ẢNH HƯỞNG của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN của mô sẹo từ mẫu lá NON cây cẩm tú cầu (hydrangea macrophylla (thun b ) ser ex DC ) IN VITRO

in vitro” được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển mô sẹo từ lá cây cẩm tú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN ĐỨC THUẬN

ẢNH HƯỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO

VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO

TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU

(Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)

IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Hoa Viên và Cây Cảnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Hoa viên và Cây cảnh

ẢNH HƯỞNG CỦA NAA VÀ BA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO

VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO

TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU

(Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)

IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn:

Ths Nguyễn Văn Ây

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Đức Thuận

MSSV: 3087751 Lớp: Hoa Viên và Cây Cảnh K34

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ

Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA NAA VÀ B A LÊN SỰ MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ

SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.) IN VITRO” do sinh viên NGUYỄN ĐỨC THUẬN thực

hiện kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012

Cán bộ hướng dẫn

Ths Nguyễn Văn Ây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèm

với tên đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA NAA VÀ B A LÊN SỰ MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY CẨM TÚ

CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.) IN VITRO” do sinh viên

NGUYỄN ĐỨC THUẬN thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp và đã được thông qua

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ………

……… … ………

Duyệt của Khoa Trưởng Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Nguyễn Đức Thuận

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1 LÝ LỊCH

Họ và tên: Nguyễn Đức Thuận Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 09/06/1989 Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Huyện Mỹ Xuyên, Tỉnh Sóc Trăng

Quê quán: Ấp Hòa Tân, xã Hòa Tú 1, Mỹ Xuyên, Sóc Trăng

Con: ông Nguyễn Quốc Nhặt và bà Nguyễn Thị Loan

2 QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

Năm 1995 - 2000: Học sinh trường tiểu học Hòa Tú 1, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng

Năm 2000 - 2005: Học sinh trường THCS Phường 3, tỉnh Sóc Trăng

Năm 2000 - 2007: Học sinh trường THPT Hoàng Diệu, tỉnh Sóc Trăng

Năm 2008 - 2012: Sinh viên ngành Hoa Viên & Cây Cảnh K34, Khoa Nông Nghiệp

& Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012

Nguyễn Đức Thuận

LỜI CẢM TẠ Kính dâng

Con xin thành kính biết ơn công lao sinh thành và nuôi dưỡng tựa trời biển của cha mẹ đã giúp con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Thầy Phạm Phước Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cố vấn học tập của lớp, đã tận tâm dìu dắt, rèn luyện và giúp đỡ em trong suốt 4 năm học tại trường Đại Học Cần Thơ

Chân thành cảm ơn:

Quý Thầy/Cô và cùng với các anh chị trong phò ng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô,

Bộ Môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ

Các bạn lớp Hoa viên & Cây cảnh K34 đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt những chuỗi ngày học Đại Học

Tác giả luận văn

Nguyễn Đức Thuận

MỤC LỤC

1.1 Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật học: 2

2.2 Phương Pháp 17

3.1 Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tạo mô sẹo của lá cây

Cẩm tú cầu in vitro

20

3.2 Khảo sát khả năng phát triển của cụm mô sẹo và tái sinh

chồi từ mẫu lá non của cây Cẩm tú cầu trên môi trường

MS với các nồng độ BA khác nhau

28

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Tỷ lệ (%) mẫu lá Cẩm tú cầu tạo mô sẹo trên môi trường có nồng độ

Hình Tựa hình Trang

3.1 Sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Cẩm tú cầu non trên môi trường MS

+ NAA 3 mg/l + BA 0,1 mg/l nuôi cấy in vitro

3.5 Sự biến đổi cấu trúc của mô sẹo trên môi trường MS bổ sung BA 4

mg/l vào thời điểm 6 tuần nuôi cấy

29

3.6 Sự phát triển của mô sẹo trên môi trường MS bổ sung BA 5 mg/l

vào thời điểm 6 tuần nuôi cấy

31

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BA: Benzyl adenine

CĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng

ctv: Cộng tác viên

LS: Linsmaier and Skoog, 1965

MS: Murashige and Skoog, 1962

NAA: Alpha-naphthalene acetic acid

TSKC: Tuần sau khi cấy

NGUYỄN ĐỨC THUẬN 2012 “Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo

và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú c ầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.) in vitro” Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Hoa

Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học

Cần Thơ Cán bộ hướng dẫn: Ths Nguyễn Văn Ây

TÓM LƯỢC

Ngày nay, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu chơi hoa kiểng cũng ngày càng tăng Tuy nhiên số lượng hoa còn hạn chế, hình dáng cây, hoa cũng như màu sắc hoa còn chưa phong phú và đa dạng Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.) là một trong những loại cây có hoa đep, sang trọng và đa dạng về màu sắc Trong phương pháp vi nhân giống, phương pháp nhân giống thông qua tạo mô sẹo có nhiều ưu điểm hơn nh ư không làm tổn hại nhiều đến cây mẹ, có nguồn mẫu dồi dào, vừa có hệ số nhân chồi cao

Vì vậy đề tài: “Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser exDC.) in vitro” được thực hiện nhằm xác định nồng độ các NAA và BA thích hợp để tạo mô sẹo và khả năng phát triển mô sẹo của lá cây Cẩm tú cầu in vitro Kết quả thí nghiệm cho thấy: (i) Môi trường MS bổ sung NAA (2-4 mg/l) hoặc MS

bổ sung NAA (2-4 mg/l) kết hợp với BA 0,1 mg/l có hiệu quả tối ưu trong việc cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy lá non cây Cẩm tú cầu in vitro (đạt 100% sau 10 tuần nuôi cấy), (ii) Môi trường MS bổ sung BA ở nồng độ từ 1 -5 mg/l đều có hiệu quả cho sự phát triển của mô sẹo cẩm tú cầu sau 6 tuần nuôi cấy

Từ khóa: Cây Cẩm tú cầu, BA, NAA, mô sẹo, tái sinh, in vitro.

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu chơi hoa kiểng cũng ngày càng tăng Tuy nhiên số lượng hoa còn hạn chế, hình dáng cây, hoa cũng như màu sắc hoa còn chưa phong phú và đa dạng

Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thumb.) Ser ex DC.) là một giống cây

thuộc họ Hydrangeaceae có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á (Nhật Bản, Trung Quốc,…) Đây là một loại cây có hoa đep, sang trọng và đa dạng về màu sắc Cây

có dạng thân thảo bụi, sống lâu năm, hoa hình cầu to đẹp Cẩm tú cầu nước ta là một loại cây được ưa chuộng và trồng rộng rãi dùng để trang trí và làm cảnh, việc nhân giống cây Cẩm tú cầu chủ yếu bằng các phương pháp truyền thống

Trong điều kiện in vivo người ta tiến hành nhân giống vô tính bằng các phương

pháp giâm cành, chiết cành…nhưng phải mất một khoảng thời gian dài để thu được kết quả (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002), đó là một kỹ thuật chiếm nhiều ưu thế nhưng không làm sạch bệnh và hệ số nhân giống thấp (Dương Công Kiên, 2007) Vì thế việc nhân giống cây đã không đáp ứng đủ số lượng theo yêu cầu thị trường

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật (Vũ Văn Vụ, 2006) Đây là một công cụ nhân giống tích cực so với các phương pháp nhân giống truyền thống tạo được cây sạch bệnh, hệ số nhân chồi cao

và thời gian sản xuất được rút ngắn (Dương Công Kiên, 2007) Trong phương pháp vi nhân giống, phương pháp nhân giống thông qua tạo mô sẹo có nhiều ưu điểm hơn như không làm tổn hại nhiều đến cây mẹ, có nguồn mẫu dồi dào, vừa có

hệ số nhân chồi cao Tuy nhiên, ở nước ta các phương pháp này còn hạn chế và mới được áp dụng trong thực tế sản xuất trong lĩnh vực vi nhân giống hoa cảnh, cây nông nghiệp…(Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Đề tài “Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của

mô sẹo từ mẫu lá non cây Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.) in vitro” được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA lên sự tạo mô sẹo và khả năng

phát triển mô sẹo từ lá cây cẩm tú cầu in vitro, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong nhân giống in vitro loại cây này

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật học

Theo Võ Văn Chi (2004), Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thumb.) Ser ex

DC.), thuộc họ Hydrangeaceae, bộ Hydrangeales Phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản Ở Việt Nam, cây cẩm tú cầu thường được trồng trong các vườn cảnh Tuy nhiên củng có thể gặp cây mọc hoang ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

1.2 Đặc tính thực vật

Cẩm tú cầu là loại thân thảo bụi, sống lâu năm, cao từ 0,5 - 1 m, thân cây chắc, có phủ lông rậm, ngắn, khi lớn gốc thân hóa gỗ dần, lá mọc đối phiến xoan bầu dục rộng, dài 7 - 20 cm, rộng 4 - 10 cm, mép có răng cưa, gân phụ 5 - 7, chiều cao cây phụ thuộc vào điều kiện trồng và chăm sóc

Hoa mọc thành cụm hình cầu to; hoa phía ngoài lép, với lá đài to như cánh hoa, màu trắng rồi chuyển sang màu lam hay hồng khi nắng; hoa sinh sản ở phía trong nhỏ, với 4 - 5 lá đài, 4 - 5 cánh hoa, 4 - 5 nhị, bầu noãn dưới có 3 -5 buồng (Đặng Minh Quân, 2010)

Hình 1.1 Cây và hoa cẩm tú cầu

(Nguồn: http://www.cayxanhsadec.com.vn/product/wiew/161.Cẩm-Tú-Cầu.html)

1.3 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật

Gottlieb Haberlandt (1902), nhà thực vật học người Đức, đã đặt nền móng đ ầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó, và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Đức Thành, 2000) Sau đó khi Went và Thimann tìm ra được chất kích thích sinh trưởng đầu tiên, sau đó xác định là indole acetic acid (IAA) Năm 1939, Gautheret và

Nobecourt đã duy trì được sự sinh trưởng của mô sẹo Carrot (Daucus carota) trong một thời gian dài (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) Năm 1941, Overbeek và cộng

sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở Carrot Patura

Năm 1957, Skoog và Miller tạo ra được chồi từ mảnh mô thân cây thuốc lá, đồng thời khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin/cytokinin: nồng độ auxin/cytokinin <1 có xu hướng tạo ra chồi, ngược lại khi nồng độ auxin/cytokinin

>1, mô có xu hướng tạo rễ và tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật đã có những bước tiến vượt bậc với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọ n tạo giống cây trồng như: đột biến soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bào trần, tạo dòng kháng thể, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn trên nhiều đối tượng cây trồng

Ở Việt Nam kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào đã được ứng dụng trong nghiên cứu

nhân nhanh và phục tráng giống cây trồng (Lê Trần Bình và ctv., 1993) và các ứng

dụng này đã giúp ích cho nhiều nước phát triển nông nghiệp, lâm nghiệp và cây cảnh theo hướng công nghệ cao (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.3.1 Mục đích và ý nghĩa

Nuôi cấy in vitro là một từ rất tổng quát để chỉ việc nuôi cấy tế bào hay mô để

chúng phát triển trong môi trường dinh dưỡng vô trùng trong một thời gian vô hạn, mục đích chính là nhân những dòng thành lượng lớn (Lâm Ngọc Phương, 2009) Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta có thể khắc phục được khó khăn mà phương pháp truyền thống như giâm cành, chiết cành,… không làm được và dễ dàng tạo ra được những phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt Từ đó

có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng mong muốn

Nuôi c ấy mô là một phương pháp làm gi ảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2010), tạo được số lượng cây con lớn và đồng đều, đáp ứng nhu cầu thị trường (Dương Công Kiên, 2007) Đó được xem là một phương pháp rất thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển, việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm đã trở thành một kỹ thuật nông nghiệp phổ biến, được sử dụng để phục tráng giống và nhân các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao

Theo Lâm Ngọc Phương (2009), việc nhân giống vô tính trong ống nghiệm nhằm các mục đích:

Tạo được một số lượng lớn cây con giống cây mẹ

Tạo nên một sự chọn lọc các gốc mẹ

Cứu lấy các loại thực vật đang trên con đường bị biến mất

Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng kỹ thuật trồng đại trà, có kiểm soát trong tạo giống và nhân giố ng cây trồng Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong s ản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp như sau:

- Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh

- Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất

- Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch

- Tạo ra sự đồng lo ạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối Sự đồng loạt này giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch Do đó năng suất lao động sẽ tăng lên Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ và chế biến (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Ở Việt Nam nhân giống vô tính in vitro đã thành công trên nhiều loài cây, trong đó

có những cây quan trọng về mặt kinh tế như: lúa, bắp, khoai tây, rau, các loại hoa,

cà phê, cau su, một số cây thân gỗ có giá trị,… (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị

1.3.2 Sự hình thành mô sẹo và tái sinh

1.3.2.1 Định nghĩa mô sẹo (callus)

Mô sẹo bao gồm một khối vô định hình của các tế bào nhu mô có vách mỏng được sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Mô sẹo là một khối tế bào không tổ chức, hình thành từ các mô ho ặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý với chất điều hòa sinh trưởng thực vật,… (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Trong quá trình t ạo mô sẹo từ lá song tử diệp, mô sẹo xuất hiện trước hết là ở vị

trí vết cắt, kế đến là xuất hiện ở vùng đáy lá, vùng giữa của lá (Pal và ctv., 1985) hay ở hệ thống mạch (Gleddie và ctv., 1983)

Sự hình thành mô sẹo ở vết thương là sự thích ứng bảo vệ và có thể chia làm ba giai đoạn: kích thích, phân chia và chuyên hóa Mô sẹo khi hình thành gồm hai loại: loại xốp chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng, không bào to

và lo ại cứng gồm các loại tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc, không bào to (Vũ Văn Vụ, 1999) Mô sẹo khi hình thành nếu được tiếp xúc duy trì trong môi trường có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ nhanh, nhưng nếu chuyển sang một môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng không có sự hiện diện của các auxin thì s ự tăng sinh của callus diễn ra rất chậm (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), việc tạo mô sẹo có những ưu điểm như:

- Đạt được các cây sạch virus

- Tạo các biến dị soma và thể giao tử

- Tạo các nguồn vật liệu để cấy tế bào trần và cấy treo

- Sản xuất cây con thông qua sự tạo phôi soma và tạo được cơ quan

- Sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp hữu ích

- Chọn lọc tế bào có đặc tính kháng với môi trường bất lợi

- Nghiên cứu sự tạo đột biến

Các tế bào thuộc mô ho ặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin (riêng lẽ hay kết hợp với cytokinin)

để cho ra mô sẹo Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên do tế bào các tượng tầng, sự xáo trộn các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan

1.3.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo mô sẹo

Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa, kiểu gene (Torres, 1989) Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh

trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy (Pal và ctv., 1985) Ánh sáng: trong sự tái sinh chồi in vitro từ lá cây Lê hoang dại, quá trình nuôi cấy

mô được chia làm 2 giai đoạn: giai đoạn 1 (30 ngày) trong tối và giai đoạn 2 ngoài ánh sáng đã làm gia tăng số chồi được tái sinh Điều kiện tối cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào lá để tạo mô sẹo và giai đoạn sáng biểu hiện (tái phân hóa)

để tái sinh chồi (Caboni và ctv., 1999) Theo Pierik (1987) trong suốt thời gian tạo

mô sẹo tùy theo mẫu cấy mà ánh sáng có thể cần hay không cần thiết Tuy nhiên

mô sẹo trong tối tăng trưởng tốt hơn mô sẹo dưới điều kiện sáng do tác động ức

chế của ánh sáng đối với mô sẹo (Gibson và ctv., 1993)

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Mô sẹo thường được tạo ra trong môi trường có bổ sung auxin, trong môi trường nuôi cấy các khối u ở các mô

và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào tạo mô sẹo, kích thích tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma, từ huyền phù tế bào (Pierik, 1987)

Tuổi và kích thước mô c ấy: tiềm năng phát sinh hình thái c ủa mô c ấy khác nhau phụ thuộc vào tuổi của lá Các mảnh mô hay cơ quan thực vật đã trưởng thành thường khó tạo mô sẹo hơn các mảnh mô hay cơ quan còn non do các tế bào của chúng đi sâu vào sự biệt hóa nên khó trở lại trạng thái tế bào phân sinh Do vậy, chúng ít có khả năng phân chia khi bị áp dụng các chất kích thích như auxin, hay

auxin kết hợp với một cytokinin (Torres, 1989) Các lá non Echeveria elegans (họ Crassullaceae) tăng trưởng rễ in vitro sớm hơn tạo chồi, trong khi đó hiện tượng

ngược lại xảy ra ở các lá già hơn (Narayanaswamy, 1994) Khả năng tái sinh chồi cũng phụ thuộc vào kích thước mô cấy lá Những mô cấy (thậm chí cả mô sẹo) quá nhỏ không thể đáp ứng với điều kiện nuôi cấy và thường bị hóa nâu Các mảnh lá

Solanum laciniatum có đường kính nhỏ hơn 2 mm không sống được, trong khi đó

những mô cấy có đường kính từ 5 - 10 mm thì có khả năng phát triển như nhau (Narayanaswamy, 1994)

Hướng đặt mô cấy: mô cấy lá đặt úp mặt bụng cho tiếp xúc trực tiếp với môi trường có hiệu quả hơn là đặt ngược lại Mô cấy lá Gasteria và Haworthia tạo ra nhiều phôi soma khi được đặt nằm úp mặt bụng lá tiếp xúc với bề mặt môi trường

Sự cấy chuyền: một số mô sẹo vẫn duy trì khả năng phát sinh cơ quan một thời

gian dài sau vài lần cấy chuyền (Narayanaswamy, 1994; Caboni và ctv., 1999) Số

lượng cây con sẽ gia tăng sau nhiều lần cấy chuyền cơ quan hay mô sẹo (Bùi Trang Việt, 2000) Nếu như các môi trường nuôi cấy cứ mãi không tách ra và cấy truyền thì mô sẹo bị hoại tử và chết Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trưởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Tuy nhiên, sự cấy chuyền nhiều lần trong thời gian dài cũng làm giảm tiềm năng phát sinh hình thái, được cho là có liên quan đến tính đa dạng

di truyền trong quần thể tế bào Khả năng cảm ứng chồi bị giảm ở một số loài, như trong mô sẹo cây thuốc lá, do sự cấy chuyền trên môi trường cảm ứng tạo chồi (Naraynaswamy, 1994)

Khả năng tạo mô sẹo ở mô hay cơ quan phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau Ngoài các yếu tố như kiểu gene, tuổi, còn có một yếu tố khác đó là trạng thái sinh

lý của vật liệu nuôi cấy (Nozeran, 1984; Nozeran và ctv., 1982; Torres, 1989) 1.3.2.3 Sự tái sinh mẫu cấy

Tái sinh là quá trình mà mô biệt hóa được khử biệt hóa và chuyển thành mô non trẻ, có khả năng phân chia tế bào và bước vào chu trình tế bào mới, hình thành cơ

quan (Klerk và ctv., 1997)

Sự tái sinh cơ quan từ mô sẹo tương tự như sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy Tế bào của mẫu cấy sẽ phản phân hóa dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật phân chia hỗn loạn tạo thành mô sẹo

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), sự tái sinh cơ quan không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp vì:

- Những tương quan cần phá vỡ để lặp lại những mối tương quan khác có thể đưa đến việc tái sinh cơ quan

- Sự phân hóa của những tế bào đã phân hóa

- Sự phân chia tế bào, đôi khi t ạo thành mô sẹo, khi tế bào phân chia thì bắt đầu xảy ra sự hình thành cơ quan

Những mô cảm ứng hình thành những cụm tế bào có tổ chức với tốc độ phân chia

tế bào và tạo cơ quan Mashayeki chỉ ra rằng sự sinh tổng hợp protein trong quá trình tái sinh chủ yếu tập trung ở vùng có khả năng tái sinh cao hoặc sự tái sinh sắp xảy ra

Trong quá trình tái sinh thường gây nên một số cấu trúc bất thường, cấu trúc này được chia thành hai dạng chính; bất thường do những thay đổi di truyền, và bất thường không di truyền (Epigenetic) Epigenetic là dạng bất thường không ổn định

do ảnh hưởng hoạt động biểu hiện gene c ần thiết cho sự tái sinh (Clinton, 1984) Một số bất thường có thể quan sát bằng mắt như thay đổi kiểu dạng thân, hình thái

lá, hoa và trạng thái phát triển của thực vật, nhưng có những thay đổi bên trong không nhận diện bằng mắt thường được như thay đổi trên con đường sinh hóa, đặc tính kháng bệnh (chuối kháng sigatoka, cỏ ba lá kháng fusarium…) Đối với nhân giống vô tính thì cây con tái sinh có đặc tính giống cây mẹ và tần số tái sinh cao rất quan trọng Tuy nhiên, sự gia tăng tần số tái sinh thường đi kèm với sự gia tăng tần

số xuất hiện cấu trúc bất thường Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vừa cảm ứng tối

đa số lượng chồi tái sinh vừa giảm tối thiểu tần số cấu trúc bất thường quyết định

sự thành công của phương pháp nhân giống

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tái sinh

Nhiều nhân tố khác nhau ảnh hưởng lên hệ thống tái sinh, trong đó nhân tố hormone đóng vai trò quan trọng nhất Các yếu tố môi trường như dinh dưỡng, nồng độ khoáng, điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm) cũng đóng vai trò quan trọng không kém Gần đây, các nhân tố cảm ứng stress được nghĩ có ảnh hưởng lớn đến quá trình tái sinh Mô tách rời khỏi cây mẹ và sống trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo sẽ chịu nhiều phản ứng stress như gia tăng tốc độ các chất oxi hóa, các gốc tự do,… đòi hỏi mô tận dụng các hệ thống kháng stress như

hệ thống Ascorbate/Dehydroasco, GSH/ GSSG (Glutathione dạng khử và dạng oxi hóa) và gia tăng hoạt động của enzyme kháng oxy hóa

Môi trường nuôi cấy: các thành phần trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sự thành công c ủa quá trình tái sinh Môi trường cơ bản thường sử dụng là bao gồm chất đa lượng, trung lượng, vi lượng, vitamin, đường và chất điều hòa sinh trưởng Nhiều loại môi trường sử dụng trong tái sinh được điều chỉnh từ môi trường Murashige và Skoog (1962) Hơn 50% mô sẹo có độ tuổi 10 - 15 ngày tạo thành công trên môi trường tái sinh và mô sẹo có độ tuổi già hơn 50 ngày thì

hầu như không có cây tái sinh (Wang và ctv., 1974) Agar không nên được sử dụng

làm chất đông đặc môi trường tái sinh vì nó chứa các chất ức chế (Gresshoff và Doy, 1972)

1.3.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho

sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sinh trưởng bình thường của cây Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi c ấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như môi trường MS,

LS

Các thành phần cơ bản của môi trường bao gồm: muối khoáng (đa lượng, trung lượng và vi lượng), vitamin, đường và chất điều hòa sinh trưởng, agar đối với môi trường cứng Ngoài ra người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,…

1.3.4.1 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy mô Nước sử dụng trong cấy mô thường là nước cất một lần Trong một số trường hợp, người ta cũng sử dụng nước cất hai lần hoặc nước khử trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.3.4.2 Các nguyên tố đa lượng

Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy

và không gây độc (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005), mỗi nguyên tố có một vai trò riêng Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca),…

1.3.4.3 Các nguyên tố vi lượng

Đây là nguyên tố mà cây trồng cần rất ít nhưng không thể nào thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây Hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết cho cây đều được cung cấp vào trong môi trường nuôi cấy mô

Welander (1977) đã đưa ra những bằng chứng cho thấy rằng tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái sẽ cần nhiều khoáng vi lượng hơn (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Các nguyên tố vi lượng thêm vào môi trường là Iodine (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Molybden (Mo), Đồng (Cu), Cobalt (Co), Sắt (Fe) Nồng độ khoáng vi lượng thường sử dụng thấp hơn 30 g/l Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.3.4.4 Nguồn carbohydrate

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp, do

đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào

Trong nuôi c ấy in vitro, nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các

chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Ngoài ra, nguồn carbon còn điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường (Vũ Văn Vụ, 1999)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), carbohydrate được phân thành hai nhóm: nhóm các carbohydrate hỗ trợ cho sự sinh trưởng của màng tế bào trong cấy mô gồm các loại đường sucrose, maltose, galactose, mannose, fructose, ribose, sorbitol, glycerol và nhóm các carbohydrate không hỗ trợ cho sự sinh trưởng c ủa tế bào trong cấy mô bao gồm arabinose, xylose, mannitol, rhamnose Sucrose 3% được sử dụng phổ biến như là một nguồn cung cấp carbohydrate Nhìn chung trong nghiên cứu mô thì môi trường MS cũng khẳng định được việc sử dụng 3% sucrose tốt hơn

2% và 4% (Pati và ctv., 2006)

1.3.4.5 Vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng, thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Trong môi trường nuôi cấy, đa số mô cấy chưa có cấu trúc để tự tổng hợp đủ lượng cần thiết nên cần phải bổ sung thêm vitamin từ bên ngoài vào (Lê Văn Hòa

và Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong cấy mô là: thiamin (B1), nicotinic acid (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol Các vitamin này được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng sức sống cho mô Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào, nicotinic acid và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cần thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loại thực vật Myo-inosiyol có tác dụng cải thiện sự sinh trưởng của mô cấy và được dùng ở hàm lượng khoảng 10 - 100 mg/l (Đặng Phương Trâm, 1997) Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và chúng cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào

nhiên được trích từ loài tảo đỏ Gelidium amansii sống ở biển (George, 1993) 1.3.4.7 Nước dừa

Năm 1941 công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van

Overbeek và ctv (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Hồng, 2009) Sau đó tác dụng tích

cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận

Nước dừa là nội nhũ lỏng cung cấp các chất dinh dưỡng nuôi phôi dừa, được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy nhằm tăng sự sinh trưởng và phát triển mô Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc

để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Thành phần nước dừa khá phong phú có

chứa inositol và các chất thuộc nhóm cytokinin như zeatin…(Vũ Văn Vụ và ctv.,

2006) Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993), có lơi cho việc tạo phôi, tạo

mô sẹo và tái sinh cây

1.3.4.8 pH

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), pH quyết định sự hòa tan của khoáng, ảnh hưởng đến sự hấp thu khoáng trong môi trường Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH c ủa môi trường nuôi cấy thường từ 5,0 - 6,5 và thường được điều chỉnh để đạt khoảng 6,0 Môi trường có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn 7,0) ức chế sự phát triển của mô (Bùi Bá Bổng, 1995)

Nếu pH của môi trường thấp hơn 5 thì thạch sẽ khó đông và cao hơn 6 thì môi trường sẽ bị cứng

1.3.4.9 Ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng kích thích sự nảy mầm của phôi, do đó ở giai đoạn còn non được nuôi cấy trong tối để phôi được phát triển và khi cần tái sinh các phôi sẽ được chuyển ra nuôi ở nơi có ánh sáng Tuy nhiên có những phôi c ần điều kiện ánh sáng để phát triển, nhu cầu về cường độ, thời gian chiếu sáng cũng không giống nhau cho sinh

trưởng tối ưu (Vũ Văn Vụ và ctv., 2000) Theo Nguyễn Thiện Tích và ctv (2002),

nhiệt độ ảnh hưởng đến các mô cấy, nhưng tốt nhất cho đa số các mô là 25 ±4,5oC Nhiệt độ cũng ảnh hưỡng đến sự tạo phôi Sự tạo phôi thường xảy ra trong kho ảng nhiệt độ 20 - 30oC, vượt qua khỏi giới hạn này sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự tạo phôi Sự gia tăng nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme tham gia vào các con đường biến dưỡng tạo các sản phẩm bậc một để cung cấp năng lượng và

nguyên liệu cho sự tăng trưởng và phân chia tế bào (Choi và ctv., 2000)

1.3.4.10 Chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi

cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) Có bốn nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong

nuôi c ấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin và abscisic acid Hiện nay hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng nhất là auxin và cytokinin Miller là người đầu tiên nhận thấy tỷ lệ auxin/cytokinin xác định phân hóa cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thi Thủy Tiên, 2002)

 Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi c ấy mô và tế bào thực vật Chúng đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật đối với các tính hiệu từ môi trường như ánh sang, trọng lực; trong việc kiểm soát các mối tương quan ưu tính ngọ n; trong sự tạo sơ khởi rễ… Auxin cũng kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy

để kích thích sự hình thành mô sẹo, điều hòa sự phát triển hình thái, đặc biệt là khi

nó được sử dụng phối hợp với cytokinin Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di truyển của auxin có vai trò trong việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật

và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000; Berleth 2001)

Năm 1926 Went ở Hà Lan lần đầu tiên nghiên cứu một nhóm chất gọi là auxin - đây là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật đầu tiên được xác định (Tomic và

indol-3-acetic acid (IAA) (Lê Văn Bé, 2007) và đây cũng là lo ại auxin tự nhiên được nhiều người biết đến nhất (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002),

có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự dình thành rễ Ngoài ra, IAA còn có các dẫn xuất của nó là naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D) Các chất này đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình hình thành rễ Các chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin gồm NAA, 2,4-D, IAA, IBA sử dụng với nồng độ trong

kho ảng 0,1 - 5 mg/l (Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1984) Tác động của auxin trong

nuôi c ấy tế bào thay đổi tùy theo loài và tùy thuộc vào nồng độ cũng như sự hiện diện của các loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật Thông thường auxin kích

thích kéo dài tế bào (Bùi Trang Việt, 2000; Sharp và ctv., 1995); cảm ứng mô sẹo

khi dùng riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác (Moon và Stomp, 1997)

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thi Thủy Tiên (2002), auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy Loại auxin thường được sử dụng cho mục đích này là 2,4–D, nhưng nếu tiếp tục duy trì mô sẹo trong môi trường có 2,4–D này thì tế bào dễ bị đột biến Vì vậy, nguời ta có thể cảm ứng

mô sẹo bằng NAA hay IAA ho ặc sau khi cảm ứng mô sẹo bằng 2,4–D thì mẫu cấy được chuyển sang môi trường NAA hoặc IAA Nồng độ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn c ản sự phát sinh hình thái nhưng l ại cảm ứng cho sự phát sinh phôi soma từ các tế bào có khả năng sinh phôi Trong cây auxin được tổng hợp ở các

mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây Nồng độ auxin cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi (Skoog và Miller, 1957)

 Cytokinin

Cytokinin được tổng hợp chủ yếu ở mô phân sinh ngọn rễ và được vận chuyển trong xylem đến chồi (Bùi Trang Việt, 2000; Kieber, 2002) Việc bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài chồi nhỏ từ các nuôi c ấy sau khoảng 4 - 6 tuần nuôi cấy Cytokinin là những chất adenine được thay thế nó kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác (Lâm Ngọc Phương, 2009), nó được phân lập đầu tiên từ DNA tinh trùng cá trích được thanh trùng và gọi là kinetin (Nguyễn Minh chơn, 2010) Hiện nay cytokinin phổ biến như BA, kinetin và 2-ip, chúng thường kích thích sự phân chia tế bào, đặc biệt nếu cộng chung với auxin Ở nồng độ cao chúng

nách do làm chậm và giảm hoạt động tính trội của chồi đỉnh (Pierik, 1991, trích dẫn bởi Lâm Ngọc Phương, 2009) Nồng độ cytokinin cao (0,5 - 10 mg/l) thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ đồng thời cũng c ản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin

Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho

sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) Ngoài ra, cytokinin còn tác động trên sự nảy mầm, sự thành lập mô mạch và sự gia tăng kích thước lá mầm của nhiều loài thực vật (Mok và Mok, 1994)

* Tương tác giữa auxin và cytokinin

Theo một số nghiên cứu cho thấy, một số tỷ lệ auxin cao và cytokinin thấp thích hợp cho tao rễ, cytokinin cao và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi Mức độ trung gian c ủa tỷ lệ này thích hợp cho sự tạo mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Để cảm ứng tạo mô sẹo từ cây hai lá mầm, người ta thường kết hợp auxin với cytokinin

1.4 Một số kết quả nghiên cứu về tạo mô sẹo và tái sinh đã được thực hiện trên một số loài cây thân thảo

Ở giống mía (Saccharum oficinarum L.), (Đặng Xuyên Như, 1998) tạo mô sẹo với

môi trường MS bổ sung 2,4-D 3 ppm sau 20 ngày nuôi cấy, tái sinh chồi từ mô sẹo với môi trường MS bổ sung IBA 0,1 ppm và BAP 2 ppm sau 2 tuần nuôi cấy Theo

Nguyễn Đức Thành (2000) tạo mô sẹo từ các bộ phận cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) trong môi trường MS có chứa NAA 1 mg/l và BAP 0,1 mg/l, sau 4 - 6 tuần mô sẹo được hình thành Tạo và tái sinh cây ở lúa (Oryza sativa L.) trong môi

trường MS chứa 2,4-D 2 mg/l, sau 2 - 3 tuần các mô sẹo được hình thành và trong môi trường MS chứa mg/l kinetin 2 - 5 mg/lvà NAA 0,5 mg/l, sau 6 - 8 tuần nuôi cấy các cây lúa được tái sinh

Quách Thị Liên và Nguyễn Đức Thành (2003) đã tạo mô sẹo từ các bộ phân của

cây trinh nữ hoàng cung (Crinum Latifolum L.) trong môi trường MS bổ sung 400

mg/l casein kết hợp với NAA 1 mg/l và tái sinh trong môi trường MS bổ sung 6 mg/l kinein kết hợp với NAA 0,2 mg/l và BAP 1 mg/l

Tạ Như Thục Anh, Trần Du Chi và Vũ Văn Vụ (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của

auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái của mô lá cây Hoắc Hương (Pogostemon