HIỆU QUẢ của CHẤT điều hòa SINH TRƯỞNG AUXIN và CYTOKININ đến sự tạo mô sẹo, tái SINH CHỒI từ mô lá và NHÂN CHỒI của GIỐNG HOA HỒNG rosa hybrida

LÊ MINH LÝ HIỆU QUẢ CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG AUXIN VÀ CYTOKININ ĐẾN SỰ TẠO MÔ SẸO, TÁI SINH CHỒI TỪ MÔ LÁ VÀ NHÂN CHỒI CỦA GIỐNG HOA HỒNG Rosa hybrida LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TR

Trang 1

LÊ MINH LÝ

HIỆU QUẢ CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG AUXIN VÀ CYTOKININ ĐẾN SỰ TẠO MÔ SẸO, TÁI SINH CHỒI TỪ MÔ LÁ VÀ NHÂN CHỒI

CỦA GIỐNG HOA HỒNG Rosa hybrida

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT

Cần Thơ - 2/ 2007

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trang 2

LÊ MINH LÝ

HIỆU QUẢ CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG AUXIN VÀ CYTOKININ ĐẾN SỰ TẠO MÔ SẸO, TÁI SINH CHỒI TỪ MÔ LÁ VÀ NHÂN CHỒI

CỦA GIỐNG HOA HỒNG Rosa hybrida

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT

Giáo viên hướng dẫn LÂM NGỌC PHƯƠNG

Cần Thơ - 2/ 2007

Trang 3

ii

Luận văn Tốt nghiệp Kỹ sư ngành Trồng Trọt với đề tài:

“HIỆU QUẢ CỦA CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG AUXIN VÀ CYTOKININ ĐẾN SỰ TẠO MÔ SẸO, TÁI SINH CHỒI TỪ MÔ LÁ VÀ

NHÂN CHỒI CỦA GIỐNG HOA HỒNG Rosa hybrida”

Do sinh viên Lê Minh Lý thực hiện

Kính chuyển lên hội đồng chấm Luận văn Tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày.… tháng……năm 2007 Cán bộ hướng dẫn

Lâm Ngọc Phương

Trang 4

iii

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong Luận văn Tốt nghiệp là trung thực và chưa được ai công bố trong bất

kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Lê Minh Lý

Trang 5

iv

Qua gần 5 năm học tập và rèn luyện tại trường Đại học Cần Thơ, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô để hôm nay

em hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Cha, mẹ đã hết lòng nuôi con khôn lớn nên người

- Cô Lâm Ngọc Phương, người đã tận tình hướng dẫn, gợi ý và cho những lời khuyên hết sức bổ ích trong việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

- Quí thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quí báu cho em trong suốt các năm học

Xin chân thành cám ơn:

- Các thầy cô và các anh chị trong Bộ môn Sinh lý- Sinh hóa đã tạo điều kiện cho

em hoàn thành tốt đề tài này

- Thầy Cố Vấn Học Tập đã tận tình chỉ dạy, động viên em trong suốt khoá học

- Các bạn lớp Trồng Trọt khóa 28 luôn gắn bó, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2007

Lê Minh Lý

Trang 6

v

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Nơi sinh: ấp Nhơn Thọ II- xã Nhơn Ái- huyện Châu Thành- tỉnh Hậu Giang

Con ông Lê Quang Đang và bà Trương Thị Túy Loan

Đã tốt nghiệp Tú Tài năm 2000 tại Trường phổ thông Trung học Châu Văn Liêm-

TP Cần Thơ

Trúng tuyển vào trường Đại học Cần Thơ năm 2002, học lớp Trồng Trọt, khóa

28, thuộc Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Trang 7

vi

Trang phụ bìa Trang kính trình hội đồng Lời cam đoan

Cảm tạ Tiểu sử cá nhân Mục lục

Danh sách hình Danh sách bảng Danh sách từ viết tắt Tóm lược

Mở đầu

Chương I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây hoa hồng

1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Đặc tính thực vật

1.2 Nuôi cấy mô và phương pháp vi nhân giống

1.3 Sự tạo thành mô sẹo

1.3.1 Định nghĩa mô sẹo

1.3.2 Tạo và nuôi cấy mô sẹo

1.4 Sự tái sinh mẫu cây 1.4.1 Tầm quan trọng của cây tái sinh 1.4.2 Quá trình phát sinh cơ quan và các yếu tố ảnh hưởng

1.4.3 Sự tạo chồi bất định từ mẫu cấy

1.5 Các kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô trên hoa hồng và sự tái sinh cơ quan

Chương II PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

Trang 8

vii

2.2.2 Chuẩn bị môi trường 2.2.3 Bố trí thí nghiệm

2.2.4 Phân tích số liệu CHƯƠNG 3-KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Chuẩn bị mẫu vật 3.2 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của 2,4-D, NAA và BA lên sự hình thành

mô sẹo ở giống hoa hồng phấn

3.2.1 Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo 3.2.2 Số mô sẹo được tạo thành 3.3 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của 2,4–D , NAA và BA lên sự hình thành

mô sẹo ở giống hoa hồng đỏ

3.3.1 Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo 3.3.2 Số mô sẹo được tạo thành 3.4 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của 2,4 – D và TDZ lên sự hình thành mô sẹo

3.4.1 Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo 3.4.2 Số mô sẹo được tạo thành 3.5 Thí nghiệm 4: Hiệu quả của BA và NAA trong sự tái sinh

3.5.1 Gia tăng kích thước 3.5.2 Tỷ lệ hóa nâu 3.6.1 Thí nghiệm 5: Hiệu quả của cytokinin và nitrate bạc trong sự tái sinh chồi

3.6.1 Gia tăng kích thước 3.6.2 Tỷ lệ hóa nâu 3.7 Thí nghiệm 6: Hiệu quả của BA, NAA, và TDZ trong sự nhân chồi 3.7.1 Số chồi gia tăng

3.7.2 Số lá gia tăng 3.7.3 Chiều cao chồi gia tăng

3.7.4 Trọng lượng tươi gia tăng

Trang 9

viii

Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ CHƯƠNG

47

Trang 10

Mô sẹo được tạo thành trong môi trường 0,5 mg/l 2,4-D (A); 0,5 mg/l

2,4-D + 1 mg/l NAA(B) ở giống hồng đỏ (ex vitro)

Mô sẹo trong môi trường có nồng độ BA và NAA khác nhau

(A) 0,5 mg/l NAA + 5 mg/l BA, (B) 0,5 mg/l NAA + 10 mg/l BA Kích thước mô sẹo gia tăng trong môi trường có nồng độ BA và NAA khác nhau

Tỷ lệ (%) mô sẹo hóa nâu trong môi trường có nồng độ BA và NAA khác nhau

Chồi hoa hồng trong môi trường có AgNO3 0 mg/l + TDZ 0,5 mg/l (A), AgNO3 5 mg/l + BA 10 mg/l (B) 6 TSKC

Mô sẹo trong môi trường có AgNO3 0 mg/l + TDZ 0,5 mg/l( A), AgNO3 5 mg/l + TDZ 0,5mg/l (B), AgNO3 10 mg/l + TDZ 0,5 mg/l(C)

Kích thước mô sẹo gia tăng trong môi trường có nồng độ AgNO3, BA,

Trang 11

x

DANH SÁCH BẢNG Bảng

Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA và

BA khác nhau ở giống hoa hồng phấn

Số mô sẹo được tạo thành trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA

và BA khác nhau ở giống hoa hồng phấn

Tỷ lệ (%) lá tạo sẹo trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA và BA

khác nhau ở giống hoa hồng đỏ (ex vitro)

Số mô sẹo được tạo thành trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA

và BA khác nhau ở giống hoa hồng đỏ (ex vitro)

Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo trong môi trường có nồng độ 2,4-D và TDZ khác nhau ở 1, 2 và 3 tuần sau khi cấy

Số mô sẹo được tạo thành trên môi trường có nồng độ 2,4-D và TDZ khác nhau ở 2 tuần sau khi cấy

Số mô sẹo được tạo thành trên môi trường có nồng độ 2,4-D và TDZ khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

Số chồi gia tăng trong môi trường có nồng độ BA, NAA và TDZ khác nhau

Số lá gia tăng trong môi trường có BA, NAA và TDZ ở các nồng độ khác nhau

Trang 12

TDZ Thidiazuron (1-phenyl-3-(1,2,3 thiadiazol-5-yl))

ĐHST Điều hòa sinh trưởng

TSKC Tuần sau khi cấy

SKC Sau khi cấy

Trang 13

Đề tài “Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin đến sự, tạo mô

sẹo, tái sinh chồi từ mô lá và nhân chồi của giống hoa hồng Rosa hybrida” được thực

hiện nhằm tìm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tạo mô sẹo, tái sinh chồi và nhân chồi cây hoa hồng làm cơ sở cho công tác lai tạo giống bằng công nghệ sinh học

Đề tài gồm 6 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1-2 nhân

tố, 4-9 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 2 keo, mỗi keo 4-5 mẫu

Kết quả các thí nghiệm cho thấy:

- Môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D 0,5 mg/l + NAA

1 mg/l + BA 0,5 mg/l hay 2,4-D 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l kích thích sự tạo mô sẹo từ nuôi cấy mô lá hoa hồng

- Môi trường MS có bổ sung 2,4-D 0, 5 mg/l + NAA 0,5 mg/l cho mô sẹo tạo thành từ nuôi cấy mô lá hoa hồng đỏ

- Kích thước và tỷ lệ sống của mô sẹo tăng cao trong môi trường MS có bổ sung TDZ 0,5 mg/l +AgNO3 0,5 mg/l

- Trong giai đoạn nhân chồi, môi trường MS có bổ sung BA 1-2 mg/l là thích hợp

Trang 14

MỞ ĐẦU

Hoa hồng (Rosa spp.) là một trong những loài hoa được ưa chuộng trên thế

giới, có màu sắc đa dạng, hương thơm nhẹ; là biểu tượng cho hòa bình, của tình yêu, hạnh phúc, lòng chung thủy và tình hữu nghị… Ngoài ra, hoa hồng còn được dùng để chưng cất dầu thơm và là một loại dược liệu có giá trị (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Hoa hồng có giá trị kinh tế cao và thị trường tiêu thụ rộng lớn nên nhiều nước trên thế giới đã đầu tư vào sản xuất hoa hồng trên qui mô lớn

Ở Việt Nam, hoa hồng được trồng chủ yếu ở Đà Lạt, Sa Đéc, ngoại thành

Hà Nội và một số vùng khác Những năm gần đây, do điều kiện kinh tế xã hội phát triển, nhu cầu thưởng thức hoa ngày càng tăng cao và từ đó nghề trồng hoa có nhiều khởi sắc và có những bước tiến đáng kể Việc sản xuất hoa hồng dựa vào kinh nghiệm và các biện pháp chiết, ghép cành cho chất lượng giống chưa cao, dễ bị thoái hóa, làm giảm chất lượng hoa

Nhân giống bằng nuôi cấy mô đã khắc phục được các nhược điểm trên, đồng thời có thể ứng dụng công nghệ mới để tạo ra cây giống với chất lượng cao

Trên thế giới, nhân giống in vitro cây hoa hồng đã được đưa vào thị trường sản xuất

do có thể nhân số lượng lớn cây giống trong thời gian tương đối ngắn, đồng thời tạo được cây khoẻ mạnh và sạch bệnh cùng khả năng tái sinh cây con trong vòng 1 năm

(Dhawan và Bhojwani, 1986) Theo Pati và ctv (2005), tái sinh cây in vitro là bước

rất quan trọng để thực hiện thành công các kỹ thuật của công nghệ sinh học trong chương trình cải thiện giống

Đề tài “Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin đến

sự tạo mô sẹo, tái sinh chồi từ mô lá và nhân chồi của giống hồng phấn Rosa

sẹo, tái sinh chồi và nhân chồi hoa hồng in vitro, làm cơ sở cho công tác lai tạo

giống bằng các kỹ thuật sinh học

Trang 15

CHƯƠNG 1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY HOA HỒNG 1.1.1 Nguồn gốc

Cây hoa hồng có tên khoa học là Rosa spp thuộc: Lớp Song tử diệp, Bộ

Rosales, Họ Rosaceae

Cây hoa hồng có nguồn gốc ôn đới và á nhiệt đới vùng bắc bán cầu Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) hoa hồng xuất hiên trên trái đất cách nay vài chục triệu năm, nhưng thật sự đã được nuôi trồng từ vài ngàn năm nay và mới được lai tạo từ vài trăm năm nay Người ta cho rằng, chắc chắn hoa hồng được trồng đầu tiên ở Trung Quốc và Ấn Độ Sau đó mới du nhập vào Hà Lan, Pháp, Đức, Bungary, và chính người Châu Âu có công tạo ra các giống hoa hồng hiện đại ngày nay Các giống hoa hồng được nhâp vào Việt Nam theo hai nguồn đó là từ Châu Âu vào Đà Lạt rồi phổ biến ra các tỉnh miền Nam và miền Bắc hoặc từ Thái Lan vào miền Nam rồi lan ra Bắc

Lá: Lá hoa hồng là lá kép lông chim, mọc cách, ở cuống có lá kèm nhẵn, mỗi

lá có 3-5 hay 7-9 lá chét, xung quanh lá chét có nhiều cưa nhỏ Tuỳ giống mà lá có màu xanh đậm hay xanh nhạt, răng cưa nông hay sâu, hoặc hình dạng lá khác

Hoa: Hoa hồng có nhiều màu sắc và kích thước khác nhau Hoa hồng thuộc

hoa lưỡng tính nhị đực và nhị cái trên cùng một hoa Các nhị đực dính vào nhau bao xung quanh vòi nhụy Khi phấn chín rơi trên đầu nhụy nên có thể tự thụ phấn Đài hoa có màu xanh

Quả: Quả hình trái xoan có cánh đài còn lại

Trang 16

Hạt: Hạt hồng nhỏ có lông, khả năng nảy mầm của hạt rất kém do có lớp vỏ

dày

1.2 NUÔI CẤY MÔ VÀ PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là quá trình nuôi cấy thực vật trong ống nghiệm, khác với nuôi cấy in vivo là quá trình nuôi cấy thực vật trong

điều kiện tự nhiên

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây sau đó khử trùng và đưa vào môi trường nuôi cấy phù hợp Các chồi hình thành được tách ra và chuyển sang môi trường mới và quy trình được lặp lại Vi nhân giống có thể được thực hiện thông qua việc tái sinh phôi hoặc cây từ mô sẹo, phương pháp này cho số lượng lớn cây giống không đồng nhất trong cùng một lúc với khoảng thời gian ngắn, thường kéo theo những biến dị soma (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Mục đích của phương pháp nhân giống in vitro:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí hiếm làm vật liệu cho công tác lai tạo giống

- Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và các cây trồng khác

- Nhân nhanh các loại cây trồng khó nhân giống bằng các phương pháp thông thường khác Làm sạch bệnh virus và bảo quản nguồn gen trong ngân hàng gen

- Bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro người ta có thể nhân giống

vô tính cây trồng ở qui mô công nghiệp với hệ số nhân giống cao (36-1012/ năm) Hơn thế các cây giống được sản xuất ra hoàn toàn sạch bệnh và đồng nhất về mặt di

truyền (Nguyễn Xuân Linh,1998)

Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài,

Trang 17

bộ phận nuôi cấy và tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà mô cấy được duy trì ở trạng thái mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ hay muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh Nhìn chung tất

cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm các thành phần cơ bản sau: Nước, các nguyên

tố khoáng đa vi lượng, nguồn carbohydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men…

Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy mô Nước sử dụng trong nuôi cấy mô thường là nước cất một lần.trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2005)

Các nguyên tố khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sắt (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Nồng độ các nguyên tố đa lượng sử dụng trong môi trường nuôi cấy phổ biến từ 1-25 mM (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

Các nguyên tố khoáng vi lượng

Nhu cầu các nguyên tố vi lượng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là rất cần thiết, có thể ảnh hưởng đến sự phân hóa tế bào khi kết hợp với chất điều hòa sinh trưởng

Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1984), trong nuôi cấy mô thường sử dụng

sắt vi lượng ở dạng phức hợp chelate (Fe- EDTA) Ở dạng này sắt không bị tủa mà phóng thích từ từ vào môi trường theo nhu cầu của mô thực vật

Nguồn carbohydrat

Mô tế bào thực vật được nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức

dị dưỡng nên việc bổ sung đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ

là điều bắt buộc (Lê Trần Bình và ctv., 1997) Hai dạng đường thường gặp nhất

Trang 18

trong nuôi cấy in vitro là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng

phổ biến hơn Tuỳ theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sucrose biến đổi từ 1-6 % (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Bên cạnh đó đường còn có tác dụng điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường (Vũ Văn Vụ, 1999)

Vitamin

Trong môi trường nuôi cấy đa số mô thực vật chưa có cấu trúc tự tổng hợp

đủ lượng cần thiết nên phải bổ sung vitamin từ bên ngoài vào (Lê Văn Hòa và ctv., 1997) Vitamin đóng vai trò là chất xúc tác trong hệ thống enzyme và chỉ yêu cầu với lượng nhỏ Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol Trong đó, thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Myo-inositol có vai trò trong sự sinh tổng hợp thành tế bào và thường được dùng với hàm lượng lớn 50-100 mg/l (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Nước dừa

Nước dừa được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp thêm một số chất hữu cơ cần thiết giúp tăng sự sinh trưởng và phát triển của mô… Chất có hoạt tính trong nước dừa là myo-inositol và các amino acid khác (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Tác dụng kích hoạt của nước dừa có lẽ do các chất điều hòa sinh trưởng như NAA, GA hoặc các chất tương tự như kinetin, zeatin trong thành phần của nó (Pierk, 1978) Những chất này có lợi cho sự tái tạo phôi, tạo mô sẹo và tái sinh cây Đối với nhiều mẫu nuôi cấy, lượng nước dừa phù hợp từ 15-20 % theo thể tích (Vũ Văn Vụ, 1999)

pH

pH môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh từ 5,7-5,8 trước khi hấp khử trùng Theo Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), pH = 6 cho kết quả tốt trong giai đoạn nhân nhanh chồi hoa hồng

Trang 19

Agar (Thạch)

Agar được sử dụng làm chất đông cứng môi trường để làm giá thể cho môi trường nuôi cấy tế bào thực vật Agar trộn với nước tạo thành dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60-1000C và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống còn 450C Do không phản ứng với chất trong môi trường nuôi cấy và không bị thủy phân bởi enzyme thực vật nên được sử dụng rộng rãi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nồng

độ agar thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là 0,5-10% Nồng độ agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán các chất dinh dưỡng cũng như hấp thụ của mô sẽ gặp khó khăn (Bùi Bá Bổng, 1995) Theo Debergh (1983) nên sử dụng nồng độ thạch 6-8 g/l, nếu sử dụng nồng độ thạch cao sẽ làm hạn chế sự phát triển của mô sẹo

Bạc nitrate

Bạc nitrate là một chất ức chế ethylen trong quá trình nuôi cấy giúp cây

sinh trưởng tốt (Beyer, 1976) Theo Philippe Vain và ctv., AgNO3 sử dụng như là chất ức chế sự sản sinh ethylen Dạng II của mô sẹo tăng lên khi phôi trưởng thành được nuôi cấy trong môi trường MS (Murashige và Shoog, 1962) có bổ sung AgNO3 (5, 10, 20 mg/l) Tuy nhiên không nên nuôi cấy mô lá trong môi trường có AgNO3 quá 10 ngày vì lúc này môi trường trở nên nghèo dinh dưỡng, tần số biệt hóa giảm, ion Ag+ trở nên độc

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng giữ vai trò quan trọng quyết định trong hầu hết

các trường hợp nuôi cấy in vitro (Lê Văn Hòa và ctv., 1997) Đây là chất có hoạt

tính sinh học cao nên với nồng độ rất thấp 10-9 cũng có thể tác dụng lên mô nuôi cấy Hiệu lực tác dụng của chúng rất khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất nồng độ và từng loại tế bào Hiện nay, có hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử

dụng rất phổ biến là auxin và cytokinin

Trang 20

Auxin

Auxin là thuật ngữ chung đại diện cho lớp của những hợp chất được đặc tính hóa bởi khả năng gây ra sự vươn dài của tế bào chồi trong vùng gần đỉnh giống như indole-3-acetic acid (IAA)

Các auxin thường được sử dụng là 2,4-D acid (2,4-dichlorophenoxy) acetic, NAA (Naphthalene acetic acid), IBA (Indol butyric acid) Theo Nguyễn Văn

Uyển và ctv., (1984), 2,4-D rất cần cho sự phản biệt hóa để tạo mô sẹo

Auxin có vai trò trong sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật auxin được dùng cho sự phân chia tế bào, phân hóa rễ và ức chế sự thành lập chồi bên (Bùi Bá Bổng, 1999) Ngoài ra khi kết hợp với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đặc biệt là cytokinin có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái Khi sử dụng auxin với nồng độ cao lại kích thích sự tạo mô sẹo (Vũ Văn Vụ, 1999)

Cytokinin

Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế nó kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin (Nguyễn Minh Chơn, 2005)

Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA của tinh trùng cá trích sau khi hấp thanh trùng đã kích thích mạnh mẽ hoạt động giảm phân và sự phân chia tế bào trong một mẫu nuôi cấy mô sẹo của thuốc lá được gọi là kinetin (Lê Văn Hòa và

ctv., 1999) Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên được phân lập đầu tiên từ hột bắp non

là zeatin Ngày nay có nhiều cytokinin tổng hợp được biết đến, trong đó có 3 chất thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là kinetin (6-furfuryl-aminopurin), BA (Benzyl adenin), BAP (Benzyl amino purine) Bên cạnh đó một số cytokinin tổng hợp khác cũng được sử dụng như DPU (Diphenylurea), CPPU (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenulurea), TDZ (Thidiazuron) Thidiazuron (TDZ) là loại cytokinin có hiệu quả cao, có thể cảm ứng sự phát sinh cơ quan ở nồng độ thấp và làm giảm ưu thế ngọn

(Murthy BNS và ctv., 1995)

Trang 21

Trong nuôi cấy mô cytokinin được bổ sung vào môi trường nhằm kích thích sự hoạt động của chồi bên và giảm hiện tượng ưu thế ngọn Việc bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài chồi nhỏ từ mẫu cấy sau 4-6 tuần, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi và những chồi này không thể kéo dài, làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Khi kết hợp với auxin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo người ta thường phối hợp giữa auxin và cytokinin

1.3 SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO 1.3.1 Định nghĩa mô sẹo

Mô sẹo là khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan

đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…, (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Xét về mặt cấu trúc thì mô sẹo

là một khối vô định hình của các tế bào nhu mô có vách mỏng, được sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2005)

Tầm quan trọng của mô sẹo

Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy mô sẹo là một khâu quan trọng trong nuôi cấy tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, protoplast, sản xuất các chất hoạt tính sinh học,…Theo Vũ Văn Vụ (1999) việc nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường hợp:

+ Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống

bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện

+ Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học…

+ Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dòng chịu mặn,… + Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

Trang 22

1.3.2 Tạo và nuôi cấy mô sẹo

Kỹ thuật tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 20 đầu những năm 30 và là một trong những phương pháp đầu tiên của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhiều năm Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo

mô sẹo dưới một tác động thích hợp nào đó Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989)

Các tế bào thuộc mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay kết hợp với cytokinin)

để cho ra mô sẹo Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do tế bào nhu mô chịu sự phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn các mô phân sinh

sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan

Theo Vũ Văn Vụ (1999) mô sẹo khi hình thành gồm hai loại:

- Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to

- Loại cứng: các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ

Theo Fatih A Canli (2003) khi sử dụng TDZ (nồng độ 1,8; 2,7 và 3,6 µM)

và giữ trong điều kiện tối 3 tuần cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất (85-100%) từ lá của hoa hồng

Huang Tao và ctv (2002) đã sử dụng 2,4-D (0,9-9,1 µM) để cảm ứng sự tạo mô sẹo từ mẫu lá Citrus grandis trưởng thành cho phần trăm mẫu lá tạo mô sẹo

cao (84,5- 96,5%), nhưng khi nồng độ cao hơn (22,6 µM và 32,2 µM) thì phần trăm mẫu lá tạo mô sẹo giảm (95,5-92,9%)

Mô sẹo thường được chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới theo từng giai đoạn Nếu như cứ nuôi mãi không tách ra và cấy chuyền thì mô sẹo sẽ bị hoại

tử và chết Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trưởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Trang 23

Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen, khi mẫu bị hóa nâu

thì sự tăng trưởng sẽ bị ức chế nếu để lâu ngày mẫu sẽ chết Các mô còn non ít bị hóa nâu hơn mô già Hiện tượng hóa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase có nhân đồng được tổng hợp và phóng thích tuỳ thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử mẫu

Ảnh hưởng của loại cơ quan tạo mô sẹo

Mô sẹo có thể được tạo ra từ nhiều loại cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan thì sử dụng chất điều hòa sinh trưởng với loại và nồng độ khác nhau tuỳ mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó (Ochatt và Caso, 1986) Có thể sử dụng các mô hay cơ quan của thực vât

để tạo mô sẹo như: rễ, thân, lá, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chưa trưởng thành, phôi hợp tử trưởng thành, tượng tầng libe mộc…

Ảnh hưởng của tuổi cơ quan trong sự tạo mô sẹo

Những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Ngược lại, cây còn non hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể hình thành mô sẹo trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin

Ảnh hưởng của ánh sáng trong sự hình thành mô sẹo

Theo Pierick (1997) trong suốt thời gian tạo mô sẹo tuỳ theo mẫu cấy mà ánh sáng có thể cần hay không cần thiết Đa số trường hợp, trong tối sự tạo mô sẹo diễn ra tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt với mẫu cấy là lá

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo, trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia

tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987) Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra

sự tạo mô sẹo (Torres, 1989) Đa số mẫu thực vật thuộc nhóm song tử diệp không

có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có sự phối hợp

Trang 24

của auxin và cytokinin Chẳng hạn như môi trường để tạo mô sẹo đối với cây thuốc

lá là MS có chứa 1 mg/l NAA và 0,1mg/l BA (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Mô sẹo khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ nhanh, nhưng nếu chuyển sang một môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo diễn ra rất chậm (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Hình thái mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy Theo Mehra và

Jaidka1(1985); Pal và ctv., (1985); Shrikhande và ctv., (1993) ghi nhận nếu giữ

nguyên nồng độ và loại auxin, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì hình thái mô sẹo thay đổi Hầu hết sự hiện diện của BAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu

và có khả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và thường

không có khả năng sinh phôi (Shrikhande và ctv., 1993) Nồng độ auxin cao kích

thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc

(Ceriani và ctv., 1992) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,

1.4.2 Quá trình phát sinh cơ quan và các yếu tố ảnh hưởng

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), sự tái sinh cơ quan không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp vì:

Trang 25

- Có những mối tương quan cần phải phá vỡ để lập lại những mối tương quan khác có thể đưa đến việc tái sinh cơ quan Gồm các quá trình:

+ Sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa + Sự phân chia tế bào, đôi khi tạo thành mô sẹo, khi tế bào phân chia thì bắt đầu xảy ra sự hình thành cơ quan

+ Sự hình thành cơ quan

+ Sự phát triển cơ quan

- Có một số hạn chế về mặt số lượng lẫn chất lượng do nhiều yếu tố:

+ Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy

+ Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hay ngoài thiên nhiên

+ Vị trí của mẫu cấy trên cây

+ Thời gian thu mẫu trong năm + Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh + Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phần dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,…, sự bổ sung của chất khác vào môi trường…

Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo tương tự như sự phát sinh cơ quan trực tiếp

từ mẫu cấy Tế bào mẫu cấy sẽ phản phân hóa dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật để phân chia hỗn độn tạo thành mô sẹo Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thì tế bào mô sẹo lại được cảm ứng

để phân hóa tạo thành cơ quan Điều này có thể giải thích cho việc người ta sử dụng các mô trẻ có tế bào đang phân chia mạnh để tạo cơ quan

Vị trí của mô phân sinh trong mô sẹo có liên quan đến tổ chức của cơ quan vừa mới được hình thành trong mô sẹo, sau đó chồi và rễ phát sinh từ bên trong mô

và phát triển ra ngoài Ở một vài loài thực vật, (ví dụ như Convolvulus) hai loại cơ

quan hình thành từ những phần khác nhau của mô sẹo, rễ thường hình thành từ tế

Trang 26

bào mặt trên của mô sẹo còn chồi xuất phát từ những tế bào tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (Christianson và Warnick, 1985)

1.4.3 Sự tạo chồi bất định từ mẫu cấy

Pierk và Zart chứng minh rằng sự tạo chồi bất định của mẫu lá tăng nhiều

khi để cho lớp biểu bì dưới của phiến lá Kalanchol farinacea tiếp xúc với môi

trường và hai ông rút ra kết luận nếu đặt mẫu lá nằm thẳng trên môi trường thì sẽ tạo được nhiều chồi hơn (trích dẫn bởi từ Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Nồng độ cao của cytokinin phối hợp với nồng độ thấp của auxin rất quan

trọng trong việc tạo chồi ở các loài thực vật khác nhau như cây ốc biển (horse

radishi), cây bông vải Benzyl adenine (BA) là loại cytokinin có hiệu quả trong sự cảm ứng sự tạo chồi ở nhiều loài thực vật Khi sử dụng BA ở nồng độ cao thì sẽ tạo

ra nhiều chồi không bình thường Vì vậy cần chuyển những chồi được hình thành trên môi trường có nồng độ cytokinin cao sang môi trường có nồng độ cytokinin thấp hơn để chồi tăng trưởng

Thorpe và ctv (1991), Huxter và ctv (1981) (trích từ Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên (2002) Ethylen cản sự hình thành chồi trong suốt 5 ngày đầu tiên tiên của quá trình khởi sự tạo chồi nhưng sau đó nó lại thúc đẩy sự tạo lá sơ khởi Như vậy sự tạo chồi sẽ bị ức chế nếu như trong giai đoạn đầu tiên của quá trình hình thành chồi có mặt của Ethylen

1.5 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CẤY MÔ TRÊN HOA HỒNG VÀ SỰ TÁI SINH CƠ QUAN

Khả năng tái sinh là đặc tính quan trọng nhất của mô sẹo, khả năng này sẽ mất đi khi mô sẹo xốp nhưng vẫn duy trì lâu hơn ở mô sẹo cứng Nguyên nhân có thể do mô sẹo mất khả năng tổng hợp một số chất chủ yếu cho sự tái sinh của nó khi

số lần cấy chuyền tăng lên (Gautheret, 1966)

Theo Valles và Boxus, (1987) Gibberellin có thể một mình làm tăng số

lượng cơ quan được tạo ra, sự tái sinh chồi từ mô sẹo Rosa hybrida có thể được cảm

Trang 27

ứng bởi BAP (1-5mg/l) nhưng khi có bổ sung thêm GA3 (0,3-1 mg/l) thì số lượng chồi hình thành sẽ tăng lên (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Kim Hằng, 2005)

Theo Burger và ctv (1990), đã sử dụng ½ MS + 1 µM BA + 0,05 µM NAA

để tạo chồi bất định từ mô sẹo có nguồn gốc từ phôi chưa trưởng thành của cây

Rosa hybrida cv Bridal Pink

Visessuwan và ctv (1997) TDZ có hiệu quả hơn BA trong sự phát sinh

phôi thứ cấp và kích thích sự nảy mầm của phôi soma nhưng số lượng chồi tái sinh

từ phôi soma lại thấp hơn so với BA (trích dẫn bởi Xiangquian L và ctv., 2001)

Ibrahim và ctv (1998) đối với mẫu lá hoa hồng khi đặt vào môi trường

MS+ 6,8 µM TDZ + 0,49 µM IBA trong điều kiện tối (1 tuần) sau đó chuyển sang môi trường tái sinh gồm MS+ BA+ IBA sẽ hình thành chồi bất định

Xiangquian L và ctv (2001) nồng độ 2,4-D tăng từ 11,3- 181µM mức độ

lá cảm ứng tạo mô sẹo sẽ giảm ở giống hồng Rosa hybrida

Theo Fatih A Canli (2003), sử dụng TDZ (nồng độ 1,8; 2,7 và 3,6 µM) giữ trong tối 3 tuần đã cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất (85-100%) từ lá hoa hồng

Theo Puchooa (2004) đã sử dụng môi trường MS kết hợp với BAP (2 mg/l)

và IAA (3 mg/l) để tái sinh chồi cây vải từ mô sẹo của lá đã cho kết quả cao (80% chồi được thành lập)

Kamo và ctv (2005), đã đưa ra thành phần môi trường nuôi cấy cho giai

đoạn phát triển từ mô sẹo đến giai đoạn tái sinh thành cây con của giống hoa hồng

đỏ Kardinal :

Giai đoạn tạo sẹo được cảm ứng trên môi trường MS + Dicamba 18,1

µM + kinetin 0,46 µM đã cho kết quả tốt và tỷ lệ tái sinh cao

Giai đọan tạo phôi nên sử dụng môi trường MS cơ bản không có chất điều hòa sinh trưởng

Giai đoạn chuyển tiếp phôi thành cây con được cảm ứng trên môi trường

MS + ABA (abscisic acid) 5-20 µM đã cho kết quả tốt

Dương Tấn Nhật và ctv (2006) Ở mẫu cấy lá cây Sinningia spp Khi sử

dụng môi trường MS có bổ sung thêm 2 mg/l BA hay môi trường MS có sự kết hợp

Trang 28

giữa 2,0 mg/l TDZ và 0,5 mg/l NAA cho tỷ lệ chồi tái sinh cao nhất (100%) Trong khi sử dụng môi trường MS có sự kết hợp giữa 1,5 mg/l TDZ và 0,5 mg/l NAA cho

số chồi tái sinh cao nhất (25,5 chồi/mẫu)

Kintzios và ctv (1999), đã đưa ra qui trình tái sinh cây hoa hồng từ lá đã trưởng thành qua việc nuôi cấy mô sẹo:

Mẫu lá hoa hồng trưởng thành

Mô sẹo được cảm ứng trên môi trường

MS + 53,5 µM PPCA + 4,6 µM Kinetin, 3% sucrose

(250 C, 50 µmol m-2 s-1)

(6 tuần)

Cấy chuyền trên môi trường giống môi trường cảm ứng tạo mô sẹo

Có sự cảm ứng của phôi soma hình cầu

Phôi phát triển tốt (250 C, 50 µmol m-2 s-1)

Trang 29

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN 2.1.1 Vật liệu thực vật

Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu lá in vitro hoa hồng phấn Rosa

hybrida và mẫu lá ex vitro hoa hồng đỏ Rosa hybrida

2.1.2 Trang thiết bị và hóa chất

Trang thiết bị thí nghiệm: tủ cấy vô trùng, cân điện tử, nồi thanh trùng (Autoclave), máy đo pH, bếp khử trùng dụng cụ cấy, tủ sấy giấy, các dụng cụ thủy tinh dùng cho thí nghiệm: ống đong, keo, ống nghiệm,…

Các hóa chất:

- Hóa chất khử trùng mẫu vật: Thủy ngân clorua (HgCl2), xà phòng

- Môi trường nuôi cấy: khoáng đa lượng - vi lượng (MS) (Murashige và Skoog, 1962) Có bổ sung vitamin như Thiamin, pyridoxin, nicotinic acid, myo-inositol Các chất điều hòa sinh trưởng: 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D), 1-naphthalene acetic acid (NAA), benzyl adenin (BA), kinetin, thidiazuron (TDZ)

và các chất khác như bạc nitrat (AgNO3) đường sucrose, agar, nước dừa, than hoạt tính

Điều kiện thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng nuôi cấy mô (nhiệt độ: 26 ± 20 C, cường độ chiếu sáng 1000-2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày), và các dụng

cụ cần thiết khác

Trang 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 Khử trùng mẫu cấy

Các lá non được lấy từ cây mẹ đem vào phòng thí nghiệm khử trùng Ngâm trong dung dịch xà phòng (khoảng 5 phút), rửa lại dưới vòi nước chảy khoảng 10 phút Tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch thủy ngân clorua 0,05% (30 phút) và rửa lại 3- 4 lần bằng nước cất vô trùng

2.2.2 Chuẩn bị môi trường

Sử dụng môi trường nền là môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (MS) (1962) có bổ sung đường sucrose (30 g/l); agar (6,5 g/l); nước dừa (15%); vitamin theo Morel (1951); myo-inositol (0,1 g/l) Các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tuỳ theo thí nghiệm Môi trường nuôi cấy có

pH từ 5,7- 5,8 Mỗi keo rót 40 ml môi trường và chuyển vào nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút

2.2.3 Bố trí thí nghiệm

Giai đoạn tạo mô sẹo

Thí nghiệm 1: Hiệu quả của 2,4-D, NAA và BA lên sự hình thành mô

sẹo của giống hoa hồng phấn

- Mục tiêu: tìm nồng độ 2,4-D, NAA và BA thích hợp cho sự hình thành

mô sẹo

- Mẫu lá được lấy từ nguồn in vitro

- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố với

4 nghiệm thức, 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 2 keo, mỗi keo cấy 5 mẫu lá

- Ký hiệu các nghiệm thức

NT1: 0,5 mg/l 2,4-D NT2: 0,5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA NT3: 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l BA NT4: 0,5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA

Trang 31

Thí nghiệm 2: Hiệu quả của 2,4-D, NAA và BA lên sự hình thành mô

sẹo của giống hoa hồng đỏ

- Mục tiêu: tìm nồng độ 2,4-D, NAA và BA thích hợp cho sự hình thành

mô sẹo

- Mẫu lá được lấy từ nguồn ex vitro

- Ký hiệu các nghiệm thức

NT1: 0,5 mg/l 2,4-D NT2: 0,5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA NT3: 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l BA NT4: 0,5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA

Thí nghiệm 3: Hiệu quả của 2,4-D và TDZ lên sự hình thành mô sẹo

của giống hoa hồng phấn

- Mẫu lá được lấy từ nguồn in vitro

TDZ (mg/l) Chất ĐHST

Chỉ tiêu theo dõi

- Phần trăm số lá cảm ứng tạo mô sẹo

- Số mô sẹo được tạo thành

- Một số hiện tượng khác: mọc chồi, hóa nâu, mọc rễ,…

- Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3 tuần sau khi cấy

Trang 32

Giai đoạn tái sinh

- Mục tiêu: tìm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tái sinh chồi hoa hồng từ mô sẹo

- Mẫu cấy: chọn các mô sẹo từ thí nghiệm 1

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố với 4 lần lặp lại (mỗi lần lặp lại là 2 keo, mỗi keo có 5 mẫu mô sẹo)

Thí nghiệm 4: Hiệu quả của BA và NAA trong sự tái sinh chồi của

giống hoa hồng phấn

BA (mg/l) Chất ĐHST

Thí nghiệm 5: Hiệu quả của cytokinin và bạc nitrate trong sự tái

sinh chồi của hoa hồng phấn

Các chỉ tiêu theo dõi

+ Số mô sẹo tái sinh thành chồi + Số chồi được tái sinh trên mẫu + Thời gian lấy chỉ tiêu: 3 đến 8 tuần sau khi cấy

+ Thời gian bắt đầu xuất hiện chồi

+ Gia tăng kích thước + Tỷ lệ (%) mô sẹo hoá nâu

Trang 33

Giai đoạn nhân chồi

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của BA, NAA và TDZ trong sự nhân chồi

của giống hoa hông phấn

- Mục tiêu: tìm nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự nhân chồi hoa hồng

- Mẫu cấy: chồi ngọn và thân với một mắt lá

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, với 9 nghiệm thức, 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 2 keo, mỗi keo

Các chỉ tiêu theo dõi

+ Chiều cao chồi, số lá, số chồi gia tăng

+ Trọng lượng tươi gia tăng

+ Thời gian lấy chỉ tiêu:1, 2, 3, 4, 6 tuần sau khi cấy

2.2.4 Phân tích số liệu

- Số liệu phần trăm được biến đổi sang arsine trước khi phân tích thống kêbằng chương trình MSTATC Các số liệu trong khoảng từ 0 đến 100 được biến đổi theo công thức sau:

Giá trị biến đổi = ASIN(SQRT(x)/10)*180/3,1416

Trong đó x là giá trị phần trăm Trước khi biến đổi các giá trị là 0% được thay thế bởi 1/4n và giá trị 100% được thay thế bởi 100-1/4n, trong đó n là số đơn

vị (sốmẫu trên keo) (Gomez & Gomez, 1984)

- Xử lý số liệu thống kê bằng chương trình MSTATC

- Vẽ đồ thị bằng chương trình Microsoft Excel

Trang 34

Mẫu chồi được chọn từ cây mẹ khoẻ mạnh khử trùng bằng dung dịch HgCl2

0,1% trong 20 phút, sau đó cấy vào môi trường BA 1 mg/l để kích thích chồi hoa hồng từ mầm ngủ tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các thí nghiệm sau

3.2 THÍ NGHIỆM 1: HIỆU QUẢ CỦA 2,4-D, NAA VÀ BA LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO Ở GIỐNG HOA HỒNG PHẤN

Nhìn chung, ở tất cả các nghiệm thức mô sẹo được hình thành từ vị trí vết cắt

và cuống lá có màu xanh và rắn chắc (Hình 3.1) Theo Pal và ctv (1985) mô sẹo

xuất hiện trước hết là ở vị trí vết cắt kế đến là vùng đáy lá, vùng giữa lá hay dọc

theo hệ thống mạch (Gleddie và ctv.,1983) Mô sẹo ít được tạo ra ở vị trí ngọn lá

mà thường ở đó chỉ có sự phân hóa rễ (Ral và ctv., 1985) Ở các nghiệm thức 2,4-D

0,5 mg/l và 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l mô sẹo hình thành với số lượng ít nhưng

có kích thước lớn hơn so với các nghiệm thức còn lại Đặc biệt khi quan sát mẫu thì thấy có sự xuất hiện rễ ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l ở thời điểm 2 TSKC (10% mẫu xuất hiện rễ) và 3 TSKC (27,5% mẫu xuất hiện rễ) (Hình 3.1b), điều này có thể được giải thích là do lượng auxin sử dụng nhiều làm cho tỷ lệ giữa auxin và cytokinin cao nên mẫu xuất hiện rễ nhiều và khả năng tạo mô sẹo giảm

Theo Nguyễn Mỹ Uyên và ctv (2004), NAA khi sử dụng kết hợp với BA sẽ làm

giảm khả năng tạo rễ ở mô sẹo hơn là khi sử dụng NAA đơn lẽ Kết quả này cũng

Trang 35

phù hợp với Nguyễn Bảo Toàn (2001) tỷ lệ nồng độ giữa auxin và cytokinin cao thì

mô cấy phát triển theo khuynh hướng hình thành rễ Mức độ trung gian giữa hai loại chất này thích hợp cho sự tạo mô sẹo

Hình 3.1 Mô sẹo được tạo thành trong môi trường có 0,5 mg/l 2,4-D (A); 0,5 mg/l

D + 1 mg/l NAA (B); 0,5 mg/l D + 0,5 mg/l BA (C); 0,5 mg/l

2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA (2,4-D) ở giống hoa hồng phấn

3.2.1 Tỷ lệ (%) lá cảm ứng tạo mô sẹo

Bảng 3.1 cho thấy ở thời điểm 1 TSKC tỷ lệ lá tạo mô sẹo cao nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l (25,0%) và thấp nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l (5,0%), tuy nhiên giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt thống kê

Tại thời điểm 2 TSKC các nghiệm thức phối hợp giữa auxin và cytokinin cho

tỷ lệ lá tạo mô sẹo cao khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức chỉ sử dụng auxin, tỷ lệ lá cảm ứng tạo sẹo cao nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l (95,0%) và nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l + BA 0,5 mg/l (95,0%)

Trang 36

khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l (72,5%) và nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l (72,5%)

Ở 3 TSKC tỷ lệ lá tạo sẹo vẫn cao nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l (100,0%) và nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l + BA 0,5 mg/l (100,0%) khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l (90,0%) trừ nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l (82,5%)

Bảng 3.1 Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA và BA

Ghi chú: Những chữ cái theo sau giống nhau trong cùng một cột thì không khác biệt có ý nghĩa

thống kê;*: khác biệt có ý nghĩa thống kê 5%; **: khác biệt có ý nghĩa thống kê 1%

3.2.2 Số mô sẹo được tạo thành

Kết quả Bảng 3.2 cho thấy ở thời điểm 2 TSKC số mô sẹo được hình thành cao ở các nghiệm thức có sự kết hợp giữa 2,4-D và BA là nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l + BA 0,5 mg/l (12,4 mô sẹo) không khác biệt so với nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l (12,3 mô sẹo) nhưng khác biệt so với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 1%

Ở 3 TSKC số mô sẹo hình thành cao nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + 0,5 mg/l BA (21,1 mô sẹo) khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với các nghiệm thức còn lại trừ nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l + BA 0,5 mg/l (21,0 mô sẹo)

Số mô sẹo tạo thành thấp nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l (9,0 mô sẹo)

Trang 37

Bảng 3.2 Số mô sẹo được tạo thành trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA và

thống kê; * *: khác biệt có ý nghĩa thống kê 1%

3.3 THÍ NGHIỆM 2: HIỆU QUẢ CỦA 2,4-D, NAA VÀ BA LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO Ở GIỐNG HOA HỒNG ĐỎ

3.3.1 Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo

Từ kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, ở thời điểm 1 TSKC tỷ lệ lá tạo mô sẹo giữa các nghiệm thức còn thấp không có sự khác biệt về mặt thống kê

Tuần 2 sau khi cấy tỷ lệ lá tạo sẹo ở các nghiệm thức là cao nhất (100%) khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l (68,8%) Đến tuần 3 sau khi cấy nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l vẫn có

tỷ lệ lá tạo mô sẹo thấp nhất (75,0%) khác biệt thống kê so với các nghịêm thức còn lại ở mức 5% (Hình 3.6) Điều này là do BA ức chế hoạt động của nhóm auxin nên hạn chế khả năng tạo mô sẹo Khi tăng nồng độ auxin (kết hợp NAA ở nghiệm thức 4) làm cân bằng giữa tỷ lệ auxin và cytokinin vì vậy cho tỷ lệ lá tạo mô sẹo cao

Theo Gaspar và ctv., (1996) auxin làm giảm sự tích luỹ của cytokinin nội sinh và

ngược lại cytokinin làm ức chế khả năng hoạt động của auxin

Trang 38

Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) lá tạo sẹo trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA và BA

khác nhau ở giống hồng đỏ (ex vitro)

Tuần sau khi cấy Nghiệm thức

thống kê; ns: khác biệt không ý nghĩa, *: khác biệt có ý nghĩa thống kê 5%

3.3.2 Số mô sẹo được tạo thành

Từ kết quả Bảng 3.4 cho thấy, ở 2 TSKC 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l cho số

mô sẹo cao nhất (19,8 mô sẹo) khác biệt có ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại Số mô sẹo thấp nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l + BA0,5 mg/l

Sau khi cấy 3 tuần, số mô sẹo vẫn cao nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l (26,3 mô sẹo) khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại và thấp nhất ở nghiệm thức 2,4-D 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l + BA 0,5 mg/l (4,0 mô sẹo) Ở các nghiệm thức mô sẹo hình thành có dạng nốt rắn chắc có màu xanh sáng, kích thước lớn Cũng tương tự như thí nghiệm 1A mô sẹo hình thành trước ở vị trí vết cắt và cuống lá

Trang 39

Bảng 3.4 Số mô sẹo được tạo thành trong môi trường có nồng độ 2,4-D, NAA và

BA khác nhau ở giống hồng đỏ (ex vitro)

Ghi chú: Những chữ cái theo sau giống nhau trong cùng một cột thì không khác biệt có ý nghĩa

thống kê; * khác biệt có ý nghĩa thống kê 5%

Hình 3.2 Mô sẹo được tạo thành trong môi trường 0,5 mg/l 2,4-D (A); 0,5 mg/l

2,4-D + 1 mg/l NAA, (B) ở giống hồng đỏ (ex vitro)

Tuần sau khi cấy Nghiệm thức

Hồng đỏ 3 tuần SKC 0,5 mg/l 2,4-D

Trang 40

3.4 THÍ NGHIỆM 3: HIỆU QUẢ CỦA 2,4-D VÀ TDZ LÊN SỰ HÌNH

THÀNH MÔ SẸO 3.4.1 Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo

Từ kết quả trình bày ở Bảng 3.5 cho thấy, ở tuần đầu sau khi cấy nồng độ

2,4-D ảnh hưởng lên tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo, nồng độ 2,4-2,4-D 0,5 mg/l cho tỷ lệ lá tạo mô sẹo cao (40,0 %) khác biệt có ý nghĩa 5% so với nghiệm thức sử dụng 2,4-D 1 mg/l (11,67%) Tỷ lệ (%) lá tạo mô sẹo không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức TDZ

và sự tương tác giữa nồng độ TDZ với 2,4-D cũng không có ý nghĩa

Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) lá cảm ứng tạo mô sẹo trong môi trường có nồng độ 2,4-D và

TDZ khác nhau ở 1, 2 và 3 tuần sau khi cấy

Ghi chú: Những chữ cái theo sau giống nhau trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa

thống kê; **: khác biệt có ý nghĩa 1%; *: khác biệt có ý nghĩa 5%; n:s khác biệt không

có ý nghĩa

Định dạng
Số trang	87
Dung lượng	1,38 MB