KHẢO sát mô học KHẢNĂNG KÍCH KHÁNG của một số hóa CHẤT đối với BỆNH THÁN THƯ DO nấm colletotrichum lagenarium TRÊN dưa LEO (cucumis sativusl )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Chứng nhận luận văn tốt nghiệp với đề tài: KHẢO SÁT MÔ HỌC KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CỦA MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỐI

Trang 1

-

-LÊ MINH CHÂU

KHẢO SÁT MÔ HỌC KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CỦA

MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỐI VỚI BỆNH THÁN THƯ

DO NẤM Colletotrichum lagenarium TRÊN DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH TRỒNG TRỌT

Cần Thơ - 2007

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trang 2

oOo

LÊ MINH CHÂU

KHẢO SÁT MÔ HỌC KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CỦA MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỐI VỚI BỆNH THÁN THƯ

DO NẤM Colletotrichum lagenarium TRÊN DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH TRỒNG TRỌT

Trang 3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Chứng nhận luận văn tốt nghiệp với đề tài:

DO NẤM Colletotrichum lagenarium

TRÊN DƯALEO (Cucumis sativus L.)

Do sinh viên Lê Minh Châu thực hiện và đề nạp

Kính trình Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp xem xét

Cần Thơ, ngày tháng năm 2007

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Trần Thị Thu Thủy

KS Lê Thị Mai Thảo

Trang 4

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn đính kèm đề tài:

DO NẤM Colletotrichum lagenarium

TRÊN DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

Do sinh viên Lê Minh Châu thực hiện bảo vệ trước Hội đồng ngày tháng năm

Duyệt của Ban Chủ Nhiệm

Khoa NN & SHƯD

Trang 5

TÓM TẮT TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: LÊ MINH CHÂU

Sinh ngày: 01/06/1985

Quê quán: Thị Xã Vĩnh Long, Tỉnh Vĩnh Long

Họ và tên cha: LÊ THANH ĐÔNG

Nghề nghiệp: Công nhân viên

Họ tên mẹ: LÊ THANH THỦY

Nghề nghiệp: Công nhân viên

Đã tốt nghiệp Phổ Thông Trung Học tại trường Phổ Thông Trung Học Lưu Văn Liệt Trúng tuyển vào trường Đại Học Cần Thơ năm 2002, sinh viên Trồng Trọt khóa 28, thuộc Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng và đã tốt nghiệp năm

2007

Trang 6

CẢM TẠ

Kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn của con Cha Mẹ cùng những người thân đã động viên, hướng dẫn và giúp đỡ con trong cuộc sống cũng như trong học tập

Cô Trần Thị Thu Thủy và chị Lê Thị Mai Thảo đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ

để em có thể hoàn thành luận văn này

Thầy Huỳnh Minh Châu, quý thầy cô và các anh chị trong Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật đã tạo đầy đủ điều kiện về cơ sở vật chất cho em nghiên cứu trong quá trình thực hiện luận văn

Các thầy cô, cán bộ trong Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng cũng như của trưòng Đại Học Cần Thơ đã tạo đầy đủ điều kiện cho em học tập và nghiên cứu trong thời gian qua

Các thầy cô trong thư viện Khoa NN & SHƯD đã cung cấp tài liệu cho em để hoàn thành luận văn

Và cuối cùng xin chân thành cảm ơn những người bạn đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng như trong quá trình làm luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Lê Minh Châu

Trang 7

LỜI CAM ĐOAN

Kết quả thí nghiệm sau đây chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây

Trang 8

LÊ MINH CHÂU, 2007 Khảo sát mô học khả năng kích kháng của một số hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium trên dưa leo (Cucumis

sativus L.) Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

_

TÓM LƯỢC

Đề tài “Khảo sát mô học khả năng kích kháng của một số hóa chất đối với

bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium trên dưa leo (Cucumis sativus

L.)” được thực hiện từ tháng 8 năm 2006 đến tháng 1 năm 2007, tại bộ môn Bảo

Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ nhằm xác định khả năng kích kháng của một số hóa chất trên khía cạnh mô học thông qua sự phát sáng của tế bào, sự tích tụ phenol và callose

Khả năng kích kháng của 5 hóa chất Chitosan, CuCl2, K2HPO4, acid Salicylic, CaCl2 thông qua phản ứng phát sáng của tế bào, sự tích tụ phenol, callose được thực hiện trên giống dưa leo Salawin, chủng bệnh khi cây dưa được 3 lá thật với mật số 106 bào tử/ml Mẫu được thu vào thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 và 120 giờ sau tấn công (GSTC), tẩy diệp lục tố và trữ trong lactoglycerol cho đến khi quan sát Sự phát sáng tế bào được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng 400-450nm) bằng dung dịch aniline Blue (0,01%), sự tổng hợp poly phenol quan sát dưới kính hiển vi quang học sau khi được nhuộm với Toluidine Blue O, sự tích tụ callose quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng 330-380nm) sau khi được nhuộm với Leucoaniline Blue

Kết quả cho thấy:

+ Cả 5 hóa chất đều có khả năng kích thích tính kháng bệnh thán thư trên dưa leo qua tỷ lệ đĩa áp tạo phản ứng phát sáng, trong đó K2HPO4, CaCl2 thể hiện tính kháng sớm ở thời điểm 72 GSTC, chitosan và CuCl2 thể hiện tính kháng

Trang 9

muộn hơn ở 96 GSTC và kéo dài đến 120 GSTC, acid salicylic chỉ thể hiện tính kháng ở 96 GSTC.

+ Khảo sát khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum

lagenarium của 5 hóa chất thông qua sự tích tụ phenol cho thấy chỉ có 3 hóa chất CaCl2, chitosan và CuCl2 có khả năng kích thích tế bào gia tăng sự tổng hợp phenol

ở thời điểm 96 GSTC Cả 3 hóa chất thể hiện tính kháng qua phần trăm đĩa áp tạo phenol và kích thước vùng tế bào tạo phenol CaCl2 chỉ biểu hiện tính kháng qua phần trăm đĩa áp tạo phenol, trong khi đó, chitosan và CuCl2 vừa thể hiện tính kháng qua phần trăm đĩa áp tạo phenol vừa thể hiện khả năng kích kháng qua kích thước vùng tế bào tích tụ phenol

+ Các hóa chất kích kháng đều có khả năng kích thích cây dưa leo gia tăng sự tích tụ callose thông qua tỷ lệ đĩa áp tạo callose, tỷ lệ đĩa áp tạo callose ở vách tế bào và kích thước vùng callose hình thành/đĩa áp Khả năng kích kháng của chitosan thể hiện sớm ở 48 GSTC, K2HPO4 xuất hiện muộn hơn ở 72 GSTC, các hóa chất còn lại thể hiện tính kháng muộn nhất ở 96 GSTC

Trang 10

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ……… 1

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ……… 2

1.1 BỆNH THÁN THƯ TRÊN DƯA LEO ……… 2

1.1.1 Triệu chứng……… 2

1.1.2 Tác nhân……… 2

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh……… 3

1.2 SỰ KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG BỆNH TRÊN CÂY TRỒNG ……… 3

1.2.1 Khái niệm……… 3

1.2.2 Các hình thức kích kháng……… 4

1.2.2.1 Kích kháng tại chỗ……… 4

1.2.2.2 Kích kháng lưu dẫn……… 4

1.2.3 Cơ sở khoa học kích thích tính kháng trên khía cạnh mô học……… 5

1.2.3.1 Sự phát sáng của tế bào……… 5

1.2.3.2 Phản ứng siêu nhạy cảm 6

1.2.3.3 Sự tích tụ phenol 7

1.2.3.4 Sự tổng hợp callose 8

1.2.3.5 Sự lignin hóa……… 9

1.3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG BỆNH CÂY TRỒNG TRÊN KHÍA CẠNH MÔ HỌC 10

1.4 ĐẶC TÍNH CỦA CÁC HÓA CHẤT KÍCH KHÁNG ……… 11

1.4.1 CuCl2.……… 11

1.4.2 Acid salicylic……… 12

Trang 11

1.4.3 Canxi clorua 12

1.4.4 Chitosan 12

1.4.5 K2HPO4 13

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ……… 14

2.1 PHƯƠNG TIỆN ……… 14

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm……… 14

2.1.2 Phương tiện thí nghiệm……… 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP ……… 15

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào……… 16

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự tích tụ phenol……… 18

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tích tụ callose……… 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……… 21

3.1 HIỆU QUẢ KÍCH KHÁNG CỦA CÁC HÓA CHẤT QUA PHẢN ỨNG PHÁT SÁNG CỦA TẾ BÀO ……… 21

3.2 HIỆU QUẢ KÍCH KHÁNG CỦA CÁC HÓA CHẤT QUA SỰ TÍCH TỤ HỢP CHẤT PHENOL ……… 26

3.3 HIỆU QUẢ KÍCH KHÁNG CỦA CÁC HÓA CHẤT QUA SỰ TÍCH TỤ CALLOSE ……… 30

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……… 36

4.1 KẾT LUẬN ……… ………36

4.2 ĐỀ NGHỊ ……….36

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 37

PHỤ CHƯƠNG……… 43

Trang 12

Sự phát sáng tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang

Sự tổng hợp polyphenol ở thời điểm 96 GSTC

Sự tích tụ callose dưới kính hiển vi huỳnh quang khi xử lí chitosan vào 48 GSTC

Sự tích tụ callose dưới kính hiển vi huỳnh quang khi xử lí K2HPO4vào 72 GSTC

Trang 13

Phần trăm đĩa áp tạo phản ứng phát sáng ở thời điểm 36 và 48 GSTC

Phản ứng phát sáng của tế bào lá dưa leo khi quan sát dưới kính hiển

vi huỳnh quang ở thời điểm 72 GSTC

vi huỳnh quang ở thời điểm 96 GSTC

vi huỳnh quang ở thời điểm 120 GSTC Phần trăm đĩa áp tạo sự tích tụ phenol ở thời điểm 72 GSTC

Sự tích tụ phenol của tế bào lá dưa leo ở thời điểm 96GSTC

Phần trăm đĩa áp tạp phenol của tế bào lá dưa leo ở thời điểm 120 GSTC

Phản ứng phát sáng Callose của tế bào lá dưa leo khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở thời điểm 48 GSTC

Trang 14

MỞ ĐẦU

Dưa leo có nguồn gốc từ Ấn Độ hơn 3000 năm trước và ngày nay đã lan truyền khắp nơi trên thế giới (Trần Khắc Thi, 1999) Do có hàm lượng vitamin và chất khoáng cao nên dưa leo rất được ưa chuộng ở các nước có khẩu phần ăn giàu năng lượng (Trần Thị Ba và ctv, 1999) Tuy nhiên việc sản xuất dưa leo ở nước ta nói chung cũng như ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng còn gặp nhiều khó khăn do sâu bệnh ngày càng phát triển Trong đó, bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum lagenarium gây ra là một trong những bệnh quan trọng và khó phòng trị, bệnh có thể gây hại trên thân, lá, trái và làm giảm năng suất từ 30-50% (Hector và ctv, 2000) Để đối phó với bệnh người dân phải thường xuyên sử dụng thuốc hóa học, biện pháp này tuy có hiệu quả nhưng ảnh hưởng đến môi trường và người tiêu dùng Vì vậy, việc tìm biện pháp quản lí bệnh đạt hiệu quả cao và hạn chế sử dụng thuốc hóa học là nhu cầu cần thiết và cấp bách hiện nay Một trong những biện pháp đã được ứng dụng thành công trên nhiều loại cây trồng là việc kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn trong cây Trên dưa leo các hợp chất như chitosan, CuCl2, Acid Salicylic, CaCl2, K2HPO4 đã dược nghiên cứu và cho thấy có hiệu quả kích kháng chống lại bệnh thán thư (Lê Thanh Toàn, 2006) Tuy nhiên, đó chỉ là những đánh giá dựa vào triệu chứng bên ngoài, trong khi đó những biểu hiện bên

trong tế bào chưa được thực hiện Do đó, đề tài “ Khảo sát mô học khả năng kích

kháng của một số hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum

xác định khả năng kích kháng của một số hóa chất trên khía cạnh mô học thông qua

sự phát sáng của tế bào, sự tích tụ phenol và callose

Trang 15

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 BỆNH THÁN THƯ TRÊN DƯA LEO

1.1.1 Triệu chứng

Bệnh có thể tấn công trên tất cả các bộ phận của cây như lá, thân, trái, nhưng chủ yếu trên lá và nặng nhất là các lá gần gốc (Nguyễn Thị Nghiêm và Võ Thanh Hoàng, 1999) Trên lá, vết bệnh có dạng hình tròn hay bất dạng, viền ngoài màu nâu, bên trong màu nâu nhạt hơn, có quầng vàng tươi xung quanh vết bệnh Ở những vết cũ tâm vết bệnh có thể bị rách, ở những lá còn nhỏ, đang phát triển, bệnh

có thể làm cho lá bị vặn vẹo, biến dạng hoặc lá bị thối khi vết bệnh nặng (Averre, 1999) Còn ở những lá già, vết bệnh ban đầu nhỏ sau đó từ từ lan rộng ra nhanh chóng, trở nên nâu và nâu đỏ Sau đó nhiều vết bệnh hợp lại làm cho lá bị khô, rách (Sikora, 1997)

Trên thân, lúc đầu là các vết nhỏ màu nâu, khô và sần sùi Sau đó vết bệnh lan rộng ra và có màu xám làm cho thân khô và chết (Nguyễn Thị Nghiêm, 2001)

Trên trái, vết bệnh có màu hồng, dạng hình tròn hay hình thoi, hơi úng nước, lõm xuống và có thể làm vỡ mô Trên vết bệnh có những chấm đen nhỏ li ti bên trong Các vết bệnh phát triển nhanh và rải rác khắp đều vùng vỏ trái, có khi liên kết lại thành các vết thối rộng ra Đặc biệt nếu quan sát kỹ sẽ thấy những vòng tròn đồng tâm nơi vết bệnh (Weber, 1973; Trần Thị Ba, 1981)

1.1.2 Tác nhân

Bệnh thán thư trên dưa leo do nấm Colletotrichum lagenarium (Colletotrichum

orbiculare) gây ra (Weber, 1973; Trần Thị Ba, 1981; Nguyễn Thị Nghiêm, 2001)

Nấm Colletotrichum lagenarium thuộc chi Colletotrichum, bộ Molanconiales, lớp

Deuteromycetes (Barnett và Hunter, 1998)

Trang 16

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

Nhiệt độ tối hảo cho nấm Colletotrichum lagenarium phát triển và nảy mầm là

20-300C Lượng mưa và ẩm độ cao là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự phát triển mạnh của bệnh thán thư ở cây dưa bầu bí (Trần Thị Ba và ctv, 1999) Mầm bệnh có thể lưu tồn trong xác bã thực vật hay bám trên bề mặt hạt giống Bệnh thường xảy

ra vào những tháng mưa nhiều, bào tử lây lan chủ yếu nhờ mưa (Nguyễn Thị Nghiêm, 2001) Vào những tháng mưa nhiều, bệnh thán thư có thể gây hại và lây lan mạnh, làm thiệt hại khoảng 30-50% năng suất (Hector và ctv, 2000)

Bón phân không hợp lý, đặc biệt là phân đạm cũng góp phần tạo điều kiện cho bệnh phát triển Ngoài ra, ở những ruộng đã trồng nhiều vụ dưa liên tiếp nhau rất

thích hợp cho nấm Colletotrichum lagenarium tích lũy mật số tạo nhiều cơ hội gây

bệnh cho dưa leo (Phạm Văn Kim, 2000)

Chất kích kháng có thể là một loài sinh vật không gây bệnh (nonphathogen) hoặc không độc (avirulent pathogen) trên cây trồng đó hoặc có thể là một loại hóa chất nào đó không độc và không có tác dụng diệt vi sinh vật như những hóa chất dùng trong nông nghiệp Để đạt hiệu quả cao trong kích kháng đòi hỏi sự kích

Trang 17

kháng phải tạo ra được tính kháng không đặc hiệu nghĩa là chống lại với phổ rộng của mầm bệnh (Trần Thị Thu Thủy, 2006)

1.2.2 Các hình thức kích kháng

1.2.2.1 Kích kháng tại chỗ (local acquired resistance, LAR)

Kích kháng tại chỗ là kích kháng chỉ có thể ngăn cản được mầm bệnh nơi được

xử lý chất kích kháng và thời gian thể hiện hiệu quả sau khi xử lý kích kháng dưới 3 ngày (Trần Thị Thu Thủy, 2006) Sử dụng hóa chất monopotassium phosphat (KH2PO4) 1% phun lên lá ớt giúp kích thích tính kháng bệnh phấn trắng do

Leveillula taurica (Reuveni và ctv, 1998) Khi xử lý dung dịch có chứa bào tử nấm

Colletotrichum lindemuthianum của dòng không độc (avirulence) trên lá và trục hạ diệp của cây đậu giúp chống lại sự xâm nhập của dòng có độc tính khác của nấm này (Skip và Deverall, 1973)

1.2.2.2 Kích kháng lưu dẫn (systemic acquired resistance, SAR)

Kích kháng lưu dẫn là hiện tượng kích kháng có thể ngăn cản mầm bệnh ở các

bộ phận khác của cây nơi không có xử lý chất kích kháng và thời gian thể hiện hiệu quả trên 3 ngày cho đến 1 tháng (Trần Thị Thu Thủy, 2006) Sự kích kháng có thể lưu dẫn lên lá (Phạm Văn Kim, 2000) hoặc xuống rễ (Gessler và Kuc, 1982, trích dẫn từ Nguyễn Hồng Tín, 2005) Kích kháng lưu dẫn khác với kích kháng tại chỗ vì những tín hiệu tạo ra qua sự kích kháng được truyền đi đến các nơi khác của cây và

có khả năng nâng cao tính tự vệ của cây (Van Loon và ctv, 1998)

Kích kháng lưu dẫn cũng có thể biểu hiện trên lá khi xử lý kích kháng bằng cách ngâm hạt Sự kích kháng lưu dẫn thường không mang tính chuyên biệt đối với nhiều tác nhân gây bệnh trên cây trồng như nấm, vi khuẩn, virus (Phạm Văn Kim, 2000) Theo Huỳnh Minh Châu (2003) thì Kuc (1995) nhận thấy hai điều kiện đưa đến kích kháng lưu dẫn (SAR) là cây được xử lý trước với tác nhân có thể kích thích những phản ứng sinh hóa để tổng hợp SAR bên trong tế bào và có sự lignin hóa

Trang 18

nhanh hơn hoặc thấy được sự tự phát huỳnh quang của những hợp chất phenol tích

tụ trong tế bào quanh vị trí đĩa áp của nấm gây bệnh

1.2.3 Cơ sở khoa học kích thích tính kháng trên khía cạnh mô học

1.2.3.1 Sự phát sáng của tế bào

Phản ứng phát sáng của tế bào bao gồm sự phát sáng của cấu trúc Papillae (fluorescent papillae, FP), phát sáng tế bào biểu bì (fluorescent epidermal cell, FEC) hay vách tế bào biểu bì ( FECW ) và phát sáng tế bào thịt lá (fluorescent mesophyll cell, FMC) Hầu hết các loại phát sáng này được thành lập ở tế bào ngay dưới đĩa áp (appressoria) của nấm gây hại (Trần Thị Thu Thủy, 2002; Huỳnh Minh Châu và ctv, 2002), tại vết thương hoặc một vài tác động làm mô cây bị stress

Cấu trúc papillae (fluorescent papillae, FP) được phát hiện khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang FP là một hiện tượng phát sáng được thành lập ở tế bào ngay dưới đĩa áp của nấm gây hại và tại vị trí xung quanh vòi xâm nhiễm của nấm gây bệnh FP được hình thành do sự tích tụ các hợp chất phenol, callose, lignin, vật liệu phát huỳnh quang và silicon tạo ra để chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Thuy, 2002, Heath và ctv, 1989) FP được ghi nhận là cơ chế kháng đầu tiên chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây hại trên cỏ (Vance và Shewood, 1997) Trên cây lúa, FP xuất hiện với tần số rất thấp, 1,5-2% trong tương tác bất tương hợp với nấm

Bipolaris oryzae (Thuy, 2002) và < 7% trong tương tác với nấm Pirycularia grisea

(Heath và ctv, 1989)

Phản ứng phát sáng của tế bào là do sự tích tụ các hợp chất như phenol, callose, hoặc lignin khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Các hợp chất này được tổng hợp nhằm tiêu diệt mầm bệnh hoặc ngăn cản việc lấy dinh dưỡng của mầm bệnh (Trần Thị Thu Thủy, 2002; 2006) Phản ứng tự phát sáng của tế bào có thể ngăn cản hoàn toàn sự phát triển của nấm kí sinh bắt buộc (biotrophic pathogens) (Koga và ctv, 1988; Dai và ctv, 1995) cũng như một số nấm kí sinh không bắt buộc (Heath và ctv, 1989) Tuy nhiên, theo Nguyễn Hồng Tín (2005) thì Jorgensen và ctv (1998) cho rằng với các nấm kí sinh không bắt buộc như

Trang 19

Drechslera teres thì phát sáng tế bào không ngăn cản hoàn toàn sự phát triển của nấm trên lúa mạch

Sự phát sáng của vách tế bào được xem như là phản ứng tự vệ của cây lúa đối với sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thu Thủy, 2002) và có liên quan đến phản ứng siêu nhạy cảm (Koga và ctv, 1988) Phản ứng phát sáng tế bào biểu bì có hiệu quả trong việc giới hạn sự phát triển của nấm, giới hạn sự chết do mầm bệnh

Pirycularia grisea gây ra trên lúa (Heath và ctv, 1989; Koga và ctv, 1988)

Khi xử lý kích kháng bằng clorua đồng chống lại bệnh cháy lá lúa, Huỳnh Minh Châu (2003) ghi nhận phản ứng phát sáng vách tế bào sớm hơn và cao hơn so với nghiệm thức không kích kháng Ngoài ra khi xử lý kích kháng bằng Clorua đồng, Benzoic acid & Chitosan chống bệnh cháy lá lúa, Nguyễn Hồng Tín (2005) đã ghi nhận tỷ lệ đĩa áp phát sáng tế bào và số vách tế bào phát sáng cao hơn so với nghiệm thức không kích kháng và Clorua đồng có khả năng kích thích tạo phản ứng phát sáng sớm hơn (24 GSTC)

1.2.3.2 Phản ứng siêu nhạy cảm (Hypersensitive Response, HR)

Phản ứng siêu nhạy cảm là sự tự chết của từng đám tế bào khi bị mầm bệnh tấn công, nhằm cô lập mấm bệnh và mầm bệnh chết theo (Phạm Văn Kim, 2002) Đây

là dạng kháng bệnh chủ động rất phổ biến của cây trồng chống lại các bệnh do nấm,

vi khuẩn, siêu vi khuẩn, tuyến trùng gây ra và là hình thức kháng bệnh rất quan trọng trên nhiều loại cây trồng (Trần Thị Thu Thủy, 2006)

Phản ứng siêu nhạy cảm thường đi kèm với một số phản ứng tự vệ trong đó có phản ứng oxy hóa khử và sự chết nhanh chóng của tế bào xảy ra ngay sau khi mầm bệnh tiếp xúc với kí chủ Do đó, HR được xếp vào nhóm phản ứng tự vệ về sinh hóa (Agrios, 1997) Đây là phản ứng xảy ra rất nhanh để tạo ra những chất trung gian ROI (Reactive Oxigen Intermediates) sau khi nhận biết có sự xâm nhiễm của mầm bệnh, đặc biệt là O2-, OH-, và H2O2 (Trần Thị Thu Thủy, 2002)

Theo Trần Thị Thu Thuỷ (2006), siêu nhạy cảm thường gắn liền với những thay đổi sinh lý trong mô như tạo ra các kháng sinh thực vật và lignin Phản ứng siêu

Trang 20

nhạy cảm có được do sự tích tụ nhanh các phenol quanh những tế bào bị xâm nhiễm

và sự oxi hóa chúng thành những quinone độc bởi những enzyme polyphenol oxidase và peroxidase

Sự phát sáng tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang là một hiện tượng có liên quan đến phản ứng siêu nhạy cảm Koga và ctv (1988) ghi nhận trong sự tương tác

giữa lúa mạch và nấm Blumeria graminis f sp hordei có sự liên quan giữa phản ứng

phát sáng tế bào và phản ứng siêu nhạy cảm

1.2.3.3 Sự tích tụ phenol

Hợp chất phenol có vai trò quan trọng trong phản ứng tự vệ của cây trồng đã được báo cáo qua nhiều công trình nghiên cứu (Chattopadhyay và Bera, 1980; Sathiyanathan và Vidhyasekaran, 1981) Hợp chất phenol được tích lũy nhanh sau khi cây trồng bị nấm bệnh xâm nhiễm và được tạo thành thông qua sự biến đổi của nhóm phenylpropanoid Vidhyasekaran và ctv, (1992) cho rằng vai trò đầu tiên của độc tố được tiết ra từ mầm bệnh là để ức chế sự tổng hợp phenol ở tế bào kí chủ Tuy nhiên, sự tổng hợp phenol luôn được thực hiện ở tế bào kí chủ khi không có sự hiện diện của mầm bệnh Khi có sự hiện diện của mầm bệnh, hợp chất này được tích tụ nhanh xung quanh vòi xâm nhiễm và hạn chế sự phát triển của mầm bệnh (Thuy, 2002)

Các hợp chất phenol như chlorogenic, caffeic acid, ferulic acid có khả năng trung hòa các độc tố do nấm bệnh cháy lá tiết ra Do đó giống cây nào có khả năng tập trung nhiều hợp chất phenol (làm đổi màu vùng mô nhiễm bệnh) thì có khả năng kháng bệnh cháy lá (Võ Thanh Hoàng, 1993)

Theo Nguyễn Hồng Tín (2005) thì Ibrahim và Towers (1960); Fincher (1976) cho rằng sự tích tụ hợp chất phenol thường liên quan đến sự phát sáng tế bào vì sự phát sáng tế bào thường mang thuộc tính của phenol Phenol tích tụ trong papillae

và hiện diện trong vách dày ở bó gỗ của lá bao mầm và những vách tế bào song song với tế bào biểu bì (Aist và ctv, 1986, trích dẫn từ Huỳnh Minh Châu, 2003) Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Minh Châu (2003) cho thấy clorua đồng và

Trang 21

acibenzolar-S-methyl có khả năng kích kháng bệnh cháy lá nhờ có sự gia tăng mức

độ tổng hợp polyphenol so với không xử lí kích kháng và thời điểm xuất hiện là 48h sau khi chủng nấm tấn công

1.2.3.4 Sự tổng hợp callose

Callose (β - 1,3 glucan) hình thành trong quá trình phát triển của cây và khi cây

bị stress cơ học Callose được tạo thành như hàng rào chống lại sự xâm nhiễm và phát triển của tác nhân gây bệnh trong mô kí chủ (Delmer và ctv, 1993; Beffa & Meins, 1996; Conrath và ctv, 1998) Callose cũng được tìm thấy trong papillae, bên dưới các đĩa áp, là thành phần của vách tế bào dầy lên và có liên quan đến cơ chế tự

vệ Theo Agiros (1997) papillae do callose lắng tụ ở mặt trong của vách tế bào để phản ứng lại với sự xâm nhiễm của nấm

Callose có khả năng ngăn chặn sự phát triển của nấm Phytophthora parasitice trên Arabidopsis thalian (Parker, 1993, trích dẫn từ Nguyễn Hồng Tín, 2005) Trong sự tương tác giữa nấm Bipolaris oryzae và cây lúa, Thuy (2002) ghi nhận

callose tích tụ trong những tế bào quanh đĩa áp nhằm ngăn chặn sự hấp thu dinh dưỡng, ức chế sự phát triển của nấm và sự tích tụ callose ở vách tế bào trong sự tương tác bất tương hợp cao hơn trong sự tương tác tương hợp

1.2.3.5 Sự lignin hóa

Sự lignin hóa là một cơ chế quan trọng trong tính kháng, cơ chế này xảy ra sau khi bị nhiễm do những vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus và tuyến trùng (Mauch-Mani và Slusarenko, 1994) Vách tế bào được lignin hóa có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm đĩa áp của mầm bệnh, ngăn cản dưỡng chất tự do đi vào, do đó làm cho mầm bệnh chết (Sticher và ctv, 1997) Sự lignin hóa góp phần vào tính kháng bệnh bằng nhiều cách như tham gia trong sự hình thành cấu trúc papillae (Heath và ctv,

1989, Trần Thị Thu Thủy, 2002), lignin hóa những phần nội bào của mầm bệnh, làm thay đổi cấu trúc của mầm bệnh (Mauch-Mani và Slusarenko, 1996) Sự gắn chặt của lignin vào vách tế bào kí chủ tạo nên tính kháng mạnh hơn (Singh, 1984)

Trang 22

Bản thân tiền chất của sự lignin hóa cũng có ảnh hưởng độc đến mầm bệnh bởi

sự gắn vào vách tế bào mầm bệnh làm cho chúng cứng hơn và không thấm làm cản trở sự hấp thu nước và dưỡng chất (Sticher và ctv, 1997) Vì thế, làm cản trở sự phát triển của mầm bệnh Theo Huỳnh Minh Châu (2003) thì Lam và ctv (1989) đã chứng minh enzyme phenylalanin amonia – lyaz (PAL) tổng hợp lignin và isoflavonoid được tạo ra trên cây đậu nành (giống nhiễm) có thể kích thích tính

kháng bệnh chống lại Phytophthora megasperma f sp glyciena Khi ức chế 2

enzym tổng hợp lignin là Phenylalanin amonialyaz và cinnamyl alcohol dehydrogenar trên cây lúa đã được xử lí kích kháng, Thieron và ctv (1995) nhận thấy có sự phá vỡ tính kháng di truyền cũng như tính kháng do kích thích, điều này

chứng tỏ vai trò của sự lignin hóa trong tính kháng bệnh

1.3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG

BỆNH CÂY TRỒNG TRÊN KHÍA CẠNH MÔ HỌC

Khi khảo sát sự tương tác giữa nấm Bipolaris oryzae với cây lúa, Thuy, (2002)

ghi nhận phần trăm bào tử tạo phát sáng đơn tế bào ở sự tương tác bất tương hợp thì cao hơn trong sự tương tác tương hợp ở 12 GSKP nhưng không có khác biệt ở 24 GSKP, trong khi đó phần trăm bào tử tạo phát sáng đa tế bào, vách tế bào ở sự tương tác bất tương hợp cao hơn trong sự tương tác tương hợp ở 2 thời điểm Ngoài

ra, mức độ tổng hợp polyphenol, sự tổng hợp callose ở sự tương tác bất tương hợp đều cao hơn tương tác tương hợp

Huỳnh Minh Châu (2003) khi khảo sát về khả năng kích kháng của

acibenzolar-S-methyl và Clorua đồng đối với bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia grysea cho

thấy acibenzolar-S-methyl thể hiện tính kháng thông qua mức độ tổng hợp polyphenol, Clorua đồng có khả năng kích kháng thông qua gia tăng số tế bào, số vách tế bào phát sáng và sự tổng hợp polyphenol Bên cạnh đó, Huỳnh Minh Châu (2003) cũng ghi nhận trên giống kháng cho phản ứng phát sáng tế bào thể hiện sớm, ngoài sự tổng hợp polyphenol còn có sự tổng hợp những hợp chất khác và xuất hiện

Trang 23

phản ứng siêu nhạy cảm đã giúp cho giống kháng hạn chế được sự xâm nhiễm của nấm

Các hóa chất benzoic acid, chitosan cũng có khả năng kích thích tính kháng bệnh cháy lá trên lúa, Nguyễn Hồng Tín (2005) cho rằng benzoic acid và chitosan

có khả năng kích kháng thể hiện qua tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào và số lượng vách tế bào phát sáng trên đĩa áp cao Ngoài ra, khả năng kích kháng của benzoic acid còn thể hiện tỷ lệ đĩa áp tạo sự tổng hợp H2O2 ở thời điểm 20 và 36 GSTC, trong khi đó chitosan thể hịện ở 4 thời điểm 20, 24, 36 và 48 GSTC đồng thời làm gia tăng mức độ tổng hợp H2O2 (+++) ở 36 GSTC và gia tăng diện tích tế bào tổng hợp H2O2 trên đĩa áp ở 48 GSTC

Trên cây cà chua, Trần Lê và Trần Thị Kim Thúy (2006) ghi nhận đồng clorua

có khả năng kích thích tính kháng bệnh thán thư thông qua phần trăm đĩa áp đĩa áp tạo phát sáng ở hai thời điểm 48 và 72 GSTC, trong khi đó canxi clorua chỉ thể hiện tính kháng thông qua phần trăm đĩa áp tạo phát sáng ở 48 GSTC Khi khảo sát sự

xâm nhiễm của nấm Colletotrichum lagenarium gây bệnh thán thư trên dưa leo,

Nguyễn Ngọc Phương Uyên (2006) cho thấy trên giống ít nhiễm cho phản ứng phát sáng của tế bào ở 2 thời điểm quan sát (24 và 48 GSTC), trong khi đó trên giống nhiễm không thể hiện phản ứng phát sáng tế bào

1.4 ĐẶC TÍNH CỦA CÁC HÓA CHẤT KÍCH KHÁNG

1.4.1 CuCl 2

Tên hóa học: Đồng (II) clorua

Thường tồn tại ở dạng ngậm 2 phân tử nước: CuCl2.2H2O2Tên khác: Copperchlorite, cupric chlorite…

Trọng lượng phân tử: 170,48g Dạng tinh thể lăng trụ màu lục, chảy rửa ngoài không khí, tan hoàn toàn trong nước

Nhiệt độ sôi: dung dịch clorua đồng bão hòa sôi ở 1590C

Trang 24

Trọng lượng riêng: 2,5 Trên khía cạnh mô học, Huỳnh Minh Châu (2003) đã khảo sát khả năng kích kháng của CuCl2 và kết luận CuCl2 có khả năng kích kháng thể hiện qua sự gia tăng vách tế bào phát sáng, gia tăng sự tích tụ phenol so với đối chứng Ngoài ra, trên khía cạnh sinh hóa khả năng kích kháng của đồng clorua thể hiện rất rõ qua kết quả nghiên cứu của Ngô Thành Trí và ctv (2004), hiệu quả giảm bệnh cháy lá khi xử lý hạt giống với clorua đồng trước khi gieo là 68,7%, đồng thời sau khi bị nấm tấn công có sự gia tăng hoạt tính của enzyme catalase và peroxidase trong lá lúa

Đồng clorua còn có khả năng kích kháng bệnh thán thư trên cà chua thông qua việc hạn chế số lượng vết bệnh và có thể bảo vệ cây đến 10 ngày sau khi chủng nấm tấn công đối với bệnh thán thư trên dưa leo (Trần Lê và Trần Thị Kim Thúy,

2006; Lê Thanh Toàn, 2006)

1.4.2 Acid salicylic

Công thức hóa học: C7H6O3Tên khác: acid 2-hydroxy – benzoic Trọng lượng phân tử: 113,4g

Dạng hạt kết tinh dài màu trắng giống như bột ngọt, tan trong nước

Phạm Văn Dư và ctv (2004) đã thử nghiệm khả năng kích kháng bệnh cháy lá lúa của acid salicylic trong nhà lưới bằng ngâm hạt và ngâm rễ, kết quả cho thấy acid salycilic có thể hiện tính kháng đối với bệnh Acid salicilic còn có khả năng kích thích tính kháng bệnh thán thư trên dưa leo, bằng cách xử lí hạt trong 24 giờ trước khi gieo cho hiệu quả giảm kéo dài 7 ngày (Lê Thanh Toàn, 2006)

1.4.3 Canxi clorua

Công thức hóa học: CaCl2Trọng lượng phân tử: 147,02g Dạng kết tinh màu trắng

Trang 25

Canxi clorua có khả năng kích kháng bệnh thán thư trên cà chua thông qua hạn chế số lượng vết bệnh, ức chế sự hình thành bào tử trên vết bệnh cấp 1 Hiệu quả kích kháng của canxi clorua còn thể hiện ở khía cạnh mô học, phản ứng phát sáng của tế bào ở nghiệm thức xử lý canxi clorua cao hơn so với đối chứng không xử lí

(Trần Lê và Trần Thị Kim Thúy, 2006)

Khi phun chitosan lên lá ở giai đoạn cây lúa 20 ngày tuổi thì hiệu quả kích kháng là 52% kéo dài hiệu lực kích kháng 40 ngày sau khi gieo (Trịnh Ngọc Thúy, 2000) Ngoài ra, chitosan còn có khả năng hạn chế sự hình thành bào tử nấm

Pirycularia grisea ở 5 ngày sau khi phun nấm tấn công và có hiệu quả giảm bệnh khác biệt so với đối chứng trên giống nhiễm, trên khía cạnh mô học khả năng kích kháng của chitosan được thể hiện qua phần trăm đĩa áp tạo phản ứng phát sáng tế bào và số lượng vách tế bào phát sáng tạo ra trên mỗi đĩa áp cao hơn so với đối chứng (Ngô Phương Đại và ctv., 2004)

Lê Thanh Toàn (2006) ghi nhận chitosan có khả năng kích kháng bệnh thán thư trên dưa leo và hiệu quả kéo dài đến 10 ngày sau khi chủng nấm tấn công Đặc biệt chitosan có khả năng ức chế sự hình thành bào tử trên vết bệnh cấp 1, 2 và 3 đối với bệnh thán thư trên cà chua (Trần Lê và Trần Thị Kim Thúy, 2006)

Trang 26

1.4.5 K 2 HPO 4

Tên hóa học: dipotassium hydrogen phosphate Trọng lượng phân tử: 174,18g

Dạng hạt kết tinh màu trắng

K2HPO4 có khả năng kích thích tính kháng bệnh thán thư trên dưa leo, bằng cách xử

lí hạt trong 24 giờ trước khi gieo cho hiệu quả giảm kéo dài 7 ngày (Lê Thanh Toàn, 2006)

Trang 27

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2006 đến tháng 2/2007

- Địa điểm: phòng thí nghiệm và nhà lưới của bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm:

- Giống dưa leo thí nghiệm: Salawin

- Nguồn nấm: nấm Colletotrichum lagenarium (chủng BM3) được cung cấp từ Bộ

môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

- Phân bón, bọc ươm cây, bảng mica…

- Hóa chất dùng để xử lí và quan sát mẫu: acid acetic, Lactoglycerol, Aniline Blue,

Toluidine Blue O, Leucoaniline Blue,phloroglucinal …

- Các hóa chất kích kháng: Chitosan (100ppm), CuCl2 (0,075mM), K2HPO4(50mM), acid Salicylic (4mM), CaCl2 (100mM)

- Môi trường nuôi cấy nấm: môi trường PSA

2.1.2 Phương tiện thí nghiệm:

- Kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi thường, tủ cấy, tủ thanh trùng khô, tủ thanh trùng ướt,…

Trang 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP

Các thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại Các nghiệm thức trong thí nghiệm gồm:

Nghiệm thức 1: Xử lí kích kháng bằng Chitosan (100ppm) Nghiệm thức 2: Xử lí kích kháng bằng CuCl2 (0.075mM) Nghiệm thức 3: Xử lí kích kháng bằng K2HPO4 (50mM) Nghiệm thức 4: Xử lí kích kháng bằng acid Salicylic (4mM) Nghiệm thức 5: Xử lí kích kháng bằng CaCl2 (100mM) Đối chứng: Xử lí bằng nước cất

* Cách tiến hành thí nghiệm:

- Trồng và chăm sóc dưa leo: Dưa leo được trồng trong bọc ươm cây, một

cây/bọc ươm Bón phân theo công thức cho 1 hecta: 250kg urea; 250kg super lân; 200kg KCl; 25 tấn phân chuồng; 1,5 tấn tro trấu (Trần Thị Ba và ctv, 1999) (tương đương 0,58g urea; 0,57g lân; 0,45g kali; 4,52g tro trấu trong 1 bọc ươm cây)

+ Bón lót: tất cả lân

+ Bón thúc:

• 7 ngày sau khi gieo: 1/10 N

• 15 ngày sau khi gieo: 3/10 N + 1/4 Kali

• 25 ngày sau khi gieo: 3/10 N + 1/4 Kali

- Xử lí kích kháng: chất kích kháng được xử lí bằng cách áo hạt

+ Ngâm hạt giống với chất kích kháng Chitosan (100ppm), CuCl2(0,075mM), K2HPO4 (50mM), acid Salicilic (4mM), CaCl2 (100mM) trong 24 giờ sau đó đem gieo

+ Nghiệm thức đối chứng ngâm hạt trong nước cất thanh trùng

Trang 29

- Chủng bệnh nhân tạo: nấm Colletotrichum lagenarium được nhân mật số trên

môi trường PSA ở nhiệt độ 250C, chiếu đèn cận cực tím 12 giờ sáng xen kẻ 12 giờ

tối Bào tử nấm Colletotrichum lagenarium được thu thập ở 7-10 ngày sau khi nuôi cấy Chủng nấm Colletotrichum lagenarium khi cây dưa khoảng 3 lá thật (17-18 NSKG) với

mật số 106 bào tử/ml, mỗi cây phun 5ml huyền phù Sau khi phun nấm, ủ tối trong phòng ủ bệnh ở nhiệt độ 250C, ẩm độ 97% trong 36 giờ nhằm tạo điều kiện thích hợp cho nấm bệnh xâm nhiễm sau đó chuyển ra điều kiện phun sương cho bệnh phát triển

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào

Mục đích: khảo sát khả năng kích kháng của từng loại hóa chất thông qua phản ứng

phát sáng của tế bào

- Cách thu và xử lí mẫu: thu mẫu vào thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 và 120 giờ

sau khi chủng, cho mẫu lá vào đĩa petri có lót giấy thấm chứa 3ml dung dịch ethanol-acetic acid (tỷ lệ 3:1) để tẩy diệp lục tố lá Thay giấy thấm và dung dịch ethanol-acetic acid mỗi ngày cho đến khi mẫu lá không còn màu xanh của diệp lục

tố Sau đó chuyển sang nước cất trong 60 giây Cuối cùng giữ mẫu trong dung dịch lactoglycerol ( lactic acid + glycerol + nước cất với tỉ lệ 1:1:1) cho đến khi quan sát

- Cách quan sát và ghi nhận chỉ tiêu: trên mỗi nghiệm thức quan sát 4 lá, mỗi lá

quan sát ngẫu nhiên 15 bào tử, lá được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng 400-450nm) bằng dung dịch aniline Blue (0,01%) và ghi nhận các chỉ tiêu sau:

• Số lượng đĩa áp tạo sự phát sáng của tế bào

• Số lượng đĩa áp tạo phát sáng vách tế bào

• Số lượng vách tế bào phát sáng/đĩa áp

• Số lượng đĩa áp tạo phát sáng tế bào thịt lá

Trang 30

Số đĩa áp tạo phát sáng vách tế bào

% đĩa áp tạo phát sáng vách tế bào = - x 100

Số đĩa áp quan sát

Tổng số vách tế bào phát sáng

Số lượng vách tế bào phát sáng/đĩa áp = -

Số đĩa áp tạo phát sáng vách tế bào

Số đĩa áp tạo phát sáng tế bào thịt lá

% đĩa áp tạo phát sáng tế bào thịt lá = - x 100

Diện tích tế bào phát sáng

Diện tích tế bào phát sáng/đĩa áp = -

Số đĩa áp tạo phát sáng tế bào thịt lá

Trang 31

Số đĩa áp tạo sự phát sáng tế bào

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự tích tụ phenol

Mục đích: khảo sát khả năng kích kháng của từng hóa chất qua sự tích tụ phenol

của tế bào

- Phương pháp nhuộm: sau khi tẩy diệp lục tố lá được nhuộm với Toluidine Blue

O (0,05%, pH = 6,8) ở 500C trong 25 phút

- Cách quan sát và ghi nhận chỉ tiêu: Trên mỗi nghiệm thức quan sát 4 lá, mỗi lá

quan sát ngẫu nhiên 15 đĩa áp Mẫu được quan sát dưới kính hiển vi quang học và ghi nhận các chỉ tiêu sau:

Trang 32

• Số lượng đĩa áp có tạo sự tích tụ polyphenol (tế bào bên dưới đĩa

áp có màu xanh lá cây)

• Số lượng đĩa áp tạo sự tích tụ phenol ở vách tế bào

• Số lượng đĩa áp tạo sự tích tụ phenol ở tế bào thịt lá

• Diện tích vùng tế bào có sự tích tụ polyphenol

Số đĩa áp tạo sự tích tụ phenol vách tế bào

% đĩa áp tạo sự tích tụ phenol vách tế bào = - x 100

Số đĩa áp tạo sự tích tụ phenol tế bào thịt lá

% đĩa áp tạo sự tích tụ phenol tế bào thịt lá = - x 100

Kích thước vùng tế bào có sự tích tụ phenol: theo công thức diện tích hình chữ nhật

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tích tụ callose

Mục đích: khảo sát khả năng kích kháng của từng hóa chất qua sự tích tụ callose

Trang 33

- Phương pháp nhuộm: Sau khi tẩy diệp lục tố, mẫu lá được nhuộm với

Leucoaniline Blue hòa tan trong 0,15M K2HPO4, (pH = 8,2) ở 500C trong 20 phút

- Cách quan sát và ghi nhận chỉ tiêu sự tổng hợp callose: Trên mỗi nghiệm thức

quan sát 4 lá, mỗi lá quan sát ngẫu nhiên 15 đĩa áp Mẫu quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng 330-380nm) Chỉ tiêu ghi nhận gồm:

• Số đĩa áp tạo sự tổng hợp callose

• Số đĩa áp tạo sự tổng hợp callose ở vách tế bào

• Diện tích bề dầy callose hình thành

Số đĩa áp có sự tích tụ callose ở vách tế bào

% đĩa áp có sự tích tụ callose ở vách tế bào = - x 100

Số đĩa áp có sự tích tụ callose

Kích thước vùng callose hình thành: theo công thức tính diện tích hình chữ nhật

Bề dày callose hình thành: đo vách tế bào phát sáng

- Số liệu được xử lý bằng phần mềm MSTATC

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	455,45 KB