KHẢO sát KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME CHITINASES và β 1,3 GLUCANASE của các CHỦNG nấm trichodermaspp được sưu tập tại ĐỒNG BẰNG SÔNG cửu LONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Chứng nhận đã chấp thuận luận văn với đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME CHITINASES VÀ β β-1,3-G

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ÐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

PHẠM HỒNG THI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME CHITINASES

VÀ ββββ-1,3-GLUCANASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC KHÓA 29

(2003 - 2008)

Cần Thơ, 02 – 2008

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ÐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

PHẠM HỒNG THI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME CHITINASES

VÀ ββββ-1,3-GLUCANASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Chứng nhận đã chấp thuận luận văn với đề tài:

“KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME CHITINASES VÀ

β

β-1,3-GLUCANASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM Trichoderma spp

ĐƯỢC SƯU TẬP TẠI ĐỒNG BẲNG SÔNG CỬU LONG”

Do sinh viên: PHẠM HỒNG THI thực hiện và đề nạp

Kính trình hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp xem xét

Cần Thơ, ngày … tháng năm 2008

Cán bộ hướng dẫn

Th.s DƯƠNG MINH Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn với đề tài:

“KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME CHITINASES VÀ

β

β-1,3-GLUCANASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM Trichoderma spp

ĐƯỢC SƯU TẬP TẠI ĐỒNG BẲNG SÔNG CỬU LONG”

Do sinh viên: PHẠM HỒNG THI thực hiện và bảo vệ trước hội đồng ngày…

tháng… năm 2008 Luận văn đã được hội đồng chấp thuận và đánh giá ở mức:………

Ý kiến hội đồng: ………

………

………

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2008 DUYỆT KHOA Chủ tịch hội đồng

Trưởng khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

iv

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Sinh viên: PHẠM HỒNG THI

Sinh ngày 21 tháng 9 năm 1985

Tại xã Hiếu Thành, huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long

Con Ông: PHẠM HOÀNG CHUẨN

Và Bà: HUỲNH ANH THƠ

Đã tốt nghiệp tại trường Trung học Phổ thông Hựu Thành, huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long, năm 2003

Vào trường Đại học Cần Thơ năm 2003, theo học Ngành Nông Học, khóa 29

Tốt nghiệp Kỹ sư Nông Nghiệp chuyên ngành Nông Học năm 2008

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Chân thành cảm tạ thầy Cố vấn học tập Ngô Thành Trí, cùng toàn thể quý thầy cô khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng vì những kiến thức mà quý thầy cô đã truyền đạt cho em trong suốt thời gian học tập tại trường Đây sẽ là hành trang vững chắc giúp em bước vào đời

Xin gửi lời cảm tạ đến:

- Chị Đào Thị Hồng Xuyến, các anh chị trong Bộ môn Bảo vệ Thực vật đã đóng góp những ý kiến quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

- Các bạn cùng khóa, đặc biệt là bạn Dương Phạm Minh Châu Xin cảm ơn sự hỗ trợ và động viên của các bạn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vi

Phạm Hồng Thi, 2007 “Khảo sát khả năng tiết enzyme chitinases và βββ-1,3-glucanase

của các chủng nấm Trichoderma spp được sưu tập tại đồng bằng sông Cửu Long”

Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC

Đề tài “Khảo sát khả năng tiết enzym chitinases và β-1,3-glucanase của các

chủng Trichoderma spp được sưu tập tại đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện

từ tháng 9/2007 đến tháng 2/2008 nhằm chọn lọc các chủng nấm Trichoderma spp có

khả năng tiết nhiều enzyme chitinases và β-1,3-glucanase cao trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả đạt được sẽ góp phần hữu ích trong chiến lược phòng trừ bệnh hại cây trồng theo hướng sinh học ở đồng bằng sông Cửu Long trong tương lai

Đề tài gồm hai thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm tại bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, đại học Cần Thơ từ tháng 9/2007 đến tháng 2/2008 Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại

Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tiết enzyme chitinases của các chủng

Trichoderma spp Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường TSM lỏng với 11 chủng

nấm Trichoderma BM2a, LV1a, OM2a, CB1b, CB3a, CB8a, CB8c, CB8d, T-CB10a, T-CB10b và T-CB11c và một chủng nấm Fusarium solani F-OM2 làm

T-cơ chất so với chitin Nấm F solani (106 bào tử/ml) được nuôi lắc (140 vòng/phút) trước

3 ngày, sau đó chủng nấm Trichoderma (106 bào tử/ml) và lắc tiếp 7 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng

Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của các chủng

Trichoderma spp Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường TSM lỏng với 10 chủng

nấm Trichoderma BM2a, CB8c, CB10b, CB11c, CTTG2e, CTTG6b, CTTG7d, T-CTTG8c, T-CTTG9e, T-CTTG10a và một chủng nấm Phytophthora palmivora P-CL2 làm cơ chất so với β-1,3-glucan Nấm P palmivora (106 bọc bào tử/ml) được nuôi lắc (140 vòng/phút) trước 3 ngày, sau đó chủng nấm Trichoderma (106 bào tử/ml) và lắc tiếp 7 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng

T-Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vii

Dịch trích các mẫu thí nghiệm được lọc qua giấy Whatman No5, trữ ở 40C và ước lượng hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (1976) và khảo sát hoạt tính của các enzyme chitinases và β-1,3-glucanase theo phương pháp của Isaac và Gokhale (1982)

Kết quả thí nghiệm cho thấy:

- Chitin là cơ chất giúp nấm Trichoderma gia tăng sinh khối và khả năng tiết enzyme chitinases tốt hơn khuẩn ty nấm F solani

- Sinh khối khô của nấm Trichoderma đạt được cao nhất khi được nuôi trong môi

trường TSM lỏng-chitin sau 7 ngày nuôi lắc

- Bốn chủng nấm T-BM2a, T-OM2a, T-CB1b và T-CB8a tiết nhiều enzyme chitinases nhất

- Việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy bằng β-1,3-glucan hoặc nấm P palmivora không giúp gia tăng sinh khối khô của các chủng nấm Trichoderma trong thí nghiệm, tuy

nhiên lại giúp tăng khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase β-1,3-glucan là cơ chất giúp nấm

Trichoderma tiết nhiều enzyme β-1,3-glucanase hơn so với nấm P palmivora

- Khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của các chủng CTTG10a, BM2a, CB8c, T-CB10b, T-CB11c và T-CTTG9e tốt nhất sau 7 ngày nuôi lắc

T Chủng nấm Trichoderma TT CB8c có khả năng tiết cả hai loại enzyme chitinases

và β-1,3-glucanase khá cao trong cả hai thí nghiệm

Từ kết quả này, các chủng Trichoderma có triển vọng (T-LV1a, T-OM2a, T-CB1b

và T-CB8c đối với nấm đối nấm bệnh có vách tế bào chứa chitin; T-CTTG10a, T-BM2a, T-CB8c, T-CB10b, T-CB11c và T-CTTG9e đối với nấm bệnh có vách tế bào chứa glucan)

sẽ tiếp tục được thử nghiệm trong các điều kiện nhà lưới và ngoài đồng để đánh giá khả năng đối kháng với nấm bệnh và chọn lọc ra được những chủng hiệu quả nhất phục vụ công tác phòng trừ bệnh hại theo hướng sinh học trong tương lai

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái học của nấm Trichoderma 3

1.1.2 Cơ chế tiết enzyme và khả năng đối kháng của nấm Trichoderma

1.1.3 Vai trò của nấm Trichoderma trong phòng trừ sinh học bệnh cây trồng 7

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tiết enzyme chitinases của các

* Ước lượng hàm lượng protein trong mẫu dịch trích 13

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của

* Ước lượng hàm lượng protein trong mẫu dịch trích 16

3.1 Khả năng tiết enzyme chitinases của các chủng nấm Trichoderma spp

3.1.2.2 Khả năng tiết enzyme chitinases của các chủng nấm Trichoderma 20

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

ix

3.2 Khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của các chủng nấm Trichoderma

3.2.2.2 Khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của các chủng nấm

x

DANH SÁCH BẢNG

1 Sinh khối khô (g/lít) của các chủng nấm Trichoderma trong môi

trường TSM lỏng có/không thêm chitin và F solani khác nhau

sau 7 ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2007 - 2008)

19

2 Độ hấp thu (ODabs) của enzyme chitinases trong các dịch trích có

chủng các chủng nấm Trichoderma khác nhau sau 7 ngày nuôi lắc

(Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2007 - 2008)

21

3 Sinh khối khô (g/lít) của các chủng nấm Trichoderma trong

môi trường TSM lỏng có/không thêm β-1,3-glucan và P

palmivora khác nhau sau 7 ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2007 - 2008)

23

4 Độ hấp thu (ODabs) của enzyme β-1,3-glucanase trong các dịch

trích có chủng các chủng nấm Trichoderma khác nhau sau 7

ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2007 - 2008)

24

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

xi

DANH SÁCH HÌNH

3 Chuẩn bị mẫu đo độ hấp thu (ODabs) của protein và enzyme chitinases và

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1

MỞ ĐẦU

Theo Phạm Văn Kim (2000) có khoảng hơn 100.000 loài nấm tồn tại trong đất

và trong trồng trọt, nấm là nhóm vi sinh vật gây bệnh quan trọng nhất Việc áp dụng các biện pháp phòng trừ bằng nông dược trong thời gian dài làm mất đi sự đa dạng sinh học và sự cân bằng sinh thái, có rất nhiều loài nấm có khả năng kháng thuốc đã được ghi nhận Mặt khác, việc sử dụng thuốc không đúng liều, đúng lúc và không đúng biện pháp đã gây ô nhiễm môi trường, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật vượt quá mức cho phép trên nông sản gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người sản xuất cũng như người tiêu dùng (Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Tuy nhiên, bên cạnh các loài nấm gây hại cho cây trồng, trong tự nhiên cũng

có sự hiện diện của một số loài nấm thiên địch, trong đó có nấm mốc xanh

Trichoderma spp có khả năng đối kháng được với nhiều loại nấm bệnh như

Rhizoctoni, Fusarium, Phytophthora , Pythium…(Wells, 1993, trích từ Nguyễn Thị Ngân, 2007, Nguyễn Thế Quyết và ctv., 2003) Nấm Trichoderma có nhiều cơ chế

để kiểm soát bệnh hại thực vật như là cạnh tranh dinh dưỡng, ký sinh, tạo chất kháng sinh hay tiết các enzym thủy phân vách tế bào ký chủ như: chitinases, β-1,3-glucanase… (Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng, 2003), kích thích cây trồng tăng khả năng kháng bệnh hoặc kết hợp đồng thời các khả năng trên (Vazque- Garciduenas và ctv., 1998, Ait-Lahsen và ctv., 2001, trích từ Nguyễn Thị Ngân, 2007), trong đó hoạt động của hai enzym chitinases và β-1,3-glucanase có vai trò

quan trọng trong quan hệ ký sinh giữa Trichoderma và nấm bệnh (Cruz và ctv.,

1995, Margolles Clark và ctv., 1995, Muhammad và Asuma., 2003, trích từ Nguyễn Thị Ngân, 2007)

Trước những triến vọng mà nấm Trichoderma mang lại, việc nghiên cứu và

ứng dụng loài nấm thiên địch này trong phòng trừ bệnh hại cây trồng là điều rất cần

thiết Trên cơ sở đó đề tài “Khảo sát khả năng tiết enzym chitinases và

β-1,3-glucanase của các chủng nấm Trichoderma spp được sưu tập tại đồng bằng sông Cửu Long” nhằm chọn lọc các chủng nấm Trichoderma spp có khả năng tiết

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2

nhiều enzyme chitinases và β-1,3-glucanase cao trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả đạt được sẽ góp phần hữu ích trong chiến lược phòng trừ bệnh hại cây trồng theo hướng sinh học ở đồng bằng sông Cửu Long trong tương lai

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3

CHƯƠNG 1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 NẤM TRICHODERMA

1.1.1 Ðặc điểm phân loại và hình thái học của nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm Bất Toàn (Deuteromycetes),

bộ nấm Bông (Moniliales), họ Moniliaceae và chi Trichoderma (Vũ Triệu Mân và Lê

Lương Tề, 1998) Nấm này có giai đoạn sinh sản hữu tính thuộc lớp Ascomycetes, bộ Hyporcaelos và chi Hypocrea (Agrios, 1997)

Nấm Trichoderma phân bố khắp nơi trên thế giới và thường chiếm ưu thế

trong thành phần vi sinh vật đất Chúng có thể sống trong đất, trên xác bã thực vật (Gams và Bissett, 1998) Nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển của hầu hết các

loài nấm Trichoderma là 25 - 300C (Klein và Eveleigh, 1998; Lại Văn Ê,

2003) Theo Kubicek-Pranz (1998), những loài Trichoderma có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới (như T citrinoviride) sẽ có khoảng nhiệt độ tối hảo cao hơn những loài có nguồn gốc ôn đới (như T polysporum và T viride)

Ở giai đoạn phát triển đầu, khuẩn lạc của Trichoderma có màu trắng nếu được nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng như PDA (Potato Dextrose Agar) và trong suốt nếu được nuôi trên môi trường corn meal dextrose agar (CMA) Trong quá trình phát triển nấm thường tiết sắc tố vàng vào môi trường nuôi cấy, nhất là khi được nuôi cấy trên môi trường PDA (McCray, 2002)

Bào tử của nấm Trichoderma thường mọc thành chùm, ban đầu có màu trắng

sau chuyển thành màu xanh (Cook và Baker, 1989) Bào tử nấm thường có hình bầu dục, kích thước (3 - 5) x (2 - 4) µm (dài/ngang ≥ 1,3), vách trơn láng hoặc sù sì

(McCray, 2002) Tất cả các loài Trichoderma đều có khả năng sinh bào tử áo

(chlamydospore) Bào tử áo có hình cầu méo và đa số tồn tại ở dạng đơn bào (Papavizas, 1985; McCray, 2002)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

4

1.1.2 Cơ chế tiết enzyme và khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với

nấm bệnh gây hại cây trồng

Chitin và β-1,3-glucan là những thành phần cấu trúc của vách tế bào nấm, trừ lớp nấm Oomycetes, chứa chủ yếu là β-1,3-glucan và cellulose (Cruz và ctv., 1995a, 1995b; Inglis và Kawchuck, 2002)

Theo Chet và ctv (2006) thì với vai trò là tác nhân phòng trừ sinh học bệnh cây trồng, nấm Trichoderma vừa có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển

của nấm bệnh thông qua hiện tượng ký sinh (mycoparasitism), vừa có thể kích thích

tính kháng bệnh của cây Các chủng Trichoderma có thể ký sinh trên nhiều loại nấm bệnh quan trọng như Sclerotium rolfsii, Fusarium spp., Pythium, Macrophomiana, Botrytis cenerea , Rhizoctonia solani (Harman, 1996; Agrios, 1997)

Cơ chế ký sinh lên nấm bệnh của Trichoderma khá phức tạp và bao gồm nhiều giai đoạn Ở giai đoạn đầu của sự ký sinh, Trichoderma có khuynh hướng tiến

nhanh về phía ký chủ Khi đã tiếp xúc với ký chủ chúng sẽ cuộn xung quanh sợi nấm ký chủ và thành lập cấu trúc giống lưỡi câu để bám chặt vào vách tế bào ký chủ Cuối cùng chúng làm thủng màng ngoài và đâm xuyên qua các lớp tế bào của

ký chủ bằng cách tiết ra các enzyme (Chet và ctv., 2006) Theo ghi nhận của Marco

và ctv (2002), Kredics và ctv (2003), nấm Trichoderma có khả năng sản sinh nhiều

loại enzyme như glucanases, chitinases (endo-/exochitinase, glucosaminidase), lipases, proteases… Những enzyme này hoạt động rất mạnh và có thể ức chế sự phát triển của nấm bệnh trong suốt quá trình ký sinh mà không gây ra những tác động xấu đến cây trồng

Trong số các enzyme được tiết ra từ nấm Trichoderma thì chitinases và glucanases đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động ký sinh của nấm Trichoderma

Do vách tế bào của hầu hết các loài nấm đều được cấu tạo bởi chitin và glucan nên tác động đồng thời của endochitinase và glucanase lên vách tế bào nấm bệnh sẽ làm

tăng khả năng đối kháng của Trichoderma (Margolles-Clark và ctv., 1995)

Nghiên cứu của Cruz và ctv (1995a) cho biết enzyme chitinases do T harzianum tiết ra có khả năng chống lại nấm Venturia inaequalis gây bệnh trên cây

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

5

táo và ảnh hưởng mạnh mẽ lên quá trình mọc mầm của bào tử nấm Botrytis cinerea Ngoài ra, enzyme cellulases do nấm Trichoderma tiết ra cũng có thể làm mềm vách

tế bào của nấm gây bệnh

Enzyme β-1,6-glucanase được phân lập từ T harzianum giúp kiềm hãm sự phát triển của sợi nấm B cinerea và Gibberella fujikuroi Đặc biệt hiệu quả kiềm

hãm tăng lên khi nó kết hợp với các enzyme thủy phân khác (Cruz và ctv., 1995a, 1995b) Khi kết hợp hai enzyme glucan β-1,3-glucosidase và endochitinase sẽ ngăn cản quá trình tăng trưởng của nhiều loại nấm thuộc nhóm Ascomycetes trong nuôi cấy, thêm vào đó chúng còn có hiệu quả cao trong việc ngăn cản sự nảy mầm của bào tử nấm bệnh hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margo-Clark và ctv., 1995; Elad,

2000, trích từ Nguyễn Kim Thu, 2004) Ngoài ra, β-1,3- glucanase kết hợp với chitinases hoặc những đồng dạng khác nhau của chitinases có hoạt tính chống nấm trong in vitro (Simmons, 1994, trích từ Chu Vũ Trang Anh và Dương Thúy Hằng, 2006) Tác giả nhận thấy, khi kết hợp enzyme chitinases với enzyme β-1,3-glucanase ức chế được 15 trên 18 loài nấm bệnh trên đậu Hà Lan

Kết quả thí nghiệm của Thrane và ctv (1997) cho thấy enzyme glucanase (1,3-(1,3;1,4)-D-Glucan 3(4)-glucanohydrolase, trọng lượng phân tử 17 KDalton, điểm đẳng điện pI = 5,0) và hai enzyme cellulase (1,4-(1,3;1,4)-D-Glucan 4-glucanohydrolase, trọng lượng phân tử lần lượt là 40 và 45 KDalton, điểm đẳng điện của chúng là pI = 6,4 và 7,6) của chủng nấm T harzianum Rifai T3 được hình

endo-1,3-thành trong môi trường nuôi cấy khi có sự hiện diện của nấm Pythium ultimum gây

chết cây con dưa leo Hai enzyme này có khả năng ức chế sự nẩy mầm bào nang

(cyst) của động bào tử và sự kéo dài ống mầm của P ultimum

Theo Vazquez-Garciduenas và ctv (1998), nấm Trichoderma thường sản sinh

nhiều enzyme như glucanases, chitinases và proteases khi được nuôi trong môi

trường có bổ sung cả thể hệ sợi và vách tế bào nấm ký chủ Một số chủng

Trichoderma được phân lập đã sản xuất ra nhiều enzyme như chitinases, 1,3 và 1,6-glucanases có khả năng phân hủy vách tế bào của nhiều loài nấm bệnh (Kullnig

β-và ctv., 2000; Cruz β-và ctv., 1995a, 1995b; Soler β-và ctv., 1999; Ait-Lahsen β-và ctv.,

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

6

2001) Vì vậy, các loài Trichoderma spp có tiềm năng phòng trừ sinh học bệnh hại

cây trồng rất lớn (Cruz và ctv., 1995a, 1995b)

Enzyme β-1,3-glucanase được phân lập từ loài T harzianum cũng có khả năng

ức chế sự nẩy mầm của động bào tử và kiềm hãm sự phát triển sợi nấm của

Phytophthora capsici trong điều kiện phòng thí nghiệm (Ahmed và ctv., 1999)

Nấm T harzianum thường tiết ra enzyme α-1,3-glucanase khi được thêm

polysaccharides và nó có thể phá hủy vách tế bào của nhiều nấm gây bệnh khác nhau như

Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Collectotrichum acutatum, Fusarium oxysporum, Penicillium aurantiogriseum, hoặc Rhizoctonia solani (Ait-Lahsen và ctv., 2001)

Khảo sát tác động của enzyme chitinases và cellulases của nấm T harzianum lên nấm Sclerotium rolfsii, Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (2003) nhận thấy hàm lượng glucose và glucosamine được tạo ra ở các nghiệm thức có chủng S rolfsii nhiều hơn so với đối chứng (không chủng S rolfsii) Kết quả này được giải thích là

do các enzyme chitinases và cellulases mà nấm T harzianum tiết ra đã tác động lên

vách tế bào của nấm bệnh, làm nhăn nheo, biến dạng, phá vỡ vách tế bào và tạo ra lượng đường trên Đồng thời, khi sử dụng chitin vỏ tôm hoặc chitin của vách tế bào

nấm làm cơ chất thì nhận thấy khả năng tạo enzyme chitinases của T harzianum tăng lên Ngoài ra, khả năng tiết cellulases của nấm này cũng tăng khi sử dụng cơ chất là

CMC hoặc bột cellulose (Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Nghĩa (2007) cho thấy việc bổ sung thêm

CMC, β-1,3-glucan và nấm Phytophthora palmivora vào môi trường TSM lỏng để nuôi cấy các chủng nấm Trichoderma T-BM2a, T-CB8c, T-CTTG6b, T-OM9e, T-

TN1d và T-CLBT1b đã giúp tăng cường khả năng tạo sinh khối khuẩn ty Đặc biệt, chủng nấm T-CTTG6b phát triển tốt nhất và cho sinh khối cao nhất khi được bổ sung thêm CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) Các chất CMC và β-1,3-glucan, nấm

P palmivora đều góp phần giúp tăng khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của sáu

chủng nấm Trichoderma BM2a, CB8c, CTTG6b, OM9e, TN1d và

T-CLBT1b Riêng chủng T-BM2a vẫn có khả năng tiết nhiều enzyme β-1,3-glucanase

dù có hay không thêm vào các cơ chất Chất β-1,3-glucan tỏ ra có hiệu quả nhất so Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

7

với CMC và nấm P palmivora trong việc kích thích các chủng nấm Trichoderma

tiết ra enzyme β-1,3-glucanase

Bên cạnh khả năng đối kháng hiệu quả, nấm Trichoderma còn có thể tấn công

nấm gây hại bằng nhiều cách khác: Sản xuất chất kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng, sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào, kích thích cây trồng tăng khả năng kháng bệnh hoặc kết hợp đồng thời những khả năng trên (Vazquez-Garciduenas và ctv., 1998; Ait-Lahsen và ctv., 2001) Theo Schneider (1982), cách tốt nhất để ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh là giới hạn nguồn dinh dưỡng trong đất Khi trong đất không có dinh dưỡng dư thừa thì mầm bệnh không thể phát triển tốt, thậm chí chúng sẽ suy yếu dần Điều này cho thấy sự canh tranh dinh dưỡng giữa các loài

nấm ký sinh như Trichoderma spp và các vi khuẩn có ích sống gần rễ với nấm bệnh

cũng là một nhân tố quan trọng để khống chế nguồn bệnh trong đất

Sự hiện diện của nấm Trichoderma cũng giúp cây trồng tăng khả năng đề kháng với nhiều loài nấm bệnh (Calderon và ctv., 1993) Theo Yedidia và ctv (2001), sau khi ký sinh lên rễ cây trồng Trichoderma sẽ xâm nhập vào mô cây, kích

thích một chuỗi thay đổi về hình thái và sinh hoá trong cây như sự thay đổi cấu trúc polymer của lignin và hydroxyproline làm gia tăng nồng độ chất hữu cơ trong vách

tế bào cây chủ, gia tăng khả năng sản xuất hormone, tăng khả năng tiết ra các phytoalecxin của cây tại nơi bị tổn thương để tiêu diệt các tế bào nấm gây bệnh hoặc tạo ra các enzyme để phân hủy các tế bào nấm bệnh làm gia tăng sức đề kháng

và tăng khả năng đối kháng của cây đối với nấm bệnh

Khi định cư trên rễ cây trồng, nấm Trichoderma còn kích thích sự sinh trưởng

và phát triển của cây trồng, làm gia tăng số lượng rễ, giúp rễ phát triển khỏe, tỏa rộng

và ăn sâu vào đất, tăng sự thành lập rễ mới qua đó làm gia tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng sức đề kháng với các nhân tố gây stress, thúc đẩy mạnh mẽ hoạt động

phòng vệ của cây và làm giảm khả năng nhiễm bệnh (Newsham và ctv., 1995)

1.1.3 Vai trò của nấm Trichoderma trong phòng trừ sinh học bệnh cây trồng

Nhờ khả năng phân hủy được chitin của vách tế bào nấm bệnh đồng thời sản xuất ra glucosamine (đơn phân của phân tử chitin) làm nền tạo chất kích kháng Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

8

bệnh cho cây trồng, các chủng Trichoderma được sử dụng như một tác nhân đối kháng hiệu quả với nấm F solani gây hại cây trồng (Lafontaine và Benhamou,

1996; Sathiyabama và Balasubramanian, 1998)

Các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả trong và ngoài nước cho thấy

nấm đối kháng Trichoderma đã chứng tỏ khả năng ứng dụng tốt để phòng trị một số bệnh trên cây trồng như:bệnh thối trái chuối sau thu hoạch (do Lasiodiplodia theobromae) (Mortuza và Ilag, 1999), bệnh thối củ khoai mỡ (Okigbo và

Ikediugwu, 2000), bệnh thối trái (Botryodiplodia theobromae), bệnh thán thư (Colletotrichum gloeosporioides) và đốm nâu (Gliocephalotrichum microchlamydosporum) trên trái chôm chôm (Sivakumar và ctv., 2000), bệnh loét

trên cây táo (Valsa mali)(Kenxiang và Xiaoguang, 2001), bệnh chết héo cây con trên ớt, cà tím, cúc giấy (zinnia), dưa leo và cải bắp (do nấm Rhizoctonia solani) (Lewis và Lumsden, 2001), bệnh thối gốc hành (Sclerotium cepivorum) (Metcalfa

và Wilson, 2001), bệnh thối rễ cam quít (nấm Fussarium solani), gây bệnh chảy nhựa gốc, thân cành, nhánh và thối trái sầu riêng (do nấm Phytophthora palmivora), bệnh mốc hồng cam quít (Corticium salmonicolor) (Dương Minh và ctv., 2001, 2003a, 2003b, 2004, 2005, 2006) T.virens và T hamatum làm giảm bệnh héo do Fusarium một cách có ý nghĩa so với đối chứng từ 30 -65% (Larlin và ctv., 1998, trích từ Nguyễn Kim Thu, 2005)

Enzyme endochinase do T harzianum tiết ra giúp cây thuốc lá và cà chua chống chịu tốt với các loại nấm bệnh thuộc lớp Ascomycetes như Alternaria alternata , A solani, Botrytis cinerea và nấm Rhizoctonia thuộc lớp nấm đảm (Lorito và ctv., 1994) Việc sử dụng T harzianum trên lô đất trồng đậu bị nhiễm nấm Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani đã làm giảm được thiệt hại do nấm S rolfsii từ 25% xuống còn 10% và R solani từ 13% còn 7,5% (Elad và ctv., 1980)

T harzianum cũng được dùng để trộn chung với hạt giống trước khi gieo nhằm làm

giảm thiệt hại của bệnh héo cây con do nấm R solani (Phạm Văn Kim, 2000) Tương tự, hai chủng T viride và T polysporum được sử dụng rộng rãi trong việc phòng trừ bệnh thối trái

dâu tây trước và sau thu họach (Tronsmo và Dennis, 1977, trích từ Papavizas, 1985)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

9

Hoạt động của các enzyme protease, NAGase, muramidase… cũng giúp

Trichoderma đối kháng tốt với nhiều lọai vi khuẩn gây hại (Kredics và ctv., 2003)

T viride tiết cellulase làm tăng phản ứng phòng vệ (phản ứng siêu nhạy cảm) trên

cây nho (Calderon và ctv., 1993) Yedidia và ctv (2001) đã tiến hành thí nghiệm trên cây dưa leo con và nhận thấy khi chủng T harzianum lên rễ cây sẽ tạo hiện

tượng kích kháng nhờ hoạt động của peroxidase và chitinases trong cây

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngân (2007) cho thấy nấm Trichoderma

với chủng T-LV1a và T-OM2a có khả năng kích kháng lưu dẫn trên cây con quít Tiều trong điều kiện nhà lưới, giúp cây phục hồi và chống chịu với bệnh thối rễ do

nấm Fusarium solani gây ra

1.2 NẤM FUSARIUM SOLANI VÀ PHYTOPHTHORA PALMIVORA

Nấm Fusarium solani thuộc ngành Mycota, lớp nấm Bất Toàn (Deuteromycetes), bộ nấm Bông (Moniliales), họ Tuberculariaceae, chi Fusarium, loài Fusarium solani (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998; Phạm Văn Kim, 2003) Cấu trúc vách tế bào của nấm Fusarium bao gồm các polysaccharides là β-glucans

(trong đó có cellulose, β-1,3 và β-1,6-glucan) và chitin (Inglis và Kawchuck, 2002)

Nấm Phytophthora thuộc giới Chromista, ngành Oomycota, lớp Oomycetes, bộ Pythiales, họ Pythiaceae, chi Phytophthora (Crop Protection Compendium, 2002)

Theo Springer và Heidelberg (1971), vách tế bào của lớp Oomycetes chứa khoảng 80% polysaccharides, 14% protein, một lượng nhỏ lipid và khoáng Trong đó, polysaccharides phần lớn là glucan (chứa hơn 90%) có nhiều β-1,3 và β-1,6-glucans

và một lượng nhỏ β-1,4-cellulose

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN 2.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 9 đến tháng 12 - 2007

- Địa điểm: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

2.1.2 Vật liệu thí nghiệm

2.1.2.1 Vật liệu thí nghiệm

∗

∗ Thiết bị

- Nồi thanh trùng ướt hiệu Sibata (Nhật), model KL300

- Tủ cấy hiệu Dalton (Nhật), model FAP1300AN

- Cân điện tử: Hiệu Sibata (Nhật), model JPN-200W (trọng lượng tối đa 200 g; sai

số d = 0,01 mg) và hiệu Sartorius (Đức), model BL1500 (trọng lượng tối đa 1500 g; sai

số d = 0,1 g)

- Máy đo pH (hiệu Oaklon)

- Máy ly tâm lạnh (hiệu Hermle Z323K )

- Máy đo quang phổ (Safas UV mC2 spectrometry)

- Máy lắc (hiệu Vortex Stuart SA6, Uk)

∗

∗ Dụng cụ

- Bình tam giác 250 ml và 500 ml

- Đĩa petri đường kính đáy 9,5 cm, nắp 10 cm

- Lamme đếm hồng cầu (haemocytometer) hiệu Malassez (Đức)

∗

∗ Hóa chất

- Bovine serum albumin (Sigma)

- Coomassie Brilliant Blue G250 (Sigma)

- Sodium acetate, sodium carbonate

- Các hóa chất dùng xác định hoạt tính của enzyme: Colloidal chitin (được chuẩn

bị từ chitin Nhật), laminarin (Sigma), KNatartarate (Merck), 3,5-dinitrosalicylic (Sigma), NaOH

- Các hóa chất cần thiết khác: Ethanol, phosphoric acid, NaOH, acetone…

2.1.2.2 Nguồn nấm

- Fusarium solani F-OM2 - Quận Ô Môn, thành phố Cần Thơ

- Phytophthora palmivora P-CL2 - Huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang

- Trichoderma spp.:

+ T-CB1b, T-CB3a, T-CB8a,

T-CB8c, T-CB8d, T-CB10a, T-CB10b, T-CB11c

- Huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang

+ T-CTTG2e, T-CTTG6b, T-CTTG7d,

T-CTTG8c, T-CTTG9e, T-CTTG10a

- Huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang

2.1.2.3 Môi trường nuôi cấy