VI NHÂN GIỐNG cây HOA cúc “đài LOAN” VÀNG (chrysanthemum sp ) với GIÁ THÀNH THẤP

TÓM LƯỢC Hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ được thực hiện ở điều kiện môi trường nuôi cấy trong phòng tăng trưởng có nhiệt độ 29±2oC, cường độ chiếu sáng trung bình 1.800 lux và ngoài ph

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TỐNG HỒ NAM

VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA CÚC “ĐÀI LOAN” VÀNG

(Chrysanthemum sp.) VỚI GIÁ THÀNH THẤP

Luận văn tốt nghiệp Ngành: TRỒNG TRỌT

Cần Thơ, 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: TRỒNG TRỌT

VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA CÚC “ĐÀI LOAN” VÀNG

(Chrysanthemum sp.) VỚI GIÁ THÀNH THẤP

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Ts Lê Văn Bé Tống Hồ Nam

MSSV: 3065363

Lớp: TT K32

Cần Thơ, 2010

ii

Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Trồng trọt với đề tài:

VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA CÚC “ĐÀI LOAN” VÀNG

(Chrysanthemum sp.) VỚI GIÁ THÀNH THẤP

Do sinh viên Tống Hồ Nam thực hiện

Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2010

Cán bộ hướng dẫn

TS Lê Văn Bé

iii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Trồng trọt với đề tài:

VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA CÚC “ĐÀI LOAN” VÀNG

(Chrysanthemum sp.) VỚI GIÁ THÀNH THẤP

Do sinh viên Tống Hồ Nam thực hiện và bảo vệ trước Hội đồng

Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Luận văn tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức

DUYỆT KHOA Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2010

Trưởng Khoa Nông nghiệp & SHƯD Chủ tịch Hội đồng

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Tống Hồ Nam

Họ và tên cha: Tống Hồ Hải

Họ và tên mẹ: Trần Kim Loan

Địa chỉ liên lạc: 58, Tân Mỹ, Tân Qui Đông, Sa Đéc, Đồng Tháp

Quá trình học tập:

1993–1998: Trường Tiểu học Tân Qui Đông, Sa Đéc, Đồng Tháp

1998–2002: Trường Trung học cơ sở Hùng Vương, Sa Đéc, Đồng Tháp

2002–2005: Trường Trung học Phổ thông Thị xã Sa Đéc, Sa Đéc, Đồng Tháp

2006–2010: Trường Đại học Cần Thơ, ngành Trồng trọt, khóa 32, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2010

Người khai

Tống Hồ Nam

vi

LỜI CẢM TẠ

Xin kính dâng lên cha mẹ và gia đình tôi!

Xin chân thành biết ơn!

Thầy Lê Văn Bé đã tận tình hướng dẫn và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Cô Lê Thị Điểu và anh Nguyễn Văn Kha đã chỉ dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Cô cố vấn học tập Lê Thị Xua, đã quan tâm dìu dắt, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học

Quý Thầy, Cô Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt khóa học

vii

Tống Hồ Nam, 2010 “Vi nhân giống cây hoa cúc “Đài Loan” vàng

(Chrysanthemum sp.) với giá thành thấp” Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Nông

Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Trường Đại Học Cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Văn Bé

TÓM LƯỢC

Hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ được thực hiện ở điều kiện môi trường nuôi cấy trong phòng tăng trưởng có nhiệt độ 29±2oC, cường độ chiếu sáng trung bình 1.800 lux và ngoài phòng tăng trưởng (lồng kiếng) có nhiệt độ 31±2oC, cường độ chiếu ánh sáng tự nhiên trung bình 6.000 lux

Vào giai đoạn nhân chồi, chồi cây cúc được tái sinh từ mảnh lá trong môi trường MS có bổ sung 1 mg BA/lít + 1 mg NAA/lít tạo ra 5 chồi sau 6 tuần nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy trong và ngoài phòng tăng trưởng có số chồi tương đương nhau Các thông số nông học như chiều cao chồi, số lá/chồi thì không khác biệt nhau ở trong môi trường MS có bổ sung 1 mg NAA/lít Ngược lại, vào giai đoạn ra

rễ chồi cây cúc nuôi cấy trong lồng kiếng cho ra nhiều rễ và chiều dài rễ hơn trong phòng tăng trưởng ở môi trường có bổ sung 1 mg NAA/lít Hơn nữa, tỷ lệ sống sót của chồi con ở ngoài phòng tăng trưởng khi đem ra thuần dưỡng cũng khá cao 84%, cao hơn trong phòng tăng trưởng 70% Sản xuất cây cúc cấy mô theo qui trình và sử dụng điều kiện ngoài phòng tăng trưởng (lồng kiếng) thay cho phòng tăng trưởng, chi phí sản xuất giảm được 28%

1.3.2 Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cây và tạo nguồn mẫu khởi đầu 4

1.3.5 Giai đoạn 4: Thuần dưỡng cây con ngoài môi trường tự nhiên 6

1.4.2 Nuôi cấy mô hoa cúc CN01 (Standard Chrysanthemum) 6

1.5 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 7

ix

1.1 MỘT SỐ KỸ THUẬT GIÚP GIA TĂNG SỰ SINH TRƯỞNG

1.1.3 Một số nghiên cứu sử dụng ánh sáng tự nhiên để vi nhân giống 13

2.2.1 Thí nghiệm 1 So sánh sự nhân chồi trực tiếp bằng mẫu lá cây hoa

cúc Đài Loan ở điều kiện trong và ngoài phòng tăng trưởng 16 2.2.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện nuôi

3.2 THÍ NGHIỆM 1 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH

TRƯỞNG VÀ MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI

3.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và môi trường ngoại

3.2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và môi trường ngoại

3.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và môi trường ngoại

3.3 THÍ NGHIỆM 2 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NAA VÀ

ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH LÊN SỰ RA RỄ IN VITRO CỦA CHỒI

x

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

MS: Murashige and Skoog

BA: benzyladenin

NAA: α-1-naphthaleneacetic acid

SKC: sau khi cấy

IAA: indole-3-acetic acid

cm: centimet

in vitro: trong ống nghiệm

PTT: phòng tăng trưởng

xi

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Các thông số môi trường giữa hai điều kiện trong và

ngoài phòng tăng trưởng trong suốt quá trình thí

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA và điều kiện nuôi

cấy đến sự hình thành số chồi hoa cúc từ lá ở thời điểm

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA và điều kiện nuôi

cấy đến sự gia tăng chiều cao chồi cúc (cm) ở thời

Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA và điều kiện nuôi

cấy đến số lá/chồi cúc ở thời điểm 6 tuần SKC

Hiệu quả của nồng độ NAA và điều kiện nuôi cấy đến

sự sinh trưởng của rễ hoa cúc sau 6 tuần quan sát

Hiệu quả của nồng độ NAA và điều kiện nuôi cấy lên

chiều cao chồi và số lá gia tăng trên chồi sau 6 tuần

Chồi cúc tái sinh từ lá nuôi cấy ở 2 điều kiện trong (a)

và ngoài (b) phòng tăng trưởng

Chồi cúc được ra rễ trong ống nghiệm ở điều kiện

trong (a) và ngoài (b) phòng tăng trưởng 6 tuần SKC

1

MỞ ĐẦU

Hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là một trong ba loài hoa cắt cành được ưa

chuộng nhất trên thế giới Hoa cúc rất đa dạng và phong phú về chủng loại, đa hương, đa sắc, có thể sử dụng với nhiều mục đích khác nhau Chẳng hạn trong dịp tết, hoa cúc được người dân sử dụng để trang trí nhà cửa, vì hoa cúc tượng trưng cho sự sung túc, màu sắc đẹp, tươi lâu và đặc biệt khi tàn thì cánh hoa không rụng

Ở Việt Nam, hoa cúc trồng với mục đích cắt cành tập trung nhiều ở các vùng như

Hà Nội, Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng,… Riêng Đồng Bằng Sông Cửu Long, ở các tỉnh như: Đồng Tháp, Tiền Giang, Cần Thơ, Bến Tre, thường có tập quán trồng hoa trên chậu (giỏ) để chưng và bán vào các dịp lễ, tết (Lê Hữu Cân

và Nguyễn Thị Hải Hà, 2005) Các loại cây chủ yếu được trồng tại đây là cúc, hồng, vạn thọ, cát tường,… Số lượng cây được trồng hàng năm là khá lớn, nhưng chủ yếu

sử dụng cây con bằng cách nhân giống truyền thống, chỉ một số ít nhà vườn sử dụng cây con từ nhân giống cấy mô Bởi vì, trồng cây cấy mô thì chi phí đầu tư cho nguồn giống ban đầu khá lớn nên lợi nhuận không nhiều Chẳng hạn, giá bán của cây vạn thọ hay cúc cấy mô khoảng 1.000 – 2.000 đồng/cây (www.dongthap.gov.vn)

Nuôi cấy mô là kỹ thuật quan trọng trong ngành trồng hoa kiểng Nhân giống bằng phương pháp này cho hệ số nhân chồi cao, cây giống được tạo ra đồng nhất về mặt di truyền, cây sạch bệnh, phát triển mạnh, ít bị biến dị (Nguyễn Đức Thành, 2000; Bùi Bá Bổng, 1995) Nhưng giá thành sản xuất cây giống cấy mô còn khá cao dẫn đến giá bán cây con trên thị trường cũng cao Vì thế, cây cấy mô chưa được sử dụng phổ biến trong sản xuất Do đó, đề tài “Vi nhân giống cây hoa cúc “Đài Loan” với giá thành thấp” được thực hiện nhằm tìm quy trình sản xuất cây cấy mô với giá thành thấp bằng cách sử dụng ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên của môi trường thay cho ánh sang đèn và nhiệt độ nhân tạo Từ đó có thể giảm bớt chí phí sản xuất và tăng lợi nhuận cho người nông dân

2

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CÂY HOA CÚC

1.1.1 Nguồn gốc

Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp., thuộc họ Asteraceae,

phân họ Asteroideae, chi Chrysanthemum Hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, một số nước Châu Âu và được nhập vào nước ta từ lâu đời (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Hiện nay trên thế giới có khoảng 200 loài hoa cúc, ở nước ta có 5 loài chủ yếu thuộc hoa cảnh rất phổ biến vì vẻ đẹp của hoa Hoa cúc không chỉ đẹp mà còn lâu tàn Hoa cúc có thể trồng trên chậu hay trồng để cắt cành, vì dáng vẻ cây cũng rất đẹp Bên cạnh đó, hoa cúc còn là vị thuốc quý Hoa cúc ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt

độ trung bình không cao quá 350C cũng không thấp quá 10oC, ẩm độ không quá 80% (Đặng Phương Trâm, 2005)

 Thân

Hoa cúc thuộc nhóm cây thân thảo, khả năng phân nhánh mạnh, có nhiều đốt giòn, dễ gẫy, cây càng lớn thân sẽ càng cứng Chiều cao cây cúc ở nước ta có thể cao khoảng 30 – 80cm Trong điều kiện ngày dài hoa cúc có thể cao đến 1,5 – 2m (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

 Rễ

Cây hoa cúc thuộc loại rễ chùm, rễ cây ít ăn sâu mà phát triển theo chiều ngang Khối lượng bộ rễ lớn do sinh nhiều rễ phụ và lông hút, nên khả năng hút nước và dinhh dưỡng mạnh (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

 Lá

Lá hoa cúc xẽ thùy có một răng cưa, thường là lá đơn mọc so le nhau, mặt dưới lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, phân hình mạng lưới Phiến lá to hay nhỏ, dày hay mỏng, màu sắc xanh đậm, xanh vàng hay xanh nhạt, và còn phụ thuộc vào đặc điểm của từng giống (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

 Hoa

Chủ yếu ở hai dạng: Dạng lưỡng tính tức là trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái Còn dạng đơn tính chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có dạng vô tính (không

1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

1.2.1 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô

Trong nhiều năm qua, các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống giữ một vai trò quan trọng trong ngành trồng trọt, vì phương pháp này có thể giữ lại một

số đặc tính có lợi của cây bố mẹ và tạo ra các ngân hàng gen cây trồng Tuy nhiên, phương pháp này có một số giới hạn về mùa vụ, hệ số nhân giống thấp,… Chính vì

thế trong những năm gần đây, phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống, nuôi cấy mô) đã được áp dụng rộng rãi (Pati et al., 2006; Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Với cách nhân giống in vitro, người ta có thể nhân nhanh chóng

và có thể nhân rất nhiều loại cây thuộc nhiều vùng khí hậu khác nhau Ngoài ra, phương pháp nhân giống này có thể kiểm soát được dịch bệnh cây trồng, chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen, kiểm soát kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch, tạo ra sự đồng loạt về giống Đây thật sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong trồng trọt (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Ở nước ta, nhân giống vô tính in vitro đã thành công trên nhiều loại cây,

trong đó có những cây quan trọng về mặt kinh tế như: lúa, bắp, khoai tây, rau, các loại hoa, cà phê, cacao, một số loại cây thân gỗ có giá trị,…(Nguyễn Đức Lượng và

Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.2.2 Ưu khuyết điểm của nuôi cấy mô

 Ưu điểm

Theo George (1993) nhân giống in vitro có các ưu điểm sau:

 Bắt đầu từ những mẫu cấy nhỏ, chỉ cần một khoảng không gian nhỏ để nuôi cấy hoặc nhân lên thành một số lượng rất lớn

 Cây con tạo ra không nhiễm khuẩn, nấm và các vi sinh vật khác, do làm việc trong điều kiện vô trùng

 Có thể tạo ra một số lượng lớn cây sạch virus

 Hệ số nhân giống cao, có thể tạo ra một số lượng lớn cây trồng trong cùng một thời gian

4

 Khuyết điểm

Theo George (1993) thì bất lợi chủ yếu của phương pháp vi nhân giống là cần phải có kỹ năng vận hành thành công, đòi hỏi kỹ thuật cao, trang thiết bị đắt

tiền Hơn nữa kết quả nhân giống in vitro thường:

 Mặc dù phương pháp này có thể tạo ra một số lượng cây con lớn, nhưng cây con ban đầu còn nhỏ và đôi khi mang những tính trạng không mong muốn

 Để sống trong điều kiện in vitro, mẫu cấy cần được nuôi trong môi

trường chứa đường và một số nguồn carbon khác Ban đầu chúng không có khả năng tạo ra những hợp chất cần thiết hay những hợp chất hữu cơ từ quang hợp (không thể tự dưỡng) và chúng phải chịu đựng một thời gian chuyển đổi trước khi

có khả năng phát triển độc lập

 Khi cây con được nuôi trong bình chứa bằng thủy tinh hay nhựa có ẩm độ tương đối cao, thường sự quang hợp tổng không đủ, cây con thường mẫn cảm, mất nhiều nước khi đưa ra môi trường bên ngoài

 Khả năng tạo ra những cây trồng bị biến dạng di truyền có thể tăng

 Đòi hỏi kỹ thuật cao và các trang thiết bị đắt tiền

1.3 NUÔI CẤY MÔ CÚC

1.3.1 Giai đoạn 0: chuẩn bị cây mẹ

Đây là giai đoạn khởi đầu của quá trình vi nhân giống cần phải có cây mẹ tốt, khỏe Vì vậy, cần phải lưa chọn cây mẹ cẩn thận, chúng phải đặc trưng cho giống loài, không bị nhiễm bệnh và đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất, khi nhân giống sẽ đạt kết quả cao (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.3.2 Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cây và tạo nguồn mẫu khởi đầu

Tạo nguồn mẫu sạch là điều kiện tiên quyết cho sự thành công của công việc nuôi cấy mô Theo Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý (2004) báo cáo trên giống cúc CN97 cho biết khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho tỷ

lệ sống và vô trùng cao nhất Đối với giống cúc CN20 (Sray Chrysanthemum)

Nguyễn Thị Kim Lý và Nguyễn Xuân Linh đã tiến hành so sánh hiệu quả của hai chất khử trùng H2O2 và HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau Kết quả cho thấy khử trùng bằng H2O2 cho tỷ lệ sống cao nhất là 71,4% ở nồng độ 20%, trong thời gian 15 phút

Mẫu vật khi đưa vào môi trường nuôi cấy phải đảm bảo những yêu cầu sau:

tỷ lệ bị nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao tốc độ tăng trưởng nhanh Kết quả này phụ thuộc

5

vào cách thức lấy mẫu, phương pháp khử trùng, môi trường nuôi cấy thích hợp, thì

mẫu vật sẽ có tốc độ tăng trưởng nhanh (Lê Trần Bình et al., 1997)

1.3.3 Giai đoạn 2: Nhân nhanh

Đây là giai đoạn tìm ra môi trường thích hợp để cho hệ số nhân giống cao nhất, các chồi tạo ra đồng nhất về mặt di truyền, có sức sống cao, cây phát triển ít bị biến dị Theo Nguyễn Kim Lý và Nguyễn Quang Thạch (2004) đã sử dụng môi trường MS có bổ sung 1,5 mg BA/lít hay 2 mg kinetin/lít để tái sinh chồi từ mô lá

và mầm ngủ trên giống cúc Nhật “Rivalry” cho hệ số nhân chồi cao nhất Đối với

giống CN01 (Standard Chrysanthemum) thì ở nồng độ 0,5 mg BA/lít trên môi

trường MS là thích hợp cho việc nhân chồi Còn trên giống CN97 thì cần sử dụng

BA ở nồng độ 0,1 mg/lít để cho hệ số nhân chồi cao nhất (Hoàng Thị Lan Phương, 2004)

1.3.4 Giai đoạn 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Mục đích của giai đoạn này là chuẩn bị những cây con sẵn sàng cho sự chuyển ra ngoài Nó bao gồm việc ra rễ, phát triển cây con, cũng như tạo sự cứng cỏi cho chúng thích ứng với những xáo trộn sau này (Lâm Ngọc Phương, 2009) Giai đoạn này được chia thành hai giai đoạn:

 Giai đoạn 3a: Kéo dài các chồi được hình thành ở giai đoạn 2 để đạt kích thước thích họp cho việc tạo rễ đấy đủ Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hay một lượng cytokinin thấp hơn ở giai đoạn 2 Tùy thuộc vào kiểu cây

mà có thể kéo dài trên chồi đơn hay cụm chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Giai đoạn 3b: Kích thích tạo rễ và tiền thuần dưỡng

Sự tạo rễ bất định trong nuôi cấy mô thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ tuổi cây, vị trí lấy mẫu trên cây, loài thực vật, nguồn carbon, nguồn dinh dưỡng khoáng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trong nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì auxin thường được sử dụng để kích thích tạo rễ Hai loại auxin có hiệu quả trong việc kích thích ra rễ nhất là IBA và NAA ở nồng độ khoảng 0,1–1 mg/l Tuy nhiên đối với cây cúc, khi cắt những đoạn thân hay chồi ngọn cấy chuyền vào môi trường ra rễ, thì trong môi trường có hay không có auxin thì vẫn cho 100% các chồi đều tạo rễ (Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Quang Thạch, 2004;

Trần Khắc Hạnh et al., 2004; Hoàng Thị Lan Phương et al., 2004) Nếu trong môi

trường nuôi cấy có bổ sung NAA thì số rễ trung bình được tạo ra nhiều hơn và độ dài rễ ngắn hơn, các rễ có kích thước to, khỏe và có sức sống cao hơn trong môi trường không có NAA (Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý, 2004)

6

Ngoài ra, đây là giai đoạn thích hợp cho việc tiền thuần dưỡng nhằm tăng khả năng tự dưỡng của cây con trước khi đem ra môi trường tự nhiên, với các phương pháp thực hiện như: cung cấp cho cây con lượng carbohydrate, làm thấp ẩm

độ tương đối trong bình, để keo ngoài điều kiện tự nhiên trước khi đưa ra ngoài (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.3.5 Giai đoạn 4: Thuần dưỡng cây con ngoài môi trường tự nhiên

Chất lượng cuối cùng của công việc nhân giống in vitro phụ thuộc một vào

việc thần dưỡng Thông thường các cây con đầu giai đoạn cấy mô được mang trồng trực tiếp ra nhà lưới hay môi trường tự nhiên, thì tỷ lệ chết rất cao Nguyên nhân chủ yếu có thể là do cấu trúc giải phẩu của nuôi cấy mô không thích hợp với điều kiện tự nhiên, cũng có thể là do sự thay đổi đột ngột của điều kiện môi trường Vì vậy, để tăng tỷ lệ sống của cây con ngoài nhà lưới thì cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện thích nghi với sự thay đổi của nhiệt độ, ẩm độ, sự mất nước và sâu bệnh

(Lê Trần Bình et al., 1997)

Cây con chuyển từ giai đoạn 3 được rửa sạch agar, sau đó trồng trên giá thể thích hợp, được giữ ẩm độ cao, tránh ánh sáng cao Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi này khoảng 2–3 tuần, trong thời gian này phải hạn chế tối đa những yếu tố bất lợi như mất nước nhanh chóng làm cho cây khô héo, nhiễm vi khuẩn và nấm làm cây thối nhũng cháy lá do nắng (George,1993)

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ CÚC

1.4.1 Nuôi cấy mô hoa cúc CN97 (hoa màu trắng)

Theo Hoàng Thị Lan Hương et al (2004) đã xây dựng qui trình nhân chồi

hợp lý như sau: Khử trùng nguyên liệu bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút cho tỉ lệ mẫu sống 51,5% Sử dụng môi trường MS + BA (0,1 mg/lít) + 15% nước dừa để nhân nhanh chồi cúc với hệ số nhân chồi là 5,3 chồi/mẫu và tạo cây hoàn chỉnh ở môi trường MS + NAA (0,1 mg/lít) + 15% nước dừa là tốt nhất

1.4.2 Nuôi cấy mô hoa cúc CN01 (Standard Chrysanthemum)

Theo Trần Khắc Hạnh et al (2004) sử dụng môi trường MS + BA (0,5

mg/lít) + 15% nước dừa thì số chồi thu được sau 4 tuần cấy là 4,98 chồi/mẫu Và sử dụng môi trường MS + 15% nước dừa để tạo cây hoàn chỉnh sau 2 tuần nuôi cấy Thuần dưỡng nhà lưới, sử dụng giá thể là đất và tro trấu theo tỉ lệ 1:1 hay cát và tro trấu (tỉ lệ 1:1) cho tỉ lệ sống cao

7

1.4.3 Nuôi cấy mô cúc “Farm tím”

Theo Nguyễn Mộng Thúy (2009), sử dụng môi trường nhân chồi là ½ MS + 10% nước dừa, đây là môi trường thích hợp cho nhân chồi hoa cúc Hoặc sử dụng ½

MS + BA (1 mg/lít) + NAA (0,2 mg/lít) + 10% nước dừa cho hệ số nhân chồi cao nhất là 133,3 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy

Giai đoạn để hoàn chỉnh cây cúc cấy mô là môi trường MS có sự hiện diện của than hoạt tính kết hợp với NAA (0,5 mg/lít) cho tỉ lệ tạo rễ cao (100%), số rễ được hình thành là 4,3 rễ/chồi, sự vươn dài rễ là 5,6 cm và chiều cao chồi gia tăng

là 4,6 cm Đây là môi trường tốt nhất cho sự tạo rễ/chồi (Đỗ Bé Thảo, 2009)

1.5 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Trong điều kiện in vitro, mô cấy khi tách rời khỏi cơ thể mẹ sẽ phụ thuộc vào

những điều kiện môi trường nuôi cấy cung cấp Môi trường dinh dưỡng cơ bản của nuôi cấy mô hiện nay rất đa dạng do những tác giả khác nhau với các mục đích khác nhau Trải qua nhiều thử nghiệm người ta nhận thấy phải sử dụng môi trường

chuyên dụng cho từng loài hay từng loại mô cấy chuyên biệt (Lê Văn Hòa et al.,

2001)

Các thành phần cơ bản của nuôi cấy mô thực vật bao gồm: muối khoáng (đa lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng, agar (đối với môi trường rắn) (Nguyễn Đức Thành, 2000) Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và các cơ quan được nuôi cấy Đối với cùng loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy khác nhau, môi trường nuôi cấy cũng khác nhau Ngoài ra, môi trường nuôi cấy còn thay đổi

theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ et al., 2006)

1.5.1 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy Nước sử dụng trong nuôi cấy thường là nước cất một lần Trong một số trường hợp, người ta sử dụng nước cất hai lần hay nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

1.5.2 Khoáng đa lượng

Trong môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962), 1/2MS và White’s

(1963) (trích dẫn bởi Lê Trần Bình et al., 1997) gồm các nguyên tố N, P, K, Mg, S,

Ca, Na Các nguyên tố đa lượng được sử dụng với nồng độ 30 mg/l

Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng lớn cho sự hấp thu mô cấy

và chúng không gây ngộ độc Trong nuôi cấy in vitro nguồn nitơ thường được sử

dụng dưới dạng nitrate (NO3-), ammonium (NH4+) Ngoài ra, nitơ còn được sử dụng

8

dưới dạng nitơ hữu cơ như acid amin Tuy nhiên, nếu chỉ dùng acid amin làm nguồn cung cấp nitơ cho mô rất yếu, sự có mặt đồng thời của nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ ở hàm lượng thích hợp sẽ thúc đẩy tế bào sinh trưởng mạnh (Vũ văn Vụ, 1999)

1.5.3 Khoáng vi lượng

Nhu cầu về khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô tế bào là rất cần thiết Đây là những nguyên tố rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng, nhưng chỉ sử dụng với lượng rất ít Các khoáng vi lượng thường được thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molybden (Mo),

Cobalt (Co), Sắt (Fe) Theo Legrand et al (1975) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2002), sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc biệt quan trọng trong quá trình tạo chồi và rễ bất định Sắt được sử dụng trong nuôi cấy mô là ở dạng chelate (Fe-EDTA) Vì ở dạng chelate, sắt không bị tủa mà được phóng thích

từ từ vào môi trường nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Văn Uyển et al., 1993)

1.3.4 Nguồn carbohydrate

Trong nuôi cấy mô, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp chúng phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay trong nuôi cấy mô thường sử dụng là sucrose (2 – 8%), và đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nhìn chung trong nuôi cấy mô thì môi trường MS cũng khẳng định được

việc sử dụng 3% sucrose tốt hơn 2% và 4% (Pati et al., 2006)

1.3.5 Vitamin

Trong môi trường nuôi cấy, đa số mô cấy chưa có cấu trúc để tự tổng hợp đủ lượng vitamin cần thiết nên cần phải bổ sung thêm vitamin từ bên ngoài vào (Lê

Văn Hòa et al., 1999) Việc bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy in vitro là rất

cần thiết Tuy rằng, vitamin được sử dụng với lượng nhỏ, nhưng nó có vai trò quan trọng trong xúc tác hệ thống enzym để có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của mô cấy Các vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol Trong đó, thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các loại tế bào thực vật (Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Myo-inositol có vai trò trong sự sinh tổng hợp thành tế bào và thường được dùng với hàm lượng 50 – 100 mg/l (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

thuộc nhóm cytokinin như zeatin,…(Vũ Văn Vụ et al., 2006) Lượng nước dừa

thường dùng trong nuôi cấy mô khá lớn từ 15 – 29% thể tích môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.3.8 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất có hoạt tính sinh học rất lớn, được tạo ra một lượng rất nhỏ để điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát

triển của thực vật (Lê Văn Hòa et al., 1999) Trong cấy mô thường sử dụng hai

nhóm chất chính là auxin và cytokinin, ngoài ra gibberellin và ethylene cũng có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2000)

 Auxin

Nhóm auxin được bổ sung vào môi trường nuôi cấylà rất cần thiết, vì chúng rất cần cho sự phân chia tế bào (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002), tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Kogl (1934) (trích dẫn bởi Lê Văn Bé, 2007) đã xác định được công thức hóa học của các auxin và gọi tên là indole-3-acetic acid (IAA) Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic (IAA)

và auxin tổng hợp là indole-3-butyric acid (IBA), 1-alpha-naphthaleneacetic acid (NAA) và 2,4-dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D) (Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Tùy theo mục đích thí nghiệm nên có thể sử dụng loại và nồng độ auxin khác nhau Auxin được dùng với hàm lượng thấp sẽ gia tăng sự hình thành rễ, ngược lại sử dụng nồng độ cao sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự thành lập rễ nhưng lại kích thích

sự tạo callus (Vũ Văn Vụ et al., 2006) 2,4 – D rất cần cho sự phản biệt hóa để tạo

callus NAA là một loại auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA và IBA thường được sử dụng để tạo ra rễ (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

10

 Cytokinin

Cytokinin là một trong hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nhóm cytokinin có tác dụng kích thích sự

phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro; có biểu hiện ức chế

sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến

sự phát sinh phôi vô tính của mẫu cấy Ngoài ra, cyttokinin còn ức chế quá trình già

ở lá, kích thích tạo diệp lục tố Các cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy

mô là 6-benzyladenine (BA), kinetin, zeatin, 2-ip,… Trong đó, BA và kinetin thường được sử dụng hơn, BA cũng giống như kinetin là thành phần thiết yếu của môi trường nuôi cấy mô, BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin

Một số nghi nhận trong các nghiên cứu nhân chồi in vitro cho rằng nếu tăng

nồng độ cytokinin sẽ nhận được nhiều chồi, tuy nhiên sẽ dẫn đến hiện tượng cây sinh trưởng bất thường, lá nhỏ, cong queo, mất diệp lục tố, đặc biệt trong môi

trường lỏng; người ta gọi hiện tượng này là dư thừa nước (hyperhydricity) (Debergh

et al., 1991) Để giảm bớt hiện tượng này phải giảm hàm lượng cytokinin trong môi

trường cấy hoặc kết hợp với nhóm auxin (George, 1993) Ngoài ra, trên một số cây

trồng lại cho thấy tỷ lệ nhân giống giảm khi tăng nồng độ cytokinin (Corchete et al.,

1.6 ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH TÁC DỤNG LÊN CÂY CẤY MÔ

1.6.1 Ánh sáng

Ánh sáng là nhân tố môi trường quan trọng kiểm soát sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, vì nó liên quan đến quang hợp, sự quang dưỡng và sự phát sinh hình thái (Salisbury và Ross, 1994; Read và Preece, 2003) Sự chiếu sáng có thể là

quan trọng nhất vì nó liên quan rất nhiều đến quang hợp và hô hấp (Matthijs et al.,

1993) Theo George (1993) các đặc tính của ánh sáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

in vitro là: độ dài sóng, cường độ sáng và thời gian chiếu sáng hay chu kỳ sáng

11

 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của chồi trong ống nghiệm

Theo Murashige (1974) thì chồi trong ống nghiệm phát triển ở cường độ sáng khoảng 1000 lux (14 – 15 µmol.m-2.s-1) Cây Limonium sinh trưởng trong điều kiện quang tự dưỡng in viro kết hợp với cường độ chiếu sáng cao (200 µmol.m-2.s-1) cho nhiều lá, hàm lượng diệp lục tố, tỷ lệ quang hợp thuần và phần trăm sống sót khi đem ra ngoài cao hơn những cây sinh trưởng trong điều kiện chiếu sáng yếu (50

và 100µmol.m-2.s-1) (Lian et al., 2002) Cây Siningia có thể tạo chồi ở cường độ

sáng từ 3000 – 10.000 lux (Haramaki, 1971) Theo Miller và Murashige (1976), cây hoa kiểng nhiệt đới cũng tạo chồi mạnh với điều kiện sáng từ 3000 – 10.000 lux Tùy theo loài mà yều cầu cường độ sáng khác nhau trong giai đoạn nhân chồi Cây Gloxinia tạo chồi ở cường độ sáng khoảng 3.200 lux, nhưng khi tăng cường độ ánh sáng lên 10.700 lux thì sự sinh trưởng của chồi bị giới hạn (Haramaki, 1971)

 Ảnh hưởng của ánh sáng đối với sự thành lập rễ

Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng ánh sáng làm tăng sự thành lập rễ và

sự sinh trưởng của chồi (Cabeleiro và Economou, 1992; Cui et al., 2000; Lian et al., 2002; Kumar et al., 2003) Một số nghiên cứu khác thì cho rằng điều kiện tối, thích

hợp cho sự thành lập rễ (Hammerschlag, 1982) Ánh sáng làm giảm sự ra rễ là do

có sự suy giảm hàm lượng IAA nội sinh trong cây (George, 1993)

1.6.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng khác nhau lên tiến trình sinh l ý như hô hấp và quang hợp, và từ lâu người ta đã biết nó ảnh hưởng rất lớn đến nuôi cấy mô thực vật và vi nhân giống (Altman, 2000; Read và Preece, 2003) Trong môi trường tự nhiên, thực vật trải qua những khoảng biến động nhiệt độ lớn, đặt biệt giữa ngày và đêm Do đó nên tập cho cây trồng quen với sự biến đổi này giúp cây trồng cải thiện sự sinh trưởng và ở những phòng tăng trưởng không sử dụng máy điều hòa thì tiết kiệm được chi phí nhiên liệu do nhiệt độ về đêm giảm (George, 1993) Một thuận lợi nữa

là sự biến động nhiệt độ hỗ trợ cho sự trao đổi khí bên trong bình chứa (Chalupa, 1987)

1.7 MỘT SỐ KỸ THUẬT GIÚP GIA TĂNG SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HẠ

GIÁ THÀNH TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO

1.7.1 Sử dụng ánh sáng tự nhiên

Theo Ahloowalia và Savangikar (2002), giảm chi phí về năng lượng và lao động là rất cần thiết để hạ giá thành sản xuất Phần lớn điện năng sử dụng trong nuôi cấy mô được dùng cho việc khử trùng, chiếu sáng phòng tăng trưởng, tủ cấy, máy điều hòa,… Ánh sáng nhân tạo trong phòng tăng trưởng là một trong những

12

phương pháp tốn kém và không hiệu quả nhất trong kỹ thuật nuôi cấy mô Thay đổi

sự chiếu sáng nhân tạo sang sử dụng ánh sáng tự nhiên là một lựa chọn giảm chi phí đáng kể Sự vận hành của đèn, thiết bị cảm ứng, bộ điều khiển thời gian, máy ổn áp, góp phần làm tăng chi phí Hơn nữa, đèn chiếu sáng làm tỏa ra một lượng nhiệt, do đó làm tăng thêm chi phí làm mát bằng máy điều hòa

Hơn nữa, ánh sáng từ đèn huỳnh quang chỉ cung cấp nhu cầu năng lượng tối thiểu cho quang hợp Mô thực vật hình thành và thích nghi ở điều kiện ánh sáng yếu và có thể bị thủy tinh thể, làm cho chúng sống sót kém ở môi trường bên ngoài Điều này có thể là bất lợi lớn cho sự phát triển của cây trồng sau này ở điều kiện bên ngoài (Ahloowalia và Savangikar, 2002)

Dưới cường độ ánh sáng nhân tạo thấp, cây trồng dự trữ kém và hệ thống rễ yếu Nên khi chuyển ra thuần dưỡng môi trường bên ngoài, rễ mọc trong điều kiện

in vitro phải tự điều chỉnh cho phù hợp với sự thay đổi pH trong đất Thường thì hệ

rễ không thích nghi với pH đất nên cây không phát triển Nếu cây không mọc ra rễ mới thì cây trồng sẽ chết Để giải quyết vấn đề này, phương pháp tối ưu là sử dụng ánh sáng tự nhiên để nuôi cấy Phương pháp này có thể giúp cây trồng mạnh hơn và tăng tỷ lệ sống sót giai đoạn thuần dưỡng (Ahloowalia và Savangikar, 2002)

Do đó, sử dụng ánh sáng tự nhiên thay cho ánh sáng đèn là một lựa chọn

hiệu quả để giảm chi phí trong kỹ thuật nuôi cấy mô (George, 1993; Escalona et al.,

1998; Firoozabady và Gutterson, 2003) Điều này không những giảm chi phí mà còn giúp cải thiện chất lượng cây trồng Có thể thay thế ánh đèn bằng cách nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng tự nhiên của nhà kiếng hoặc bằng plastic Cách này rất tốt

ở vùng ôn đới, nhưng ở vùng nhiệt đới thì phải thiết kế một máy quạt để hút nhiệt ra bên ngoài (Ahloowalia và Savangikar, 2002)

1.7.2 Giảm chi phí điều hòa nhiệt độ

Theo Ahloowalia và Savangikar (2002), không có sự khác biệt về chỉ tiêu sinh trưởng của cây trong điều kiện có và không có máy điều hòa nhiệt độ Thực tế, khi nuôi cấy dưới ánh sáng đèn, cây trồng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ hẹp

nên sẽ bất lợi trong giai đoạn vườn ươm Thực tế, cây trồng in vitro có thể chịu

đựng với sự thay đổi biên độ nhiệt giữa ngày và đêm khá lớn Và cây có khả năng

sự sinh trưởng tốt hơn Theo Kodym et al (2001), chuối và khoai tây khi nuôi cấy

mô ở nhiệt độ từ 16 – 41oC dưới ánh sáng tự nhiên cho thấy sinh truởng tốt hơn ở phòng tăng trưởng Ngoài ra, Be và Debergh (2006), đề nghị sử dụng môi trường tự nhiên của nhà lưới để nuôi cấy khóm

13

1.7.3 Một số nghiên cứu sử dụng ánh sáng tự nhiên để vi nhân giống

 Sản xuất khóm cấy mô (Ananas comosus (L.) Merr.)

Lê Văn Bé et al (2006) đã sử dụng hai điều kiện môi trường nuôi cấy trong

sản xuất khóm cấy mô và có một số kết luận sau: Trong quy trình nuôi cấy mô khóm, giai đoạn nhân chồi và ra rễ có thể tiến hành trong điều kiện nhà lưới sử dụng nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên (6.000 – 8.000 lux, 30 – 31oC) thay cho điều kiện nhiệt độ và ánh sáng trong phòng tăng trưởng (2.000 lux, 24oC) Do vậy, chi phí sản xuất ra cây con giảm 18,78% do không phải chi cho khoảng tiền điện và trang thiết bị như của điều kiện phòng tăng trưởng Từ một chồi ban đầu được cấy trong môi trường MS có bổ sung 0,8 đến 1 mg BA/lít sẽ thu được trung bình từ 7,7 đến 8,6 chồi hữu hiệu (chiều cao chồi > 2,5 cm) sau 8 tuần nuôi cấy Theo lý thuyết

hệ số nhân giống là 1,2 triệu chồi con được tạo ra trong thời gian một năm từ một chồi ban đầu

 Vi nhân giống cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides L.)

Lê Văn Bé et al (2006) quy trình vi nhân giống cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides L.) sử dụng môi trường Murashige và Skoog (MS) lỏng có bổ sung 2 –

4 mg BA/l cho hiệu quả nhân giống tốt nhất, trung bình 1 chồi ban đầu sau 6 tuần

nuôi cấy thì được 8 chồi mới Giai đoạn nhân chồi và giai đoạn ra rễ in vitro có thể

thực hiện ngoài điều kiện môi trường tự nhiên của nhà lưới thay vì trong phòng tăng trưởng Không có sự khác biệt thống kê về sinh trưởng của cây giữa 2 điều kiện ngoại cảnh nuôi cấy cỏ Vetiver và khả năng sống sót gần 100% sau 10 tuần đem ra ngoài nhà lưới Sử dụng môi trường tự nhiên để nhân giống bằng phương pháp cấy

mô so với cây được nhân trong phòng tăng trưởng được ước tính thấp hơn khoảng 22% giá thành sản xuất

14

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 09/2009 đến tháng 06/2010

Địa điểm: phòng cấy mô của Bộ môn Sinh lý – Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp

và Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ

2.1.2 Vật liệu thí nghiệm

Cây cúc “Đài Loan” vàng được mang từ vườn của Ông Tống Hồ Hải ở khóm Tân Mỹ, phường Tân Qui Đông, thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp để sử dụng làm vật liệu ban đầu

Hóa chất: HgCl2, môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), agar, nước dừa, chất điều hòa sinh trưởng như: benzyladenin (BA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA) và một số vitamine như: thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6),

Dụng cụ: Tủ cấy, keo (6 x 12cm), thước đo, máy chụp ảnh kỹ thuật số, cân điện tử (LIBROR EB-3300 HW), máy đo cường độ ánh sáng (L1-250 Light Meter), máy đo nhiệt độ và ẩm độ,…

2.1.3 Điều kiện thí nghiệm

 Phòng tăng trưởng

Phòng tăng trưởng là phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh Lý – Sinh Hóa,

có nhiệt độ trung bình 2920C, cường độ chiếu sáng 1800500 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày

 Ngoài phòng tăng trưởng (Lồng kiếng)

Lồng kiếng có diện tích 10 m2, đặt tại nhà lưới bộ môn Sinh lý – Sinh hóa được bao xung quanh bằng kiếng, sử dụng hoàn toàn ánh sáng tự nhiên Lồng kiếng được thiết kế sao cho giảm hiện tượng hiệu ứng nhà kính tối đa bằng cách bơm hơi

ẩm qua màng lọc vào trong lồng kiếng và không khí nóng bên trong được hút ra ngoài bằng quạt hút liên tục (Hình 2.1) Thí nghiệm sử dụng nhiệt kế và thiết bị đo cường độ ánh sáng hai lần mỗi ngày (10 giờ sáng và 3 giờ chiều) trong suốt thời gian thí nghiệm Các thông số nhiệt độ và ẩm độ trong hai môi trường ngoại cảnh được ghi nhận ở Bảng 2.1

15

Hình 2.1 Lồng kiếng đặt trong nhà lưới để vi nhân chồi 2.2 PHƯƠNG PHÁP

 Giai đoạn tạo mẫu ban đầu

Vật liệu tạo chồi ban đầu là những đoạn thân non có chiều dài khoảng 1 – 2

cm Các đoạn thân này được cắt bỏ hết lá và khử trùng theo phương pháp George (1993)

Phương pháp khử trùng mẫu: đoạn thân cây hoa cúc được rửa dưới vòi nước máy, sau đó ngâm trong nước có chứa 2 – 3 giọt nước rửa chén từ 1 – 2 phút rồi rửa nhẹ dưới vòi nước chảy trước khi được chuyển vào xử lý tiếp trong điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm Các mẫu được ngâm trong Chlorua thủy ngân (HgCl2) 0,1%, 15 phút Trong suốt thời gian ngâm mẫu trong dung dịch này có lắc nhẹ Sau

đó, rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng Tất cả các mẫu sau khi đã khử trùng được đưa vào môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,5 mg NAA/lít và 1 mg BA/lít, và được đặt trong phòng tăng trưởng nhiệt độ 2920C, cường độ sáng 1800500 lux (Bảng 2.1), thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày

16

Bảng 2.1 Các thông số môi trường giữa hai điều kiện trong và ngoài phòng tăng

trưởng trong suốt quá trình thí nghiệm

Điều kiện nuôi cấy Cường độ ánh sáng

Giai đoạn vô mẫu ban đầu thành công rất thấp khoảng 10/100 keo còn sống,

do thao tác của người cấy, nhiễm nấm, mẫu còn bị chết do ngâm clorua thủy ngân ở thời gian dài,

Sau 6 tuần, từ những chồi tái sinh này sẽ được nhân nhanh trong môi trường

MS cơ bản có bổ sung 10% nước dừa, 1 mg BA/lít và 0,5 mg NAA/lít đủ số lượng chồi thì tiến hành giai đoạn kế tiếp

2.2.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh đến sự nhân chồi từ lá của cây hoa cúc “Đài Loan”

cấy thích hợp lên sự tạo chồi trực tiếp từ mẫu lá cây hoa cúc

Lá từ chồi tái sinh in vitro được sử dụng làm vât liệu thí nghiệm này Chọn

những lá trên ngọn có kích thước tương đương nhau (1 cm) Các lá này được cấy vào những keo thủy tinh có kích thước 6x12 cm (đường kính x chiều cao) và được đậy bằng nắp nhựa Mỗi keo chứa 30 ml môi trường MS đặc có bổ sung 10% nước dừa và các kích thích tố ở các nồng độ khác nhau Các nghiệm thức sau khi cấy được 3 – 5 ngày thì đem ra ngoài lồng kiếng, mục đích của việc để trong phòng tăng trưởng 3 – 5 ngày là để cho cây ổn định, thích nghi dần với điều kiện nuôi cấy Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 2 nhân tố:

Nhân tố 1 là môi trường ngọai cảnh nuôi cấy (phòng tăng trưởng và lồng kiếng)

17

6 2 mg BA/lít + 1 mg NAA/lít

7 4 mg BA/lít + 1 mg NAA/lít Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, 7 lần lặp lại, 1 keo/lần lặp lại, mỗi keo cấy 5 mẫu lá có kích thước tương đương nhau và có tạo vết thương

Số chồi trên hữu hiệu/mẫu lá

Chiều cao gia tăng

Số lá/chồi gia tăng

Chỉ tiêu được ghi nhận thời điểm 2 tuần sau khi cấy, 2 tuần ghi nhận một lần

và liên tục trong 6 tuần

2.2.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện nuôi cấy lên sự

ra rễ in vitro của chồi cúc “Đài Loan”

Nhân tố 1 là điều kiện nuôi cấy (phòng tăng trưởng và lồng kiếng)

Chiều dài rễ gia tăng

Chiều cao gia tăng

Số lá gia tăng

Chỉ tiêu được ghi nhận thời điểm 2 tuần sau khi cấy, 2 tuần ghi nhận một lần

và liên tục trong 6 tuần

Hình 2.2 Chồi cúc ở 5 ngày SKC

 Giai đoạn thuần dưỡng cây con

Sử dụng cây con của thí nghiệm 3 để trồng ở điều kiện nhà lưới Cây con được chọn phải đồng nhất về kích thước và được trồng trên giá thể phân rơm đã oai mục Mỗi khai trồng 50 cây và trồng riêng cây con của hai điều kiện nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi: Sau 4 tuần ghi nhận tỷ lệ sống (%)

 Ước lượng và so sánh giá thành sản xuất một chồi con cúc “Đài Loan” vàng trong hai điều kiện nuôi cấy khác nhau, phòng tăng trưởng và lồng kiếng

2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỐ LIỆU

Các số liệu thu thập được phân tích bằng phần mềm Exel và SPSS 11.4