KHẢO sát KHẢ NĂNG đối KHÁNG của một số CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SP đối với nấm COLLETOTRICHUM SPP gây BỆNH THÁN THƯ TRÊN SEN ởcần THƠVÀ TỈNH ĐỒNG THÁP TRONG điều KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Để nấm có thể xâm nhiễm được vào bên trong mô cây ký chủ và gây bệnh cần phải trải qua các giai đoạn sau: 1 Bào tử phát triển trên bề mặt vết bệnh.. Phòng trừ sinh học nhằm 3 mục đích: l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD

NGUYỄN HUY THẢO

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ

CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SP ĐỐI VỚI NẤM

COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯ

TRÊN SEN Ở CẦN THƠ VÀ TỈNH ĐỒNG THÁP TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

Nguyễn Huy Thảo, 2008 “Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng

Bacillus sp đối với nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên sen ở Cần

Thơ và tỉnh Đồng Tháp trong điều kiện phòng thí nghiệm” Luận văn tốt nghiệp

ngành Nông học, Trường Đại Học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học Ths Phạm Hoàng Oanh

TÓM LƯỢC

Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng của 18 chủng vi khuẩn Bacillus

sp với bốn loài nấm Colletotrichum THTH1, CT, GGB1, THTG4 được bố trí hoàn

toàn ngẫu nhiên với năm lần lặp lại

- Cả bốn loài nấm Colletotrichum spp đều chịu sự tác động của vi khuẩn

Bacillus sp Trong đó loài nấm Colletotrichum CT bị ức chế sự phát triển khuẩn ty

mạnh nhất với bán kính vòng vô khuẩn trung bình là 4,36 mm; ba loài nấm GGB1(4,20 mm), THTG4 (4,18 mm), THTH1 (3,39 mm) chịu sự ức chế kém hơn Chủng vi khuẩn 6-3 có hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty của bốn loài nấm mạnh nhất, chủng vi khuẩn 11-3 có hiệu quả ức chế kém nhất

- Khả năng đối kháng của từng chủng vi khuẩn Bacillus thay đổi theo từng loài nấm Colletotrichum spp Loài Colletotrichum CT rất nhạy cảm với 18 chủng vi

khuẩn với hiệu suất đối kháng trung bình là 40,35% Kế đến là hai loài nấm GGB1 (37,80%); THTG4 (34,91%) và thấp nhất là loài THTH1 (28,49%) Loài nấm GGB1 có 14 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng tốt đối với sự phát triển khuẩn

ty của nấm, kế đến là loài THTG4 có 13 chủng vi khuẩn đối kháng có hiệu quả, loài

CT có 10 chủng, và loài THTH1 có ít nhất với chín chủng vi khuẩn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỞ ĐẦU

Cây sen là loại thủy sinh được tiêu thụ mạnh khắp Châu Á cũng như một số nước phương Tây Tất cả các bộ phận của sen như lá, bông, hạt, củ đều có thể sử dụng được Ngoài nhu cầu thực phẩm, sử dụng làm thuốc, thưởng thức trà đạo thì hoa sen cũng được xem là yếu tố quan trọng trong hoạt động tín ngưỡng ở nhiều lễ hội thuộc khu vực các nước Châu Á Đạo Phật xem bông sen là biểu tượng cao nhất của sự tinh khiết, hòa bình, từ bi và vĩnh hằng (William, 1998) (Nguyen Quoc Vong, 2001 trích dẫn) Để đáp ứng nhu cầu thị trường nên diện tích trồng sen ngày càng tăng Tuy nhiên, trong quá trình canh tác lại xuất hiện nhiều vấn đề khó khăn

do nhiều nguyên nhân như thời tiết, sâu bệnh hại… và có thể nói trở ngại lớn nhất

đó là bệnh thán thư Theo Agrios (1997) thì bệnh thán thư do nấm Colletotrichum

thường gây thiệt hại trầm trọng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới điển hình như Việt Nam Đã có các biện pháp phòng và trị bệnh như sử dụng nhiều loại thuốc hóa học khác nhau, tuyển chọn giống sen có sức đề kháng cao…nhưng hầu như đều không mang lại hiệu quả như mong muốn

Hiện nay, nhằm hướng tới mục tiêu nông nghiệp an toàn và phát triển bền vững, các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp sinh học theo hướng đối kháng để quản lý phòng trừ dịch hại

Đề tài “Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng vi khuẩn

Bacillus sp đối với nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên sen ở Cần

Thơ và tỉnh Đồng Tháp trong điều kiện phòng thí nghiệm” được thực hiện cũng

dựa trên hướng đi mới này Mục đích của đề tài nhằm tìm hiểu rõ hơn về khả năng

hạn chế sự phát triển mầm bệnh của vi khuẩn Bacillus cũng như định hướng tìm ra

giải pháp sinh học phòng trị hữu hiệu với bệnh này

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH TRỒNG SEN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Cây sen có tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn hay Nelumbium

speciosum Willd, thuộc họ Nulumbonaceae, dạng sinh trưởng là Nê thực vật (Phạm

Hoàng Hộ, 1999)

Cây sen có nguồn gốc ở Châu Á, xuất phát từ Ấn Độ (Makino, 1979) sau đó lan qua Trung Quốc, vùng đông bắc Châu Úc và nhiều nơi khác (Hoshikawa, 1970; Herklots, 1972 do Nguyen Quoc Vong, 2001 trích dẫn) Sen được trồng nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, các nước Đông Nam Á, Nga và một số nước Châu Phi Sen cũng được trồng ở Châu Âu và Châu

Mỹ nhưng với mục đích trang trí hơn là thực phẩm (Nguyễn Phước Tuyên, 2008) Cây sen là loại thủy sinh được tiêu thụ mạnh khắp Châu Á Lá, bông, hạt, củ đều là những bộ phận có thể ăn được Riêng bông sen được sử dụng trong nhiều lễ hội ở các nước Châu Á Tuy nhiên củ sen lại có thị trường lớn nhất so với các bộ phận khác của cây sen (Nguyen Quoc Vong , 2001)

Ở Việt Nam, sen được trồng từ Bắc vào Nam với diện tích nhỏ lẻ và không tập trung, tuy nhiên chỉ có một số vùng trồng sen tập trung như ở Đồng Tháp, Huế và một số tỉnh miền Trung (Lê Phước Thiện, 2007)

1.2 BỆNH THÁN THƯ TRÊN SEN 1.2.1.Tác nhân gây bệnh

Bệnh thán thư là do nấm Colletotrichum gây ra Đây là chi nấm ký sinh trên

rất nhiều ký chủ: ngũ cốc, họ bầu bí, cây họ cà, dâu tây, măng cụt (Agrios, 1997)

Các loài nấm Colletotrichum sp được tìm thấy và gây bệnh trên sen là: C coccodes,

C craspes, C graminicola, C gloeosporioides, C langenarium Trong đó hai loài

C coccodes và C craspes gây hại nặng nhất trên lá non và hạt (Võ Thị Dạ Thảo,

2007)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1.2.2 Nấm Colletotrichum sp

1.2.2.1 Lịch sử của chi nấm Colletotrichum

Chi nấm Colletotrichum được mô tả đầu tiên vào năm 1790 với tên gọi là

Vermicularia và sau đó là Colletotrichum vào năm 1837 Chi nấm này đã được gọi

với nhiều tên khác nhau nhưng hai tên thông dụng là Vermicularia và

Gloeosporium được sử dụng thay đổi luân phiên cho nhiều loài trong thế kỷ XIX và

đầu thế kỷ XX Ngày nay, tên gọi Vermicularia và Gloeosporium đã được chấp nhận trong chi Colletotrichum Sutton (1980) đã phân loại chi Colletotrichum thành

39 loài dựa trên những tiêu chuẩn chi tiết về hình thái, đặc điểm sinh học và khả

năng gây bệnh (Nguyễn Quốc Đạt, 2006 trích dẫn)

1.2.2.2 Đặc điểm chung của nấm Colletotrichum spp

Theo Phạm Văn Kim (1999), nấm Colletotrichum spp thuộc bộ nấm Đĩa Đài

(Melanconiales) của lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) Đặc điểm của nấm này là sợi nấm có vách ngăn và tế bào chất trong suốt Ở giai đoạn sinh sản vô tính cho ra các bào tử đính, đơn bào có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ, không màu và đôi khi có giọt dịch trong bên trong bào tử Agrios (1997) quan sát thấy đĩa đài có gai cứng (setae) sẫm màu, nhọn ở đầu và có vách ngăn Ở giai đoạn sinh sản hữu

tính, nấm Colletotrichum sp thuộc lớp nấm nang (Ascomyces) có tên là Glomerella

cũng cho ra dạng bào tử đơn bào

1.2.2.3 Một số đặc tính sinh học của nấm Colletotrichum spp

*Bào tử

Hình dạng bào tử của những loài nấm Colletotrichum spp có thể phân thành

hai nhóm chính, dạng bào tử thẳng và dạng bào tử hình liềm và đã có hơn 20 loài

Colletotrichum spp đã được công nhận (Skip et al., 1995) Những loài có dạng bào

tử hình liềm thì rất dễ phân biệt, nhưng với những dạng bào tử hình trụ thì có thể bị nhầm lẫn (CABI, 2003) (Nguyễn Quốc Đạt, 2006 trích dẫn)

Theo Nguyễn Quốc Đạt (2006) thì Sutton (1980) đã phân biệt giữa

Colletotrichum gloeosporioides và C acutatum dựa trên hình dáng của bào tử C gloeosporioides có dạng bào tử hình trụ, còn C acutatum có dạng bào tử hình thoi

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm C nigrum có bào tử phân

sinh hình bầu dục hoặc hình trụ hai đầu tròn, không màu, đơn bào, kích thước 18-25

x 3 μm Cành bào đài ngắn hình gậy kích thước 20-25 x 2,5 μm Nấm C capsici có

bào tử phân sinh, không màu, đơn bào, hơi cong hình lưỡi liềm, kích thước 17-28 x 3-4 μm, có giọt dầu bên trong

Theo Nguyễn Thị Quế Phương (2003), bào tử của loài nấm C acutatum gây

hại trên ớt có dạng thon dài, thỉnh thoảng có thắt eo ở giữa, kích thước 10-15 x

3,75-4 μm Bào tử của loài nấm C trichellum có dạng hình liềm, kích thước 20-25 x 3-4 μm Bào tử của loài nấm C corchori có dạng hình liềm, kích thước 18-20 x 2,5-

3 μm

Theo Lê Hoàng Lệ Thủy (2004), bào tử của loài nấm C acutatum gây hại trên xoài có dạng hình thoi, kích thước từ 8,75-17,75 x 3,25-5 μm còn bào tử của loài C

gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài, sầu riêng có dạng thẳng, một đầu cùn,

một đầu hẹp lại ở đế, đôi khi hẹp lại ở giữa như dạng thắt eo hoặc dạng bào tử có hai đầu cùn, kích thước từ 7,5-20 x 2,5-5 μm

Với kết luận của Nguyễn Văn Phương (2004) thì trên môi trường MT2 (khoai tây 200 g, đường 10 g, agar 15 g, nước cất 1000 ml và pH từ 6,5-6,8) thì khả năng

tạo bào tử của các chủng nấm Colletotrichum sp là nhiều nhất

*Đĩa áp

Theo Vinnere (2004) gần đây kích thước và hình dạng đĩa áp đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại trong toàn thể loài trong chi nấm

Colletotrichum (Nguyễn Quốc Đạt, 2006 trích dẫn) Theo Sutton (1980), đĩa áp của

loài C gloeosporioides hơi rộng hơn C acutatum Tuy nhiên, theo Smith and Black

(1990), trong thực tế rất khó để phân biệt giữa các loài nấm này mà chỉ dựa trên đặc điểm về hình thái đĩa áp Simmonds (1965) cho biết rằng trong tất cả những loài

Colletotrichum spp., trong đó đĩa áp của C acutatum có hình dạng ít thay đổi nhất

(Nguyễn Quốc Đạt, 2006 trích dẫn)

Đĩa áp có màu nâu nhạt đến nâu sậm được tìm thấy khi nuôi cấy trên hai loại môi trường PCA và PDA, có bốn dạng đĩa áp đã được tìm thấy: (1) dạng chùy, (2) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

dạng trứng, (3) dạng trứng ngược và có nếp nhăn, (4) dạng xẻ thùy Đĩa áp được mọc lên từ đầu sợi nấm, đôi khi được tạo ra bằng cách chen vào khoảng giữa của

sợi nấm, đĩa áp của loài C acutatum gây hại trên xoài có dạng chùy, kích thước 17,5 x 5-7,5 μm, và đĩa áp của loài C gloeosporioides gây bệnh thán thư trên xoài

10-và sầu riêng có dạng trứng, trứng ngược 10-và dạng xẻ thùy, mép rìa dọc thành đĩa áp thường có nếp nhăn và hơi nhô cao, kích thước 6,25-17,5 x 3,75-11,25 μm (Lê Hoàng Lệ Thủy, 2004)

1.2.2.4 Đặc điểm một số loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên

sen

- Colletotrichum coccocdes: ổ nấm dạng đĩa đài, trong đĩa đài có các bào tử

đính trên các đính bào đài, có 10-15 gai nhọn, 1-2 vách ngăn Đính bào đài rất ngắn chỉ có một tế bào xếp thành lớp dày đặc, bào tử chỉ một tế bào, hình trụ thẳng, không màu và có kích thước 5-6 x 18-20 μm (Võ Thị Dạ Thảo, 2007) Khi nuôi cấy nấm trên môi trường PDA sau 24 giờ, hạch nấm có màu đen, sợi nấm có màu trắng,

có nhiều gai cứng Bào tử hình thoi, thẳng, có eo ở giữa, kích thước bào tử 16-22 x 3-4 μm Đĩa bám hình chùy, dài, màu hơi nâu, không đều, đôi khi rìa dún tai bèo, kích thước 11-16,5 x 6-9,5 μm (Sutton, 1980) Theo Nguyễn Quốc Đạt (2006) thì

Oh-Is et al., (1998) cho rằng C coccodes có khả năng hình thành gai cứng trên môi

trường PDA trong điều kiện tối

- Colletotrichum graminicola: ổ nấm dạng đĩa đài, trên đĩa đài có từ 15-28 gai

nhọn, màu nâu đen, hơi cong, có từ 2-4 vách ngăn Đính bào đài không màu xếp thành một khối dày đặc, bào tử một tế bào, hình liềm, không màu, kích thước 3-4 x 20-25 μm (Võ Thị Dạ Thảo, 2007)

- Colletotrichum craspes: ổ nấm dạng đĩa đài, có màu nâu; có 6-10 gai cứng

màu nâu, 1-3 vách ngăn, kích thước 3-6 x 45-70 μm Đính bào đài không màu xếp thành một khối dày đặc hiện diện rất nhiều bên trong đĩa đài, bào tử hình trụ không màu, kích thước 2-5 x 14-16 μm (Võ Thị Dạ Thảo, 2007)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Colletotrichum langenarium: ổ nấm dạng đĩa đài có màu nâu, có 1-2 gai

nhọn màu nâu đen, có từ 2-4 vách ngăn Đính bào đài một tế bào, xếp thành lớp dày đặc Bào tử có một tế bào hình trụ 4-5 x 15-20 μm (Võ Thị Dạ Thảo, 2007)

- Thán thư ở lá non (thối lá non): Bệnh gây hại nặng ở lá non, lá mũi giáo,

lúc lá mọc lên cách mặt nước khoảng 5 cm, vết bệnh gây thối từ cuống lá rồi lan ra hoặc thối từ rìa lá lan dần vào trong, vết bệnh mới chỉ là những chấm nhỏ màu đen đôi khi thấy những vòng tròn đồng tâm Bệnh nặng thối cả lá, biến thành màu đen Nếu có ẩm độ thích hợp, trên vết bệnh có những chấm nhỏ li li màu hồng Tác nhân

gây bệnh là Colletotrichum coccodes

- Thán thư trên gương: Bệnh tấn công vào gương từ lúc gương còn non đến

già, nhưng thường là giai đoạn gương còn non Bệnh gây thối gương có màu đen, không có viền, trên vết bệnh có những vòng tròn đồng tâm, nếu có điều kiện thích hợp, trên vết bệnh có những chấm nhỏ li ti màu hồng nhạt Bệnh nặng có thể gây

thối cả gương Tác nhân gây bệnh là Colletotrichum graminicola (Ces.) G.W.Wils

- Thán thư trên hạt: Bệnh gây hại chủ yếu trên hạt từ lúc hạt còn non cho đến

khi hạt sắp thu hoạch Bệnh xuất hiện bất cứ vị trí nào trên hạt, vết bệnh có màu nâu sậm, có quầng vàng ở xung quanh, vết bệnh hơi lõm xuống có những chấm nhỏ li ti màu đen; nếu có ẩm độ thích hợp, trên vết bệnh những chấm nhỏ này có màu hồng nhạt Bệnh tấn công lúc hạt còn non thì làm lem, lép hạt Nếu tấn công hạt lúc gần thu hoạch thì chỉ trên một vài hạt bị hư, nên vẫn còn thu hoạch được Tác nhân gây

bệnh là Colletotrichum craspes

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Thán thư trên bông: Chủ yếu gây hại ở giai đoạn trước khi bông nở (bông

búp) Vết bệnh lúc đầu là những chấm nhỏ li ti màu đen gây hại bất cứ vị trí nào của bông nhưng thường tấn công ở cuống bông Bệnh gây thối cả bông làm bông biến thành màu đen, trong điều kiện thích hợp trên vết bệnh có những chấm nhỏ li ti màu

hồng nhạt Bệnh nặng nhất là vào mùa mưa Tác nhân gây bệnh là Colletotrichum

gloeosporioides Penz

- Thán thư trên lá già: Vết bệnh lúc đầu chỉ là những chấm nhỏ li ti màu nâu

xuất hiện bất kỳ vị trí nào của lá, sau đó lớn dần liên kết lại thành vết bệnh bất dạng Bệnh thường cháy từ rìa lá cháy vào, có những vòng tròn đồng tâm, có những chấm nhỏ li ti màu đen nằm trên vòng tròn, vết bệnh có viền nâu, xung quanh có quầng vàng Vết bệnh thường liên kết lại thành từng mảng cháy lớn và làm rách lá Tác

nhân gây bệnh là Colletotrichum langernarium (Paerini) Ellis and Halsted

1.2.4 Sự gây hại và điều kiện phát triển của bệnh

1.2.4.1 Cơ chế gây bệnh

Bào tử phân sinh của nấm Colletotrichum nảy mầm trong nước sau 4 giờ (Vũ

Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) Sợi nấm sau khi xâm nhiễm vào trong, và len lõi giữa các tế bào, sau đó tiết ra các enzyme phân hủy vách và màng nguyên sinh chất của tế bào để hấp thu dưỡng chất cần thiết Và để xâm nhập vào bên trong mô ký chủ, sợi nấm thường tạo thành bộ phận gọi là đĩa áp, đây là bộ phận do đầu sợi nấm phình to ra có nhiệm vụ tìm cách xâm nhập vào bên trong nhu mô của ký chủ Khi vào bên trong tế bào thì nấm tạo thành vòi hoặc đầu hút có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng của tế bào ký chủ (Phạm Văn Kim, 2000) Bên cạnh đó nấm có thể xâm nhập qua các lỗ hơi tự nhiên hoặc qua các vết thương trên cây như: lỗ hơi, lỗ mật, lỗ thoát nước, ống bầu hoa và các vết nứt nẻ, vết sâu cắn (Đường Hồng Dật, 1980) Để nấm có thể xâm nhiễm được vào bên trong mô cây ký chủ và gây bệnh cần phải trải qua các giai đoạn sau: (1) Bào tử phát triển trên bề mặt vết bệnh (2) Lây lan và bám trên bề mặt ký chủ (3) Bào tử nảy mầm (4) Hình thành đĩa áp (5) Xâm nhiễm qua lớp biểu bì của cây (6) Phát triển và lây lan qua các vùng xung quanh (7) Tạo Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

nhiều ổ nấm và bào tử (Jeffries et al., 1990; Prusky et al., 2000 do Trần Thị Bạch

Lan, 2007 trích dẫn)

Tín hiệu đầu tiên của bào tử nảy mầm là tiết ra chất extracellular matrix (ECM)- dấu hiệu trong suốt quá trình nảy mầm và hình thành đĩa áp Quá trình hình thành và phát triển của đĩa áp trải qua bảy bước: (1) Tiết ECM, (2) Phân chia nhân, (3) Tạo thành vách ngăn thứ nhất, (4) Mầm nhú ra, (5) Đỉnh phồng lên, (6) Tạo thành vách ngăn thứ hai, (7) Hình thành sắc tố melanin của đĩa áp Tổng thời gian cho bào tử nảy mầm và tạo thành đĩa áp khoảng 6-9 giờ (Ker- Chung Kuo, 1999) (Đinh Thị Mỹ Lệ, 2005 trích dẫn)

1.2.4.2 Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

Nhiệt độ

Nhiệt độ tối hảo cho nấm Coletotrichum sp phát triển và nảy mầm là 20-300C

Ở nhiệt độ 520C trong thời gian 10 phút sẽ làm giảm sức nảy mầm của bào tử

Colletotrichum sp (Zhi et al., 1997) (Lê Nguyễn Ngọc Huỳnh, 2006 trích dẫn)

Kết quả thí nghiệm qua hai mùa ở Bangladesh (Bakak-AB et al., 1996) đưa

đến kết luận: tỷ lệ bệnh thay đổi cùng với sự thay đổi của các yếu tố khí hậu như nhiệt độ, ẩm độ, lượng mưa Tính mẫn cảm đối với bệnh thán thư giữa các giống có nguồn gốc khác nhau từ các quốc gia như: Korea, USA, India, Thailand…thì khác biệt không ý nghĩa (Houg-, Huang-BK, 1998) (Nguyễn Văn Đông, 2002 trích dẫn)

Ẩm độ

Đại đa số bào tử nấm chỉ có thể nảy mầm trong giọt nước Tuy vậy, một số khá lớn bào tử có thể nảy mầm trong điều kiện không khí bảo hòa hơi nước Nhưng trong giọt nước bào tử nảy mầm nhanh hơn, tỷ lệ và tốc độ nảy mầm cao hơn (Đường Hồng Dật, 1980) Ở đồng bằng sông Cửu Long bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum sp phát triển và lây lan mạnh vào mùa mưa, nhất là các tháng 7, 8, 9

dương lịch (Phạm Hồng Cúc và ctv., 2001) Vào lúc này mưa nhiều nên rất khó

khăn cho việc phòng trừ bệnh bằng thuốc hóa học (Nguyễn Việt Thắng và Trần Khắc Thi, 1999) Theo Võ Thị Dạ Thảo (2007) thì bệnh thán thư trên sen gây hại mạnh khi ẩm độ cao nhất là vào mùa mưa thể hiện rõ nhất là bệnh thán thư trên Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

bông, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất vì thối bông sẽ không hình thành được gương

1.2.4.3 Mức độ gây hại và tính nhiễm bệnh của sen

Theo Võ Thị Dạ Thảo (2007) thì bệnh thán thư gây hại là nặng nhất trên sen chiếm 60,9% trên tổng số bệnh giám định được tại các vùng trồng sen ở Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ Chúng gây hại tất cả các bộ phận của sen (lá non, lá già, gương, hạt, bông) và gây hại trên tất cả các giai đoạn phát triển của sen, nhưng gây hại nặng nhất là lá còn non khoảng 10-25 ngày tuổi, bệnh có thể gây thối toàn

bộ lá làm cho sen chết hàng loạt Bệnh thán thư bông gây hại nặng ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất do khi bông bị thối thì sẽ không hình thành gương và hạt Thán thư hạt gây hại nặng nhất là lúc hạt còn non làm hạt bị lép, nếu vào giai đoạn hạt đã lớn thì bệnh chỉ tấn công một vài hạt nên vẫn thu hoạch được Trên lá già không ảnh hưởng đến năng suất, nhưng đó là nơi lưu tồn để lây lan qua vụ sau Bệnh thán thư gây hại nặng nhất trong mùa lũ

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1.3 PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH CÂY 1.3.1 Khái niệm về phòng trừ sinh học bệnh cây

Biện pháp sinh học trong phòng trừ sinh học bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp để tạo nên một thể cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại Nhờ đó bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không ảnh hưởng nghiêm trọng về mặt kinh tế Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt mầm bệnh và cũng không có khả năng này (Phạm Văn Kim, 2000)

Theo Cook and Baker (1989) phòng trừ sinh học bệnh cây là việc sử dụng một hay nhiều vi sinh vật (ngoại trừ con người) để khống chế mầm bệnh hay làm giảm

sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó Phòng trừ sinh học nhằm 3 mục đích: làm giảm mật số tác nhân gây bệnh bằng cách sử dụng vi sinh vật đối kháng và làm giảm sức sống hay sự phát triển của mầm bệnh, bảo vệ bề mặt cây trồng bởi các vi sinh vật định cư ở vết thương, lá hoặc vùng rễ nơi mà chúng thực hiện nghĩa vụ rào cản tác nhân gây bệnh bằng hình thức cạnh tranh, tiết kháng sinh hoặc hạn chế hoạt động ký sinh của các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, sử dụng vi sinh vật không gây bệnh để kích thích tính kháng bệnh cây trồng

1.3.2 Vai trò của vi sinh vật trong phòng trừ sinh học bệnh cây

Trên thế giới vi sinh vật có lợi trong tự nhiên như nấm, xạ khuẩn, virus thì vi khuẩn đối kháng là vi sinh vật đơn bào có cấu tạo đơn giản nhưng giữ vai trò vô cùng quan trọng Chúng tồn tại khắp nơi trong đất, nước, bề mặt cây trồng … Chúng có khả năng hạn chế những vi sinh vật khác bằng các cơ chế như tiết ra kháng sinh (Antibiotic), cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi ở, nó hạn chế sự phát triển của nhóm sinh vật khác góp phần tạo cân bằng sinh thái trong tự nhiên (Mukerji and Garg, 1993 do Nguyễn Thị Thu Nga, 2003 trích dẫn)

Trong đất, vi sinh vật vừa có vai trò chuyển hóa các vật chất vừa là tác nhân gây bệnh cho cây trồng, đồng thời giữ vai trò đối kháng với các nấm bệnh của cây trồng (Agrios, 1997) Trong quá trình hoạt động sống, vi sinh vật sản sinh ra nhiều chất hóa học (chất kháng sinh, acid amin, độc tố,…) tác dụng trực tiếp đến quá trình Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

sống, sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khác, nhất là các vi khuẩn thường có đặc tính đối kháng với nấm hoặc vi khuẩn gây bệnh cây trồng (Voznyakovskaya and Statsevien, 1995) (Nguyễn Mạnh Cường, 2000 trích dẫn) Cơ chế của sự kiềm hãm do vi khuẩn và việc sử dụng vi khuẩn đối kháng để giảm sự lây lan đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Lê Thị Ngọc Xuân, 2000)

1.3.3 Tính đối kháng giữa các vi sinh vật

Trong tự nhiên tồn tại rất nhiều vi sinh vật đối kháng như: nhóm nấm

Trichoderma, Penicillium, Sporidesmium ; hoặc nhóm vi khuẩn: Bacillus, Pseudomonas Nhóm vi sinh vật đối kháng này có khả năng làm giảm nguồn bệnh

bằng cách tiết ra kháng sinh Các vi khuẩn Bacillus, Enterobacter và Pseudomonas

có khả năng đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng như Sclerotium ceptivorum,

Phytophthora, Pythium và một số nấm khác (Agrios, 1997)

Một số vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Bacillus trong đất có thể sống bám trên sợi nấm của Fusarium oxysporium f sp cubense hoặc Phytophthora spp đồng

thời tiết ra chất ức chế sự phát triển của sợi nấm này (Phạm Văn Kim, 2000)

Mỗi loại vi sinh vật chỉ có thể tiêu diệt hiệu quả được một loại vi sinh vật gây bệnh nhất định nên ta cần chọn đúng dòng vi khuẩn hay nấm đối kháng với mầm bệnh mới có hiệu quả (Nguyễn Mạnh Cường, 2000)

Theo Võ Thanh Hoàng (1990) có ít nhất 17 giống nấm và 5 giống vi khuẩn đã được tuyển chọn là có hiệu quả đối kháng với các mầm bệnh thuộc nhóm nấm, vi

khuẩn và tuyến trùng, trong đó Trichoderma spp., Bacillus spp và Pseudomonas có

nhiều triển vọng nhất (Nguyễn Mạnh Cường, 2000 trích dẫn)

Trong số 5 giống vi khuẩn được sử dụng như tác nhân sinh học để phòng trừ

bệnh cây Vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus spp đặc biệt là Bacillus subtilis là có tiềm

năng nhất, loài này ảnh hưởng rất mạnh trên bệnh héo rũ ở đậu nành (Mousa, 1994);

hoặc có khả năng kiểm soát bệnh chết cây con trên đậu xanh gây ra bởi Rhizoctonia

solani, thối nâu trái (Monilinia fructicola) ở cây ăn trái và bệnh rỉ đậu Ảnh hưởng

của Bacillus subtilis lên bệnh thối nâu quả Đào được kiểm soát trên quy mô lớn

bằng cách phun huyền phù vi khuẩn này lên trái (2 x 107 CFU/ml) Loài vi khuẩn Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bacillus megaterum ở vùng rễ cây bông vải con cũng kiềm hãm nấm Rhizoctonia solani mạnh mẽ trong phòng thí nghiệm Tiêm chủng vi khuẩn này lên cây giúp

giảm 16% hoặc tăng sự sống sót của cây con khoảng 26% Nên xử lý vi khuẩn lên

hạt giống sẽ giảm 49-69% sự thiệt hại cây con khi trong đất đã chủng Rhizoctonia

solani (Vargas and Ramirez, 1983) (Nguyễn Mạnh Cường, 2000 trích dẫn)

1.3.4 Cơ chế và tiến trình của hiện tượng suy giảm nguồn bệnh

Theo Agrios (1997), vi sinh vật đối kháng có khả năng làm giảm mức độ phát triển của nguồn bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau Việc hiểu biết những cơ chế này

sẽ giúp ích rất nhiều trong công tác phòng trừ sinh học bệnh cây một cách có hiệu quả Có ba cơ chế làm suy giảm nguồn bệnh

- Sự đối kháng: Sự đối kháng là hiện tượng xảy ra khi có một loài bị hại do tác động của một hay nhiều loài vi sinh vật khác Tác động ở đây là do vi sinh vật đối kháng đã tiết ra chất kháng sinh hoặc những chất có tác động tương tự Chất kháng sinh thường là những hoạt chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp Ở nồng độ thấp, chất kháng sinh tác động đến sự tăng trưởng hoặc các hoạt động biến dưỡng của các

vi sinh vật khác Các dòng vi khuẩn Bacillus có khả năng sản xuất kháng sinh như

Fengycin, Zwittermicin A (nhóm aminopolycol) và Konosamine D-glucose) những chất kháng sinh này đóng vai trò quan trọng trong phòng trừ sinh học bệnh cây (Agrios, 1997)

(3-amino-3-deoxy Sự cạnh tranh: Sự cạnh tranh giữa hai loài xảy ra khi môi trường sống thiếu nguồn cung cấp dinh dưỡng hoặc chỗ ở Một số kết quả nghiên cứu đã cho thấy

nấm Pythium oligandrum hiện diện ở vùng rễ cây có khả năng kích hoạt hệ thống tự

vệ trong mô rễ cây hoặc cạnh tranh trực tiếp thức ăn và chỗ ở với các tác nhân gây bệnh khác nằm trong đất Sự cạnh tranh dinh dưỡng, đặc biệt là chất sắt là hiện tượng khá phổ biến trong cộng đồng vi sinh vật Khi trong môi trường thiếu chất sắt hữu dụng, một số loài vi sinh vật sẽ tiết ra chất Siderophores Đây là chất ngoại tiết,

có trọng lượng phân tử thấp có khả năng thu hút cao các ion Fe trong môi trường để

sử dụng (Nguyễn Quốc Đạt, 2007 trích dẫn)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Ký sinh và ăn mồi: Hiện tượng ký sinh và ăn mồi là một hiện tượng trong đó một loài trực tiếp ký sinh trên loài khác và khai thác nguồn dinh dưỡng của loài vi sinh vật ký chủ Hiện tượng ký sinh và khả năng ứng dụng chúng trong phòng trừ sinh học đã được biết đến từ năm 1932 (Biện Phương Đông, 2005 trích dẫn)

1.4 VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG BACILLUS 1.4.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus

Chi vi khuẩn Bacillus thuộc họ Bacillaceae, có trong đất, hình que, gram

dương, hiếu khí, kích thước 1,0-1,2 x 3,0-5,0 μm, không có vỏ nhày, chuyển động,

nội bào tử có kích thước 1,0-1,5 μm Vi khuẩn Bacillus thích hợp ở nhiệt độ trung

bình 30-45 0C, có thể sống sót được trong điều kiện khắc nghiệt nhất Vì thế các dòng vi khuẩn này có thể được chọn lọc từ việc xử lý dịch trích trong đất với nước nóng 80 0C trong 10 phút hoặc xử lý đất bằng cách xông hơi nước 60 0C trong 30 phút đối với các vi khuẩn hiếu khí (Cook and Baker, 1989)

Theo Dương Văn Điệu (1989) thì vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn sinh nội

bào tử, khuẩn lạc có màu hoặc không màu, mặt khuẩn lạc bị nhăn, trong môi trường lỏng chúng tạo thành lớp nhăn, đục và lắng cặn Chiều dày của tế bào khoảng 0,5-1,2 μm, chiều dày phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và mức độ phát triển, chúng không có nhân định hình Những tế bào sinh sản chủ yếu bằng phân cắt, nhiệt độ cho sự phát triển của chúng là 25-32 0C, pH từ 6,8-7,2 Trong điều kiện bất lợi, trong tế bào hình thành một bào tử, bào tử có thể nằm ở giữa hoặc đầu tế bào cũng như nằm ở giữa khoảng này Những bào tử này rất bền vững với những chất sát trùng ở nhiệt độ cao và trạng thái khô Ở nhiệt độ 100 0C, nội bào tử của một số loài

của giống Bacillus có thể chịu được từ 2,5-1200 phút (20 giờ) (Phạm Văn Kim,

2000)

Bacillus spp có những nét đặc trưng riêng biệt, phân bố rộng trong đất, có sức

chịu đựng về nhiệt độ cao, có thể phát triển nhanh chóng trong môi trường lỏng và hình thành nội bào tử trong điều kiện khắc nghiệt Vi khuẩn này được đánh giá hội

tụ những tính năng căn bản trong việc ngăn chặn bệnh cây trồng Chúng được xem Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

như là những tác nhân sinh học an toàn và có tiềm năng cao trong phòng trừ sinh

học (Silo- suh et al., 1994) (Kim et al., 2003 trích dẫn)

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn

pH và nhiệt độ

Nhóm vi khuẩn Bacillus thường cư trú nơi có tính baz cao như hồ chứa muối

Natri carbonate (soda lakes) Các vi sinh vật chịu mặn có khả năng tiết ra enzyme thủy phân như protease giữ vai trò tốt ở pH kiềm Trong quá trình nuôi cấy, vi sinh vật thường tiết ra acid hay baz làm thay đổi pH của môi trường ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển của vi khuẩn Do đó trong điều kiện nuôi cấy, chất đệm K2HPO4, Na2HPO4 thường được bổ sung giúp ổn định pH của môi trường (Madigan et al., 1997) do Nguyễn Quốc Đạt (2007) trích dẫn

Tương tự như pH, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng trưởng và tồn tại của

vi khuẩn Mỗi vi khuẩn đều hoạt động trong khoảng nhiệt độ cho phép gồm ba ngưỡng là nhiệt độ tối thiểu, nhiệt độ tối đa và nhiệt độ tối hảo Khi nhiệt độ tăng, hoạt động của enzyme và hoạt chất tăng dần đến các tiến trình đồng hóa gia tăng và

sự tăng trưởng cũng nhanh hơn, tuy nhiên khi nhiệt độ vượt qua ngưỡng cho phép thì protein, nucleic acid và các thành phần tế bào khác sẽ bị thiệt hại hoàn toàn không thể hồi phục Còn khi nhiệt độ thấp sự tăng trưởng sẽ ngưng lại do tế bào chất từ dạng lỏng bị ngưng tụ làm quá trình trao đổi ion và hoạt động của enzyme trong tế bào chất bị đình chỉ, nên sự tăng trưởng của vi sinh vật bị ngừng lại (Madigan et al., 1997 do Nguyễn Thị Thu Nga, 2003 trích dẫn)

1.4.3 Cơ chế và khả năng đối kháng của vi khuẩn đối với nấm bệnh

Các loại vi sinh vật đối kháng tiêu diệt hoặc ức chế hoạt động của vi sinh vật gây bệnh cây chủ yếu bằng các chất kháng sinh, là những sản phẩm trao đổi chất trong quá trình sống của chúng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998), tiết ra enzyme phân huỷ thành phần vách tế bào của nấm như glucan, chitin, protein, và tiết ra enzyme phân huỷ vách tế bào (Nguyễn Thị Thu Nga, 2003) Tuy nhiên, để

nghiên cứu sâu về cơ chế hoạt động của Bacillus spp trong quá trình ức chế mầm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

bệnh trên cây trồng trong đất vẫn còn hạn chế do chuyên đề còn mới (Kim et al.,

2003)

* Tiết kháng sinh

- Pseudomonas fluorescens tạo ra các kháng sinh kiểm soát các tác nhân gây

bệnh như: 2,4- diacetyl- phloroglucinol (DAPG) (Leij, 2002), pyrrolnitrin (PRN)

(Cartwright et al., 1995), pyoluteorin (PLT), phenazine-1-carboxyclic acid (PCA), 2-hydroxy phenazines, phenazine-1-carboxamide (PCN) (Fernando et al., 2005), aerugine [4-hydroxymethyl-2-(2-hydroxyphenyl)-2-thiazoline] (Lee et al., 2003)

- Chi vi khuẩn Bacillus tiết các loại kháng sinh kanosamine (Milner et al., 1996), zwittermicin A (Fernando et al., 2005), bacillomycin (Volpon et al., 1999), iturin A2 (Yoshida et al., 2002), prodigrosin và (+)-(S)- dihydroaeruginoic acid (Carmi et al., 1994 do Nguyễn Thị Thu Nga, 2003 trích dẫn)

Theo Carmi et al (1994) thì DAPG, PRN, PLT và (+)-(S)- dihydroaeruginoic acid có khả năng hạn chế các nấm gây bệnh cây như Pythium

ultimum, Sclerotium rolfsii, Colletotrichum gloeosporioides và Rhizoctonia solani

(Nguyễn Thị Thu Nga, 2003 trích dẫn) Trong các loại kháng sinh trên, DAPG và PRN được phát hiện khá nhiều ở các chi vi khuẩn đối kháng Có loại kháng sinh có phổ ức chế rộng như DAPG, nó có thể ức chế được cả nấm, vi khuẩn và tuyến trùng gây hại (Nguyễn Thị Thu Nga, 2003)

* Tiết ra các enzym phân huỷ vách tế bào

Vách tế bào nấm gồm nhiều thành phần như glucan, chitin, protein (Phạm Văn

Kim, 1999) Theo Nielsen et al (1997) thì vi khuẩn đối kháng có khả năng tiết ra

các enzyme phân huỷ các thành phần glucan hay chitin hoặc thành phần protein của

vách tế bào nấm gây bệnh Các dòng vi khuẩn Paenibacillus polymyxa, Bacillus

pumilus, Bacillus sp có khả năng tiết enzyme thuộc nhóm glucan như cellulase,

mannase và xylanase và các enzyme phân hủy protein của vách tế bào nấm

Aphamyces cochlioides gây bệnh thối rễ trên cây củ cải đường (Nguyễn Thị Thu

Nga, 2003 trích dẫn)

Vi khuẩn Bacillus cereus strain 65 có khả năng tạo enzyme chitinase có khối

lượng phân tử 36 Kda, chitinase này giúp phân giải diacetylchitodibose Khi áp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

dụng Bacillus cereus str 65 trực tiếp vào đất thì bảo vệ cây bông vải con khỏi bệnh thối rễ do nấm Rhizoctonia solani (Pleban, 1997) (Nguyễn Thị Thu Nga, 2003 trích dẫn) Bacillus cereus NCTU2 tiết ra chitinase ChiNCTU2 (Kuo et al., 2006)

Bacillus sp 739 có thể sản suất β-1,3-glucanases, protease và chitinases Trong

số những enzyme phức tạp này thì β-1,3-glucanases và chitinases tham gia thủy

phân làm phân hủy vách tế bào của Bipolaris sorokiniana, mầm bệnh gây thối rữa

rễ của cây ngũ cốc Tuy nhiên, chỉ có β-1,3-glucanases có thể làm thoái hóa vách tế

bào trên hệ sợi của nấm khi vắng mặt những enzyme thủy phân khác (Aktuganov et

al., 2007)

1.5 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VIỆC SỬ DỤNG CÁC NHÓM VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH SINH HỌC

Theo Biện Phương Đông (2005) trích dẫn từ Mew et al (1993) thì từ năm

1985, IRRI đã tiến hành nghiên cứu và phòng trừ sinh học bệnh đốm vằn hại lúa Rất nhiều dòng vi khuẩn đã được thu thập từ ruộng lúa và được trắc nghiệm khả

năng đối kháng với nấm gây bệnh đốm vằn qua thí nghiệm in vitro Những dòng có

hiệu lực nhất được tiếp tục khảo nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng Kết

quả đã chọn ra được một số dòng vi khuẩn có hiệu quả như Bacillus subtilis 33,

Bacillus subtilis 76, Pseudomonas flourescens 7-14, Pseudomonas cepacia 6854, Pseudomonas cepacia 1821

Theo Lê Nguyễn Ngọc Huỳnh (2006) vi khuẩn Bacillus sp TG19 có hiệu quả đối kháng cao với nấm Colletotrichum sp gây hại trên sứ Thái, Sóng Sao và Hoa Hồng Hai chủng vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 và Bacillus sp TG19 đều có hiệu quả ức chế sự phát triển của bệnh chết cây con do nấm Rhizoctonia solani gây

ra trên cây cải xanh và cải ngọt trồng trong khay ở nhà lưới (Biện Phương Đông, 2005)

Thí nghiệm trên ớt ở giai đoạn lá (6-10 lá) của Nguyễn Quốc Đạt (2005) thì

chủng vi khuẩn Bacillus sp TG19 của hiệu quả đối kháng cao hơn với nấm

Colletotrichum sp (TG2) gây bệnh thán thư trên ớt so với chủng vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 và nghiệm thức đối chứng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Ở Thái Lan các nhà nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng vi khuẩn đối

kháng với nấm Rhizoctonia solani tác nhân gây bệnh đốm vằn cây lúa Ruộng lúa được phun vi khuẩn đối kháng (Pseudomonas sp và Bacillus sp.) 3 lần trong mỗi

vụ Vi khuẩn đối kháng này ức chế sự sinh sản ra hạch nấm của R solani; sau 5 vụ

phun vi khuẩn đối kháng liên tục, bệnh đốm vằn đã giảm một cách đáng kể và giúp tăng năng suất so với đối chứng (Phạm Văn Kim, 2000)

Theo Agrios (1997) Pseudomonas fluorescens làm giảm sự lây nhiễm

Drechslera (Helminthosporium) dictyoides; và khi phun kết hợp với Bacillus subtilis làm giảm vết thương trên lá ở táo do Nectria galligena và Eutypa lata ở nho

gây ra

Theo Lại Văn Ê (2003) khi nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng trong

phòng trừ sinh học nấm Fusarium oxysporum và R solani Kühn gây bệnh chết cây con trên bông vải, qua thí nghiệm thấy được vi khuẩn Pseudomonas sp chủng AG-

249, AG-245 và Bacillus sp chủng CT-241 hạn chế sự phát triển khuẩn ty nấm R

solani và Fusarium spp trên môi trường PDA và NA rất tốt Vi khuẩn Pseudomonas sp chủng AG-249 và AG-245 xử lý riêng rẽ hay phối hợp đều cho tỷ

lệ cây bông sống rất cao (76,25 – 91,25%)

Theo Biện Phương Đông (2005) khảo sát hiệu quả đối kháng của 2 chủng vi

khuẩn B cepacia TG17 và Bacillus sp TG19 đều có hiệu quả ức chế sự phát triển của bệnh chết cây con do nấm R solani gây hại trên cải xanh và cải ngọt trồng trong

khay ở nhà lưới của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ Bán kính vòng vô khuẩn giữa các nghiệm

thức có sự khác biệt và vùng ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm R solani của hai

chủng vi khuẩn trên môi trường King’s B biến động từ 8,9 mm đến 14 mm và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng

*Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus

Tại trường Đại học Cần Thơ đã phân lập được 214 chủng vi khuẩn có bán kính vòng vô khuẩn từ 1mm trở lên và trong 214 chủng này có hai chủng vi khuẩn có

khả năng đối kháng đáng kể là Pseudomonas cepacia TG17, Bacillus sp TG19 với

bán kính vòng vô khuẩn tuần tự là 16,5mm và 14,5 mm Và khi sử dụng hai nguồn Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vi khuẩn đối kháng này kết hợp với ¼ liều Validacin phun ba lần, lần đầu vào 45 ngày sau khi gieo, lần phun sau cách lần phun trước năm hoặc bảy ngày thì có hiệu quả hạn chế bệnh đốm vằn tốt tương đương với nghiệm thức phun Validacin đủ liều

(Phạm Văn Kim và ctv., 1999)

Theo nghiên cứu của He et al (2002) hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BS1

và B subtilis BS2 được phân lập từ lá, thân ớt không chỉ ức chế sự phát triển của

sợi nấm mà còn ngăn chặn sự phát triển của bệnh thán thư từ 57,34% - 94,08% do

nấm Colletotrichum gloeosporioides (Glomerella cingulata) gây ra Bệnh thán thư

trên cây giống được BS2 và BS1 ngăn chặn với hiệu quả lần lượt là 81,5-93,3% và 66,1-79,2%

Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R14, B pumilus C116, B megaterium pv

cerealis RAB7 và B cereus C210 tạo được chất kháng sinh, có khả năng ức chế vi

khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris LFR-3 gây bệnh thối rễ ở họ thập tự trong điều kiện in vitro Ở nhiệt độ 30 0C vòng vô khuẩn của B subtilis R14: 1,7cm,

B pumilus C116: 1,4cm, B megaterium pv cerealis RAB7: 1,6 cm, B cereus

C210: 1,5 cm (Luna et al., 2002) Các chủng vi khuẩn Bacillus R14, C210, C240 đã

ức chế bệnh do X c pv campestris LFR-3 gây ra trong điều kiện nhà lưới đến

100% Trong thí nghiệm phun ở 3 thời điểm: trước khi chủng bệnh 3 ngày, ngay khi

chủng bệnh và sau khi chủng bệnh 3 ngày với vi khuẩn X c pv campestris LFR-3,

thì vi khuẩn đối kháng có khả năng kiểm soát bệnh 100% ở cả 3 thời điểm trên

(Assis et al., 1996 do Luna et al., 2002 trích dẫn)

Theo Zhen et al (2005) vi khuẩn Bacillus subtilis LX04 (BS-LX04) có khả năng ức chế nấm Colletotrichum morifolium Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng BS-

LX04 có tác dụng ức chế sự hoạt động của sợi nấm và sự nảy nầm của bào tử dến 73,22% sau 24 giờ Ngoài ức chế sự nảy mầm của bào tử, BS-LX04 còn làm biến dạng đĩa áp và sợi nấm

Theo Huang et al (2005) vi khuẩn Bacillus cereus 28-9 có khả năng đối kháng

với nấm Botrytis elliptica B061 ở mật số 2.108 CFU/ml khi tiêm chủng trước 2 hoặc

3 ngày, hoặc sau khi chủng nấm 1 ngày đều ức chế hiệu quả sự phát triển của vết bệnh

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bệnh thán thư trên dâu tằm do nấm Colletotrichum dematium bị ức chế khi sử dụng dịch trích của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens RC2, khi phun lên lá trước khi chủng C dematium sẽ ức chế sự phát triển của vết bệnh Kết quả cho thấy,

nghiệm thức phun môi trường nuôi cấy vi khuẩn, dịch trích vi khuẩn làm cho đường kính của vết bệnh thán thư giảm có ý nghĩa so với nghiệm thức chỉ phun tế bào vi khuẩn đã được rửa sạch, môi trường PDB có 0,5% polypeptone và đối chứng

(Yoshida et al., 2002)

Khi pha loãng dịch trích vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens RC2 1 lần và 2 lần sẽ ức chế nấm Colletotrichum acutatum, C dematium, Glomerella cingulata làm cho các nấm này không phát triển được Pha loãng 4 lần, sợi nấm của C

dematium và G cingulata vẫn không phát triển được; còn C acutatum phát triển

với đường kính 2,4-7,6mm, khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (Yoshida et al.,

2002)

Nghiên cứu của Kim et al (2003) cho thấy hai chủng Bacillus subtilis

GB-0365 và Bacillus sp GB-017 có khả năng đối kháng với các chủng nấm gây bệnh:

Botritys cinerea, Fusarium sp., Pythium sp và Colletotrichum gloeosporioides

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 2.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ tháng 2/2008 đến tháng 5/2008 Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm

Máy khử trùng ướt (autoclave) Máy khử trùng khô

Tủ cấy Máy đo pH Cân điện tử Bình tam giác, beaker, đĩa petri, ống nghiệm, cây đục môi trường

• Nguồn nấm: 4 loài nấm Colletotrichum THTH1, CT, GGB1, THTG4

được tổ bệnh cây bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và SHƯD, trường Đại Học Cần Thơ cung cấp

Ký hiệu Tên nấm Bộ phận bị hại Địa điểm thu mẫu

THTH1 Colletotrichum craspes Hạt Tân Hội Trung, Cao Lãnh, Đồng Tháp

GGB1 C gloeosporioides Bông Gáo Giồng, Cao Lãnh, Đồng Tháp THTG4 C graminicola Gương Tân Hội Trung, Cao Lãnh, Đồng Tháp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

● Nguồn vi khuẩn: 18 chủng vi khuẩn Bacillus sp cũng được cung cấp

từ tổ bệnh cây của Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật

● Môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus sp được nhân nuôi trên môi trường King’s B theo công

Nấm Colletotrichum spp được nhân nuôi trên môi trường PDA (Potato

Dextrose Agar) theo công thức:

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Agar 20g

2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.2.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là một dĩa petri

Nấm Colletotrichum được nuôi cấy 5 ngày và vi khuẩn Bacillus được nuôi

cấy 3 ngày trước khi thử đối kháng

Cho 10ml môi trường PDA vào dĩa petri, sau đó đặt khoanh khuẩn ty nấm

Colletotrichum (5 mm) ở điểm giữa, bốn điểm xung quanh ta đặt một đối chứng và

ba chủng vi khuẩn Bacillus mật số 10±2.106 CFU/ml Khoảng cách từ khoanh khuẩn ty nấm đến đối chứng và vi khuẩn là 25 mm

Ghi nhận chỉ tiêu:

- Chờ cho khuẩn ty nấm vừa tiếp xúc với đối chứng, đo bán kính khuẩn

ty hình vành khăn (mm) của vòng vô khuẩn

- Tính hiệu suất đối kháng (A.E: antagonistic efficacy) A.E.(%) = [(C-T) x 100]/C

C: bán kính khuẩn lạc của nấm Colletotrichum tương ứng ở nghiệm thức

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA 18 CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI VỚI

BỐN LOÀI NẤM COLLETOTRICHUM SPP

* Khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty bốn loài nấm của trung bình 18 chủng vi khuẩn

Qua bảng 3.1 cho thấy cả 18 chủng vi khuẩn Bacillus đều có khả năng ức sự

phát triển khuẩn ty của cả bốn chủng nấm CT, GGB1, THTG4 và THTH1 Loài

Colletotrichum CT bị ức chế mạnh nhất với bán kính vòng vô khuẩn trung bình là

4,36 mm, kế đến là hai loài nấm GGB1 và THTG4 với bán kính vòng vô khuẩn trung bình là 4,20 mm và 4,18 mm, và sự ức chế của 18 chủng vi khuẩn lên sự phát triển trung bình khuẩn ty của ba loài nấm này không khác biệt ý nghĩa với nhau qua phân tích thống kê Loài nấm THTH1 bị ức chế kém nhất với bán kính vòng vô khuẩn trung bình là 3,39 mm khác biệt có ý nghĩa 5% trong thống kê so với ba loài

nấm trên Tương tự kết quả của Kim et al (2003); Yoshida et al (2002); He et al (2002) ghi nhận được về khả năng ức chế có hiệu quả cao của vi khuẩn Bacillus lên

sự phát triển khuẩn ty của nấm Colletotrichum; và Kim et al (2003) chứng minh rằng Bacillus sp có khả năng ức chế sự phát triển của chín trong số 16 mầm bệnh khác nhau gây hại trên cây trồng, trong đó có cả nấm Colletotrichum với hiệu quả

ức chế là 15 mm

Như vậy, những loài nấm khác nhau chịu sự ức chế của từng chủng vi khuẩn

khác nhau, trong đó loài nấm Colletotrichum THTH1 có khả năng chống chịu mạnh nhất, và loài Colletotrichum CT nhạy cảm nhất trong bốn loài nấm thử nghiệm đối với sự tác động của 18 chủng vi khuẩn Bacillus

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 3.1 Sự tương tác của 18 chủng vi khuẩn Bacillus sp đối với bốn loài nấm Colletotrichum spp

Colletotrichum Bacillus

THTH1 CT GGB1 THTG4

Trung bình

vi khuẩn 1-2 4,10 d-o 4,30 d-m 3,60 h-p 4,60 c-j 4,15 c 1-3 3,00 n-r 3,30 k-q 3,90 e-o 3,70 g-p 3,48 e-h 2-3 4,00 d-o 5,10 b-e 4,80 b-h 5,20 b-d 4,78 b 5-3 4,00 d-o 4,60 c-j 4,10 d-o 4,40 d-l 4,28 bc 6-3 5,90 b 5,70 bc 5,90 b 7,14 a 6,16 a 7-3 3,70 g-p 4,20 d-n 3,80 f-p 4,00 d-o 3,93 c-f 8-3 3,60 h-p 4,90 b-g 4,50 c-k 4,60 c-j 4,40 bc 10-3 2,20 q-r 3,40 j-p 3,50 i-p 4,20 d-n 3,33 gh 11-3 2,00 r 3,70 g-p 3,90 e-o 3,00 n-r 3,15 h 13-3 3,10 m-r 5,00 b-f 3,50 i-p 3,84 f-p 3,86 c-g 14-3 2,90 o-r 4,54 c-k 4,70 c-i 4,20 d-n 4,09 cd 16-3 3,20 l-q 4,84 b-h 4,52 c-k 3,40 j-p 3,99 c-e 22-3 2,90 o-r 4,10 d-o 3,10 m-r 3,40 j-p 3,38 f-h 26-3 2,60 p-r 3,78 f-p 3,70 g-p 4,20 d-n 3,57 d-h 28-3 3,04 m-r 4,50 c-k 3,90 e-o 4,10 d-o 3,89 c-f 8-4 3,20 l-q 4,10 d-o 5,20 b-d 3,50 i-p 4,00 c-e 16-4 3,90 e-o 4,30 d-m 4,60 c-j 3,90 e-o 4,18 c 18-4 3,60 h-p 4,20 d-n 4,30 d-m 3,80 f-p 3,98 c-e Trung bình

nấm

3,39 B 4,36 A 4,20A 4,18A

CV 19,53 %

Ghi chú: Các số liệu trong cùng một cột mang cùng mẫu tự theo sau thì không

khác biệt nhau ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Chữ thường so sánh theo cột, chữ in hoa so sánh theo hàng ngang

* Hiệu quả ức chế của 18 chủng Bacillus trên bốn loài nấm Colletotrichum spp

Tại cột trung bình vi khuẩn trong bảng 3.1, chủng vi khuẩn Bacillus 6-3 có

khả năng ức chế mạnh nhất lên sự phát triển khuẩn ty của cả bốn loài nấm

Colletotrichum (THTH1, CT, GGB1, THTG4) với bán kính vòng vô khuẩn trung

bình là 6,16 mm, khác biệt có ý nghĩa 5% so với 17 chủng vi khuẩn còn lại Kế đến Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

là chủng Bacillus 2-3 có bán kính vòng vô khuẩn trung bình 4,78 mm không khác biệt với hai chủng vi khuẩn Bacillus 8-3 (4,40 mm) và 5-3 (4,28 mm) nhưng khác

biệt với 15 chủng vi khuẩn còn lại

Hai chủng vi khuẩn 8-3 và 5-3 ức chế sự phát triển khuẩn ty của bốn loài nấm với bán kính vòng vô khuẩn trung bình là 4,40 mm và 4,28 mm, không khác biệt có ý nghĩa so với 10 chủng vi khuẩn 2-3 (4,78 mm); 16-4 (4,18 mm); 1-2 (4,15 mm); 14-3 (4,09 mm); 8-4 (4,00 mm); 16-3 (3,99 mm);18-4 (3,98 mm); 7-3 (3,93 mm); 28-3 (3,89 mm); 13-3 (3,86 mm), nhưng khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% qua thống kê so với sáu chủng vi khuẩn còn lại ở mức ý nghĩa 5% trong thống kê

Hai chủng vi khuẩn Bacillus 16-4 và 1-2 ức chế sự phát triển khuẩn ty của

bốn chủng nấm với bán kính vòng vô khuẩn trung bình là 4,18 mm và 4,15 mm

không khác biệt so với chín chủng vi khuẩn Bacillus 8-3 (4,40 mm); 5-3 (4,28 mm);

14-3 (4,09 mm); 8-4 (4,00 mm); 16-3 (3,99 mm); 18-4 (3,98 mm); 7-3 (3,93 mm); 28-3 (3,89 mm); 13-3 (3,86 mm), nhưng khác biệt ở mức độ 5% trong thống kê so với các chủng vi khuẩn còn lại

Chủng vi khuẩn Bacillus 11-3 có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty của bốn loài nấm Colletotrichum yếu nhất với bán kính vòng vô khuẩn là 3,15 mm và

khác biệt không ý nghĩa so với bốn chủng vi khuẩn 26-3; 1-3; 22-3; 10-3, với bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 3,57 mm; 3,48 mm; 3,38 mm; 3,33 mm nhưng khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% qua thống kê so với 13 chủng vi khuẩn còn lại

Như vậy, tất cả 18 chủng vi khuẩn Bacillus đều có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty của bốn loài nấm Colletotrichum spp nhưng khả năng ức chế mạnh hoặc yếu tuỳ thuộc vào từng chủng vi khuẩn Bacillus sử dụng trong thí nghiệm

Chủng vi khuẩn 6-3 có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty của cả bốn loài nấm

Colletotrichum cao nhất, và chủng vi khuẩn 11-3 có khả năng ức chế kém nhất Lê

Nguyễn Ngọc Huỳnh (2006) cũng đã ghi nhận hiệu quả đối kháng của chủng vi

khuẩn Bacillus TG19 thay đổi tùy theo chủng nấm Colletotrichum spp.; chủng vi khuẩn Bacillus TG19 có hiệu quả đối kháng cao với nấm Colletotrichum spp gây

hại trên Sứ Thái, Hoa Hồng và Kim Đuôi Cong, nhưng thể hiện hiệu quả ức chế

thấp với nấm Colletotrichum spp gây hại trên những đối tượng hoa kiểng khác

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu