ẢNH HƯỞNG của hgcl2 1‰ và THỜI GIAN KHỬ TRÙNG đến tỷ lệ SỐNG và tác ĐỘNG của BA, NAA lên sự tạo CHỒI và NHÂN CHỒI cây LINH SAM (desmodium unifoliatum) IN VITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN SINH LÝ- SINH HÓA Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa viên - cây cảnh với đề tài:“ẢNH HƯỞNG CỦA HgCl 2 1‰ VÀ THỜI GIAN KHỬ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN BÉ TÂM

KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC ĐỘNG

CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ

NHÂN CHỒI CÂY LINH SAM

Sinh viên thực hiện

Trần Bé Tâm MSSV: 3087745

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: HOA VIÊN - CÂY CẢNH

KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC ĐỘNG

CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ

NHÂN CHỒI CÂY LINH SAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN SINH LÝ- SINH HÓA

Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa viên - cây cảnh với đề tài:“ẢNH HƯỞNG CỦA HgCl 2 1‰ VÀ THỜI GIAN KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ NHÂN CHỒI CÂY LINH

SAM (Desmodium unifoliatum) IN VITRO”

Do sinh viên TRẦN BÉ TÂM thực hiện, kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN SINH LÝ- SINH HÓA

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp đính kèm với

tên đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA HgCl 2 1‰ VÀ THỜI GIAN KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ

NHÂN CHỒI CÂY LINH SAM (Desmodium unifoliatum) IN VITRO”, do sinh

viên TRẦN BÉ TÂM thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

và đã được thông qua

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ……… điểm

Ý kiến hội đồng: ………

………

………

………

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012 Chữ ký của thành viên hội đồng Thành viên 1 Thành viên 2 Thành viên 3 ……… ……… ………

Duyệt của khoa Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn Các

số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Trần Bé Tâm

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!

Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con

Xin tỏ lòng biết ơn đến!

- Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

- Thầy cố vấn Phạm Phước Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cùng với quý thầy cô khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã dìu dắt, rèn luyện trong thời gian tôi học

tại trường Đại Học Cần Thơ

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1 LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Họ và Tên: Trần Bé Tâm Giới tính: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 1988 Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Xã Vị Thanh, huyện Vị Thanh, tỉnh Cần Thơ

Địa chỉ: 134/65, ấp 5, xã Vị Thanh, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang

Họ và tên cha: Trần Văn Quang

Họ và tên mẹ: Nguyễn Thị Nương

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012

Người khai ký tên

Trần Bé Tâm

MỤC LỤC

1.1 Sơ lược về cây linh sam 21.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật 31.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô 31.2.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô 41.2.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô thực vật 51.2.4 Thành phần môi trường 8

1.2.4.2 Khoáng đa lượng 81.2.4.3 Khoáng vi lượng 91.2.4.4 Nguồn carbohydrate 10

gỗ

14

2.1 Phương tiện nghiên cứu 162.1.1 Vật liệu thí nghiệm 162.1.2 Dụng cụ và hóa chất 16

2.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 162.1.4 Điều kiện thí nghiệm 162.2 Phương pháp nghiên cứu 162.2.1 Chuẩn bị môi trường 162.2.2 Bố trí thí nghiệm 172.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời

gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy linh sam

17

2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA trên sự tạo chồi

in vitro cây linh sam

18

2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA và NAA trên sự

nhân chồi in vitro cây linh sam

19

2.2.3 Xử lý số liệu 20

3.1 Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng

đến tỷ lệ sống của mẫu cấy linh sam

21

3.1.1 Tỷ lệ (%) mẫu chết 213.1.2 Tỷ lệ (%) mẫu sống 233.2 Ảnh hưởng của BA trên sự tạo chồi in vitro cây

linh sam

26

3.2.1 Số chồi/mẫu linh sam 263.2.2 Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi 293.2.3 Chiều cao chồi linh sam 293.2.4 Số lá/mẫu linh sam 303.3 Ảnh hưởng của BA và NAA trên sự nhân chồi in

vitro cây linh sam

32

3.3.1 Số chồi gia tăng 323.3.2 Số lá gia tăng 353.3.3 Chiều cao gia tăng 36

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

MS: Murashige và Skoog

BA: Benzyl adenine

NAA: Naphthalene acetic acid

SKC: Sau khi cấy

HgCl2: Clorua thủy ngân

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng lên tỷ lệ (%) chết

mẫu cấy linh sam vào thời điểm 1 và 2 tuần sau khi cấy

22

3.2 Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng lên tỷ lệ (%) sống

mẫu cấy linh sam vào thời điểm 1 và 2 tuần sau khi cấy

24

3.3 Ảnh hưởng của BA lên số chồi/mẫu linh sam in vitro theo thời gian 27

3.4 Ảnh hưởng của BA lên tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi linh sam in vitro theo

3.6 Ảnh hưởng của BA lên số lá/mẫu linh sam in vitro theo thời gian 31

3.7 Chồi linh sam in vitro gia tăng trên môi trường có nồng độ BA &

NAA khác nhau theo thời gian

32

3.8 Số lá linh sam in vitro gia tăng trên môi trường có nồng độ BA &

NAA khác nhau theo thời gian

35

3.9 Chiều cao (cm) chồi linh sam in vitro gia tăng trên môi trường có

nồng độ BA & NAA khác nhau theo thời gian

37

DANH SÁCH HÌNH

1.1 Cây và hoa linh sam (Desmodium unifoliatum) 22.1 Vật liệu dùng để bố trí thí nghiệm 182.2 Chồi cây linh sam in vitro 203.1 Mẫu cấy linh sam in vitro chết vào thời điểm 1 tuần sau khi cấy 233.2 Mẫu cấy linh sam in vitro vào thời điểm 2 tuần sau khi cấy 253.3 Chồi linh sam phát sinh từ mầm ngủ ở 3 tuần sau khi cấy trên

môi trường có các nồng độ BA khác nhau

28

3.4 Sự sinh trưởng chồi linh sam vào thời điểm 6 tuần sau khi cấy

trên môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

34

TRẦN BÉ TÂM, 2012 “Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng đến tỷ

lệ sống và tác động của BA, NAA lên sự tạo chồi và nhân chồi cây linh sam

(Desmodium unifoliatum) in vitro” Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Hoa viên -

cây cảnh, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Ây

TÓM LƯỢC

động của BA, NAA lên sự tạo chồi và nhân chồi cây linh sam (Desmodium unifoliatum) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra thời gian khử trùng bằng dung

và nhân chồi cây linh sam in vitro Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, bộ môn Sinh lý - Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ, từ tháng 01 đến tháng 06/2012 Kết quả thí nghiệm cho thấy: (i) Trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu, khử trùng bề mặt mẫu cấy cây linh sam 2 lần bằng dung dịch HgCl 2 1‰ (HgCl 2 1‰ (10 phút) + HgCl 2 1‰ (10 phút)) thì mẫu cấy sinh trưởng và phát triển tốt, đạt tỷ lệ sống cao (96,0%) nhất; (ii) Sử dụng môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l là thích hợp nhất trong giai đoạn tạo chồi; (iii) Môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l là thích hợp nhất trong giai đoạn nhân chồi linh sam, cho số chồi gia tăng cao (3,0 chồi sau 6 tuần nuôi cấy) và các chồi sinh trưởng và phát triển tốt

Từ khóa: cây linh sam, HgCl 2 1‰, BA, NAA, khử trùng, nhân chồi

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nước ta đang chuyển mình vào thời kì mới với nhiều sự thay đổi Khi đời sống vật chất ngày một nâng cao thì đời sống tinh thần cũng dần được quan tâm hơn Bonsai như là một môn nghệ thuật đã từ lâu được nhiều người biết đến Bởi bonsai được xem như một thú chơi tao nhã, nó giúp con người quên đi mọi sự mệt mỏi, lo toan của cuộc sống mà trở về với thiên nhiên tươi đẹp

Hiện nay, có nhiều loại cây kiểng được người ta chọn làm cây bonsai như nguyệt quới, si, sanh, sơn tùng, Trong đó, cây linh sam được chọn làm cây kiểng bonsai rất phổ biến Bởi cây có bộ lá nhỏ, hoa đẹp, thân đẹp rất thích hợp làm cây bonsai Hơn nữa, cây linh sam có giá trị kinh tế cao, hoa có hương thơm nhẹ rất dễ chịu nên

nó gần như được xem là cây kiểng quý

Đối với cây linh sam, việc nhân giống chủ yếu thường là giâm cành hoặc chiết

cành Tuy nhiên, để tạo ra một lượng lớn cây có chất lượng cao trong thời gian ngắn

để phục vụ cho nhu cầu thị trường bằng các phương pháp truyền thống trên thì rất

khó Hiện nay, phương pháp nhân giống in vitro đóng vai trò quan trọng trong công

tác nhân giống cây trồng Bằng phương pháp này, người tacó thể tạo ra hệ số nhân chồi cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất, cây con sạch bệnh và đồng đều về độ tuổi

Từ những lý do trên, đề tài “Ảnh hưởng của HgCl 2 1‰ và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống và tác động của BA, NAA lên sự tạo chồi và nhân chồi cây linh

sam (Desmodium unifoliatum) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra thời gian khử

trùng bằng dung dịch HgCl2 1‰, nồng độ BA và NAA thích hợp trong giai đoạn tạo

mẫu cấy ban đầu và nhân chồi cây linh sam in vitro Đồng thời làm cơ sở cho các

nghiên cứu tiếp theo trên cây linh sam

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây linh sam

Cây linh sam có tên khoa học là Desmodium unifoliatum, thuộc họ Fabaceae (họ

Đậu) Cây linh sam thuộc cây bụi nhỏ, cao 30-40 cm, thân cứng, vỏ xám, nứt mịn Lúc non cành không có lông, chót nhánh tạo thành gai nhọn chẻ 2-3 và có chiều dài khoảng 2,5-5,0 cm Lá nhỏ, có kích thước khoảng 18x6 mm, tà tròn hai đầu, dai và cứng, gân phụ rất mịn Cuống lá khoảng 1 mm Hoa màu tím thẩm, mọc chùm khoảng 1-2 cm ở đầu cành và nách lá (Hình 1.1) Cuống hoa khoảng 6 mm, dài 2

mm (Phạm Hoàng Hộ, 1999)

Cây thường ra hoa rải rác trong năm Hoa nhỏ, chỉ nở khoảng một hoặc hai ngày rồi tàn nhưng cái nọ nối tiếp cái kia trên từng chùm hoa và kéo dài khoảng 3-5 ngày Cây thường được nhân giống bằng phương pháp giâm cành Linh sam là một trong những loại cây được trong giới chơi bonsai đánh giá cao, ưa chuộng nhất hiện nay

và cũng không thể thiếu trong bộ sưu tập bonsai trong vườn kiểng của mọi người Bởi linh sam là chủng loại làm bonsai rất đẹp, từ thân, cành, lá, hoa Đặc biệt là lũa,

gỗ linh sam làm lũa thì ít có loại gỗ nào trong nhóm cây làm bonsai sánh kịp Linh sam là giống cây ưa nước, ở trong rừng cây sống ven các suối Vào mùa mưa, nước chảy ngập hàng tháng mà cây vẫn sống khỏe (Chí Thiện, 2005)

Hình 1.1 Cây và hoa linh sam (Desmodium unifoliatum)

(Nguồn: http://my.opera.com/tranbaphung/blog/show.dml)

1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật

1.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô

Vào năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đã đưa ra thuyết

tế bào và nêu rõ rằng mọi cơ thể sinh vật cho dù phức tạp đến đâu cũng đều được tạo nên bởi sự kết hợp của rất nhiều đơn vị rất nhỏ, đó là các tế bào Haberlandt là người đầu tiên thực hiện việc nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 và ông đã nhận thấy có sự ảnh hưởng của các khoáng chất và điều kiện môi trường trên sự chuyển hóa của các tế bào cô lập trên môi trường nuôi cấy Năm 1934, White nuôi cấy

thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng có

chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm men trong một thời gian dài

Cũng trong khoảng thời gian này, Gautheret ở Pháp đã tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tượng tầng của một số loài cây thân gỗ Năm 1939, Nobécourt và

Gautheret đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng của mô sẹo ở cà rốt (Daucus

carota) trên môi trường có agar (môi trường đặc) trong thời gian vô hạn bằng cách

cấy chuyền đều đặn sáu tuần một lần Tiếp theo, Overbeck chứng minh được khả năng kích thích sinh trưởng phôi của cây thuộc họ cà (Datura) của nước dừa trong quá trình nuôi cấy Trong thời gian này, người ta đã nghiên cứu và tổng hợp thành công nhiều chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhân tạo thuộc nhóm auxin như - naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-dichloro phenoxy acetic acid (2,4-D) Đến năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận được sự hình thành cơ quan từ mô sẹo thuốc lá chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Về sau, dựa trên nền tảng của Haberlandt, đã có hàng loạt công trình nghiên cứu công bố Trong đó, Guha và Maheshwari (1964) đã chứng minh tính toàn năng của

tế bào hạt phấn, tế bào sinh dưỡng (vegetative cells) (Rashid & Street, 1974) và tế bào sinh sản (Nguyễn Đức Thành, 2000) Như vậy, từ khi ý tưởng thực hiện nuôi cấy mô của Haberlandt (1902) đến nay đã hơn 100 năm, kỹ thuật này đã được phát triển mạnh mẽ và có khá nhiều ứng dụng quan trọng trong việc chọn giống, nhân giống và phục hồi giống Các ứng dụng này đã giúp ích cho nhiều nước phát triển nông nghiệp, lâm nghiệp và cây cảnh theo hướng công nghệ cao, làm tăng giá trị sản phẩm nông lâm nghiệp và tiết kiệm nhiều chi phí (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Tình hình nuôi cấy mô ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được nghiên cứu trên 30 năm Nhưng áp dụng vào thực tế sản xuất trong các lĩnh vực vi nhân giống cây hoa cảnh, cây nông nghiệp, cây lâm nghiệp và cây dược liệu trong khoảng 10-20 năm trở lại Nhiều phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia, các trung tâm công nghệ sinh học với

các trang thiết bị hiện đại cũng được xây dựng ở các thành phố lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Bên cạnh đó, có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

và tế bào thực vật cũng được xây dựng ở các trường đại học, viện nghiên cứu, sở khoa học và công nghệ của các tỉnh, thành phố (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Theo Nguyễn Đức Thành (2000), phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đầu tiên được xây dựng tại viện sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam do Lê Thị Muội đứng đầu

Nhiệm vụ của các phòng thí nghiệm là xây dựng và phát triển các phương pháp nghiên cứu, đồng thời tổ chức những hướng nghiên cứu ứng dụng phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở Việt Nam và đã thu được những kết quả quan trọng như: vi nhân giống dứa, khoai tây, hoa hồng, cúc, cẩm chướng… (Viện công nghệ sinh học) Nhân giống chuối, hoa lan… (Viện nghiên cứu Đà Lạt, Đại học Nông Nghiệp I) Nhân giống bạch đàn (Viện lâm nghiệp) Đặc biệt là các kết quả nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá, nuôi cấy tế bào trần của cây thuốc lá và khoai tây ở Viện công nghệ sinh học và Viện sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh (Vũ Văn Vụ, 1999)

1.2.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô

Theo Vũ Văn Vụ (1999), vi nhân giống in vitro là lĩnh vực sử dụng các kỹ thuật

nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm Vi nhân giống có các ưu điểm như: tạo ra hệ số nhân chồi cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất, cây con hoàn toàn sạch bệnh và đồng đều về độ tuổi Bên cạnh đó, cây con tạo ra có đặc điểm di truyền giống cây mẹ, việc nhân giống được thực hiện từ các mẫu cấy rất nhỏ và mẫu vật có thể dự trữ lâu dài (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Ngoài ra, vi nhân giống còn có thể: nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong 1 m2 nền có thể để được 18.000 cây, thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng chứa 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15 kg) Đặc biệt, nhu cầu

về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều Mấy năm gần đây, hằng năm trên thế

giới sản xuất khoảng 50 triệu cây Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu cầu thực tiễn (Nguyễn Đức Thành, 2000) Theo Lâm Ngọc Phương (2009), các phương pháp nuôi cấy mô là nền tảng của công nghệ di truyền, một số cây thân gỗ khó nhân giống bằng phương pháp giâm cành, chiết hoặc ghép thì có thể được vi nhân giống Hơn nữa, một trong những lợi ích của nhân giống vô tính trong ống nghiệm là người ta có thể lập chương trình cho việc nuôi cấy suốt năm, không lệ thuộc vào mùa màng Vi nhân giống không thay thế các phương pháp nhân giống truyền thống nhưng bản thân nó có vị trí trong các lĩnh vực chất lượng cao

Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn có những khả năng đóng góp cho những nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong cải biến di truyền (chọn dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển gen) và trong công nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành Trồng trọt (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.2.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô thực vật

Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4 giai đoạn khác nhau (không kể giai đoạn 0), mỗi giai đoạn có một chức năng riêng (trích dẫn bởi Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

* Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ

Cây mẹ phải sạch bệnh và đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao Khi chọn cây mẹ, tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính, cây phải được bón phân và phun thuốc phòng trừ sâu bệnh chu đáo (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

* Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy

Đây là giai đoạn đưa mẫu từ bên ngoài vào trong điều kiện nuôi cấy vô trùng, là

điều kiện tiên quyết cho sự thành công trong nuôi cấy in vitro Mục tiêu của giai

đoạn này là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Thông thường khó đạt thành công 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Theo Lâm Ngọc Phương (2009), phương pháp vô trùng thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn như: calcium hypochloride (Ca(OCl)2), natri hypochloride (NaOCl), hydro peroxide (H2O2), clorua thủy ngân (HgCl2), Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng mẫu phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị thủy Tiên, 2002) Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng

30 giây với rượu ethylic 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn

Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn (đối với các bộ phận có nhiều bụi rác, trước khi xử lý phải rửa kỹ bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy) Khi xử lý xong mô cấy phải được rửa lại sạch

bằng nước cất vô trùng (tối thiểu 3 lần) Theo Vũ Văn Vụ (1999), kích thước của mẫu khi vô trùng phải lớn hơn khi cấy vào môi trường vì sau đó phải cắt bớt phần bị hủy hoại do hóa chất vô trùng gây ra Đối với các mẫu mà bề mặt chúng được bao phủ bởi một lớp sáp thì muốn đạt kết quả tốt cần cho thêm vào dung dịch khử trùng một vài giọt các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 20, Tween 80… Vì những chất này làm tăng tính linh động của hóa chất vô trùng

Nếu như mẫu bị nhiễm thì sẽ dễ dàng nhận ra sau 3-5 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy Ngược lại, tình trạng nhiễm xuất hiện sau 10 ngày thì hoặc là mẫu bị nhiễm bên trong hoặc do có kiến hay rận hiện diện trong phòng nuôi làm lây lan nguồn gây nhiễm Trong trường hợp này thì vùng bị nhiễm sẽ không nằm trên mẫu cấy mà xuất hiện ở vị trí vết cắt của mẫu nằm ngập trong môi trường hoặc trên bề mặt môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị thủy Tiên, 2002)

* Giai đoạn 2: Nhân

Đây là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng cây thông qua con đường tạo chồi và tạo phôi vô tính Mục đích của giai đoạn này

là tạo được số lượng cây con theo ý muốn, thường kéo dài khoảng 4-5 tuần Tùy vào vật liệu thực vật tạo được ở giai đoạn 1, người ta có thể vi giâm cành đối với các cây con này, hay có thể phân lập chồi con đối với cụm chồi Các mẫu này được cấy chuyền nhiều lần cho đến khi đạt được số lượng cây con mong muốn (Lâm Ngọc Phương, 2009)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), trong giai đoạn 2, việc gia tăng số chồi phụ thuộc nhiều vào việc sử dụng cytokinin và auxin Sử dụng hàm lượng cytokinin cao và auxin thấp kích thích sự phát sinh nhiều chồi bên và chồi bất định Ngược lại, sử dụng cytokinin thấp và auxin cao dễ phát sinh callus và chồi bất định từ callus Benzyl adenine (BA) là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật như nhân nhanh chồi hoa cẩm chướng (môi trường MS + BA 2 mg/l), nhân chồi cây hương nhu (môi trường chứa ½ MS + BA 3 mg/l) (Nguyễn Văn Uyển, 1993),… và cũng được đề nghị sử dụng để nhân chồi cho nhiều giống hoa hồng khác nhau

Theo Trịnh Đình Đạt (2007), điều kiện thích hợp để nhân nhanh là ở nhiệt độ

25-27oC, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày và cường độ chiếu sáng khoảng

2000-4000 lux Tuy nhiên, tùy theo từng loài mà có chế độ môi trường cũng như điều kiện khác nhau Ví dụ, nhân nhanh các loài hoa thập tự (súp lơ, su hào…) chỉ cần thời gian chếu sáng 9-10 giờ/ngày; còn nhân các loài hoa phong lan thì giai đoạn đầu lại để trong tối Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), toàn bộ quá trình nhân giống

in vitro xét cho cùng chỉ nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất Chính vì vậy,

giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Có 3 phương pháp nhân chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận được từ mô sinh vật nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô sinh vật không thông qua mô sẹo và phương pháp nhân chồi bên (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị thủy Tiên, 2002)

Theo Olufl và Gregogy (1995), phương pháp khá đơn giản để nhân nhanh số chồi là phương pháp nhân chồi bên Phương pháp này có ý nghĩa rất quan trọng trong thực

tế vì nó đơn giản hơn các phương pháp khác, tốc độ nhân giống cao, sản phẩm ổn định về mặt di truyền và cây con tăng trưởng rất tốt có lẽ là do đã được trẻ hóa Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này chính là kích thích sự tái sinh chồi từ các mầm ngủ Mầm ngủ thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân Do tính

ưu thế chồi ngọn, các mầm bên ở trạng thái miên trạng và không phát triển Do đó khi các chồi bên được xử lý chất điều hòa sinh trưởng sẽ phá vỡ miên trạng và phát triển thành những chồi có lá đầy đủ như thân chính Các chồi có thể được tách ra, đưa vào môi trường tạo rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh hay sử dụng cho quá trình nhân giống trở lại

* Giai đoạn 3: Tạo rễ và phát triển

Theo Lâm Ngọc Phương (2009), mục đích của giai đoạn này là chuẩn bị những cây con sẵn sàng cho sự chuyển ra ngoài Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm khi có được tỷ lệ cây con sống tốt cao sau khi ra khỏi giai đoạn nuôi cấy vô trùng và chuyển trồng nơi vườn ươm Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), giai đoạn 3 sẽ được chia thành 2 giai đoạn sau:

Giai đoạn 3a: Kéo dài

- Trong nhiều trường hợp, sự kéo dài là một yêu cầu cho sự tạo rễ đầy đủ

- Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc một cytokinin yếu hơn cytokinin đã sử dụng trong giai đoạn 2

- Có thể cần thiết thêm than hoạt tính để trung hòa hiệu quả cytokinin còn lại trong giai đoạn 2

Tùy thuộc vào kiểu cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hoặc cụm chồi

Giai đoạn 3b: Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng

- Auxin thường được sử dụng để kích thích tạo rễ Tạo rễ tốt nhất thường đạt trên môi trường có hàm lượng khoáng thấp

- Các rễ phát triển trong in vitro luôn luôn không thích nghi với điều kiện nhà lưới

và rễ quá dài sẽ gặp khó khăn khi trồng

- Kích thích rễ có thể xảy ra trên chồi đơn hay cụm chồi

* Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng

Đây là giai đoạn chuyển cây ra nhà ươm để chuẩn bị cây con sẵn sàng cung cấp cho

sản xuất Chất lượng cuối cùng của kế hoạch in vitro tùy thuộc một phần vào việc

thuần dưỡng Thông thường các rễ non được tạo ra trong ống nghiệm có một biểu bì yếu ớt, nên khi đặt tiếp xúc với chất nền trong nhà ươm, chúng trở nên khô héo nhanh chóng và chết (Lâm Ngọc Phương, 2009) Vì vậy, mục đích của giai đoạn

này là làm giảm tối thiểu chết cây con, khi chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc

điều kiện ngoài đồng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.2.4 Thành phần môi trường

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng

sẽ thay đổi Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tuy nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm các thành phần như: nước, khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, nguồn carbohydrate, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men… nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999)

1.2.4.1 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy Nước sử dụng trong nuôi cấy mô thường là nước cất một lần Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.2.4.2 Khoáng đa lượng

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là nitrogen, potassium, magnesium, calcium,…

Nitrogen (N)

Mô, tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium

và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid

Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc

NH4NO3 Ammonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3 (Nguyễn

Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Theo Vũ Văn Vụ và ctv (2006), trong môi

trường MS (Murashige và Skoog, 1962), amon được cung cấp ở dạng muối

NH4NO3, còn môi trường B5 của Gamborg có amon ở dạng muối (NH4)2SO4

2-25 mM (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006)

Magnesium (Mg)

Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ không thay đổi nhiều (trung bình 6,8

mM hoặc 5,3 mM) Thường MgSO4là nguồn duy nhất bổ sung nguồn ion Mg2+ cho

mô nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.2.4.3 Khoáng vi lượng

Theo Vũ Văn Vụ và ctv (2006), yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật

trong nuôi cấy khá phức tạp và ít được nghiên cứu Tuy nhiên, trong nhiều loại môi trường cơ bản đã được xây dựng, các tác giả đều cung cấp cho môi trường hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy Sau đây là một số khoáng vi lượng thông dụng cung cấp cho mô thực vật:

Mangan (Mn)

Mangan là một trong những nguyên tố vi lượng quan trọng trong môi trường nuôi cấy, là thành phần trong quang phân ly nước và cũng là thành phần hoạt hóa cho nhiều enzym Mô cây hấp thu mangan ở dạng Mn2+ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), trong nuôi cấy mô, sự vắng mặt của Mn2+ trong môi trường làm giảm sự khởi tạo chồi trên mẫu cấy tử diệp xà lách

Sắt (Fe)

Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005), sắt là nguyên tố cần thiết bởi vì nó đóng vai trò then chốt của hệ thống enzym Sắt không là thành phần của diệp lục tố nhưng nó rất cần cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố Thiếu sắt, cây sẽ thiếu diệp lục

tố Theo Vũ Văn Vụ và ctv (2006), sắt là nguyên tố vi lượng được đưa vào môi

trường ở dạng muối FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3… nhưng chúng sẽ bị kết tủa và mẫu nuôi cấy rất khó hấp thụ các loại muối này Do đó, phải cho thêm vào môi trường nuôi cấy Na2EDTA (Sodium ethylene diamine tetraacetate), để tạo ra muối phức NaFeEDTA (dạng chelate) có chứa cả Na, Fe và được mô nuôi cấy hấp thụ dễ dàng

1.2.4.4 Nguồn carbohydrate

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng

nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là điều bắt buộc Đường không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường mà còn là nguồn carbohydrate tốt nhất cung cấp cho mô và tế bào Nhưng khi hàm lượng chất hữu cơ quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây (Lâm Ngọc Phương, 2009)

Hai dạng đường thường gặp nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và

sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn Một số loài thực vật tăng trưởng tốt trong môi trường có sucrose được hấp tiệt trùng so với môi trường

có sucrose được lọc vô trùng và người ta cho rằng khi tế bào được nuôi trong môi trường có sucrose được hấp tiệt trùng thì nó được cung cấp vừa sucrose vừa glucose (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.2.4.5 Vitamin

Vitamin được sử dụng như là coenzym và được sử dụng một lượng rất nhỏ (mg/l) (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin, nicotinic acid, pyridoxin

- Thiamine (B1) là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Thiamin thường được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l

- Nicotinic acid (B3, PP, niacin) tham gia tạo coenzym của chuỗi hô hấp, hàm lượng

sử dụng 0,1-5,0 mg/l

- Pyridoxin (B6)là một coenzym quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất, sử

dụng 0,1-1,0 mg/l (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006)

1.2.4.6 Agar

Agar (thạch) là sản phẩm tự nhiên được trích từ tảo Nó là một polysaccharide (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Agar được dùng để chuẩn bị môi trường đặc Agar tan ở

100oC và đông đặc ở 45oC Trong môi trường acid, agar không thể đông đặc Nồng

độ thường dùng từ 0,6% đến 0,7% tùy theo loại agar (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.2.4.7 Nước dừa

Nước dừa là nội nhũ lỏng cung cấp các chất dinh dưỡng nuôi phôi dừa Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường sử dụng nước từ quả bánh tẻ và quả già Thành phần của nước dừa khá phong phú nhưng có chứa inositol và các chất thuộc nhóm cytokinin như zeatin… Các thành phần này có hàm lượng thay đổi, khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả cùng độ tuổi Vì nước dừa là một thành phần phức hợp không xác định Hàm lượng sử dụng của nước dừa 10-

20% (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006)

1.2.4.8 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi

cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu

quả tác động của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, hoạt

tính vốn có của chất điều hòa sinh trưởng và mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và ctv.,

2006) Có hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1999)

Auxin

Auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích hình thành rễ, thúc đẩy

sự sinh trưởng và giản nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao

Theo Vũ Văn Vụ (1999), những chất thuộc nhóm auxin hay dùng là indol-3-butyric axid (IBA), -naphthalene acetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) 2,4-D sử dụng rất có hiệu quả trong việc tạo

mô sẹo ở nhiều loài thực vật, nó không được dùng trong môi trường tái sinh cơ quan IBA và NAA dùng cho quá trình tạo rễ ở đa số các loài cây Theo Nguyễn

Minh Chơn (2010), các chất tổng hợp như IBA và NAA đã cho hiệu quả kích thích tạo rễ hơn cả IAA Hơn nữa, IAA do kém bền nhiệt nên ít được sử dụng (Vũ Văn

Vụ, 1999)

Cytokinin

Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào Cytokinin có nhiều nhất trong miền phân sinh và vùng tế bào phát triển liên tục bao gồm rễ, lá non, trái đang phát triển và hạt (Nguyễn Minh Chơn, 2010) Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005), người ta cũng phát hiện nồng độ cytokinin

cao xuất hiện vào mùa xuân trong nhựa cây Đỉnh rễ là vị trí chính yếu của sự tạo hormone ở những cây con Từ đó nó được vận chuyển trong mô mạch đến thân

6-(4-Hàm lượng sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l Ở những nồng

độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Trong các loại cytokinin nói trên, kinetin và BA là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào cũng như có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.2.4.9 Giá trị pH

pH môi trường được điều chỉnh trước khi hấp tiệt trùng, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính acid của môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống, do một số mẫu thực vật

sản sinh ra các acid hữu cơ (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) pH thường được điều chỉnh

trong khoảng 5,5 và 6 trước khi hấp khử trùng pH quyết định sự hòa tan của khoáng trong môi trường pH còn ảnh hưởng sự hấp thu khoáng trong môi trường

và ảnh hưởng trên sự tạo gel của agar khi hấp khử trùng pH thấp (<4,5) môi trường

có agar rất khó tạo gel (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

thời gian khử trùng tương đối ngắn 0,5-1 phút ở nồng độ 100%

Ion kim loại nặng

Trong các kim loại nặng thì Mercuric chloride (HgCl2) là chất khử trùng thông dụng nhất Sử dụng hoá chất này phải hết sức cẩn thận vì độc cho thực vật lẫn động vật, cũng như chất thải sau khi khử trùng có ảnh hưởng đế́n môi trường Ở các nước phát triển, các chất thải sau khi khử trùng bằng HgCl2 sẽ được thu hồi và tái sử dụng lại Các chất này không được thải ra môi trường tự nhiên nếu chưa xử lý

Dung dịch hypochloride

Ion hypochloride có trong Sodium hypochloride (NaOCl) hoặc Calciumhypochloride [Ca(OCl)2] Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox Nồng độ cuối cùng cần thiết có thể thay đổi từ 0,25-2% trọng lượng/thể tích tuỳ thuộc vào vật liệu thí nghiệm và thời gian ngâm mẫu Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch hypochloride là cả hypochlorous acid (HOCl) và ion OCl- Người ta cho rằng HOCl hiệu quả hơn OCl- do hiệu quả diệt khuẩn chlorine tốt nhất

ở dung dịch hypochloride acid nhẹ Nồng độ sử dụng từ 5-10% để ngâm mẫu trong

các chất này thường được kết hợp trước hoặc sau khi khử trùng với chất khử trùng khác

Chất khử nấm

Nhiều chất khử nấm có nguồn gốc là thuốc bảo vệ thực vật cũng được sử dụng trong khử trùng Ví dụ Benomyl, Carbendazim, Fenbendazol là các chất khử nấm của thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng trong khử trùng bề mặt Nồng độ và liều lượng thay đổi theo loại mẫu thực vật Người ta cũng cho các chất này vào trong môi trường nuôi cấy

Chất kháng sinh (antibiotic)

Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt để loại trực tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy Các chất kháng sinh thường được sử dụng là:

- 0,15% streptomycin 0,01% merthiolate thêm vào trong 4% NaOCl cho khử trùng

bề mặt trái Euterpe trong 12 giờ

- 100g/l của hỗn hợp penicilin/streptomycin trong 15 phút của chồi cây Đào

- 17% Alcide trong 1 giờ sau đó trong rifampicin (50g/l) để khử trùng nốt thân cây

Nauclea

1.3 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô trên cây thân gỗ

Ở hoa hồng, Nguyễn Thị Kim Thanh (2005) đề nghị khử trùng mẫu cấy bằng HgCl20,5% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu sạch trên 60% Mẫu này được cấy vào môi trường

MS bổ sung BA hoặc Kinetin 1 mg/l, mẫu sẽ bật chồi 100% sau 14 ngày nuôi cấy Theo Nguyễn Thị Thuở (2008) khử trùng trên cây hồng nhung bằng HgCl2 0,1% trong 15 phút hoặc bằng HgCl2 0,05% trong 30 phút hoặc kết hợp HgCl2 0,1% trong

15 phút + HgCl2 0,05% trong 30 phút rồi cấy vào môi trường nuôi cấy thích hợp đã cho tỷ lệ mẫu sống cao trên 70% (2 tuần sau khi cấy) Đến giai đoạn nhân chồi, có thể sử dụng BA 1-3 mg/l cho tỷ lệ nảy chồi cao

Theo Nguyễn Thị Lý Anh và ctv (2009) khử trùng mẫu cấy cây hoa đào Nhật Tân (Prunus persical) với cồn 70% trong 5 phút và HgCl2 0,1% trong 5 phút rồi nuôi cấy trong môi trường MS lỏng bổ sung Cefotaxime 1000 mg/l cho tỷ lệ mẫu sống

và vô trùng cao nhất, đạt 65% sau 14 ngày

Theo Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Kim Hằng (2007), cây măng cụt 2-3 tuần tuổi được khử trùng với cồn 70% trong 3 phút và dung dịch HgCl2 0,2% trong 20 phút rồi cấy vào môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l và adenine 10 mg/l đã cho số chồi cao nhất là 15,2 chồi sau 60 ngày nuôi cấy

Theo Hồ Tân (2006), ở giống hoa hồng (Rosa spp.), sử dụng BA ở nồng độ 3 mg/l

cho tỷ lệ ra chồi từ mầm ngủ cao nhất (100% sau 3 tuần nuôi cấy) Trong giai đoạn nhân chồi, môi trường bổ sung BA 1 mg/l ở mẫu cấy ngọn hay thân đều cho số chồi cao Theo Nguyễn Kim Hằng (2005), ở giống hồng đỏ, môi trường bổ sung BA 1,5 mg/l đã cho số chồi tốt nhất (2,36 chồi sau 3 tuần nuôi cấy)

Theo Nguyễn Hữu Tính (2008), sử dụng môi trường bổ sung BA 1,5 mg/l + NAA 0,15 mg/l cho tỷ lệ nhân chồi tốt nhất Theo Lâm Mỹ Ngọc (2009), trong giai đoạn khởi đầu, sử dụng BA 0,1 mg/l để tạo chồi cây hồng tỷ muội là thích hợp nhất với chiều cao chồi là 1,8 cm và số lá đạt được là 5,6 lá sau 2 tuần nuôi cấy Để nhân chồi sử dụng BA 1,5 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất với số chồi là 2,2 chồi và số

lá đạt được 7,8 lá sau 5 tuần nuôi cấy

Theo Mai Vũ Duy (2009), sử dụng môi trường MS bổ sung BA 4 mg/l cho số chồi tốt nhất (2,2 chồi sau 8 tuần nuôi cấy) đối với cả mẫu cấy thân và ngọn của cây mai vàng Trong giai đoạn nhân chồi, môi trường bổ sung BA 1,5 mg/l đã cho 1,4 chồi sau 4 tuần nuôi cấy

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm

Thí nghiệm sử dụng nguồn mẫu cấy từ cây linh sam khỏe mạnh, bón phân và phun thuốc phòng trừ bệnh được trồng tại nhà lưới bộ môn Sinh lý - Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất

Trang thiết bị thí nghiệm: tủ cấy vô trùng, tủ sấy giấy, nồi thanh trùng

(autoclave), máy đo pH, cân điện tử, tủ lạnh Các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm: ống đong, keo…

Hóa chất: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng theo công thức của Murashige và

Skoog, 1962 (MS)

- Vitamin:thiamin, pyridoxin, nicotinic acid

- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: BA và NAA

- Các chất khác như: đường sucrose, agar, nước dừa tươi, Tween 80, HgCl2 1‰, cồn

70o

2.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, bộ môn Sinh lý - Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 06/2012

2.1.4 Điều kiện thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng cấy mô có nhiệt độ: 262oC, cường độ chiếu sáng 1.000-2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị môi trường

Sử dụng môi trường nền là môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (MS, 1962), bổ sung đường 30 g/l, agar 7,5 g/l, nước dừa tươi 100 ml/l, thiamin 1 mg/l, nicotinic acid 1 mg/l và pyridoxin 1 mg/l Ngoài ra, tùy theo từng thí nghiệm còn bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như BA và NAA thích hợp

Môi trường được điều chỉnh pH về 5,7-5,8 Thể tích môi trường trong mỗi keo là 40

ml và chuyển vào nồi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm, thời gian 20 phút

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của HgCl 2 1‰ và thời gian khử trùng đến tỷ

lệ sống của mẫu cấy linh sam

Mục tiêu: Nhằm xác định thời gian khử trùng với HgCl2 1‰ thích hợp để đạt được

tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất, tạo nguồn mẫu in vitro ban đầu cho việc thực hiện

các bước tiếp theo trong quy trình vi nhân giống cây linh sam

Thu mẫu và thao tác khử trùng mẫu:

- Mẫu cấy là các đoạn cành bánh tẻ được chọn lọc từ những cây mẹ trồng trong nhà lưới Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa Mẫu được bỏ lá, cắt thành từng đoạn khoảng 2 mắt

lá (Hình 2.1) và cho vào keo chứa Thao tác khử trùng với các công đoạn:

- Rửa mẫu với dung dịch xà phòng, lắc đều trong 15 phút

- Rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút

- Đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng

- Tráng bằng cồn 70o trong 30 giây và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng

- Tiếp tục khử trùng 2 lần Các nghiệm thức được ký hiệu như sau:

1 Đối chứng: không dùng dung dịch HgCl2 1‰

- Các nghiệm thức đều được thêm một giọt Tween 80 trong lần khử trùng đầu tiên

và được rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng sau mỗi lần khử trùng

Mẫu cấy: Chọn những đoạn cành mang 2 mắt lá (dài 2-2,5 cm) (Hình 2.1B) đã

được khử trùng để bố trí thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1

nhân tố, 7 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức có 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 5 keo, mỗi keo cấy 1 mẫu trên môi trường MS đã chuẩn bị sẵn