HIỆU QUẢ của CHẤT hữu cơ bổ SUNG vào môi TRƯỜNG NUÔI cấy TRÊN sự SINH TRƯỞNG của LAN CON hồ điệp (PHALAENOPSIS SP ) IN VITRO

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèmvới tên đề tài: HIỆU QUẢ CỦA CHẤT HỮU C Ơ BỔ SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA LAN CON HỒ Đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: HOA VIÊN & CÂY CẢNH

MSSV: 3053357

Lớp: HV&CC K31

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

…….…….

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèmvới tên đề tài:

HIỆU QUẢ CỦA CHẤT HỮU C Ơ BỔ SUNG VÀO MÔI

TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA

LAN CON HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS SP.)

Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD Cần Thơ, ngày… tháng……năm 2009

Chủ nhiệm khoa Chủ tịch hội đồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

…….…….

Luận văn tốt nghiệp Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài:

HIỆU QUẢ CỦA CHẤT HỮU C Ơ BỔ SUNG VÀO MÔI

TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA

LAN CON HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS SP.)

IN VITRO

Sinh viên thực hiện: Võ Văn Ngân

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009

Cán bộ hướng dẫn

Ts Nguyễn Bảo Toàn

LỜI CAM ĐOAN

…….…….

Tôi xin cam đoan đây là công tr ình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết

quả được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được aicông bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Sinh viên nghiên c ứu

Võ Văn Ngân

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

…….…….

1 LÝ LỊCH

Ngày, tháng, năm sinh: 10/09/1984 Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Càng Long, Trà Vinh

Quê quán: Ấp số 4, xã Mỹ Cẩm, huyện Càng Long, tỉnh Trà Vinh

Con: ông Võ Trung Trực và bà Lê Thị Bé

Điện thoại nhà: 0746550034

Di động: 0982579019

2 QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

Năm 1991-1996: học tại trường tiểu học Chính Đức, số 4 Mỹ Cẩm

Năm 1996-2000: học tại trường THCS Chính Đức, số 4 Mỹ Cẩm

Năm 2001-2004: học tại trường THPT Nguyễn Đáng, C àng Long, Trà VinhNăm 2005-2009: học tại trường Đại học Cần Thơ

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009

Võ Văn Ngân

LỜI CẢM TẠ

…….…….

Kính dâng

Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

Thầy Nguyễn Bảo Toàn đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá tr ìnhthực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Thầy Cô cố vấn: Lâm Ngọc Ph ương, Nguyễn Văn Ây cùng với quí thầy côKhoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tâm, dìu dắt, rèn luyện em suốt 4

năm học tại trường Đại Học Cần Thơ

Chân thành cảm ơn

Chị Lê Hồng Giang, cô Nhung và cùng với các anh chị trong ph òng thínghiệm Nuôi Cấy Mô, Bộ Môn Sinh Lý -Sinh Hóa, Khoa Nông Nghi ệp và Sinh Học

Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ

Các bạn sinh viên lớp Hoa viên & cây cảnh K31 đã giúp đỡ động viên emtrong những năm tháng trên giảng đường Đại Học

MỤC LỤC

…….…….

LỜI CAM ĐOAN - - - iii

TIỂU SỬ CÁ NHÂN - - - iv

LỜI CẢM TẠ - - - v

MỤC LỤC - - - vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT - - viii

DANH SÁCH BẢNG - - - ix

DANH SÁCH HÌNH - - - x

TÓM LƯỢC - - - xi

MỞ ĐẦU - - - 1

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU - - 2

1.1 NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY LAN HỒ ĐIỆP - - 2

1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại - - 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật - - 2

1.1.2.1 Ánh sáng - - 3

1.1.2.2 Độ ẩm - - 3

1.1.2.3 Nhiệt độ - - 3

1.1.2.4 Nước - - - 4

1.2 SƠ LƯỢC KỸ THUẬT NUÔ CẤY MÔ - 4

1.2.1 Phương pháp nhân gi ống trong nuôi cấy mô - 4

1.2.1.1 Nhân giống hữu tính - - 4

1.2.1.2 Nhân giống vô tính-vi nhân giống - 4

1.2.1.3 Một số thuận lợi của phương pháp vi nhân giống - 4

1.2.1.4 Các giai đoạn trong vi nhân giống - 5

1.2.2 Môi trường trong nuôi cấy mô - - 6

1.2.2.1 Nước - - - 6

1.2.2.2 Carbon và nguồn năng lượng - 6

1.2.2.3 Các vitamin - - 7

1.2.2.4 Than hoạt tính - - 7

1.2.2.5 Agar - - 7

1.2.2.6 Nguồn sắt - - 8

1.2.2.7 Dinh dưỡng khoáng đa-vi lượng - - 8

1.2.2.8 Vai trò của một số acid hữu cơ - 8

1.2.2.9 Vai trò của một số amino acid - -10

2.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM - -14

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm - -14

2.1.2 Điều kiện thí nghiệm - -14

2.1.3 Phương tiện thí nghiệm - -14

2.1.3.1 Thiết bị - - 14

2.1.3.2 Dụng cụ - - 14

2.1.3.3 Hóa chất - - 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHI ỆM - -15

2.2.1 Môi trường nuôi cấy - -15

2.2.1.1 Thành phần đa lượng của môi trường ½ MS -15

2.2.1.2 Vi lượng - - 15

2.2.2 Phương pháp nghiên c ứu - -15

2.2.3 Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu - -17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - -18

3.1 HIỆU QUẢ CỦA SỰ BỔ SUNG PHÂN D ƠI VÀO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN CON PV - -18

3.1.1 Chiều cao chồi gia tăng t ương đối - 18

3.1.2 Số lá gia tăng tương đối - -19

3.1.3 Tỷ lệ tạo rễ - - 19

3.1.4 Số rễ tạo thành - - 19

3.2 HIỆU QUẢ CỦA SỰ BỔ SUNG ACID HỮU CƠ VÀO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SỰ SINH TRƯỞNGVÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN CON PV - -22

3.2.1 Chiều cao chồi gia tăng t ương đối - 22

3.2.2 Số lá gia tăng tương đối - -23

3.2.3 Tỷ lệ tạo rễ - - 24

3.2.4 Số rễ tạo thành - - 24

3.3 HIỆU QUẢ CỦA SỰ BỔ SUNG AMINO AC ID VÀO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN CON PV - -26

3.3.1 Chiều cao chồi gia tăng t ương đối - 26

3.3.2 Số lá gia tăng tương đối - -26

3.3.3 Tỷ lệ tạo rễ - - 27

3.3.4 Số rễ tạo thành - - 27

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - - 29

KẾT LUẬN - - 29

ĐỀ NGHỊ - - -29

TÀI LIỆU THAM KHẢO - - -30

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

…….…….

MS: Murashige and Skoog (1962)

NSKC: Ngày sau khi cấy

Ctv: Cộng tác viên

N: Nitrogen

Na2FEDTA: Natri – Ethylen Diamin Tetra Acetat

PV: Giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) lai có hoa màu vàng

LSD: Least Significant Difference

CAM: Crassulacean Acid Metabolism

PEP: Phosphoenol Pyruvate

NADH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide plus HydrogenATP: Adenosine Tri-Phosphate

IAA :Indol Acetic Acid

HgCl2: Mercuric Chloride

[Ca(OCl)2]: Calcium Hypochloride

[Na(OCl)]: Sodium Hypochloride

H2O2: Hydrogen Peroxide

DANH SÁCH BẢNG

…….…….

1.1 Phân tích thành phần của phân dơi của (Sridhar et al 2006) 13

3.1 Hiệu quả của phân dơi lên chiều cao gia tăng tương đối (%) theo

3.2 Hiệu quả của phân dơi lên số lá gia tăng tương đối (%) theo thời

3.3 Hiệu quả của phân dơi lên tỷ lệ tạo rễ (%) theo thời gian của chồi

3.4 Hiệu quả của phân dơi lên số rễ tạo thành theo thời gian của chồi

3.5 Hiệu quả của acid hữu cơ lên chiều cao gia tăng tương đối (%) theo

3.6 Hiệu quả của acid hữu cơ lên số lá gia tăng tương đối (%) theo thời

3.7 Hiệu quả của acia hữu cơ lên tỷ lệ tạo rễ (%) theo thời gian của

3.8 Hiệu quả của acid hữu cơ lên số rễ tạo thành theo thời gian của chồi

3.9 Hiệu quả của amino acid l ên chiều cao gia tăng tương đối (%) theo

3.10 Hiệu quả của amino acid l ên số lá gia tăng tương đối (%) theo thời

3.11 Hiệu quả của amino acd l ên tỷ lệ tạo rễ (%) theo thời gian của chồi

3.12 Hiệu quả của amino acid l ên số rễ tạo thành theo thời gian của chồi

DANH SÁCH HÌNH

…….…….

1.2 Sơ đồ chu trình Citric acid (chu trình Krebs) 10

3.1 Sự phát triển chiều cao chồi lan Hồ điệp tr ên môi trường bổ

sung phân dơi khác nhau ở 60 ngày sau khi cấy (NSKC) 213.2 Sự phát triển chiều cao chồi lan Hồ điệp tr ên môi trường bổ

3.3 Sự phát triển lá và rễ lan Hồ điệp trên môi trường bổ sung

VÕ VĂN NGÂN 2009 “Hiệu quả của chất hữu c ơ bổ sung vào môi trường nuôi

cấy trên sự sinh trưởng của lan con Hồ điệp ( Phalaenopsis sp.) in vitro”, Luận văn

Tốt nghiệp Đại học, Khoa Nông nghiệp v à Sinh học Ứng dụng, Trường Đại HọcCần Thơ

Người hướng dẫn khoa học: Ts Nguyễn Bảo Toàn.

TÓM LƯỢC

…….…….

Đề tài: “ Hiệu quả của chất hữu c ơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy trên

sự sinh trưởng của lan con Hồ điệp ( Phalaenopsis sp.) in vitro” nhằm xác định

hiệu quả của các chất hữu c ơ trên sự sinh trưởng và phát triển của cây lan Hồ điệp ở

giai đoạn tiền thuần dưỡng Đề tài này được thực hiện gồm ba thí nghiệm với các

acid hữu cơ khác nhau và mỗi thí nghiệm được bố trí theo thể thức ho àn toàn ngẫunhiên một nhân tố với 4 nghiệm thức, có 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại l à một chai

chứa 4 mẫu cấy Chồi lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) lai có hoa màu vàng (kí hi ệu

PV) in vitro có chiều cao khoảng 1-1,2 cm, có từ 1-2 lá được tách từ cây riêng rẽ.

Các thí nghiệm được bổ sung phân dơi từ 1 g/l đến 4 g/l; acid hữu c ơ (acid citric,acid malic, acid succinic ở nồng độ 100 mg/l) v à amino acid (tryptophan, glycine,glutamic acid ở nồng độ 5 mg/l) Ở thí nghiệm bổ sung phân d ơi kết quả cho thấy bổ

sung 4 g/l phân dơi vào môi trư ờng ½ MS tốt hơn hẳn đối chứng và các nghiệm thức

còn lại về chiều cao chồi (đạt 120,8%) và số rễ được hình thành (đạt 2,0 rễ) Thínghiệm bổ sung acid hữu c ơ ở nghiệm thức bổ sung acid malic 100 mg/l nhận thấy

có hiệu quả trên sự tăng trưởng chiều cao chồi (đạt 96,4%) v à số lá tương đối (đạt148,0%), về chỉ tiêu rễ giữa các nghiệm thức không có khác biệt về mặt thống k ê.Riêng thí nghiệm bổ sung amino acid nhận thấy kết quả kém h ơn so với nghiệmthức đối chứng về số lá gia tăng v à số rễ hình thành

MỞ ĐẦU

…….……

Lan là loài hoa vương gi ả tượng trưng cho tình yêu và vẻ đẹp, có ý nghĩa

thanh khiết và tao nhã, thể hiện sự quý phái và thanh lịch Hoa lan loài cây thânthảo, có màu sắc đẹp, hoa lâu tàn, sống lâu năm ở đất, nơi hốc, vách đá, sống khísinh, bì sinh nghĩa là không cần đất, đôi khi có mùi thơm nhẹ nhàng (Trần Hợp,

1998) Lan Hồ điệp (Phalaenopsis) là loài lan đơn thân, không có gi ả hành, lá to,

dày, mọc sát vào nhau, lá có màu xanh đ ậm Đây là loài hoa được trồng phổ biến và

nó thích hợp trồng trong nhà Hiện nay có nhiều giống lan Hồ điệp đ ược lai tạo rất

đa dạng về màu sắc và đang xuất hiện trên thị trường giống lan Hồ điệp lai có hoa

màu vàng rất đẹp Ngày nay hoa lan thường được nhân giống bằng ph ương phápnuôi cấy mô hay còn gọi là vi nhấn giống Theo Debergh v à Zimmerman (1991) quytrình vi nhân giống được chia làm bốn giai đoạn Ở giai đoạn tạo rễ (giai đoạn 3)

trước khi đem ra ngoài thuần dưỡng thì cây lan con cần phát triển đầy đủ, khoẻ

mạnh về (thân, lá, rễ) để cây có thể thích ứng v à phát triển tốt trong giai đoạn thuần

dưỡng Ở giai đoạn này cây con cần cung cấp nhiều chất hữu c ơ như dịch thuỷ phân

từ sữa, chuối xay, nước khóm, khoai tây, peptone, dịch chiết nấm men,…Việc cungcấp các chất này nhằm giảm giá thành và mang lại kết quả thuận lợi cho mô cấy(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Ngoài ra các chất thải hữu cơ

khác như phân dơi khi đư ợc cung cấp cho cây lan trồng trong v ườn cho thấy có hiệu

quả tốt trong sự sinh tr ưởng của cây lan, nhưng trong nuôi cấy mô việc bổ sung

phân dơi vào môi trư ờng nuôi cấy chưa được nghiên cứu nhiều Bên cạnh đó nhiều

acid hữu cơ (acid citric, acid malic, acid succinic) và các amino acid (tryptophan, glycine, glutamic acid) nh ận thấy có vai trò quan trọng cho cây quang hợp theo kiểuCAM mà cây lan là cây quang h ợp theo chu trình CAM

Do đó đề tề nghiên cứu: “Hiệu quả của chất hữu c ơ bổ sung vào môi

trường nuôi cấy trên sự sinh trưởng của lan con Hồ điệp ( Phalaenopsis sp.) in

vitro” nhằm mục đích xác định hiệu quả của các chất n ày trên sự sinh trưởng và

phát triển của cây lan Hồ điệp ở giai đoạn tiền thuần d ưỡng

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY LAN HỒ ĐIỆP 1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại

Lan Hồ điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis

Thuộc họ phụ Vandeae

Lan Hồ điệp được khám phá vào năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius

xác định dưới tên là Angraecum album Đến năm 1753, Linnes đổi lại l à

Epidendrum amabile và Blume 1825, m ột nhà thực vật Hà Lan đã định danh một lần

nữa là Phalaenopsis amabilis Bl và được dùng cho đến ngày nay.

Tên gọi phalaenopsis do ông Blume, 1825 đặt tên có nguồn gốc chữ Hy

Lạp: Phalaina có nghĩa l à “con bướm” và Opsis có nghĩa là “giống như”, nghĩa là

hoa của chúng giống như con bướm, và được gọi là Hồ điệp (Nguyễn Thiện Tịch và ctv., 2006) Giống lan Hồ điệp trên thế giới có khoảng trên 40 loài và càng ngày

càng được lai tạo thêm nhiều hơn Riêng ở Việt Nam có khoảng 6 lo ài phổ biến,được phân biệt dựa vào cánh môi và độ dài của hoa (Trần Hợp, 1998)

Lan Hồ điệp xuất xứ ở miền Bắc Australia, Ấn Độ v à các nước Đông Nam

Á như Philippines, Indonesia, bán đảo Đông Dương Lan Hồ điệp mọc ở độ cao

khoảng 200-400 mét, thích hợp khí hậu ẩm và nhiệt độ từ 20-350C (Huỳnh VănThới, 2005)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Lan Hồ điệp là loài cây đơn thân, không có gi ả hành, thân rất nhỏ được baobọc bởi các gốc lá ngắn sản xuất ra các rễ Hồ điệp có từ 4-5 lá có hình ngọn dáohay hình oval rất đẹp, có lá to và dày, lá có màu xanh đ ậm đặc biệt màu lá thay đổitheo mùa (Trần Văn Huân và Văn Tích Lượm, 2004) Lan Hồ điệp (H ình 1.1) làgiống hoa to, hoa gom lại th ành chùm đơn hay phân nhánh r ất đẹp (Thiên Ân,2004) Hoa mọc từ nách lá, có phát hoa d ài, hoa mọc thành chum và hoa nở từngcái, hoa Hồ điệp có 3 cánh đài to tròn, hai cánh xoè r ộng kín Môi hoa cong dẹp cóhai râu dài và hoa xếp đều đặn 2 bên cành nên cả đoá hoa trong giống như con

bươm bướm (Huỳnh Văn Thới, 2005) Hoa nở luân phi ên hết cái này đến cái khác,

thời kỳ nở hoa thay đổi theo lo ài và có thể nở trong vài tháng (Nguyễn Thiện Tịch

và ctv., 2006) Với điều kiện khí hậu mát nh ư huyện Di Linh, Bảo Lộc tỉnh Lâm

Ðồng thì hoa Hồ điệp thường nở chậm nhưng rất lâu tàn, có thể kéo dài đến 3- 4tháng (www.new.dalatrose.com)

Lan Hồ điệp trên thị trường hiện nay chủ yếu l à những cây lan được nuôitrồng từ nguồn giống cấy mô, có m àu sắc đa dạng với khoảng 16 - 17 màu khác nhau

từ những màu phổ biến như màu tím, màu trắng lưỡi đỏ, trắng lưỡi vàng, màu đỏ

đến những màu mới như trắng điểm đen, màu vàng, hoa có chấm sọc,…Ngoài dánghoa độc đáo, đẹp mắt và đa dạng về màu sắc, lan Hồ điệp còn có ưu điểm là cây trổhoa quanh năm (mỗi năm cây có thể trổ 3 lần hoa/chậu) v à hoa lâu tàn Đối với lan

Hồ điệp thời gian từ khi trồng cây cấy mô đến lúc ra hoa l à khoảng hơn 1 năm(www.longdinh.com)

1.1.2.1 Ánh sáng

Ánh sáng hữu hiệu cho loài hoa này ở 30-40% Ở vùng nhiệt đới nên chebớt ánh sáng bằng lưới che sáng 60% là thích hợp cho lan Hồ điệp nó phát triển tốt(Trần Văn Bảo, 1999)

1.1.2.2 Độ ẩm

Ẩm độ tối thiểu cần thiết cho lan l à 60ºC với điều kiện ẩm độ này nước ta

đủ thoả mãn với những yêu cầu tốt nhất cho cây lan sinh tr ưởng Do lá lan Hồ điệp

rộng và mọng nước nên rất dễ bị các giọt nước làm chấn thương, giúp vi khuẩn xâmnhập gây thối lá do đó khi t ưới nước nên cẩn thận và nhẹ nhàng (Nguyễn Thiện Tịch

và ctv., 2006).

1.1.2.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ cần thiết cho Hồ điệp v ào ban đêm phải trên 18oC và từ 24-29oC

vào ban ngày để cho lá và rễ phát triển tốt Nhiệt độ v ào ban đêm từ 16-18oC và banngày không quá 25,5oC là nhiệt độ cần thiết để cây tạo v òi hoa và hình thành hoa

Sự thay đổi nhiệt độ mạnh mẽ v à đột ngột có thể làm rụng nụ hoa nên điều kiện khíhậu lý tưởng nhất cho việc nuôi trồng lo ài hoa Hồ điệp từ 220C- 270C là thích hợpcho sự sinh trưởng và phát triển (Huỳnh Văn Thới, 2005)

Hình 1.1 Hoa lan Hồ điệp

1.1.2.4 Nước

Nước đặc biệt quan trọng đối với lan Hồ điệp v ì chúng không có cơ quan

chính giữ nước nào khác ngoài lá, diện tích bốc hơi của bản lá lớn nên phải cungcấp nước đầy đủ và thường xuyên Vào giữa mùa hè ở khí hậu khô nên tưới hàng

ngày cho cây lan Nên tư ới vào buổi sáng, khi tưới cần phải tưới kỷ để có thể ngăn

ngừa cho lá lan khỏi bị thối rữa v à pH tưới khoảng 5,2 là thích hợp (Trần Hợp,1998)

1.2 SƠ LƯỢC KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

1.2.1 Phương pháp nhân gi ống trong nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân

giống lan trên qui mô công nghiệp với hệ số nhân rất cao, th ường đạt từ 36

-1012/năm Cho đến nay không có phương pháp nhân giống vô tính nào khác có hệ số

nhân giống cao hơn và đã có trên 300 loại cây có thể nhân giống bằ ng phương phápnuôi cấy mô (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.2.1.1 Nhân giống hữu tính

Nhân giống hữu tính áp dụng trong nuôi cấy mô l à gieo hạt lan trong ốngnghiệm Một số loài lan ở vùng Đông Nam Á được gieo hạt trong ống nghiệm nh ư:hạt Vanda hay cây lai của Ascocentrum, Renamthera, Ascocenda,…đư ợc nảy mầmrất tốt ở 270C (Nguyễn Thiện Tịch và ctv., 2006).

1.2.1.2 Nhân giống vô tính-vi nhân giống

Cây lan sinh ra từ hột sẽ không hoàn toàn giống nhau, nên người ta đã ápdụng sự nảy chồi, đâm c ành để tách chiết và người ta cũng áp dụng nuôi cấy mô đểtạo ra vô số lan đồng nhất chỉ trong thời gian ngắn từ một khối mô rất nhỏ bé

(Nguyễn Thiện Tịch và ctv., 2006).

1.2.1.3 Một số thuận lợi của phương pháp vi nhân giống

- Nhân giống in vitro nhanh hơn nhân giống in vivo và sự sinh trưởng của cây in vitro mạnh hơn cây in vivo.

- Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống in vivo và giảm chi phí về năng lượng đối với các trường hợp các cây cần

được nhân giống trong nh à kính

- Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống kế tiếp, cây nhân giống in vitro có hữu dụng để tạo ra các ngân h àng gen.

- Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính nh ư các cây đơn bội,cây bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến, có thể duy trì bằng phương pháp nhân

giống in vitro (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

1.2.1.4 Các giai đoạn trong vi nhân giống

Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4 giai

đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng (Nguyễn Bảo Toàn, 2005)

In vivo Giai đoạn 0: sự chuẩn bị cây mẹ

In vitro Giai đoạn 1: bắt đầu diệt trùng

Giai đoạn 2: nhânGiai đoạn 3a: kéo dàiGiai đoạn 3b: tạo rễ và tiền thuần dưỡng

In vivo Giai đoạn 4: thuần dưỡng

Khử trùng đây là giai đoạn rất quan trọng, thậm chí quyết định to àn bộ quy

trình nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn n ày là phải tạo ra nguồn nguyên liệu thật sạch không bị nhiễm để đ ưa vào nuôi cấy in vitro, khử trùng mô thực vật

người ta thường dùng một số chất hóa học như: HgCl2, Ca(OCl)2, Na(OCl),

H2O2, tùy thuộc vào từng loại mô thực vật v à từng loại cây mà lựa chọn loại, nồng

độ và thời gian xử lý hóa chất cho thích hợp (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

 Giai đoạn 2

Chủ yếu nhân nhanh để tiếp tục cho giai đoạn 3 , chồi và cây con ở giai

đoạn 2 còn nhỏ chưa đủ khả năng để phát triển ngo ài tự nhiên Tùy thuộc vào từngđối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự h ình thành các

cụm chồi hay kích thích sự phát triển của chồi nách hoặc thông qua việ c tạo cây từphôi vô tính (Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý, 2005)

 Giai đoạn 3

Ở giai đoạn 3 là rất quan trọng đối với cây cấy mô v ì ở giai đoạn này cây

con sẽ được hình thành hoàn chỉnh và để đảm bảo cho hiệu quả sau n ày, vì vậy việc

xác định môi trường thích hợp để cây phát triển tối ưu là rất quan trọng để có thểđem cây ra ngoài nhà lư ới để thuần dưỡng Sự kéo dài các chồi ở giai đoạn 2 nhằmđạt kích thước thích hợp cho việc tạo rễ đầy đủ, nh ưng ít có loài thực vật nào có khả

quá trình tạo rễ là chất hữu cơ, chất điều hòa sinh trưởng, đa vi lượng, than hoạt

tính,…(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Giai đoạn 4

Giai đoạn này cây đã hoàn chỉnh (có đủ rễ, thân, lá) đ ưa từ ống nghiệm ra

đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả

năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Đây l à giai đoạn chuyển cây

con in vitro từ trạng thái sống dị d ưỡng sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm

bảo được điều kiện ngoại cảnh nh ư: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…ph ù hợp để

cây con đạt được tỷ lệ sống cao trong v ườn ươm (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.2.2 Môi trường trong nuôi cấy mô

Môi trường Murashige & Skoog, 1962 (MS) đây l à môi trường giàu về

thành phần muối khoáng Vì vậy đối với một số loài thì thành phần dinh dưỡng của

môi trường MS tỏ ra quá cao v à có trường hợp gây ngộ độc cho mô nuôi cấy Đối

với chồi cẩm chướng (Dianthus spp), hương nhu (Ocimum gratis-simum) chỉ sinh

trưởng được khi hàm lượng khoáng MS giảm đi một nửa (Vũ Văn Vụ, 1999), đây l àmôi trường được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Đồng thời

theo Bùi Bá Bổng (1995) thì môi trường MS giàu khoáng nên ở giai đoạn 3 này cầngiảm bớt hàm lượng ¼ hoặc ½ sẽ thu được hiệu quả hơn trên lan do loài th ực vậtnày nhạy cảm với muối

1.2.2.1 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy mô N ước được sửdụng trong cấy mô là nước cất một lần Trong một số tr ường hợp người ta sử dụng

nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng Nước khử khoáng là nước khử một lần hoặc

hai lần đi qua các cột khử khoáng hoặc các cột trao đổi ion (Nguyễn Bảo To àn,2005)

1.2.2.2 Carbon và nguồn năng lượng

Trong nuôi cấy in vitro, mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo ph ương

thức dị dưỡng nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết (Lê Trần

Bình và ctv., 1997) Trong nuôi cấy in vitro nguồn carbon giúp mô, tế b ào thực vật

tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp các tế bào phân chia, tăng sinh kh ối không phải

là do quá trình quang h ợp cung cấp mà chính là nguồn carbon được bổ sung vào môi

trường dưới dạng đường Hai loại đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là

glucose và sucrose, nhưng hi ện nay sucrose được sử dụng phổ biến h ơn, nồng độ

của nó thường ở mức 2-3% (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).Ngoài ra còn có thể dùng các loại đường khác như: glucose, fructose, maltose,…tu ỳ

thuộc vào từng loại mô, loại tế b ào và các mục đích của việc nuôi cấy (NguyễnXuân Linh, 1998).

1.2.2.3 Các vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng t ưởng và

sự phát triển của chúng T hực vật cần vitamin để xúc tác quá tr ình biến dưỡng khác

nhau Các vitamin thư ờng được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô l à: thiamine

(B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo -inositol Thiamin là một vitamin

căn bản cần thiết cho sự tăng t ưởng tất cả tế bào, thường được sử dụng với nồng độ

0,1-10 mg/l, acid nicotinic 0,1 -5 mg/l, pyridoxine 0,1-10 mg/l Myo-inositol người

ta cho rằng nó được phân tách ra thành acid ascorbic và peptine và đư ợc đồng hoáthành phosphoinositide và phosphatidylinosito lcos vai trò quan trọng trong phânchia tế bào Thường myo-inositol được sử dụng với nồng độ 50 -500

mg/l,….(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002)

cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong môi tr ường nuôi cấy hoặc làm

đen môi trường Than hoạt tính làm đen môi trường kích thích sự hình thành và sinhtrưởng hoàn thiện bộ rễ Đối với mẫu dễ bị hoá nâu th ì than hoạt tính làm giảm cácđộc tố đến mô nuôi cấy và than hoạt tính thường được sử dụng ở nồng độ 2 -3g/l (VũVăn Vụ, 1999)

1.2.2.5 Agar

Agar là chất thường được sử dụng nhất để tạo môi tr ường đặc hay môi

trường bán lỏng để nuôi cấy mô thực vật mặt khác agar có một số thuận lợi so với

chất làm đặc khác Độ cứng của agar được quyết định bởi nồng độ agar sử dụng v à

độ pH của môi trường nuôi cấy Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trongmôi trường nuôi cấy và không bị thủy phân bởi enzyme thực vật Nồng độ agarthường được sử dụng trong môi tr ường nuôi cấy là 0,5 -10%, những nồng độ nàycho độ cứng của agar ổn định ở các độ pH cho phép (Nguyễn Đức L ượng và Lê Thị

Thuỷ Tiên, 2002)

Agar có tác dụng cung cấp thêm iod, làm giàu hàm lư ợng iod trong môi

trường Ngoài ra trong thành phần agar có chứa một số thành phần vô cơ: Cu, Fe,

Mg, Mn, Cl, Zn, và hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).

1.2.2.6 Nguồn sắt

Fe là nguyên tố cần thiết cho việc tạo diệp lục tố Hiện nay hầu hết cácphòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp v ới Na2 – Ethylen Diamin

Tetra Acetat (EDTA) Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi

trường theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

1.2.2.7 Dinh dưỡng khoáng đa-vi lượng

Nhu cầu muối khoáng của tế b ào thực vật không khác so v ới cây trồng trong

tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần cung cấp bao gồm N, P, K, S, Mg, Ca, Na, Cl

Chúng được sử dụng ở nồng độ tr ên 30 mg/l nhằm cung cấp chất khoáng để cấu trúc

tế bào và mô thực vật (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Hầu hết các nguyên tố vi lượng đều cần thiết đới với mô nuôi cấy trong môi

trường nhân tạo Các nguy ên tố Fe, Bo, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, I, Mo đ ược sử dụng với

nồng độ dưới 30 mg/l Các nguy ên tố này đóng vai trò quan trọng hoạt động củaenzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.2.2.8 Vai trò của một số acid hữu cơ

Citric acid kết tinh từ dung dịch nước với một phân tử nước Citric acid phổbiến trong các loại cây thuộc họ cam, quýt, ở chanh h àm lượng đạt 9% khối lượngkhô, nó có hoạt tính sinh lý rất cao v à được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp.Malic acid có ở nhiều loại cây trồng, quả của các cây có hạt v à lá của các cây ngũcốc, cây đậu đổ Trong thuốc lá v à thuốc lào hàm lượng malic acid đạt 6,5% Ri êng

succinic acid ở dạng muối trong tế b ào của nhiều thực vật (Ngô Xuân Mạnh và ctv.,

2006)

Acid citric, acid malic, acid succinic là các acid h ữu cơ quan trọng trongquá trình quang hợp của thực vật Trong chu tr ình Citric acid (chu trình Krebs), acidcitric là chất trung gian quan trọng trong đó pyruvate bị oxy hoá ho àn toàn tạo ra

CO2 và năng lượng dưới dạng ATP, NADH, FADH xảy ra trong ty thể d ưới điềukiện có oxy Nói chung, khi bẻ g ãy hoàn toàn một phân tử pyruvate sẽ tạo ra4NADH, 1FADH2, 5ATP, 3CO2 và hàng loạt các chất trung gian nh ư: Acetyl-CoA,acid citric, acid glutamic, acid succi nic, là nguyên liệu để tổng hợp nên các acidamin, protein, chất béo, chất điều hoà sinh trưởng (Lê Văn Bé, 2007)

Theo Phạm Đình Thái và ctv (1987) chu trình Krebs là chu trình t ự xúc tác,

nghĩa là sự hô hấp của mô thực vật tăng l ên khi các acid hữu cơ của nó được thêmvào mà các acid citric, acid malic, acid succinic là các acid h ữu cơ tham gia vào chutrình này (Hình 1.2) Thông qua quá trình đường phân, đường glucose bị oxy hoá

thành pyruvate trong đi ều kiện háo khí, bước tiếp theo khử carboxyl hoá b ằng cáchoxy hoá pyruvate để tạo thành Coenzyme A (acetyl -CoA) quá trình này xảy ra ở

matric của ty thể là cầu nối giữa đường phân và chu trình Citric acid sau đó chất này

oxy hoá hoàn toàn CO2 nhờ vào chu trình Citric acid là đường hướng chung cuốicùng cho sự oxy hoá các phân tử amino acid, các acid béo v à carbohydrate, hầu hếtcác chất này đi vào chu trình dưới dạng acetyl CoA [pyruvate + CoA -SH + NAD+

→ acetyl CoA + CO2 + NADH] (xúc tác phản ứng này là một phức dehydrogenasecủa pyruvate) Chu trình Citric acid: Acetyl CoA vào chu trình, oxaloacetate ng ưng

tụ với acetyl CoA tạo th ành acid citrate (phản ứng xúc tác bởi citrate synthase)

Cirate đồng hóa thành iso citrate, iso citrate b ị oxy hóa và khử carboxyl hóa thành ketoglutarate, oxaloacetate đư ợc tái tạo trở lại bởi sự oxi hóa succinate, succinate bị

α-oxi hóa thành fumrate b ởi succirate dehydrogenase chất nhận hydrogen l à FAD

Bước kế tiếp là sự hyrate hóa fumrate để tạo ra L -malate, cuối cùng malate bị oxi

hóa thành oxalo acetate + NADH + H+ (Hình 1.2) theo Ngô Xuân M ạnh và ctv.

(2006)

Các acid hữu cơ như acid citric, acid malic và acid succinic giúp cây c ấy mô

đồng hóa đạm amonium, hạn chế hiện t ượng thừa nước, giúp tái tạo oxaloacetc acid

để duy trì hoạt động của chu trình Krebs khi các acid h ữu cơ của chu trình này lấy ra

do sự chuyển hóa thành apartic acid, glutamic acid, chlorophyl và cytochrome(Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Ở tất cả các loài thực vật ngày và đêm đều có một vài cố

định CO2 thành tạo oxaloacetc acid bằng phản ứng xúc tác bởi PEP carb oxyl Phản

ứng này cần thiết cho sự sinh tr ưởng vì bổ sung các acid hữu c ơ đã được chuyển hóa

vào các phân tử lớn hơn và cho phép chu tr ình Krebs hoạt động liên tục (Lê VănHòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Cây lan là cây quang h ợp theo chu trình CAM, ởloài này thường tích lũy một lượng lớn acid hữu cơ trong không bào đặc biệt là acidmalic (Nguyễn Như Khanh và Cao Phi B ằng, 2008)

Cây CAM (Crassulacean Acid Metabolism) khẩu mở vào ban đêm và đónglại vào vào ban ngày (cây C3 và C4 khẩu mở vào ban ngày và đóng lại ban đêm).Ban đêm khẩu mở CO2 vào và được cố định thành OAA rồi thành malic acid dự trữtrong không bào Ban ngày khẩu đóng lại để tránh mất nước, acid malic trong khôngbào di chuyển ra ngoài tế bào chất, malic khử thành acid pyruvic và CO2 , CO2nàytham gia vào chu trình Calvin (kiểu cố định CO2của cây C3)

1.2.2.9 Vai trò của một số amino acid

Amino acid hay còn g ọi là acid amin, cấu trúc chung của một phân tử acidamin (Hình 1.3), với nhóm amin bên trái và nhóm acid cacbonxylic ở bên phải.Nhóm R tùy thuộc vào từng amin cụ thể Amino acid ở trạng thái tinh thể rắn khôngmàu, hầu hết hòa tan dễ trong nước Sở dĩ amino acid có nhiệt độ nóng chảy cao v àhòa tan nhiều trong nước vì chúng tồn tại ion lưỡng cực hay muối nội phân tử(nhóm –COOH sau khi cho H+ mang điện tích âm; nhóm NH2 sau khi nhận H+

mang điện tích dương)

Mặt dù tế bào có khả năng tổng hợp các amino acid cần thiết nh ưng sự bổ

sung các amino acid vào môi trư ờng nuôi cấy để kích thích sự tăng tr ưởng của tế

bào Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi tr ường nuôi cấy tế bào

và nuôi cấy tế bào trần Amino acid cung cấp cho tế b ào thực vật sẵn sàng cho nhu

Hình 1.3 Phân tử acid amin Hình 1.2 Sơ đồ chu trình Citric acid (chu trình Krebs)

cầu tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.

Các nguồn nitrogen hữu cơ thường được sử dụng trong môi tr ường nuôi cấy

tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid nh ư casein hydrolysate, L -glutamine, asparagine và adenine Khi cung c ấp amino acid riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó

L-có thể cản trở sự tăng tưởng của tế bào (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,

2002) Các amino acid khi đư ợc thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ cung cấp cho cây

thêm nguồn N có sẵn một cách trực tiếp v à được tất cả tế bào hấp thu một cách

nhanh chống hơn dạng N vô cơ (Thorn et al.,1980) Theo Sander et al (1948) khi nghiên cứu sự sinh trưởng của phôi datura trong các môi trường có bổ sung amino

acid khác nhau nhận thấy rằng mỗi loại amino acid có ảnh h ưởng đặc trưng đến hìnhthái học của cây và tác giả cho biết thêm khi cho amino acid vào nuôi cấy phôi lan

thường gây ảnh hưởng ức chế đến sự sinh tr ưởng Riêng glutamic acid, arginine,

alanine, aspartic acid có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh tr ưởng phụ thuộc vào nồng

độ, điều kiện ánh sáng, giống lan v à tuổi của phôi

Tryptophan là amino ac id có mạch bên chứa nhân thơm, là tiền chất để tổnghợp nên vitamine (PP), thành ph ần không thể thiếu của NAD+ và NADP+, là nhữngcoenzyme của các enzyme dehydrogenase yếm khí, l àm nhiệm vụ vận chuyển H+ vàenzyme trong các phản ứng oxi hóa khử của quá tr ình hô hấp Đồng thời tryptophan

đây cũng là tiền chất để tổng hợp IAA, một auxin nội sinh của thực vật (Vũ Văn Vụ

và ctv., 1998) Glutamic acid là m ột amino acid với mạch b ên mang điện âm, là cơ

chất tổng hợp glutamic acid v à tổng hợp các amino acid khác Trong cơ thể thực vật

glutamic acid và glutamine là các amino acid đư ợc tạo ra đầu tiên từ khung carbon

của α –cetoglutarate, khi cây đư ợc cung cấp đủ glucid th ì glutamine được tích lũynhiều hơn asparagine Glycine là m ột amino acid không phân cực với mạc h bênthẳng Sự kết hợp glycine, glutamic acid v à cysteine tạo thành glutathion là hợp chất

đóng vai trò vận chuyển H+ và e- trong phản ứng oxi hóa khử

1.2.2.10 Nước dừa trong nuôi cấy mô

Chất có hoạt tính trong n ước dừa hiện nay được chứng minh là myo-inositol

và một số amino acid khác L ượng nước dừa dùng trong môi trường cấy mô khá lớn15-29% (w/w) thể tích môi trường Nước dừa được lấy, lọc trong và đựng trong túi

nilong được bảo quản trong tủ lạnh Thời gian bảo quản không quá v ài tháng nhưng

tốt nhất là sử dụng nước dừa tươi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Trong thành phần nước dừa có chứa nhiều muối khoáng, acid amin, kích tốrất cần thiết cho sự sinh tr ưởng và phát triển cho lan, thành phần nước dừa: muốikhoáng, glucid 3%, lipid 1%, p rotid 0,15-0,21% Nước dừa còn chứa rất nhiềuvitamine B1, B6, chứa auxin như IAA (Nguyễn Công Nghiệp, 2000) Nó không chỉ

(diphenylurea) là chất được tích từ nước dừa và được chứng minh chất n ày là

Cytokinin Nước dừa được sử dụng ở liều lượng 20-30% kết hợp với đường 20g/l

cho hiệu quả gia tăng kích th ước protcorms (Lê Văn Đơn, 1986) Ngoài ra theoSheena (2000) nước dừa góp phần hỗ trợ sự phát triển của rễ

1.2.2.11 Một số đặc điểm của phân d ơi

Hiện nay phân dơi được nhiều hộ nông dân sử dụng phân d ơi bón cho câytrồng thu gom phân d ơi về bón cho đồng ruộng thấy rất có hiệu quả về mặt kinh tế.Nhờ vào kết quả đó mà nông dân đã chủ động nuôi dơi để lấy phân Phân tích th ànhphần hóa học của phân d ơi có: urea, acid uric, kali, phosphorus, vitamine A,…và

phân dơi có hàm lượng lân rất cao So với các lọai phân hữu c ơ khác thì phân dơiđối với cây ăn quả cho năng suất rất cao đặc biệt là sầu riêng, dưa hấu,

(www.new.dalatrose.com ) Thí nghiệm của Sridhar et al (2006), ảnh hưởng của

phân dơi ở các mức độ khác nhau tr ên sự sinh trưởng của cây kê và đậu xanh giúp

cho cây trồng phát triển tốt do hấp thu h àm lượng N cao có sự khác biệt về chiềucao và trọng lượng khô so với nghiệm thức đối chứng, th ành phần phân dơi đượcphân tích ở (Bảng 1.1) Thí nghiệm phân tích hóa học của Shahack and Grooss(2004) cho thấy mẫu phân dơi có chứa nitrogen và phosphorous cao Trong đó Nchứa 8-12%, P2O5 chứa 2-7%, còn lại các nguyên tố khác (Ca, Mg, K, Al, Fe v à S)chứa dưới 5%

Bảng 1.1 Phân tích thành phần của phân dơi (Sridhar et al., 2006).

3

(1,2-2,4)

9,94±5,9 x 103(4,5-21) Trọng lượng khô (kg/m2)* 0,3±0,2 x 10

5

(0,1-0,7)

3,1±1,4 x 105(0,5-7,4)

Ghi chú : *=chất đóng trong 3 tháng

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm

Giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) lai có hoa màu vàng (ký hi ệu là PV)

được nuôi cấy ở Phòng Cấy mô, Bộ môn Sinh Lý -Sinh Hóa, Khoa Nông Nghi ệp và

Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ Cây con có chiều cao trung bìnhkhoảng 1-1,2 cm (1-2 lá)

2.1.2 Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Cấy Mô, Bộ môn Sinh Lý -Sinhhóa

- Nhiệt độ: 260C ± 2

- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ng ày

- Đèn neon chiếu sáng với cường độ 1.000–2.000 lux

- Thời gian thực hiện thí nghiệm: 2-2009 đến 4-2009

2.1.3 Phương tiện thí nghiệm

2.1.3.1 Thiết bị

Tủ cấy vô trùng, máy hấp khử trùng, tủ sấy, máy đo pH, microwave, cânphân tích, bếp điện tử,

2.1.3.2 Dụng cụ

Chai nước biển dung tích 500 ml, đũa thủy tinh, kép cấy, dao kéo cắt mẫu

cây, beaker, ống đong,

2.1.3.3 Hóa chất

Khoáng đa lượng

Khoáng vi lượng

NaFEDTA

Đường, agar, nước cất, than hoạt tính, n ước dừa

Phân dơi được lấy, sấy khô rồi mới sử dụng nấu chung với môi tr ường MS

Các acid hữu cơ (citric acid, malic acid, succinic acid); amino acid(tryptophan, glycine, glutamic acid)

2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHI ỆM

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Tất cả các thí nghiệm đều sử dụng môi tr ường đa-vi lượng theo Murashige

và Skoog (1962), có hàm lư ợng khoáng đa lượng giảm đi một nửa v à bổ sung thêmnước dừa 100 ml/l, đường sucrose 20 g/l, than hoạt tính 1 g/l, agar 8 g/l (kí hiệu

1/2MS) Tùy theo các thí nghi ệm có bổ sung các amino acid, các acid hữu c ơ, phân

dơi khác nhau mà có hàm lư ợng và nồng độ khác nhau

2.2.1.1 Thành phần đa lượng trong môi trường ½ MS

Môi trường nuôi cấy được tiến hành pha với liều lượng thích hợp, đem đo

pH, nấu cho tan hết agar, sau đó rót v ào chai nước biển (50 ml/chai) v à được hấpkhử trùng trong nồi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, trong 20 phút

2.2.2 Phương pháp nghiên c ứu

Phương pháp nghiên cứu dựa trên các thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự bổ sung phân d ơi vào môi trường nuôi cấy lên sự

sinh trưởng và phát triển của lan con PV

 Mục tiêu thí nghiệm: Xác định hàm lượng phân dơi thích hợp cho sự sinh

trưởng và phát triển của lan PV

 Phương pháp: Chồi lan PV được cấy vào môi trường 1/2MS có bổ sung

Nghiệm thức 2: 1/2MS + phân d ơi 1g/l

Nghiệm thức 3: 1/2MS+ phân d ơi 2g/l

Nghiệm thức 4: 1/2MS + phân d ơi 4g/l

Chồi lan PV in vitro có chiều cao khoảng 1-1,2 cm, có từ 1-2 lá được tách

từng cây riêng rẽ và cấy vào môi trường 1/2MS có bổ sung phân d ơi theo các liều

lượng từ 1-4 g/l Thí nghiệm được bố trí theo thể thức ho àn toàn ngẫu nhiên một

nhân tố với 4 nghiệm thức, có 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại l à một chai chứa 4 mẫucấy

Thí nghiệm 2: Hiệu quả của acid hữu c ơ vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh

trưởng và phát triển của lan con PV

 Mục tiêu thí nghiệm: Xác định hiệu quả của acid hữu c ơ lên sinh trưởng và

phát triển của lan PV

 Phương pháp thí nghiệm: Chồi lan PV được cấy vào môi trường 1/2MS có

bổ sung các acid hữu cơ với các hàm lượng khác nhau

Nghiệm thức 1: 1/2MS (đối chứng )

Nghiệm thức 2: 1/2MS + citric acid 100 mg/l

Nghiệm thức 3: 1/2MS + malic acid 100 mg/l

Nghiệm thức 4: 1/2MS + succinic acid 100 mg/l

Chồi lan PV in vitro có chiều cao khoảng 1-1,2 cm, có từ 1-2 lá được tách

từng cây riêng rẽ và cấy vào môi trường 1/2MS có bổ sung citric acid, malic acid,succinic acid với nồng độ 100 mg/l Thí nghiệm đ ược bố trí theo thể thức ho àn toànngẫu nhiên một nhân tố với 4 nghiệm thức, có 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là mộtchai chứa 4 mẫu cấy

Thí nghiệm 3: Hiệu quả của sự bổ sung amino acid v ào môi trường nuôi cấy lên sự

sinh trưởng và phát triển của lan con PV

 Mục tiêu thí nghiệm: Xác định hiệu quả của amino acid l ên sinh trưởng và

phát triển của lan PV

 Phương pháp thí nghiệm: Chồi lan PV được cấy vào môi trường 1/2MS có

bổ sung các amino acid với các h àm lượng khác nhau

Nghiệm thức 1: 1/2MS (đối chứng)

Nghiệm thức 2: 1/2MS + tryptophan 5 mg/l

Nghiệm thức 3: 1/2MS + glycine 5 mg/l

Nghiệm thức 4: 1/2MS + glutamic acid 5 mg/l

Chồi lan PV in vitro có chiều cao khoảng 1-1,2 cm, có từ 1-2 lá được tách

từng cây riêng rẽ và cấy vào môi trường 1/2MS có bổ sung tryptophan, glycine,glutamic acid với nồng độ 5 mg/l Thí nghiệm đ ược bố trí theo thể thức ho àn toàn