ẢNH HƯỞNG của BA, TDZ và NAA lên sự tạo mô sẹo và KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂNCỦA mô sẹo từ mẫu lá NON cây BẰNG LĂNG NHIỀU HOA (lagerstroemia floribundajack) IN VITRO

DANH SÁCH BẢNG2.2 Tổ hợp các nghiệm thức của thí nghiệm 1 21 3.1 Ảnh hưởng của NAA và BA trong môi trường MS đến tỷ lệ % mẫu lá tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây bằng lăng nhiều hoa theo thời

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN PHẠM HỒNG HẠNH

ẢNH HƯỞNG CỦA BA, TDZ VÀ NAA LÊN SỰ TẠO

MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA

MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY BẰNG LĂNG NHIỀU HOA

(Lagerstroemia floribunda Jack)

IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Hoa Viên và Cây Cảnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Hoa viên và Cây cảnh

ĐỀ TÀI:

ẢNH HƯỞNG CỦA BA, TDZ VÀ NAA LÊN SỰ TẠO

MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA

MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY BẰNG LĂNG NHIỀU HOA

(Lagerstroemia floribunda Jack)

IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn:

ThS Nguyễn Văn Ây

PGs.Ts Lê Văn Hòa

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Phạm Hồng HạnhMSSV: 3083714

Lớp: Hoa Viên và Cây Cảnh K34

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ

Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA

BA, TDZ VÀ NAA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA

MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY BẰNG LĂNG NHIỀU HOA (Lagerstroemia floribunda Jack) IN VITRO” do sinh viên NGUYỄN PHẠM HỒNG HẠNH thực

hiện kính trình lên hội đ ồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012

Cán bộ hướng dẫn

PGs.Ts Lê Văn Hòa ThS Nguyễn Văn Ây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HOÁ

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèmvới tên đề tài: “ ẢNH HƯỞNG CỦA BA, TDZ VÀ NAA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO

VÀ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ NON CÂY BẰNG

LĂNG NHIỀU HOA (Lagerstroemia floribunda Jack) IN VITRO” do sinh viên

NGUYỄN PHẠM HỒNG HẠNH thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văntốt nghiệp và đã được thông qua

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ………

……… … ………

Duyệt của KhoaTrưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướngdẫn Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực vàchưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đ ây

Tác giả luận văn

Nguyễn Phạm Hồng Hạnh

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1 LÝ LỊCH

Họ và tên: Nguyễn Phạm Hồng Hạnh Giới tính: NữNgày, tháng, năm sinh: 21/02/90 Dân tộc: KinhNơi sinh: Huyện Phụng Hiệp, Tỉnh Hậu Giang

Quê quán: Ấp Tầm Vu 1, xã Thạnh Hòa, huyện Phụng Hiệp, Hậu Giang

Con: Ông Nguyễn Văn Tính và bà Phạm Thanh Nga

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng

Cha mẹ đã dưỡng dục và chăm sóc con, suốt đời tận tụy lo cho con ăn học nênngười

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Thầy Nguyễn Văn Ây và Thầy Lê Văn Hòa đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn

em trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Thầy Phạm Phước Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cố vấn học tâp của lớp, đã tận tâmdìu dắt, rèn luyện và giúp đỡ em trong suốt 4 năm học tại trường Đại Học Cần Thơ.Chân thành cảm ơn:

Quý Thầy/Cô và cùng với các anh chị trong phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô,

Bộ Môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường ĐạiHọc Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ

Các bạn lớp Hoa viên & cây cảnh K34 đã giúp đỡ đ ộng viên tôi trong suốtnhững chuỗi ngày học Đại Học

Nguyễn Phạm Hồng Hạnh

MỤC LỤC

1.1.1 Bằng lăng nhiều hoa (Lagerstroemia floribunda Jack) 2 1.1.2 Bằng lăng hoa đỏ (Lagerstroemia balansae Koechne) 3 1.1.3 Bằng lăng ổi (Lagerstroemia calyculata Kurz) 3 1.1.4 Bằng lăng còi (Lagerstroemia lecomtei Cagnep) 4 1.1.5 Bằng lăng xoan (Lagerstroemia ovalifolia Teijm Et Binn) 4 1.1.6 Bằnglăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers) 5 1.1.7 Bằng lăng lông (Lagerstroemia tomentosa Presl) 51.2 Nuôi cấy mô và phương pháp vi nhân giống 6

1.3.1 Định nghĩa mô sẹo (callus) 111.3.2 Khả năng tạo mô sẹo của tế bào trong nuôi cấy mô 13 1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo mô sẹo 13 1.3.4 Hiện tượng hóa nâu trên mẫu cấy 14 1.3.5 Nhân giống từ phôi vô tính (somatic embryo) 15 1.5.5.1 Sự phát sinh phôi 15 1.5.5.2 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo 16 1.3.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định 161.4 Một số nghiên cứu về sự phát sinh hình thái từ mô lá trên

2.1.4 Địa điểm và thời gian thí nghiệm 20

3.1 Ảnh hưởng của NAA và BA trong môi trường MS đến sự

hình thành mô sẹo từ mẫu lá non cây bằng lăng nhiều hoa

23

3.1.1 Tỷ lệ (%) mẫu lá tạo mô sẹo 23 3.1.2 Đường kính mẫu lá gia tăng (cm) 273.2 Sự phát triển của cụm mô sẹo từ mẫu lá non của cây bằng

lăng nhiều hoa trên môi trường MS bổ sung TDZ ở nồng

30

3.2.1 Đường kính mô sẹo gia tăng (cm) 30 3.2.2 Tỷ lệ (%) sống của cụm mô sẹo 31

DANH SÁCH BẢNG

2.2 Tổ hợp các nghiệm thức của thí nghiệm 1 21 3.1 Ảnh hưởng của NAA và BA trong môi trường MS đến tỷ lệ (%)

mẫu lá tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây bằng lăng nhiều hoa theo

thời gian (tuần sau khi cấy)

24

3.2 Ảnh hưởng của NAA và BA trong môi trường MS đến đường

kính mẫu lá gia tăng (cm) theo thời gian (tuần sau khi cấy)

28

3.3 Ảnh hưởng của TDZ trong môi trường MS đến đường kính

mô sẹo gia tăng (cm) theo thời gian (ngày sau khi cấy)

30

3.4 Ảnh hưởng của TDZ trong môi trường MS đến t ỷ lệ sống (%)

của cụm mô sẹo theo thời gian (tuần sau khi cấy)

31

DANH SÁCH HÌNH

1.1 Cây và hoa bằng lăng nhiều hoa 2

2.1 Cây bằng lăng nhiều hoa in vitro 19

3.1 Sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá bằng lăng non trên môi

trường MS + NAA 4 mg/l + BA 0,1 mg/l nuôi cấy in vitro

23

3.2 Sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá bằng lăng non trên môi

trường nuôi cấy in vitro

26

3.3 Đường kính mẫu của mô sẹo trên môi trường MS + NAA 4

mg/l + BA 0,1 mg/l

29

3.4 Sự phát triển của mô sẹo trên môi trường MS bổ sung TDZ

0,01 mg/l vào thời điểm 30 ngày nuôi cấy

32

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

MS: Murashige và Skoog (1962)

ctv.: Cộng tác viên

TSKC: Tuần sau khi cấy

SKC: Sau khi cấy

ĐHST: Điều hòa sinh trưởng

TDZ: Thidiazuron

NAA: Alpha-naphthalene acetic acid

BA: Benzyl adenine

NGUYỄN PHẠM HỒNG HẠNH 2012 “Ảnh hưởng của BA, TDZ và NAA lên

sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây bằng lăng nhiều

hoa (Lagerstroemia floribunda Jack) in vitro” Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành

Hoa Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại

Học Cần Thơ Cán bộ hướng dẫn: PGs.TS Lê Văn Hòa và Ths Nguyễn Văn Ây

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Ảnh hưởng của BA, TDZ và NAA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát

triển của mô sẹo từ mẫu lá non cây bằng lăng nhiều hoa (Lagerstroemia floribunda Jack) in vitro” được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có

nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA, TDZ và NAA lên sự tạo mô sẹo và khả năng

phát triển mô sẹo của lá cây bằng lăng nhiều hoa in vitro, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong nhân giống in vitro loài cây này Đề tài được thực hiện

tại Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa, khoa Nôngnghiệp và Sinh học Ứng dụng, từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2012 Kết quả thí

nghiệm cho thấy: (i) Có thể sử dụng môi trường MS bổ sung NAA 4 mg/l + BA 0,1

mg/l hoặc MS + NAA 5 mg/l + BA 0,1 mg/l trong cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lánon cây bằng lăng nhiều hoa (đạt hiệu quả tối ưu, 100% sau 9 tuần nuôi cấy, các

cụm mô sẹo tăng sinh tốt; (ii) Môi trường MS có bổ sung TDZ ở các nồng độ 0,01,

0,03 và 0,05 mg/l đều chưa có hiệu quả cao cho sự phát triển của cụm mô sẹo sau

30 ngày nuôi cấy

Từ khóa: Cây bằng lăng nhiều hoa, BA, TDZ, NAA, mô sẹo

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, cây bằng lăng trở nên là cây quan trọng trong cảnhquan vì nó có hoa màu tím rất đẹp Ở nước ta bằng lăng còn được trồng để lấy gỗ vìthân cây cho gỗ cứng thường được sử dụng làm các vật liệu như: đồ gỗ, khung cửa

và còn dùng làm nguyên liệu cho công nghệ bột giấy…

Hiện nay loại bằng lăng đang được ưa chuộng là bằng lăng nhiều hoa

(Lagerstroemia floribunda Jack) vì nó có nhiều hoa với màu sắc từ trắng, tím, tím

nhạt xen lẫn nhau rất đẹp, dễ thích nghi với nhiều vùng đất và điều kiện khí hậukhác nhau Đây là loại bằng lăng có tiềm năng nhất để trồng làm cảnh trong côngviên, trong vườn nhà hay ở các công sở Ngoài ra, cây bằng lăng nhiều hoa có chiềucao trung bình và rễ ăn sâu lại có hoa đẹp nở vào mùa hè thích hợp làm cây bóngmát, cây trồng ở vỉa hè đường phố đô thị… Vì thế việc tiến hành nhân giống loàicây bằng lăng nhiều hoa này là rất cần thiết Tuy nhiên hiện nay nhân giống câybằng lăng chủ yếu dựa vào phương pháp hữu tính truyền thống bằng cách gieo hạt Phương pháp nhân giống này còn rất hạn chế vì hạt bằng lăng rất cứng và rất khónảy mầm, hệ số nhân chồi chưa cao, tốn nhiều thời gian chưa đáp ứng được nhu cầu

về số lượng bằng lăng giống

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã làm một cuộc cách mạng trong nhân giống thự c vậtvới quy mô lớn và ngày nay được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới Trong vi nhângiống, phương pháp nhân giống thông qua con đường nuôi cấy mô sẹo có nhiều ưuđiểm hơn phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đốt thân có chứa chồi bên, tạođiều kiện nhân nhanh các giống cây, vừa ít tổn hại đến cây mẹ, vừa có nguồn mẫudồi dào, vừa có hệ số nhân chồi cao Tuy nhiên, ở nước ta việc nhân giống bằng

lăng bằng phương pháp này còn rất hạn chế Với những lý do trên đề tài “Ảnh hưởng của BA, TDZ và NAA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát triển của mô

sẹo từ mẫu lá non cây bằng lăng nhiều hoa (Lagerstroemia floribunda Jack) in vitro” được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng

độ chất điều hòa sinh trưởng BA, TDZ và NAA lên sự tạo mô sẹo và khả năng phát

triển mô sẹo của lá cây bằng lăng nhiều hoa in vitro, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong nhân giống in vitro loài cây này.

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Phân loại cây bằng lăng

Theo Trần Hợp (2002), bằng lăng là chi thuộc họ Tử Vi (Lythraceae) và gồm nhữngloài sau:

1.1.1 Bằng lăng nhiều hoa (Lagerstroemia floribunda Jack)

Bằng lăng nhiều hoa (Lagerstroemia floribunda Jack) là loài cây gỗ lớn Cây

cao từ 10-15 m, thân cây mập xốp có màu xám nâu, gần nhẵn Cây phân cành lớn

có tán rộng và dày (Hình 1.1)

Lá cây đơn mọc đối hay gần đối dạng bầu dục thuôn đều Đầu lá tù hẹp có mũinhọn Lá có màu xanh bóng dày, dai, nhẵn và cứng Lá dài từ 15-20 cm Gân bêncủa lá có từ 12-14 đôi Gân bên mảnh và nối lại với nhau ở mép lá Cuống lá dàikhoảng 1 cm

Hình 1.1 Cây và hoa bằng lăng nhiều hoa

Cụm hoa bằng lăng nhiều hoa có chùy lớn mọc ở đầu cành Cây có hoa lớnmàu trắng và tím nhạt xen lẫn nhau Nụ hoa thuôn hẹp ở gốc và rộng ở đỉnh Đàihoa hợp ở gốc thành hình chén và có 12 gờ dọc thấp và mảnh Hoa có từ 4-5 cánh.Cánh hoa cao 1,5 cm và nhăn nheo.

Ở Việt Nam cây mọc rộng rãi ở các tỉnh Nam bộ: Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa

- Vũng Tàu (Côn Đảo) trong các rừng khô, rừng thưa, rừng nửa rụng lá ở các vùngđồi núi cao trung bình

Hàng năm, cây bằng lăng nhiều hoa có hoa từ tháng 5 đến tháng 7 Cây mangquả từ tháng 11 đến tháng 12 Cây cho quả tốt

* Công dụng

Cây cho gỗ tốt, dùng trong xây dựng, đóng đồ đạc trong gia đình, làm ván, làm

đồ mỹ nghệ Cây có hoa đẹp, làm cây bóng mát, cây trang trí (Trần Hợp, 2003)

1.1.2 Bằng lăng hoa đỏ (Lagerstroemia balansae Koechne)

Bằng lăng hoa đỏ (Lagerstroemia balansae Koechne) là loại cây thân gỗ, cao

từ 20-30 m, đường kính từ 30-50 cm Vỏ ngoài mỏng, thịt vỏ màu vàng sẫm Cànhnon có màu nâu sẫm Lá đơn mọc đối hoặc gần mọc đối, hình mác hay hình trứngthuôn, lá dài từ 6-15 cm, rộng từ 3-6 cm, đỉnh lá có mũi nhọn, gốc lá hình nêm rộnghoặc gần hình tròn, lá lúc non hai mặt có lông màu vàng, lúc già thì nhẵn Cuống ládài từ 4-5 mm, cuống có lông màu xám nâu, nách lá mang chồi nhỏ phủ lông

Bằng lăng hoa đỏ có cụm hoa hình chùy, mọc ở đầu cành Hoa khá lớn Cánhđài hợp hình chuông, có từ 5-6 răng, có cánh tràng màu đỏ nhạt, hình tròn, có cuốngdài Nhị đực có từ 60-70 nhị Bầu từ 3-6 ô, hoa không có cuống, phần dưới có phủlông dày

Quả nang của bằng lăng hoa đỏ có hình trứng, cao từ 1,2-1,5 m, màu đen, nứtthành 6 mảnh

1.1.3 Bằng lăng ổi (Lagerstroemia calyculata Kurz)

Bằng lăng ổi (Lagerstroemia calyculata Kurz hay Lagerstroemia angustifolia

Pierre Ex Lann.) là loại cây gỗ rụng lá, cây cao từ 30-35 m và có đường kính từ

40-80 cm Vỏ cây màu vàng nhạt, xen những mảnh màu nâu lục rất nhẵn, thịt cây màuvàng nhạt và có nhiều xơ Cành cây mảnh, có lông màu vàng

Lá bằng lăng ổi hình mác thuôn, gốc lá tù, hơi lệch, đỉnh lá kéo dài thành mũi,

lá dài từ 7-14 cm và rộng từ 2-5 cm Lá có gân bên từ 10-13 đôi, có lông Cuống ládài 3-5 mm và có lông

Bằng lăng ổi có cụm hoa hình chùy, có nhiều lông vàng, dài từ 12-20 cm Cánhhoa dài hình chuông có nhiều lông Hoa có sáu cánh tràng, hình tròn hày hình timngược, cánh tràng rộng từ 2-5 mm Hoa có nhiều nhị đực gần bằng nhau

Quả nang bằng lăng ổi có hình trứng, dài 12 mm, nằm ẩn 1/3 trong đài và nứtthành 6 mảnh Hạt dài 8 mm

1.1.4 Bằng lăng còi (Lagerstroemia lecomtei Cagnep)

Bằng lăng còi (Lagerstroemia lecomtei Cagnep) là cây gỗ nhỏ Cây cao từ 4-6

m Thân cây nhẵn bóng Vỏ cây mỏng có màu xám vàng Lá cây đơn mọc đối Lánhỏ và có dạng trái xoan tròn Đầu lá thuôn nhọn, gốc lá tròn hay tù rộng Lá dàikhoảng 6 cm và rộng 3 cm Lá có màu xanh lục bóng Gân bên lá có từ 6-7 đôi.Cuống lá dài từ 0,3-0,5 cm và nhẵn

Cụm hoa bằng lăng còi có chùy lớn ở đầu cành và dài 5 cm Hoa có nụ trònđường kính từ 1,2-1,4 cm Lá đài hợp ở gốc dạng hình chén và có 6 gờ dọc nổi.Cánh hoa bằng lăng còi lớn từ 5-6 cánh Cánh hoa hình gần tròn, cao 1,2-1,4 cm,răn reo Cánh hoa có màu hồng hay tím Hoa có nhiều nhị đực

Cây có quả nang dạng trái xoan và cao 2 cm Hạt bằng lăng còi dẹt và có cánh

1.1.5 Bằng lăng xoan (Lagerstroemia ovalifolia Teijm Et Binn)

Bằng lăng xoan (Lagerstroemia ovalifolia Teijm Et Binn) là loại cây gỗ rụng

lá mùa khô Cây cao từ 12-18 m, đường kính 18-45 cm Bằng lăng xoan có tán rậm,màu xanh lục đậm Thân cây không thẳng, có nhiều u mấu Vỏ thân màu xám trắngvới lớp ngoài xốp, lớp giữa màu trắng vàng, lớp trong cùng nhẵn mịn Cành non củacây màu xanh lục vuông cạnh

Lá bằng lăng xoan là lá đơn nguyên, mọc đối Lá hình trứng rộng, dài từ 4-15

cm và rộng từ 3,5-9 cm Phiến lá dày cứng, mặt trên màu xanh lục thẫm, mặt dướihơi nhạt hơn Lá khi khô có màu đỏ Đầu lá nhọn, gốc lá hình nêm Lá có từ 7-11đôi gân bên Cuống lá dài từ 3-5 cm, có cánh rất nhỏ men dọc cuống lá

Bằng lăng xoan có cụm hoa hình chùy ít hoa dài từ 12-35 cm và rộng từ 7- 15

gờ cánh dọc Cánh hoa hơi lượn sóng hình tam giác có phần phụ, phía ngoài có lôngmịn, phía trong nhẵn Cánh tràng của hoa có từ 6-7 cánh Cánh tràng lượn sóng gốcthót hẹp lại Hoa có nhiều nhị đực.

Bằng lăng xoan có quả nang hình trứng, khi non màu xanh lục nhẵn Nang dài

từ 2,2-2,5 cm, rộng 1,3-1,4 cm

1.1.6 Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers)

Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers) là loại cây rụng lá Cây cao

15-25 m và đường kính 30-50 cm Vỏ cây màu xám, nứt dọc Cây có tán dày

Lá bằng lăng nước là lạo lá đơn, mọc đối hay gần đối Lá hình bầu dục, đầu cómũi nhọn Khi khô lá có màu đỏ hung nhạt ở mặt dưới Lá dài từ 10-20 cm, rộng từ5-9 cm Gân bên của lá từ 12-17 đôi Cuống lá dài 8-10 mm, khỏe và nhẵn

Cây có cụm hoa đầu cành hình chóp, dài 15-20 cm Cánh đài hình ống với 6 dảilồi nổi lên Hoa có 6 cánh tràng, không lượn sóng hay ít Cánh tràng thót dần thànhmột móng rộng và ngắn Hoa có nhiều nhị đính khoảng giữa của ống đài Cây cóquả nang hình trứng, cao 2 cm và đường kính khoảng 18 mm

1.1.7 Bằng lăng lông (Lagerstroemia tomentosa Presl)

Bằng lăng lông (Lagerstroemia tomentosa Presl) là cây gỗ rụng lá Cây cao tới

30 m, thân cây có bạnh to và cao Vỏ cây mỏng, nhẵn màu xanh hồng Cành conthường vuông 4 cạnh, phủ dày lông hình sao, màu nâu vàng

Lá cây là lá đơn nguyên, mọc đối Lá hình trứng dài, dài từ 8-14 cm và rộng từ4-6 cm Gân bên của lá từ 9-11 đôi Cuống lá ngắn

Cụm hoa bằng lăng lông hình chop và mọc ở đầu cành Cây có hoa màu trắng.Cánh tràng của hoa có hình trứng, đuôi hình tim và có móng

Cây có quả nang hình trái xoan, hoa có cánh đài tồn tại và nứt thành 5-6 mảnh.Hạt cây có cánh dài từ 2-3 mm

1.2 Nuôi cấy mô và phương pháp vi nhân giống

1.2.1 Mục đích, ý nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy thực v ật trong ống nghiệm, khác

với nuôi cấy in vivo là quá trình nuôi cấy thực vật trong điều kiện tự nhiên

(Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen

được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro Vi nhân giống thông thường là

phương pháp nhân nhanh và giảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2005)

Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đ ỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các câysau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường mới và qui trình cứ thế được lặplại Ngoài ra, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh câythẳng từ mô sẹo Phương pháp này cho số lượng lớn cây giống đ ồng nhất trong cùngmột lúc với khoảng thời gian ngắn, nhưng thường kéo theo sự biến dị soma(Nguyễn Đức Thành, 2000)

Những ưu điểm của nhân giống in vitro:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác tạogiống

- Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau,cây hoa và các cây trồng khác

- Nhân nhanh các loại cây trồng khó nhân giống bằng các phương phápthông thường khác Làm sạch virut và bảo quản nguồn gen cây trồng trong ngânhàng gen (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

- Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ Đ ối với cây trồng thuộcnhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh từ hạt khônghoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhângiống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt

- Có thể nhân một số lượng cây con s ạch bệnh lớn từ một cá thể ban đầu trongmột thời gian ngắn (Bùi Bá Bổng, 1995)

- Làm hạ giá thành vận chuyển, bảo quản cây giống cũng thuận tiện (Nguyễn ĐứcThành, 2000)

Nhìn chung nhân giống vô tính in vitro được ứng dụng thành công và dễ dàng

trên các cây hai lá mầm hơn các cây một lá mầm, cũng như cây thân thảo dễ hơn

1.2.2 Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinhhình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôicấy Môi trường cơ bản MS được xem là môi trường thích hợp với nhiều loại cây dogiàu và cân bằng về dinh dưỡng (Murashige và Skoog, 1962) Theo Nguyễn BảoToàn (2010) thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm rất nhiều chất, thông thườngcác chất được phân thành hai thành phần:

 Thành phần cơ bản là thành phần luôn có trong môi trường như: nước, cácnguyên tố khoáng, nguồn carbohydrate, vitamin, chất tạo gel, chất điều hòa sinhtrưởng

 Thành phần tự chọn là thành phần có thể thêm hoặc không thêm vào môitrường như: chelates, chất thẩm thấu, than, amino acid, đạm hữu cơ

1.2.2.1 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy Nước sử dụng trongnuôi cấy thường là nước cất một lần Trong một số trường hợp người ta cũng sửdụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.2.2.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Có nhiều nguyên tố khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, mỗinguyên tố có một vai trò riêng Các nguyên tố khoáng được chia làm h ai nhóm:khoáng đa lượng và khoáng vi lượng

Theo Lê Văn Hoà và ctv (1999) khoáng đa lượng rất cần cho cây có ảnh

hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc Các nguyên tốkhoáng đa lượng gồm các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l.Những nguyên tố đó là N, S, P, K, Mg và Ca Riêng Na và Cl cũng được sử dụng

nhưng chưa rõ vai trò của chúng (Lê Trần Bình và ctv., 1997).

Trong nuôi cấy mô in vitro nguồn nitơ thường được sử dụng dưới dạng nitrat

(NO3-) và amonium (NH4+) đồng thời cũng sử dụng các dạng nitơ hữu cơ nhưacid amin Tuy nhiên nếu chỉ dùng acid amin làm nguồn nitơ thì mô phát triển rấtyếu, sự có mặt đồng thời của nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ ở hàm lượng thích hợp sẽthúc đẩy tế bào sinh trưởng mạnh (Vũ Văn Vụ, 1999)

Các nguyên tố khoáng vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độthấp hơn 30 mg/l Đó là các nguyên tố: Sắt (Fe), Bo (B), Mangan (Mn), Iode (I),Molybden (Mo), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Niken (Ni), Cobalt (Co) Các nguyên tốnày đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn Xuân Linh,1998) Nhiều nghiên cứu cho thấy Fe kết hợp với các chất chelat (EDTA-ethylenediamine-tetraacetic acid) làm tăng khả năng trao đổi chất của sắt (Nguyễn Đức Thành,2000).

1.2.2.3 Đường

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng

nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là điều bắt buộc,

nó không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường mà còn là nguồncarbohydrate tốt nhất cung cấp cho mô và tế bào (Lâm Ngọc Phương, 2009) Haidạng đường thường gặp nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được

sử dụng phổ biến hơn và nồng độ sucrose biến đổi từ 1-8% (Nguyễn Đức Lượng và

Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002)

từ 0,5-1 mg/l (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.2.2.5 Agar

Việc làm đông đặc môi trường thường là nhờ những hợp chất polysaccharide caophân tử, chúng giữ nước và môi trường khoáng cung cấp cho cây, có thể dùng làphytagell (gelrite) hay agar Agar thường được sử dụng hơn cả vì nó trơ không chịutác dụng nhiều trong các phản ứng hóa học, tính ổn định cao và giá cũng tương đối rẻ(Dương Công Kiên, 2007)

Agar được sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán đặc để nuôicấy mô thực vật Agar trộn với nước thì tạo thành dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60-

100oC và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống 45oC Nồng độ agar thường sử dụng trongmôi trường nuôi cấy mô thực vật là 0,5-10% Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), nồng

độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng đến: thế năng nước trong môi trường nuôi cấy,

độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấynhư sự thừa nước, sự hoạt động của cytokinin trong môi trường có agar

1.2.2.6 Nước dừa

Nước dừa được bổ sung vào môi trường nhằm tăng sự sinh trưởng và phát triển

mô Trong nước dừa có chứa các loại khoáng, acid amin, myo-inosytol, đường, chấtbéo và chất điều hòa sinh trưởng như cytokynin có lợi cho sự tạo phôi, tạo mô sẹo

và tái sinh cây Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, lượng nước dừa phù hợp nhất là 20% theo thể tích (Vũ Văn Vụ, 1999)

15-1.2.2.7 pH

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) pH thường được hiệu chỉnh trong khoảng 5,5-6trước khi hấp khử trùng pH quyết định sự hòa tan của khoáng trong môi trường pHcòn ảnh hưởng đến sự hấp thu khoáng trong môi trường và ảnh hưởng trên sự tạo gelcủa agar khi hấp khử trùng Môi trường có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn7,0) ức chế sự phát triển của mô (Bùi Bá Bổng, 1995)

1.2.2.8 Chất điều hòa sinh trưởng

Theo Vũ Văn Vụ và ctv (2006), các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần

không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan t rọng trong quá trình phát

sinh hình thái thực vật in vitro Các chất kích thích sinh trưởng gồm hai nhóm chính là

auxin và cytokinin (Nguyễn Đức Thành, 2000)

* Auxin

Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole -3-acetic acid (IAA), nó hiệndiện ở nồng độ cao ở vùng phân sinh mô của thực vật và được liên quan nhiều đápứng sinh lý Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, hiệu quả chính của nó là trên sự phân chia tếbào và quá trình giảm phân (Nguyễn Bảo toàn, 2010)

Auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi nhất là i ndole-3-butyric acid (IBA), hiệnnay được chứng minh là xuất hiện trong tự nhiên trong cây, alpha -naphthalene aceticacid (NAA) và 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), các auxin này thường đượckết hợp liên kết với cytokinin (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôicấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, đặc biệt là khi nó được sử dụng phốihợp với cytokinin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

* Cytokinin

Cytokinin thường được dùng để kích thích sự sinh trưởng và phát triển, phổ biếnnhư: BA, kinetin và 2-iP; chúng thường kích thích sự phân chia tế bào, đặc biệt nếucộng chung với auxin (Lâm Ngọc Phương, 2009) Khi có tác dụng của auxin ở cácmức khác nhau, đối với các tế bào tách rời (nuôi cấy mô) sự cân đối giữa auxin vàcytokinin sẽ kích thích sự thành lập callus, rễ, chồi (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn,2005)

Nhu cầu về cytokinin có tính chuyên biệt đối với từng loại tế bào thực vật cũngnhư từng giai đoạn khác nhau Hầu hết các cây hai lá mầm khi thêm một lượng nhỏcytokinin vào trong môi trường có chứa auxin có khuynh hướng gia tăng vận tốcsinh trưởng của mô sẹo hình thành phôi vô tính (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Cáccytokinin thường được sử dụng trong cấy mô như diphenylurea (DPU), benzyladenine (BA), benzyl aminopurine (BAP), Thidiazuron (TDZ)

Thidiazuron (TDZ) là chất điều hòa sinh trưởng có hiệu quả trong nhân giốngcác loài cây thân gỗ (Malik và Saxena, 1992) TDZ ít bị phân hủy bởi enzym nộisinh so với các loại cytokinin khác, vì vậy nó có hoạt tính cao ở nồng độ thấp (Mok

và ctv., 1987) Nồng độ TDZ thường thấp hơn các chất điều hòa sinh trưởng thực

vật khác từ 10-1.000 lần Ở nồng độ thấp nó có thể cho hệ số nhân chồi cao hơn cácloại cytoknin khác và ở nồng độ cao TDZ có thể kích thích mẫu cấy hình thành mô

sẹo, chồi bất định hoặc phôi soma Tuy nhiên, TDZ lại ức chế sự vươn dài của chồi(Huetteman và Preece, 1993).

* Tương tác giữa auxin và cytokinin

Theo kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy, một tỷ lệ cao cytokinin vàauxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi, trong khi tỷ lệ cao auxin và cytokinin thấp thíchhợp cho sự tạo rễ, mức độ trung gian giữa hai tỷ lệ này thích hợp tạo mô sẹo (NguyễnBảo Toàn, 2010)

1.3 Sự hình thành mô sẹo

1.3.1 Định nghĩa mô sẹo (callus)

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) mô sẹo là một khối tếbào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới cácđiều kiện đặc biệt như vết thương hay xử lí với các chất điều hòa sinh trưởng thựcvật. Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa

trước lần phân chia đầu tiên Nhìn chung sự tạo mô sẹo in vitro (nhờ auxin tác

+ Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được

ưu tiên áp dụng ở đơn tử diệp, vì các cây này tượng tầng thiếu và n hu mô khó phảnphân hoá so với song tử diệp Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môitrường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường có màuvàng, trắng, nâu hay trắng xanh…

Sự hình thành mô sẹo ở vết thương là sự thích ứng để bảo vệ, sự phân chia tếbào được hoạt hóa do các thay đổi trong sự cân bằng nội sinh của hormone thực vật(Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Nuôi cấy mô sẹo là một khâu quan trọng trong nuôi cấy tế bào, nó là nguyênliệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như phân hóa mô và tế bào, chọn dòng

tế bào, protoplast, sản xuất các chất có hoạt tính sinh học… (Nguyễn Đức Thành,2000).

Theo Vũ Văn Vụ (1999) việc nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiềutrường hợp như:

+ Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nuôi cấy bằng

đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện được

+ Sử dụng làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, chọn dòng tế bà o, sản xuấtcác chất có hoạt tính sinh học…

+ Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

Sự hình thành mô sẹo trong in vitro có thể chia làm ba giai đoạn: kích thích,

phân chia và chuyên hóa (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

+ Sự kích thích: Hầu hết các loại thực vật, mô sẹo có thể được thiết lập tươngđối dễ dàng ở cây hai lá mầm, cây một lá mầm, khỏa tử, dương xỉ, rêu Mô củanhiều cơ quan có tiềm năng phân chia và sinh sôi trên môi trường nuôi cấy thíchhợp Tuy nhiên, một số mô chịu sự phân chia tế bào nhanh hơn các mô khác

+ Sự phân chia tế bào: Sự phân chia tế bào hoạt động, các tế bào biến đổi sangtình trạng mô phân sinh

+ Sự chuyên hóa: Sự xuất hiện về chuyên hóa tế bào và sự biểu hiện của cáccon đường biến dưỡng thứ cấp

Theo Vũ Văn Vụ (1999) mô sẹo khi hình thành gồm hai loại:

+ Loại cứng: Các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ.+ Loại xốp: Chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và khôngbào to

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) sau một thời gian cần thiết cấy chuyền mô sẹovào trong môi trường mới do hết dinh dưỡng trong môi trường và gel agar trở nênkhô đi, các chất thải do mô sẹo gây ra cũng có thể tích lũy đến mức gây độc Hầuhết mô sẹo nuôi cấy điều đòi hỏi phải được phân cắt thường xuyên và đặt các mặtcắt úp trên môi trường mới trừ trường hợp mô sẹo đang ở giai đoạn đầu của sự tăngtrưởng, nếu cứ nuôi mãi mà không tách ra và cấy chuyền thì mô sẹo sẽ bị hoại tử

mà chết (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.3.2 Khả năng tạo mô sẹo của tế bào trong nuôi cấy mô

Các loại mô trên cùng một cây tuy mang cùng một lượng thông tin di truyềnnhư nhau nhưng lại phản ứng khác nhau trên cùng môi trường nuôi cấy như khảnăng hình thành mô sẹo, sự tái sinh của các bộ phận được cấy thành chồi, rễ…cũngkhác nhau hoàn toàn Vì vậy, việc chọn đúng loại mô để cấy là rất quan trọng, nếuchọn được mô thích hợp thì sẽ dễ dàng cho việc phát triển của mô trong môi trường.Các mô đang phát triển mạnh như: mô phân sinh ngọn, mô tượng tầng, mô phânsinh đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non, lá non… khi đặt vào môi trường cóchứa chất điều hòa sinh trưởng thích hợp thì sẽ kích thích hình thành mô sẹo

Có nhiều kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô cho thấy có thể kích thích mô sẹophát triển và tạo phôi vô tính đã được báo cáo bởi Hassan và Debergh (1987) sử

dụng chồi non của tre Phyllostachys viridis để tạo mô sẹo làm vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo; Yeh và Chang (1986) đã dùng phát hoa của tre Bambusa oldhamii Munro để tạo phôi soma thông qua hình thành mô sẹo; Godbole và ctv (2002) đã sử dụng chồi bên tre Dendtrocalamus hamiltonii để tạo mô sẹo làm vật

liệu để tạo phôi soma và tái sinh cây hoàn chỉnh

Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1993) hình dáng và cấu trúc của mô sẹo là

những tế bào nhu mô không có tổ chức hay là một khối vô định h ình của các tế bàonhu mô có vách mỏng được sắp xếp lỏng lẻo Xét về mặt chức năng thì mô sẹo làmột tổ chức tế bào không phân hóa (Nguyễn Đức Thành, 2000) Mô sẹo có khảnăng tái sinh phôi rất biến động và tùy thuộc vào nhiều yếu tố: do đặc tính của loài

và ảnh hưởng của môi trường bên ngoài, chủ yếu là do thành phần hormone thựcvật

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo mô sẹo

+ Mẫu cấy: Mô sẹo có thể tạo ra từ nhiều cơ quan khác nhau của cơ thể thựcvật Tuy nhiên, tùy vào mô hay cơ quan đó mà sử dụng chất điều hòa sinh trưởngvới loại và nồng độ khác nhau cho phù hợp (Ochatt và Caso, 1986) Theo NguyễnVăn Uyển (1993) những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng hình thành

mô sẹo, ngược lại cá c mô đang phát triển mạnh như: mô phân sinh ngọn, mô phânsinh đầu rễ, mô tượng tầng, lá non, của cây trưởng thành có thể hình thành mô sẹotrong môi trường có chứa một lượng chất điều hòa sinh trưởng thích hợp đặc biệt làauxin Vì thế, tuổi của những mảnh mô hay cơ quan cũng rất quan trọng trong khả

+ Ánh sáng: Tùy theo loại mẫu cấy ánh sáng có thể cần hoặc không cần trongsuốt thời gian tạo mô sẹo (Pierik, 1987) Trong đa số trường hợp sự tạo mô sẹotrong tối còn tốt hơn ngoài sáng đặc biệt đối với mẫu cấy là lá ví dụ trường hợp môsẹo từ lá khoai tây (trích dẫn Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

Ngược lại, sự tạo mô sẹo từ lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum (Nguyễn Hoàng Lộc

và ctv., 1999) xảy ra trong điều kiện chiếu sáng.

+ Chất điều hòa sinh trưởng: Auxin trong môi trường nuôi cấy thường kíchthích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định (Pierik, 1987).Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao

thì không tạo rễ mà tạo mô sẹo Theo Can và ctv (2008) tốc độ tăng trưởng của mô

sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ của auxin Auxin thường được sửdụng để cảm ứng sự tạo mô sẹo là 2,4-D, nhưng nếu tiếp tục duy trì mô sẹo trongmôi trường 2,4-D này thì tế bào dễ bị đột biến vì vậy người ta có thể cảm ứng sự tạo

mô sẹo bằng NAA hay IAA hoặc sau khi cảm ứng mô sẹo bằng 2,4-D thì mẫu cấy

sẽ được chuyển sang môi trường có NAA hoặc IAA Để cảm ứng sự tạo mô sẹo ởcây hai lá mầm người ta thường kết hợp auxin với cytokinin

Khi Hassan và Debergh (1987) tạo mô sẹo tre Phyllosstachys viridis trong

môi trường MS có bổ sung 2,4-D thì 4-5 tuần sau khi cấy phát hiện có hai loại mô

sẹo hình thành trong môi trường : (i) cứng, dày đặc, màu xanh nâu, nhân to, tế bào

chất đậm đặc, xem giống như là hợp tử bình thường, có thể dùng để tái sinh cây

bình thường; (ii) loại xốp, chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và

không bào to, không hoặc rất ít cây con được tái sinh từ loại mô sẹo này

1.3.4 Hiện tượng hóa nâu trên mẫu cấy

Sau khi cấy mẫu có thể gặp hiện tượng hoại tử, bị hóa nâu rồi chuyển dần sangmàu đen do các phenol như: cinnamic, coumarin, salicilic acid tồn tại trong câydưới dạng glycoside; do hoạt động của oxydase chứa đồng được phóng thích hoặctổng hợp và hiện diện trong điều kiện oxy hóa khi mô bị thương Các mô nonthường ít bị hóa nâu hơn mô trưởng thành, mô già

Theo Mai Trần Ngọc Tiếng (1994) phenol hiện diện trong mẫu cấy ít hay nhiềuphụ thuộc vào giống loài, vị trí mô, tình trạng sinh lý, sinh hóa của mô, Phenol ứcchế sự phát triển của mô theo cơ chế liên kết với protein và ức chế hoạt động củaenzyme Để khắc phục tình trạng này có thể dùng các cách sau: