ẢNH HƯỞNG của BA và NAA đến sự NHÂN CHỒI và tạo rễ IN VITRO cây cẩm tú cầu (hydrangea macrophylla (thunb ) ser ex DC )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG TRỊNH THANH CAO ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY CẨM TÚ CẦU Hydrangea macrophylla Thunb...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRỊNH THANH CAO

ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN

CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY CẨM TÚ CẦU (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Ngành: Hoa Viên và Cây Cảnh

Cần Thơ - 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: HOA VIÊN VÀ CÂY CẢNH

ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ NAA ĐẾN SỰ NHÂN

CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY CẨM TÚ CẦU

(Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)

Cán bộ hướng dẫn:

Ths Nguyễn Văn Ây

Sinh viên thực hiện:

Trịnh Thanh Cao

MSSV: 3087717 Lớp: Hoa Viên Cây Cảnh K34

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Hoa viên và Cây cảnh với đề tài: “Ảnh hưởng

của BA và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây cẩm tú cầu (Hydrangea

macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)” do sinh viên TRỊNH THANH CAO thực

hiện kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm luận văn đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Hoa viên

và Cây cảnh với đề tài: “Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ

in vitro cây cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)”, do sinh

viên Trịnh Thanh Cao thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp ngày….tháng….năm 2012

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức:

Chữ ký của thành viên hội đồng

Thành viên 1 Thành viên 2 Thành viên 3

Khoa Duyệt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn Các

số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Trịnh Thanh Cao

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1 LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Nơi sinh: An Giang

Họ và tên cha: Trịnh Văn Đèo

Họ và tên mẹ: Nguyễn Thị Thúy Liên

Chỗ ở hiện nay: Ấp Vĩnh Lập, xã Vĩnh Trung, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang

2 QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

- 1996-2001: Học sinh Trường tiểu học Vĩnh Trung

- 2001-2005: Học sinh Trường trung học cơ sở Vĩnh Trung

- 2005-2008: Học sinh Trường trung học phổ thông Chi Lăng

- 2008-2012: Sinh viên Trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Ngành Hoa viên & Cây cảnh, khóa 34

Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2012

Người khai

Trịnh Thanh Cao

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!

Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con

Xin tỏ lòng biết ơn đến!

Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Thầy Phạm Phước Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cố vấn học tập của Lớp, cùng với quý thầy cô Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tâm, dìu dắt, rèn luyện tôi suốt những năm học tại trường Đại Học Cần Thơ

Chân thành cám ơn!

Cô Lê Hồng Giang, Cô Phan Thị Hồng Nhung, anh Mai Vũ Duy cùng với các anh chị, các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô, Bộ môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ

Các bạn sinh viên lớp Hoa viên & cây cảnh K34 đã giúp đỡ động viên tôi trong những năm tháng trên giảng đường Đại Học

MỤC LỤC

TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA HỘI DỒNG

LỜI CAM ĐOAN

iv

v

vi viii

1.2.1 Sự hình thành phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực

7

8

12

1.3.1 Một số kết quả nghiên cứu trong nước 13 1.3.2 Một số kết quả nghiên cứu ngoài nước

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

14

15

2.1.4 Các thiết bị và dụng cụ dùng trong thí nghiệm

2.1.5 Hóa chất dùng trong thí nghiệm

15

3.1 Ảnh hưởng của BA đến sự nhân chồi cẩm tú cầu in vitro 19

3.2 Ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ cẩm tú cầu in vitro 24

3.4 Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ cẩm tú cầu vào thời điểm 4 tuần

sau khi cấy

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

HgCl2 : Clorua thủy ngân

NAA : Naphthalene acetic acid

TRỊNH THANH CAO 2012 “Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự nhân chồi và

tạo rễ in vitro cây cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)”

Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Hoa viên - cây cảnh, khoa Nông Nghiệp và

Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ Cán bộ hướng dẫn: ThS Nguyễn

rễ Cây con in vitro sinh trưởng, phát triển tốt và có thể tiến hành thuần dưỡng trong điều kiện vườn ươm

Từ khóa: cây cẩm tú cầu, BA, NAA, nhân chồi, tạo rễ, in vitro

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của kinh tế, đời sống người dân ngày càng được cải thiện nên việc sử dụng hoa trang trí, làm cảnh trong nội thất, sân vườn ngày càng phổ biến Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của mọi người, nghề trồng hoa và kinh doanh hoa kiểng đã trở nên phổ biến và phát triển đa dạng về quy mô cũng như chủng loại Bên cạnh các loài hoa và cây cảnh thường gặp như: hoa mai, lan, hồng, cúc…thì cẩm tú cầu là loài hoa cũng khá được ưa chuộng vì có hoa đẹp có nhiều màu sắc lại dễ trồng

Cẩm Tú cầu hiện nay thường được nhân giống bằng phương pháp giâm cành Mặc dù, nhân giống bằng các phương pháp cổ truyền là một kỹ thuật chiếm nhiều

ưu thế nhưng không làm cây sạch bệnh và hệ số nhân thấp (Dương Công Kiên, 2007) Với biện pháp giâm cành thì không thể đáp ứng đủ cho nhu cầu của thị trường, khó khăn trong việc vận chuyển nguồn giống đến nơi tiêu thụ Ngày nay, phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng rộng rãi đối với nhiều loài thực vật Vì vậy, việc áp dụng phương pháp này để nhân giống cây cẩm tú cầu nhằm cung cấp nguồn giống với số lượng lớn, cây sạch bệnh trong thời gian ngắn và có khả năng trồng quanh năm để đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ Bằng phương pháp này, người ta

có thể nhân giống cây trồng ở qui mô công nghiệp với hệ số nhân giống rất cao, thường đạt 36- 1012/năm (Lê Trần Bình, 1997)

Do đó đề tài “ Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC.)” được thực

hiện nhằm tìm ra môi trường bổ sung BA và NAA thích hợp lên sự nhân chồi và tạo

rễ cây cẩm tú cầu, góp phần hoàn chỉnh quy trình nhân giống cây này, đáp ứng nhu cầu về cây con giống cho nhu cầu thị trường hiện nay

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CẨM TÚ CẦU

Hình 1.1 Cẩm tú cầu (Hydrangea macrophylla (Thunb.) Ser ex DC)

(Nguồn: http://www.cayxanhsadec.com.vn/product/wiew/161.Cẩm-Tú-Cầu.html)

1.1.2 Đặc tính thực vật

Cây nhỏ mọc thành bụi thấp Lá mọc đối; phiến xoan-bầu dục rộng, dài 7 - 20

cm, rộng 4 - 10 cm, mép có răng, và có 5 – 7 gân bên Hoa mọc thành chùm xim to như đầu tròn; hoa lép ở ngoài với lá đài to như cánh hoa, màu trắng rồi đổi sang màu lam hay hồng; hoa sinh sản nhỏ ở phía trong với 4 - 5 lá đài, có 4 - 5 cánh hoa,

4 - 5 nhị và bầu dưới, 3 - 4 ô Quả thuộc loại quả nang

Cây ưa khí hậu ẩm mát Ra hoa vào mùa xuân Hoa phơi khô dùng làm thuốc Ở Nhật Bản, dân gian dùng rễ và lá làm thuốc trị bệnh về tim Ở Vân Nam (Trung

Quốc), cây dùng chữa tim nóng trống ngực đánh mạnh, sốt rét và bệnh về tim (Võ Văn Chi, 2004)

1.2 SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

1.2.1 Sự hình thành phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hai nhà sinh học Đức, Matthias Schleiden (1804-1881) và Theosdore Schwanm (1810-1882) là những người đi tiên phong, đã đưa ra lý thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật năm 1839 Hai ông cho rằng mỗi tế bào có khả năng tồn tại độc lập, có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và trong điều kiện thích hợp có thể phát triển theo chu trình giống như sự phát triển của phôi dẫn đến hình thành cây mới hoàn chỉnh (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Tiếp theo đó, nhà thực vật học người Đức Haberlandt (1902) là người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào bằng các công trình nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường rắn có nước dừa Dựa trên quan điểm của Haberlandt, các nhà khoa học Heller (1953), Murashige & Skoog (1962)… đã thực hiện thành công kỹ thuật nuôi cấy mô thông qua nhiều thí nghiệm, nghiên cứu các môi trường nuôi cấy phù hợp Nuôi cấy mô

đã nhanh chóng hoàn thiện và phát triển cho đến ngày nay, có nhiều đóng góp trong lĩnh vực nhân giống cây trồng cho nông nghiệp, lâm nghiệp và nhiều lĩnh vực khác (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.2.2 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô thực vật

Tạo được một số lượng lớn cây con giống với cây mẹ, chọn lọc các gốc cây

mẹ, cứu lấy các loài thực vật đang trên con đường biến mất

Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Một số cây thân gỗ khó nhân giống bằng phương pháp giâm cành, chiết hoặc ghép thì có thể nuôi cấy mô Đảm bảo được nguồn cây giống sạch bệnh cho việc sản xuất Làm hạ giá thành sản xuất, vận chuyển và thuận lợi trong việc bảo quản cây giống (Lâm Ngọc Phương, 2009)

Nhìn chung nhân giống vô tính in vitro được ứng dụng thành công và dễ dàng

trên các cây hai lá mầm hơn các cây một lá mầm, cũng như cây thân thảo dễ hơn cây thân gỗ (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thủy Tiên, 2002)

1.2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật

Các thành phần môi trường trong nuôi cấy mô là rất quan trọng quyết định đến

sự thành công hay thất bại Tùy vào loài cây, giai đoạn phát triển của cây và mục đích thí nghiệm mà xem xét thành phần môi trường sao cho thích hợp để cây sinh trưởng và phát triển tốt Về cơ bản, thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm:

1.2.3.1 Nước

Nước là dung môi quan trọng trong môi trường nuôi cấy Thường thì nước được sử dụng là nước cất một lần Trong một số trường hợp người ta sử dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.2.3.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Khoáng đa lượng rất cần thiết cho cây, ảnh hưởng tốt đến sự hấp thu của mẫu vật nuôi cấy Các nguyên tố khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố có nồng độ trên 30 mg/l Những nguyên tố đó bao gồm N, S, P, K, Mg, Ca, Na, Cl Trong nuôi cấy mô nitơ thường được sử dụng dưới dạng NO3- và NH4+, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitơ như acid amin Tuy nhiên nếu chỉ dùng acid amin làm nguồn nitơ thì

mô phát triển rất yếu, sự có mặt đồng thời của nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ ở hàm lượng thích hợp sẽ thúc đẩy tế bào phát triển mạnh (Vũ Văn Vụ, 1999)

Khoáng vi lượng là các nguyên tố sử dụng với nồng độ thấp hơn 30 mg/l Đó

là các nguyên tố Fe, Bo, Mn, I, Mo, Zn, Cu, Ni, Co, các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.2.3.3 Nguồn carbohydrate

Nguồn carbohydrate giúp mô tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ, sự phân chia của tế bào, làm tăng sinh khối Bên cạnh đó, nguồn carbohydrate còn điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường

Nguồn carbon được bổ sung vào môi trường nuôi cấy là đường sucrose và glucose Tuy nhiên đường sucrose được sử dụng phổ biến hơn, nồng độ từ 20-40g/l tùy mục đích sử dụng Ngoài ra, carbohydrate giúp mẫu vật nuôi cấy tăng trưởng nhưng đồng thời ức chế sự tổng hợp diệp lục tố (Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)

1.2.3.4 Vitamin

Trong môi trường nuôi cấy đa số tế bào thực vật chưa tự tổng hợp được lượng vitamin cần thiết cho cơ thể nên phải bổ sung từ môi trường nuôi cấy Vitamin đóng vai trò trong hệ thống xúc tác các enzyme, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (vitamin B3), pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol Trong đó, thiamine là vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Mio-inositol có vai trò trong việc sinh tổng hợp thành tế bào và thường được dùng với hàm lượng lớn 50-100 mg/l

1.2.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng

Trong môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng là yếu tố quan trọng trong quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh cây nguyên vẹn từ tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô Đây là chất có hoạt tính sinh học rất cao nên với hàm lượng rất nhỏ (10-9) có thể kích thích ức chế hoặc bổ sung bất kỳ một quá trình sinh lý nào trong thực vật Có hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được dùng nhiều nhất là auxin và cytokinin (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

 Auxin

Hormone thực vật auxin là tác nhân của sự sinh trưởng kéo dài miền cực dưới đỉnh của bao lá mầm và thân cây Trong nuôi cấy mô, auxin được dùng cho sự phân chia tế bào và phân hóa rễ, ức chế sự thành lập chồi bên 2,4-D rất hữu hiệu trong việc tạo ra mô sẹo, NAA và IBA thường dùng để cho ra rễ và có thể phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi

Auxin được chia thành hai loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp Auxin tự

indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichloro phenoxy acetic acid (2,4-D), naphthalene acetic acid (NAA) (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1-Auxin được dùng ở liều lượng thấp sẽ tạo rễ phụ, ngược lại nếu dùng ở nồng

độ cao sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự tạo lập rễ nhưng lại kích thích sự tạo callus (Vũ Văn Vụ, 1999)

 Cytokinin

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào thực vật, tham gia vào quá trình tạo chồi phụ, ức chế tạo rễ, thành lập mô sẹo và tăng trưởng, kích thích chồi nách, ức chế sự lão hóa lá (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Cytokinin là những hợp chất adenine được thay thế, nó kích thích sự phân chia

tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống kinetin Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA tinh trùng cá trích được thanh trùng và được gọi là kinetin (Nguyễn Minh Chơn, 2005)

Cytokinin trong tự nhiên phổ biến nhất là zeatin (Z), kinetin furfurylaminopurine), benzyl adenine (BA) có hoạt tính mạnh hơn kinetin, 6-benzylaminopurine (BAP), 2-isopentenyladenine (2-iP), thidiazuron (TDZ) là chất đắt tiền nhưng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô

(6-Việc sử dụng hỗn hợp hơn 1 loại cytokinin cho thấy có hiệu quả trong nhân

chồi của một số loài như Corylus avellana (Anderson, 1982), Cucumis melo (Kathal

& ctv., 1988) (trích dẫn bởi Lâm Ngọc Phương, 2009)

1.2.3.6 Agar

Agar là chất được sử dụng để tạo môi trường đặc hay bán đặc để nuôi cấy mô thực vật Agar là phức hợp polysaccharide tự nhiên được trích từ loại tảo đỏ

(Gelidium amansii) sống ở biển, thuộc ngành Rhodophyta (George, 1993) Do

không phản ứng với các chất có trong môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật nên được sử dụng rộng rãi Agar trộn với nước thì tạo thành dạng gel, tan ra ở nhiệt độ từ 60-100oC và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống 45oC Nồng độ agar thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy từ 0,5-10%

1.2.3.7 pH

pH của môi trường cũng là một yếu tố quan trọng trong nuôi cấy mô Sự ổn định pH môi trường là yếu tố duy trì sự trao đổi các chất trong tế bào Giá trị pH

ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông

tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ một loạt các chất cũng phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibberellin và các vitamin Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào giá trị

pH (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Giá trị pH môi trường nuôi cấy hầu hết được điều chỉnh trong khoảng 5,70,1 trước khi hấp khử trùng Murashige & Skoog (1962) nhận thấy rằng giá trị pH = 5,7-5,8 là thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS, nếu như môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH = 5 Thường pH môi trường được điều chỉnh trước khi thanh trùng vì nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính acid của môi trường, nếu trước khi thanh trùng mà chỉnh pH = 5,7 thì sau khi hấp tiệt trùng pH sẽ giảm xuống còn 5 (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002)

1.2.3.8 Các yếu tố môi trường khác

Các yếu tố sinh lý như cường độ và thời gian chiếu sáng, nhiệt độ, nồng độ

CO2, ẩm độ của bình nuôi cấy, ẩm độ của vườn ươm, cũng có ảnh hưởng đáng kể đến tất cả các giai đoạn của vi nhân giống

 Ánh sáng: cường độ ánh sáng giữ vai trò quan trọng cho tăng trưởng chồi Tuy nhiên, nhu cầu về ánh sáng đối với các loài khác nhau là không giống nhau

Trong nhiều trường hợp ánh sáng kích thích sự tạo chồi, mẫu cấy lá của Petunia hybrida tăng trưởng trên môi trường không có cytokinin và được xử lý với ánh sáng

đỏ thì tạo nhiều chồi và có trọng lượng tươi lớn; ngược lại một số loài cây khác như hoa của Freesia lại tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối

Trong nuôi cấy chồi cây hoa hồng, cường độ ánh sáng 1-3 klux được cho là thích hợp cho sự tăng sinh chồi (Horn, 1992) và thời gian chiếu sáng 18h/ngày cũng cho sự tăng sinh chồi tốt hơn thời gian chiếu sáng 8h/ngày (Davies, 1980; Bressan

& ctv., 1982)

Còn trong tạo rễ, nhiều tác giả đồng ý rằng ánh sáng không cần thiết trong trường hợp này: Khos-Khui & Sink (1982) nhận thấy cường độ ánh sáng 3 klux ức

chế sự tạo rễ; Bressan & ctv (1982) cho rằng sự tạo rễ tốt hơn nếu làm tối môi

trường nuôi cấy Tuy nhiên Skirvin & Chu (1984) lại nhận thấy ánh sáng đỏ có ảnh hưởng tốt đến sự tạo rễ các giống hoa hồng tỉ muội

 Nhiệt độ: nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ như Begonia và Sreptocarpus cần nhiệt độ thấp để tạo chồi Nhiệt độ

25oC là thích hợp cho nhân chồi cây hoa hồng (Horn, 1992; Carelli & Echeverrigaray, 2002) và cho tạo rễ giống hồng In cv ‘Dainty Dinah’ (Alderson &

ctv., 1988) Tuy nhiên, Rahman & ctv (1992) cho rằng ở nhiệt độ 28oC là tối ưu

cho tạo rễ in vitro chồi cây hoa hồng

1.2.4 Các giai đoạn vi nhân giống

Vi nhân giống được chia thành 4 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng Giai đoạn 0 là giữ cây trong nhà lưới; giai đoạn 1 là khử trùng mẫu cấy; giai đoạn 2 là nhân nhanh; giai đoạn 3 là kéo dài chồi, tạo rễ cho chồi và tiền thuần dưỡng; giai đoạn 4 là thuần dưỡng Trong đó, giai đoạn 2 là giai đoạn quyết định số lượng cây có thể tạo ra Sự thành công ở giai đoạn này tùy thuộc vào sự kích thích chồi bất định hay là sự phát triển chồi bên và còn tùy thuộc vào số lần cấy chuyền, hệ số nhân giống, môi trường chung quanh Sự thành công của vi nhân giống phụ thuộc vào tất cả các giai đoạn (Debergh & Read, 1991)

Giai đoạn 0: sự chuẩn bị cây mẹ

Cây sử dụng để lấy mẫu cấy được gọi là cây mẹ hay cây gốc, là cây được sử dụng như một nguồn cung cấp mẫu nuôi cấy và được chọn theo kiểu hình mong muốn Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống Cây mẹ phải sạch bệnh, được bón phân và phun thuốc trừ sâu bệnh chu đáo Thường điều kiện của cây mẹ đòi hỏi phải:

- Được cung cấp đủ dinh dưỡng

- Sạch bệnh

- Thời gian lấy mẫu, tùy theo loại cây (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Thời gian tăng trưởng của cây trong năm có ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy Các thay đổi về nhiệt độ, chiều dài ngày, cường độ ánh sáng và lượng nước tưới trong năm sẽ ảnh hưởng đến lượng carbohydrate, protein và các cơ chất tăng trưởng trong cây mẹ và như thế sẽ ảnh hưởng đến sự đáp ứng của mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy Thường thời điểm lấy mẫu tốt nhất là vào đầu mùa sinh trưởng, lúc sáng sớm khi toàn cây vẫn còn ở trạng thái căng trương (Nguyễn Đức Lượng & Lê

Thị thủy Tiên, 2002; Vũ Văn Vụ & ctv., 2006)

Ở giai đoạn này chưa thực hiện sự nhân giống nên thường không được kể vào các giai đoạn trong vi nhân giống Tuy nhiên, lựa chọn cây mẹ cũng là một bước rất quan trọng vì có thể hạn chế sự nhiễm bệnh, góp phần vào sự thành công của quy trình vi nhân giống

Giai đoạn I (Nuôi cấy vô trùng)

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân

giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro Để khử trùng mô thực vật, người ta thường dùng

một số hóa chất như: HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2… và tùy thuộc vào từng loại

mô thực vật mà chọn loại, nồng độ và thời gian xử lý hóa chất thích hợp (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Theo Lâm Ngọc Phương (2009) để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của hóa chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30 giây trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý với dung dịch diệt khuẩn Đồng thời người

ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotolfo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn

Để chọn lọc mẫu vật thích hợp trong nuôi cấy khởi đầu cần lưu ý 4 điểm sau:

- Chọn loại cơ quan và vị trí mẫu ở cây

- Tuổi và tình trạng sinh lý tối ưu của cơ quan

- Mùa thích hợp đề lấy mẫu vật

- Phẩm chất của cây để lấy mẫu vật

Tỷ lệ vô trùng thành công phụ thuộc vào thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng mẫu phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và

vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị thủy Tiên, 2002)

Salehi & Khosh-Khui (1997) cho rằng nếu khử trùng kết hợp sử dụng thêm chất kháng sinh (gentamycin, ampicillin, tetracyclin hoặc amoxicillin) sẽ cho tỷ lệ mẫu sạch cao hơn Tùy theo loại mẫu cấy và loại kháng sinh mà các kháng sinh sẽ được sử dụng với nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau Thường các mẫu cấy

sẽ được nhúng vào dung dịch kháng sinh ở nồng độ thích hợp vào lúc trước khi tiến

Sau khi khử trùng, mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất hai lần vô trùng trong điều kiện vô trùng để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn thương phải được cắt bỏ đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp Mẫu cấy sau đó được đặt vào môi trường khoáng có bổ sung vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp nhất với sự tăng trưởng của mẫu cấy và loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị thủy Tiên, 2002)

Nếu như mẫu bị nhiễm thì sẽ dễ dàng nhận ra sau 3-5 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy Còn nếu như tình trạng nhiễm xuất hiện sau 10 ngày thì hoặc là mẫu bị nhiễm bên trong hoặc do có kiến hay rận hiện diện trong phòng nuôi làm lây lan nguồn gây nhiễm Trong trường hợp này thì vùng bị nhiễm sẽ không nằm trên mẫu cấy mà xuất hiện ở vị trí vết cắt của mẫu nằm ngập trong môi trường hoặc trên bề mặt môi trường (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị thủy Tiên, 2002; George, 1993)

Giai đoạn II (giai đoạn nhân giống)

Đây là giai đoạn sống còn của một quy trình vi nhân giống Nguyễn Xuân Linh (1998) cho rằng toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng chỉ nhằm

mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất Theo Pati và ctv (2006), sự thành công của

một quy trình vi nhân giống phần lớn phụ thuộc vào tỷ lệ và kiểu nhân chồi

Giai đoạn này là quá trình kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng (chồi chính, chồi bên) Có nhiều kiểu để gia tăng tốc độ nhân như cấy mắt, cấy đỉnh sinh trưởng Trong kỹ thuật cấy mắt có hai kiểu tạo chồi, một kiểu tạo chồi từ mẫu cấy chỉ có một mắt, hoặc mẫu cấy nhiều mắt Cả hai kiểu đều tạo ra số chồi nhiều và hệ số nhân tùy thuộc vào các đoạn chồi tạo thành Phương pháp này cũng giống như phương pháp giâm cành cổ điển nhưng nó khác hơn ở chỗ được

thực hiện trong điều kiện in vitro và mẫu cấy phải đảm bảo là mẫu sạch bệnh

(Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giai đoạn nhân chồi: loài/kiểu gen; môi trường nuôi cấy; các muối vô cơ và các hợp chất hữu cơ; carbohydrate; các chất điều hòa sinh trưởng thực vật; trạng thái của môi trường; các yếu tố sinh lý như ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ bình nuôi cấy, CO2,… Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), để tăng hệ

số nhân thường phải thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin,…) và các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ,

ánh sáng phù hợp Tuy nhiên, tùy thuộc vào đối tượng nuôi cấy, biện pháp nhân nhanh mà có thể bằng cách kích thích sự hình thành cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành)

Benzyl adenine (BA) là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật như nhân nhanh chồi hoa cẩm chướng (môi trường MS +

BA 2 mg/l), nhân chồi cây hương nhu (môi trường chứa ½MS + BA 3 mg/l) (Nguyễn Văn Uyển, 1993),… và cũng được đề nghị sử dụng để nhân chồi cho nhiều giống hoa hồng khác nhau

Giai đoạn III (giai đoạn tạo rễ và phát triển)

Mục đích của giai đoạn này là chuẩn bị cho cây con sẵn sàng cho sự ra ngoài

Nó bao gồm việc ra rễ, phát triển cây con, cũng như tạo sự cứng cỏi cho chúng đối với những xáo trộn sau này Phương pháp nhân giống vô tính trong ống nghiệm có hiệu quả khi có được tỉ lệ cây con sống tốt cao sau khi ra khỏi giai đoạn nuôi cấy vô trùng và chuyển trồng nơi vườn ươm Việc cấy chuyền cuối cùng được tiến hành nhằm giúp cho sự sinh trưởng và tạo rễ Có thể lợi dụng giai đoạn này để huấn

luyện cây và chuẩn bị cho chúng bước vào giai đoạn in vivo (Lâm Ngọc Phương,

2009)

Giai đoạn IV (giai đoạn thuần dưỡng)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) mục đích của giai đoạn này là làm giảm tối

thiểu chết cây con, khi chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng

Trong giai đoạn này các yếu tố cần được quan tâm là:

- Tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng

- Các yếu tố về môi trường như nhiệt độ, ẩm độ và ánh sáng của nơi thuần dưỡng hoặc tình trạng cây con trong bình cấy

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết

định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Mục đích của giai đoạn này là làm giảm tối thiểu sự chết cây con khi chuyển từ trong ống nghiệm ra ngoài nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng Trong giai đoạn này các yếu tố cần được quan tâm là: (1) tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng, (2) các yếu tố về môi trường như nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng của nơi thuần dưỡng hoặc tình trạng cây

con trong bình nuôi cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Theo Pati và ctv (2006), việc

môi trường vào khảng 52%, sẽ giúp giảm thiểu sự nhiễm bệnh của các cây con; hơn nữa, việc tạo một môi trường thuần dưỡng giàu khí carbonic (CO2) cũng làm tăng khả năng sống sót cho cây con

Theo Nguyễn Đức Thành (2000), trong một số trường hợp khi đưa cây con ra khay ươm không nhất thiết là cây phải có rễ, nhưng nhất thiết cây phải được nuôi trên môi trường tạo rễ ít nhất 2 tuần Trong những ngày đầu cần che nắng và tưới nước vừa phải để giữ cho đất ẩm Cây hoa hồng nuôi cấy mô khi trồng thường nhanh chóng cho hoa nhưng hoa bé, phải từ năm thứ hai mới cho hoa bình thường

1.2.5 Phương pháp vi nhân giống

Phương pháp nhân chồi bên

Chồi nách hay chồi bên có cấu tạo giống chồi ngọn, cành bên cùng lớn lên bởi phần đỉnh ngọn của nó và mỗi cành bên cũng được tận cùng bằng một chồi ngọn Trong nách lá thường có thể có hai, ba hoặc nhiều hơn các chồi nách sắp xếp theo hướng ngang hoặc thẳng đứng (Hà Thị Lệ Ánh, 2005)

Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi ngọn được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin

ở nồng độ cao Vai trò cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển Các chồi bên này có thể tiếp tục chuyển sang môi trường mới

bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục được tạo ra (Nguyễn Đức Lượng

& Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Ưu điểm của phương pháp này:

- Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp nhân giống khác

- Tốc độ nhân giống cao

- Sản phẩm ổn định về mặt di truyền

- Cây con tăng trưởng rất tốt, có lẽ là do đã được trẻ hóa

- Đối với một số loại cây, số lần cấy chuyền càng nhiều thì nhu cầu cytokinin càng giảm là do cây đã quen với cytokinin và mô đã được trẻ hóa (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành chồi bên