxoplasma, bệnh dịch tả, bệnh

do leptospira… Không có triệu chứng bệnh ở heo mẹ và sự phân bố bệnh theo mùa là đặc điểm riêng được dùng để phân biệt rối loạn sinh sản do virút VNNB với những nguyên nhân khác

2.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

 Phân lập virut trên tế bào nuôi cấy

Não của thai chết hoặc thai sẩy và nhau là những bệnh phẩm thường dùng trong phân lập virút, bệnh phẩm cần được bảo quản trong lạnh và phải được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Bệnh phẩm não cần được chia làm đôi cho việc thực hiện phiến đồ tổ chức, đồng thời cần thu thập mẫu huyết thanh

từ thai chết, thai sẩy và cả huyết thanh của heo mẹ Huyết thanh của heo mẹ trong những lứa đẻ bất thường do virut viêm não Nhật Bản có hàm lượng cao kháng thể thường không bền với 2-mercaptoethanol lúc đẻ (Otsuka và ctv, 1966)

Bệnh phẩm đã chuẩn bị được phân lập bằng cách tiêm vào não chuột 1-5 ngày tuổi, chuột có triệu chứng thần kinh và chết trong thời gian từ 4 ngày đến

14 ngày Thu hoạch não chuột chết và bảo quản ở -80oC dùng làm kháng nguyên Kháng nguyên này được truyền cấy tiếp qua tế bào muỗi và một tế bào khác

 Phản ứng khuyếch đại chuỗi gen ( RT_PCR Reverse Transcription

Polymerase chain reaction)

RT_PCR là sự kết hợp giữa phản ứng tổng hợp dây chuyền với phản ứng phiên mã ngược, giúp khuyếch đại cDNA từ RNA Sau khi phản ứng phiên

mã ngược kết thúc, sản phẩm cDNA sẽ được khuyếch đại nhiều lần trong phản ứng PCR là phản ứng khuyếch đại DNA theo hàm mũ Đây là kỹ thuật đặc biệt quan trọng để định lượng RNA

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

• Enzymee phiên mã ngược: Là enzymee xúc tác phản ứng RNA thành cDNA từ khuôn RNA theo chiều 5’_3’, khi có mặt của mồi Hiện nay ngoài thị trường, enzymee phiên mã ngược có nguồn gốc từ AMV (Avian Myeloblastosis Virut) và MMLV ( Moloney Murine Leukemia Virut)

• Mồi:Có 3 loại mồi thường dùng trong phản ứng RT: mồi ngẫu

nhiên, mồi oligo(dT) và mồi chuyên biệt

+ Ph ản ứng PCR

Ðể thực hiện được việc khuyếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước, mỗi bước kéo dài khoảng vài chục giây đến vài phút, tuần tự như sau :

+ Ðầu tiên là nhiệt độ được nâng lên cao hơn nhiệt Tm của phân tử , thường là khoảng 940C – 95oC để làm biến tính nucleic acid đích từ dạng sợi đôi (dsDNA) thành sợi đơn (ssDNA), đây là giai đoạn làm biến tính (denaturation) DNA đích

+ Kế đó là giai đoạn bắt cặp (anealing), lúc này nhiệt độ trong buồng ủ PCR hạ xuống ( thấp hơn Tm của mồi) thường khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc vào Tm của các mồi sử dụng, để các đoạn mồi (primer) bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích Đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu thì những sản phẩm PCR (PCR product) sẽ đặc hiệu

+ Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension), lúc này nhiệt độ được nâng lên khoảng 720C là nhiệt độ tối hảo để men polymerase chịu nhiệt xúc tác phản ứng tổng hợp bản sao của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung trên khuôn

là các sợi đơn (ssDNA) đích đã được đoạn mồi bắt bặp vào trước đó (ở giai đoạn bắt cặp).

Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR đã tổng hợp được N.2n bản sao Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product) hay amplicon, lớn như vậy (trên 109bản sao sau 30 chu kỳ), chúng dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp phát hiện nucleic acid

Các thành phần của phản ứng PCR là :

- Deoxynucleoside triphosphat (dNTP): có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn với 1 bazơ ở vị trí C1 gồm có các loại dATP ( gắn với Adenine), dTTP (gắn với Thymine), dCTP (gắn với Cytosine), dGTP(gắn với Guanine) 3 phân tử phosphate (triphosphat) được gắn tại C5 của phân tử deoxyribose và đây chính là nơi dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ xung trên chuỗi đích Năng lượng được dùng cho phản ứng này được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphat trên dNTP Ngoài ra dNTP còn gắn với Mg2+ vì vậy còn phụ thuộc vào nồng độ MgCl2

- cDNA khuôn: sản phẩm của phản ứng phiên mã ngược RT là chuỗi acid nucleic mà phản ứng PCR khuyếch đại lên để chúng có thể được phát hiện trong bệnh phẩm

- Dung dịch đệm: thường sử dụng dung dịch muối đệm là MgCl2 Nồng

độ MgCl2 sẽ ảnh hưởng đến độ chuyên biệt và lượng sản phẩm vì vậy cần phải tối ưu hoá nồng độ MgCl2

- DNA polymerase chịu nhiệt: là những men polymerase ly trích từ các

vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus gọi là Taq polymerase Nhược

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

điểm của Taq polymerase là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến những đột biến trong chuỗi DNA Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3-5exonuclease) Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq polymerase và proofreading có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn độ chính xác của DNA

- Mồi (primer): hay còn gọi là amplifier (nhân tố khuyếch đại) là đoạn DNA đơn có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích Primer có hai vai trò

+ Quyết định tính đặc hiệu của chuỗi đích

+ Khởi động men polymerase, vì men này sẽ chỉ bắt đầu tổng hợp sợi

bổ sung cho chuỗi DNA đích khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà

nó xúc tác cho 1 dNTP gắn vào) Thông thường trong phản ứng PCR người ta thường dùng một cặp mồi là mồi xuôi (down stream prime) và mồi ngược (up stream prime)

Việc chọn mồi phải tuân thủ một số nguyên tắc:

- Trình tự các nucleoic của mồi được chọn không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp

bổ sung giữa các thảnh phần khác nhau của mồi

- Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa

- Thành phần nucleoic của các mồi phải cân bằng , phải tránh các cặp G

và C lặp lại nhiều lần

- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen (Hồ Quỳnh Thuỳ Dương, 1998)

2.7.3 Xét nghiệm huyết thanh học

 Phản ứng ức chế ngăn kết hồng cầu (HI_ Haemagglutination inhibition

test)

Được xây dựng bởi Clacke và Casals năm 1958 Nguyên lý của phản ứng này là: Dùng một lượng hồng cầu đã gắn kháng nguyên đã biết cho gắn với một lượng nhất định kháng thể đặc hiệu đã biết Nếu trước khi làm phản ứng kháng thể này được ủ với bệnh phẩm (có kháng nguyên đặc hiệu) thì kháng thể đã bị bão hoà bởi kháng nguyên Tiếp đó, nếu cho kháng thể đã bảo hoà này làm phản ứng, thì không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu, khi đọc kết quả nếu không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu thì có nghĩa là phản ứng

đó dương tính (Trích dẫn Đặng Đức Trạch và ctv, 1987) Tiền thân của phương pháp xét nghiệm này là phản ứng ngưng kết hồng cầu ( HA) Vì virut VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số loài lông vũ (ngỗng, gà ) Dùng phản ứng HA để định lượng và chuẩn độ kháng nguyên virut VNNB

Virut VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ở pH nhất định Khi loại

bỏ những yếu tố ức chế ngăn kết hồng cầu ( không đặc hiệu) bằng cách xử lý với aceton, ether hoặc kaolin trước khi thực hiện phản ứng HI (Monath và ctv, 1970)

Xét nghiệm này có ưu điểm đơn giản dễ làm Do đó thường được dùng nhất trong chẩn đoán bệnh VNNB Tuy nhiêm gặp một số bất lợi vì khó đạt

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

trình độ chính xác cao do phản ứng chéo với các Flavivirus có đặc tính kháng

nguyên gần gũi với với virut VNNB

 Phản ứng MAC-ELISA (antibody capture enzyme linked

immunosorbent assay)

Đây là một xét nghiệm đơn giản, cho kết quả nhanh và không đòi hỏi các thiết bị quá phức tạp MAC_ELISA dựa trên nguyên tác phát hiện các kháng thể IgM đặc hiệu với virut VNNB, kháng thể này xuất hiện khi cơ thể vứa mới mắc bệnh và phát triển nhanh hơn so với kháng thể IgG Xét nghiệm này có độ nhạy là 73% và tính đặc hiệu là 95% Ngoài ra còn có thể khắc phục được hiện

tượng phản ứng chéo giữa các kháng thể IgG của các Flavivirus.Một cách tóm

tắt phản ứng được thực hiện như sau: sử dụng IgG dê kháng IgM của heo gắn trên tấm nhựa 96 giếng đáy bằng, ủ qua đêm IgM có trong mẫu xét nghiệm sẽ kết hợp với IgG kháng IgM của heo Nếu mẫu có IgM đặc hiệu kháng virút VNNB, nó sẽ kết hợp với kháng nguyên VNNB ở những bước tiếp theo Khi cho IgG kháng virút VNNB có gắn emzyne, nó sẽ kết hợp với kháng nguyên này nó sẽ cho một phức hợp không màu Khi có mặt cơ chất, emzyne sẽ hoạt hoá cơ chất sinh ra có màu Sự có mặt của IgM đặc hiệu kháng virút VNNB trong huyết thanh được thể hiện gián tiếp bởi mật độ quang (Optical density-OD) được ghi nhận bằng máy đo quang phổ

 Phản ứng trung hoà giảm đám hoại tử ( PRNT _ Plaque reduction

Neutralization Test)

Đây là phản ứng xét nghiệm có độ đặc hiệu và độ nhậy cao nhất trong chẩn đoán virut VNNB Các dòng tế bào LLC_MK2, Vero hay BHK-21 thường được dùng để xác định hiệu giá kháng thể

Nguyên tắc của phản ứng này là dùng lượng vi khuẩn chuẩn biết trước nồng độ cho trung hoà với kháng thể cần xác định hiệu giá Đem cấy hỗn hợp virut- kháng thể này vào tế bào sau đó phủ thạch

Phản ứng trung hoà này ít được dùng trong chẩn đoán huyết thanh vì rất đắt tiền và khó thực hiện, mặc dù phản ứng này được coi là có độ nhạy và đặc hiệu nhất

 Phản ứng hoá mô miễn dịch

Đây là kỹ thuật thường được sử dụng trong việc phát hiện kháng nguyên virut viêm não Nhật Bản trong tổ chức bệnh và dùng chẩn đoán trong trường hợp không thể thực hiện được các xét nghiệm huyết thanh hoặc phân lập virút

Có rất nhiều kỹ thuật được sử dụng để phát hiện kháng nguyên virut trong mô của bệnh phẩm: kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp, kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp, kỹ thuật kết nối men peroxidase và kết nối alkaline phosphatase (Hồ Thị Việt Thu, 2006)

2.8 Phòng và trị bệnh 2.8.1 Trị bệnh

Chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Tuy nhiên có 3 loại sản phẩm được nghiên cứu trên động vật về tính hiệu quả trong điều trị bệnh VNNB: Kháng thể đơn dòng, kháng virut và interferon Kháng thể đơn dòng cho thấy có hiệu quả trên động vật (Kimur-Kuroda và Yasui, 1988; Zhang và ctv, 1989) Trên

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

người, việc sử dụng tái tổ hợp interferon-α-A trong điều trị bước đầu cho kết quả khả quan

2.8.2 Phòng bệnh

Do chưa có thuốc đặc trị nên phòng bệnh là cách tốt nhất để hạn chế sự lây lan bệnh VNNB Phá vỡ chu trình truyền bệnh trong tự nhiên là biện pháp tốt nhất

 Kiểm soát nhân tố trung gian truyền bệnh

Diệt muỗi và ấu trùng muỗi bằng các hoá chất Tuy nhiên có thể gây ra hiện tượng kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường

Ngoài ra còn có thể áp dụng các biện pháp khác như:

- Loại bỏ những nơi có nước đọng không cho muỗi sinh sản

- Chuồng trại chăn nuôi phải cách xa khu dân cư

- Nuôi tôm cá trên ruộng lúa

- Tránh muỗi đốt cho heo bằng cách sử dụng lưới chắn muỗi vào ban đêm

- Không dùng tinh của nọc mắc bệnh

 Tiêm phòng vaccine

Tiêm phòng vaccine cho đàn heo giống là biện pháp phòng ngừa tốt nhất Heo nọc và cái hậu bị trước khi sử dụng làm giống cần phải được tiêm ngừa trước khi phối giống Ngoài ra việc tiêm phòng trên heo có thể giảm tỷ lệ mắc bệnh trên người Có nhiều loại vaccine giảm độc lực đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trong việc phòng bệnh VNNB trên heo Vaccine phòng bệnh viêm não Nhật Bản có thể sử dụng đồng thời với các vaccine khác như vaccine dịch tả heo, vaccine Parvovirus…

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG III

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian

Đề tài được thực hiện từ 4/2006 –7/2007

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Trại chăn nuôi heo tập trung + Trại chăn nuôi Vĩnh Khánh_ An Giang + Trại chăn nuôi Phước Thọ_Vĩnh Long

- Phòng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm Bộ môn Thú Y-khoa Nông Trường Đại Học Cần Thơ

Nghiệp Phòng Arbovirus, viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh

3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi

- Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virut VNNB trên heo bằng phản ứng

HI và MAC_ELISA trên heo nái có biểu hiện rối loạn sinh sản

- Kiểm tra kháng thể kháng kháng virut VNNB từ dịch xoang ngực của thai chết và huyết thanh của heo con từ các lứa đẻ rối loạn sinh sản

- Phát hiện virut VNNB bằng kỹ thuật RT_PCR

3.2 Phương tiện và phương pháp tiến hành thí nghiệm 3.2.1 Vật tư và thiết bị

 Vật tư

- Ống tiêm y tế 5-12ml, kim tiêm số 22G, 20G, 18G

- Ống nghiệm vô trùng, týp nhựa đựng huyết thanh

- Đĩa 96 giếng đáy hình chữ U và đáy bằng

- Thùng trữ lạnh, nước đá khô, dây khớp mõm

- Cối, chày, cồn 70o, bông gòn vô trùng

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

 Lấy và bảo quản mẫu

• Phương pháp chọn mẫu

+ Lấy bệnh phẩm từ nái mẹ Đối với nái sẩy thai: lấy máu khi heo mới sẩy thai

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Đối với nái đẻ thai khô, thai chết, heo con yếu có triệu chứng thần kinh (chưa bú sữa đầu) lấy máu một lần sau khi đẻ

+ Lấy mẫu bệnh phẩm từ heo con, thai chết, thai khô Trước khi tiến hành lấy mẫu, cần ghi nhận tổng số và đo kích thước của từng thai

Đối với heo con yếu và chết trước khi bú mẹ, tiến hành lấy máu tim hoặc dịch xoang ngực và não

• Ph ương pháp lấy mẫu

+ L ấy máu heo

Khớp mõm, cố định heo sao cho toàn thân heo thành một đường thẳng, hai chân trước hơi dang rộng sang hai bên kéo cho đầu ngẩng cao

Sát trùng vị trí lấy máu Dùng ống tiêm vô trùng 12ml và kim số 18 để lấy máu Xác định vị trí lấy máu ở tĩnh mạch cổ heo: là chỗ hõm sâu nhất ngay dưới cổ, kim đâm vào phải thẳng góc, nếu đúng vị trí máu ra rất nhẹ và nhanh

Lấy kim ra, bơm nhẹ cho máu chảy theo thành ống nghiệm đã được vô trùng, để máu đông tự nhiên Sau đó bảo quản ở bình trữ lạnh Máu được ly tâm để chiếc lây huyết thanh

Huyết thanh được chiết vào các type nhựa vô trùng và trữ lạnh ở -20o

+ L ấy máu dịch xoang ngực

Dùng kéo cắt 1 đường giữa ngực, dùng ống tiêm vô trùng hút lấy dịch trong của xoang ngực cho vào túp nhựa vô trùng bảo quản –20oC

+ L ấy mẫu não

Sát trùng vùng đầu bằng cồn 70oC, dùng cưa vô trùng cắt xương sọ, bộc lộ não, dùng kéo và pen vô trùng lấy não bao gồm bán cầu não, tiểu não và hành tuỷ cho vào tube nhựa

Mẫu não được bảo quản ở -80oC

 Phương pháp xét nghiệm

Sử dụng kỹ thuật RT_PCR để phát hiện hệ của virut VNNB Dùng kỹ thuật HI và MAC_ELISA để phát hiện kháng thể kháng virut VNNB từ huyết thanh của heo mẹ và từ dịch xoang ngực (hoặc huyết thanh) của heo con

3.2.3 Các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm

 Thực hiện phản ứng HI (Haemagglutination inhibition test)

+ Hoá chất xét nghiệm

Natri citrát, Natri clorua, Véronal (axit 5,5 diethyl barbiturique), Gélatine, Natri véronal, Canxi clorua, axit boric, NaOH, Na2HPO4 12H2O, NaH2PO4.2H2O

+ Tiến hành Bước 1: Lấy, rửa và bảo quản hồng cầu ngỗng

- Máu ngỗng lấy từ tĩnh mạch cánh, trước khi lấy phải sát trùng vị trí lấy máu

- Lấy 1.5ml chất chống đông Alsever vào ống kim 12ml, rút từ tĩnh mạch cánh ngỗng 8,5ml máu, lác nhẹ để máu được trộn đều với chất chống đông

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Một khối lượng máu toàn phần + 2,5 khối lượng DGV (Dextrose Gélatin Véronal), lắc nhẹ để trộn đều, quay ly tâm 1.000vòng/phút, trong 15 phút, bỏ nước nổi trên

- Hoà hồng cầu 3 khối lượng DGV, lắc nhẹ để trộn đều, quay ly tâm 1.000 vòng/phút, trong 15 phút, bỏ nước nổi trên Rửa tiếp hai lần nữa với DGV (tổng cộng 4 lần rửa)

- Dùng Hematocrit để xác định tỉ lệ hồng cầu, sau đó pha hồng cầu 8% trong DGV để bảo quản ở nhiệt độ 40C

- Hồng cầu được tiếp tục pha loãng trong VAD (theo tỉ lệ 1/24 khi sử dụng trong phản ứng HA và HI (Hồng cầu 0,33%)

Bước 2: Xử lý huyết thanh

Mục đích: là để loại bỏ chất kiềm hãm chất ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu trước khi làm phản ứng

- Hấp thụ chất ngưng kết: Cho 1ml huyết thanh đã pha loãng 1/10 vào ống nghiệm vô trùng, cho thêm một giọt hồng cầu ngỗng đặc, lắc nhẹ cho đều, để trong nước đá tan, cho tiếp xúc 20 phút, ly tâm 1.500 vòng/phút, trong 10 phút, hút lấy phần nước trong bên trên cho vào tube nhựa vô trùng, ta được huyết thanh đã xử lý Trữ huyết thanh ở nhiệt độ (-200C)

để ở nhiệt độ phòng, sau một giờ đọc kết quả của phản ứng HA

• Đọc kết quả phản ứng HA

- Dương tính 4(+): khi hồng cầu kết thành một lớp mỏng, che kín cả đáy lỗ

- Dương tính 3(+): đại đa số hồng cầu kết thành một lớp mỏng, nhưng đáy lỗ còn một ít hồng cầu không ngưng kết tụ lại thành hình nhẫn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Dương tính 2(+): đại đa số hồng cầu tụ lại ở đáy lỗ thành cụm, xung quanh

có một ít hồng cầu ngưng kết lấm tấm

- Âm tính: Hồng cầu tụ lại thành một cụm tròn nhỏ ở đáy lỗ

Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của khánh nguyên còn khả năng ngưng kết ở mức độ 4(+) hay 3(+) và gọi là một đơn vị ngưng kết

Bước 4: Thực hiện phản ứng HI

• Thành phần phản ứng HI

- Dung dịch BABS 0,4%

- Huyết thanh heo đã xử lý

- Kháng nguyên có 8 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch BABS 0,4%, để ở nhiệt độ 40C trong một giờ

- Hồng cầu ngỗng 0,33% pha trong VAD

• Tiến hành phản ứng HI

- Cho vào mỗi lỗ của đĩa microplate 0,025ml dung dịch BABS 0.4%

- Cho 0,025ml huyết thanh đã xử lý vào lỗ đầu tiên, trộn đều, hút 0,025ml sang lỗ thứ hai, trộn đều, hút 0,025ml sang lỗ thứ ba… tiếp tục như thế đến lỗ thứ 12 thì bỏ đi 0,025ml

- Tiếp tục cho vào mỗi lỗ 0,025ml kháng nguyên đã pha loãng trong dung dịch BABS 0.4%, trữ lạnh ở nhiêt độ 40C trong 8-18 giờ, hoặc 1 giờ ở nhiệt độ phòng

- Cho vào mỗi lỗ 0,05ml hồng cầu ngỗng đã pha loãng 0,33%, để ở nhiệt độ phòng

- Ghi nhận kết quả sau 1 giờ

- Dương tính ở lỗ thứ 1 tương đương với hiệu giá 1/20

- Dương tính ở lỗ thứ 2 tương đương với hiệu giá 1/40

- Dương tính ở lỗ thứ 3 tương đương với hiệu giá 1/80

- Đối chứng âm: cách làm giống như đối chứng dương nhưng thay mẫu chứng

dương bằng mẫu chứng âm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Đối chứng hồng cầu: cho vào 10 lỗ, mỗi lỗ 0,05ml BABS 0,4%, sau đó cho

tiếp 0,05ml hồng cầu ngỗng 0,33% Sau 1giờ quan sát làm đối chứng hồng cầu

- Ki ểm tra nồng độ kháng nguyên: kháng nguyên sau khi pha ở 8 đơn vị HA

cần kiểm tra lại nồng độ: Cho 0,025ml Borat pH=9 vào trong 6 lỗ, cho tiếp 0,025ml kháng nguyên đã pha loãng ở 8 đơn vị HA vào lỗ thứ nhất và lỗ thứ hai, pha loãng bậc hai từ lỗ thứ đến lỗ thứ sáu, cho tiếp vào lỗ thứ nhất 0,05ml hồng cầu 0,33% và các lỗ còn lại 0,025ml Sau một giờ đọc kết quả kiểm tra: Nếu lỗ thứ nhất đến lỗ thứ tư có hiện tượng hồng cầu ngưng kết và lỗ thứ năm đến lỗ thứ sáu hồng cầu lắng, kết luận kháng nguyên đã pha đúng nồng độ

Hình 3.1: Kết quả phản ứng HI

 Thực hiện phản ứng MAC_ELISA (antibody capture enzyme linked

immunosorbent assay)

+ Sinh phẩm

- Kháng thể gắn bảng: kháng thể IgG của dê kháng IgM heo

- Huyết thanh mẫu chứng dương và chứng âm do Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp)

- Kháng nguyên virút viêm não Nhật Bản chủng Nakayama chế tạo theo phương pháp Sucroze – axeton

- Cộng hợp 4G2 – HRPO do Viện Pasteur Paris cung cấp

+ Hóa chất xét nghiệm

• Coating buffer pH =9,6: dung dịch pha kháng IgM để gắn bảng

• PBS pH = 7,4

• PBS pH = 7,2

• PBS – Tween 20 0,05%: dung dịch rửa

• PBS – Tween 20 0,5% - sữa 5%: dung dịch phủ bảng

• PBS – Tween 20 0,5%: pha huyết thanh, kháng nguyên, dung dịch phủ bảng

• PBS – sữa 1%: cộng hợp