ĐỊNH DANH VIRUS NUCLEOPOLYHEDROVIRUS (NPV) gây BỆNH côn TRÙNG và HIỆU QUẢ của một số CHỦNG VIRUS PHÂN lập đối với sâu ăn tạp spodoptera lituraTRONG điều KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN THỊ TỐ NGA ĐỊNH DANH VIRUS NUCLEOPOLYHEDROVIRUS NPV GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ HIỆU QUẢ CỦA MỘT SỐ C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ TỐ NGA

ĐỊNH DANH VIRUS NUCLEOPOLYHEDROVIRUS (NPV) GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ HIỆU QUẢ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP ĐỐI VỚI SÂU ĂN TẠP

Spodoptera litura TRONG ĐIỀU KIỆN

PHÒNG THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Tên đề tài:

ĐỊNH DANH VIRUS NUCLEOPOLYHEDROVIRUS (NPV) GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ HIỆU QUẢ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP ĐỐI VỚI SÂU ĂN TẠP

Spodoptera litura TRONG ĐIỀU KIỆN

PHÒNG THÍ NGHIỆM

Lớp: Nông Học k34

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nông Học với đề tài:

ĐỊNH DANH VIRUS NUCLEOPOLYHEDROVIRUS (NPV) GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ HIỆU QUẢ CỦA MỘT SỐ CHỦNG

VIRUS PHÂN LẬP ĐỐI VỚI SÂU ĂN TẠP Spodoptera litura

TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Tố Nga

Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày… tháng…năm 2012

Cán bộ hướng dẫn

PGs Ts Trần Văn Hai

Ths Trịnh Thị Xuân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nông Học với đề tài:

ĐỊNH DANH VIRUS NUCLEOPOLYHEDROVIRUS (NPV) GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ HIỆU QUẢ CỦA MỘT SỐ CHỦNG

VIRUS PHÂN LẬP ĐỐI VỚI SÂU ĂN TẠP Spodoptera litura

TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Do sinh viên Nguyễn Thị Tố Nga thực hiện Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn

tốt nghiệp:

Đề tài tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức:

Cần Thơ, ngày … tháng… năm 2012 DUYỆT KHOA Cán bộ hướng dẫn

CHỦ NHIỆM KHOA NN & SHƯD

Phản biện 1 Phản biện 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Tố Nga

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng

Cha, Mẹ lòng biết ơn chân thành và thiêng liêng nhất Con luôn ghi nhớ công ơn cha mẹ đã sinh thành, dưỡng dục và đã tận tụy nuôi dạy con nên người, sự

hy sinh cao cả đó chính là động lực giúp con vượt qua tất cả những khó khăn

Tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

PGs.Ts Trần Văn Hai và Ths Trịnh Thị Xuân đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Chân thành cảm ơn

Anh Nguyễn Chí Long lớp BVTV K32, cùng tất cả các bạn phòng thí nghiệm NEDO đã luôn giúp đỡ, đóng góp ý kiến giúp tôi hoàn thành tốt luận văn

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Tố Nga Giới tính: Nữ

Nơi sinh: Phú Thọ - Phú Tân – An Giang

Con ông: Nguyễn Văn Tân và bà: Trần Thị Bạch Tuyết

Nguyên quán: xã Phú Thọ, huyện Phú Tân, tỉnh An Giang

Địa chỉ liên lạc: số nhà 1187 , tổ 2, ấp Phú Mỹ Hạ, xã Phú Thọ, huyện Phú Tân, tỉnh An Giang

Email: nttnga57@ctu.edu.vn

Tóm tắt quá trình học tập:

Từ năm 2004 – 2007: học sinh trường THPT Chu Văn An, địa chỉ:

thị trấn Phú Mỹ, huyện Phú Tân, tỉnh An Giang

Từ năm 2008 – 2012: sinh viên ngành Nông Học khóa 34, Khoa Nông nghiệp và SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ Tốt nghiệp Kỹ sư Nông Học năm 2012

Cần Thơ, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Tố Nga

1.1 Sâu ăn tạp Spodoptera litura Fabricius (Lepidoptera:Noctuidae) 2

1.2.4.1 Cơ chế lây nhiễm và triệu chứng của bệnh virus côn trùng 10

1.2.5 Phương pháp chuẩn đoán và định danh virus gây bệnh côn

trùng

12

2.2.1 Thu thập và định danh virus gây bệnh trên sâu ăn tạp tại một

số tỉnh của Đồng Bằng Sông Cửu Long

16

2.2.2 Đánh giá hiệu lực của các dòng virus SpltNPV trên sâu ăn tạp

tuổi 2 trong điều kiện phòng thí nghiệm

17

2.2.3 Đánh giá hiệu lực của 1 chủng virus SpltNPV thu tại Kiên

Giang trên sâu ăn tạp tuổi 3 và 4 trong điều kiện phòng thí nghiệm

18

2.2.4 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm virus SpltNPV dạng khô trên

sâu ăn tạp tuổi 2 trong điều kiện phòng thí nghiệm (ngay sau khi sản xuất, sau 2 tháng và 5 tháng bảo quản)

19

3.1 Thu thập và định danh virus gây bệnh trên sâu ăn tạp tại một số tỉnh của

Đồng Bằng Sông Cửu Long

22

3.2 Đánh giá hiệu lực của các dòng virus SpltNPV trên sâu ăn tạp tuổi 2

trong điều kiện phòng thí nghiệm

25

3.3 Đánh giá hiệu lực của 1 chủng virus SpltNPV thu tại Kiên Giang trên

sâu ăn tạp tuổi 3 và 4 trong điều kiện phòng thí nghiệm

27

3.3.1 Hiệu lực của SpltNPV thu tại Kiên Giang lên SAT tuổi 3 27 3.3.2 Hiệu lực của SpltNPV thu tại Kiên Giang lên SAT tuổi 4 28

3.4 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm virus SpltNPV dạng khô trên sâu ăn tạp

tuổi 2 trong điều kiện phòng thí nghiệm (ngay sau khi sản xuất, sau 2

tháng và 5 tháng bảo quản)

31

3.4.1 Hiệu lực của chế phẩm virus SpltNPV ngay sau khi sản xuất 31 3.4.2 Hiệu lực của chế phẩm virus SpltNPV sau 2 tháng sản xuất 32 3.4.3 Hiệu lực của chế phẩm virus SpltNPV sau 5 tháng sản xuất 33

DANH SÁCH BẢNG

1.1 Một số tiêu chuẩn so sánh nhận dạng virus gây bệnh côn trùng 13

2.3 Các nghiệm thức thể hiện sự phối trộn công thức khác nhau 20

3.1 Các nguồn virus thu thập được từ sâu ăn tạp tại một số tỉnh của

ĐBSCL

22

3.2 Độ hữu hiệu của các dòng virus SpltNPV thu thập tại 4 tỉnh

ĐBSCL với SAT tuổi 2 trong điều kiện PTN NEDO bộ môn

BVTV-ĐHCT

26

3.3 Độ hữu hiệu của virus SpltNPV đối với SAT tuổi 3 ở các nồng

độ trong điều kiện PTN NEDO bộ môn BVTV-ĐHCT

27

3.4 Mật số OBs/sâu nhiễm bệnh trên từng nghiệm thức theo thời

gian

28

3.5 Độ hữu hiệu của virus SpltNPV đối với SAT tuổi 4 ở các nồng

độ trong điều kiện PTN NEDO bộ môn BVTV-ĐHCT

29

3.6 Mật số OBs/sâu nhiễm bệnh trên từng nghiệm thức theo thời

gian

30

3.7 Sự đáp ứng liều gây chết của SAT ở tuổi 3 và 4 đối với SpltNPV

ở điều kiện phòng thí nghiệm NEDO bộ môn BVTV-ĐHCT

30

3.8 Độ hữu hiệu của chế phẩm virus trên sâu ăn tạp tuổi 2 trong điều kiện

PTN, Bộ môn BVTV – ĐHCT

31

3.9 Độ hữu hiệu của chế phẩm virus sau 2 tháng sản xuất trên sâu ăn tạp

tuổi 2 trong điều kiện PTN, Bộ môn BVTV – ĐHCT

33 3.10 Độ hữu hiệu của chế phẩm virus sau 5 tháng sản xuất trên sâu ăn tạp

tuổi 2 trong điều kiện PTN, Bộ môn BVTV – ĐHCT

34

DANH SÁCH HÌNH

1.3 Khóa xác định một số nhóm virus bằng phương pháp nhận

dạng triệu chứng bên ngoài của ký chủ

14

2.2 Chủng nhiễm sâu ăn tạp với chế phẩm virus NPV lây nhiễm

IPM Integrated Pest Management

NPV Nucleo polyherosis virus

NSKC Ngày sau khi chủng

MỞ ĐẦU

Trước sự gia tăng dân số như hiện nay thì nhu cầu lương thực, thực phẩm cũng tăng theo Chính vì thế cây trồng nói chung, cây lương thực thực phẩm và hoa màu nói riêng đang chịu sự khống chế và lạm dụng của con người trong việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nhằm tăng năng suất và phẩm chất cây trồng để dáp ứng nhu cầu dân số ngày càng tăng Sự lạm dụng qua mức thuốc bảo vệ thực vật trong nông nghiệp đang là vấn đề hết sức cấp bách, không những gây ô nhiễm môi trường, mà còn xảy ra tình trạng kháng thuốc của các loài côn trùng và bệnh hại cây trồng, làm thất thu đáng kể cho mùa màng

Đứng trước tình hình này, rất nhiều nỗ lực tìm kiếm giải pháp để giải quyết vấn đề trên Quan điểm IPM (Integrated Pest Management - quản lý dịch hại tổng hợp) đã

ra đời, trong đó đấu tranh sinh học dịch hại đóng vai trò khá quan trọng trong điều chỉnh sự cân bằng sinh học của quần thể

Virus gây bệnh côn trùng (siêu vi khuẩn thiên địch) đã được các nhà khoa học trên thế giới phát hiện ra hơn 1.540 loài, ngay từ đầu thập kỷ 80 của thế kỷ XX thuốc trừ sâu virus phát triển với nhịp độ rất nhanh, có hơn 20 loại virus của các loài sâu hại đã được sản xuất theo phương pháp công nghiệp thành dạng thuốc trừ sâu thương mãi như Gemstar, Virin-HS, Spod-X, Ness-A, Ness-E, Spodopterin, Capex 2… được bán ra thị trường để phòng trừ các loại sâu hại cây trồng phổ biến như

sâu ăn tạp Spodoptera litura, sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh da láng Spodoptera exigua, sâu xanh bông Heliothis armigera, sâu tơ Plutella xylostella, sâu cuốn lá trà Adoxophyes orana, sâu xếp lá trà Homona magnamima (Kunimi, 2005; Kunimi, 2007; Hughes và Wood, 1981; Hughes et al., 1986; Takatsuka et al.,

- Thu thập và định danh loài virus gây bệnh sâu ăn tạp Spodoptera litura Fabricius

tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long

- Đánh giá hiệu quả của các chủng virus thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sâu ăn tạp Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae )

1.1.1 Phân bố

Sâu ăn tạp Spodoptera litura hay còn gọi là sâu đất, sâu ổ, sâu khoang là đối tượng

gây hại quan trọng và phân bố rộng khắp trên hầu hết các loại cây trồng đặc biệt là rau màu ở các vùng nhiệt đới châu Á, kể các một số nước ôn đới, Châu Úc và đảo Thái Bình Dương

1.1.2 Ký chủ

Phổ ký chủ của sâu ăn tạp rất rộng Tại Việt Nam, sâu ăn tạp gây hại trên 290 loại cây của 90 họ thực vật (Nguyễn Văn Tuất, 2003) Sâu ăn tạp tấn công mạnh mẽ, cắn phá nhiều bộ phận non của cây làm giảm phẩm chất cây trồng, ảnh hưởng đến giá trị kinh tế Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để kiểm soát sâu ăn tạp (SAT) rất

khó khăn vì sâu có khả năng kháng thuốc cao (Kasai và Ozaki, 1975; Takatsuka et al., 2002; Takai, 1991)

Tại ĐBSCL theo kết quả ghi nhận của Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), thì từ tháng 2/2000 đến tháng 2/2001 sâu ăn tạp xuất hiện phổ biến trên các ruộng điều tra như: bắp, cải xanh, cải bông, đậu nành…ngoài ra chúng còn gây hại trên các loại cây trồng khác như: ớt, cà chua, khoai lang

từ 5-7 ngày, đôi khi đến 10 hoặc 12 ngày

Giai đoạn trứng: Trứng hình bán cầu, đường kính từ 0,40-0,50 mm Bề mặt trứng

có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô nhỏ Trứng mới đẻ có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu vàng tro, lúc sắp nở có màu tro đậm Ổ trứng có phủ lông từ bụng bướm mẹ thời gian ủ trứng từ 4-7 ngày

Giai đoạn ấu trùng: Sâu có 5-6 tuổi tùy điều kiện môi trường và phát triển trong thời gian từ 20 đến 25 ngày Sâu lớn đủ sức dài khoảng 35-53 mm, hình ống tròn Sâu tuổi nhỏ có màu xanh lục, càng lớn sâu chuyển dần thành màu nâu đậm Toàn thân màu xanh ở tuổi nhỏ và màu nâu ở tuổi lớn với 1 sọc màu vàng sáng ở hai bên hông chạy từ đốt thứ nhất của bụng đến đốt cuối Dọc theo đường ấy có những điểm hình bán nguyệt Từ đốt thứ nhất đến đốt thứ tám của bụng mỗi đốt có một chấm đen rõ, đây là điểm đặc biệt của loài sâu này để phân biệt với các loài sâu khác cùng giống; trong số đó hai chấm đen ở đốt thứ nhất to nhất và càng lớn hai chấm này gần như giao nhau thành một khoang đen trên lưng nên sâu này còn có tên gọi là “Sâu Khoang”

Hình1.1 Thành trùng, trứng và ấu trùng SAT trong đất (Nguồn: Trần Văn Hai, ĐHCT)

Giai đoạn nhộng: Nhộng dài từ 18-20 mm, màu nâu hoặc màu nâu tối Cuối bụng

có một đuôi gai ngắn Thời gian nhộng từ 7-10 ngày Theo ghi nhận của Phạm Thị Nhất (2000), thì mép trước của đốt bụng thứ 4 và vòng quanh mép trước đốt bụng thứ 5-7 của nhộng có nhiều chấm lõm

1.1.4 Tập quán sinh sống và cách gây hại

Bướm thường vũ hóa vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối, ban ngày bướm đậu ở các mặt sau lá hoặc trong các bụi cỏ Bướm hoạt động từ tối đến nửa đêm Bướm bay rất mạnh, có khi xa đến vài chục mét và cao đến 6-7m Sau khi vũ hóa vài giờ bướm có thể bắt cặp và 1 ngày sau đẻ trứng

Trứng được đẻ thành từng ổ có phủ lông màu vàng

Sâu vừa nở ăn gặm vỏ trứng và sống tập trung, nếu bị khua động nhẹ chúng có thể

bò phân tán ra chung quanh hoặc nhả tơ buông mình xuống đất; ở giai đoạn này sâu chỉ gặm mặt dưới lá, chừa biểu bì trên và gân Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán

và ăn gặm lá nhiều hơn Từ tuổi 4 sâu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sáng, nghĩa

là sâu thường trốn ánh sáng nên ban ngày sâu ẩn những nơi tối hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm sâu chui lên cây; trong những ngày trời râm mát hoặc mưa nhẹ thì ban ngày sâu có thể bò hoạt động trên cây Ở tuổi lớn sâu có tập quán ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành và trái non Khi sắp hóa nhộng sâu chui xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đó hóa nhộng

1.1.5 Thiên địch của sâu ăn tạp

1.1.5.1 Nấm ký sinh

Nấm có hơn 4 loài được ghi nhận, những loài nấm này khi tấn công sẽ gây rối loạn

cơ thể ký chủ làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển vào giai đoạn ấu trùng Nghiên cứu của Trịnh Thị Xuân (2006), thì các loài nấm ký sinh trên sâu ăn

tạp bao gồm: Paecilomyces sp., Nomuraea rileyi, Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae

1.1.5.2 Nguyên sinh động vật

Theo Nakai et al (2005) thì sâu ăn tạp ở ĐBSCL còn bị ký sinh thêm bởi loài Nosema bombycis thuộc nhóm nguyên sinh động vật (protozoa) Một kết quả của

Hatakeyama và nhóm nghiên cứu của trường Đại học Cần Thơ năm 2011 cho biết

rằng tỷ lệ thành trùng sâu ăn tạp tại Tp Cần Thơ bị nhiễm protozoa là 46,7% và đã xác định, phân làm 4 nhóm trong đó loài Nosema bombycis (Nosematidae: Microsporida) chiếm đa số với 10/16 mẫu được phân tích

Con đường lây nhiễm của nguyên sinh động vật là qua đường tiêu hóa của ký chủ vào trong máu Triệu chứng của côn trùng bị nhiễm nguyên sinh động vật thường biểu hiện không rõ ràng tùy thuộc vào những tác nhân gây bệnh khác nhau bao gồm kích thước nhỏ, hình dạng méo mó, lờ đờ, kém ăn, cơ thể mất cân bằng thải

ra phân màu trắng Ký chủ có lớp da trong suốt khi bị bệnh thường có màu trắng đục hoặc những vùng phồng lên trên biểu bì, côn trùng có màu sậm thì biểu hiện thành những đốm màu đen trên da

Nhìn chung nhóm Noseme bombycis phát triển tương đối chậm vì thế đòi hỏi phải

có sự lây nhiễm khởi đầu ở giai đoạn sớm để biểu hiện triệu chứng cấp tính Giai đoạn ấu trùng nằm ở tuổi cuối thường sống sót với số bào tử cho phép và tạo ra sự lây nhiễm mãn tính ở thành trùng

1.1.5.3 Ong ký sinh

Từ kết quả khảo sát của Đặng Thị Dung và Vũ Quang Côn (1996) thì trong nhóm côn trùng ký sinh thì họ Braconidae chiếm ưu thế với 3 loài phổ biến là

Microplitis prodeniae, Microplitis sp 1 và Microplitis sp 2

Cũng theo nhóm tác giả này số cá thể sâu ăn tạp bị nhiễm ở những ngày cuối tuổi

1 đến hết tuổi 4 là tương đương nhau Ở ngày đầu của tuổi 5 tỷ lệ sâu bị nhiễm ký sinh thấp hơn rõ rệt, còn ngày cuối của tuổi 5 và 6 do sức đề kháng cao, thành phần dinh dưỡng không còn phù hợp, nên ong ký sinh bị chết trong cơ thể vật chủ

Ở tuổi 1 do kích thước của sâu quá nhỏ nên ấu trùng của ong ký sinh bị thiếu dinh dưỡng do vậy bị chết hoặc không hình thành pha nhộng dẫn đến hiệu quả ký sinh thấp

Theo Giản Thị Ngọc Mẫn (2003), thì thường các loài ong (thuộc họ Braconidae)

ký sinh trên sâu non bộ cánh vẩy thường lựa chọn vật chủ ở tuổi 1 – 2 Nhưng đối

với loài Microlitis prodeniae ký sinh trên sâu ăn tạp phổ biến tuổi đẻ trứng ký sinh

tương đối rộng (từ tuổi 1 – 4) ngoại trừ sâu tuổi 5, ong có đẻ trứng nhưng ong non không thể phát triển được đến thành thục

1.1.5.4 Vi khuẩn

Vi khuẩn Bacillus thuriniensis (Bt) là loài vi khuẩn sản sinh tinh thể một loại chất

độc chứa protein có tác dụng phòng trừ đối với nhiều loài sâu, là loài vi khuẩn kiêm ký sinh (Chu Thị Thơm và ctv, 2006) Hiệu quả phòng trừ lên tới trên 90% (Trần Văn Mão, 2002)

Tác dụng gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn Bt đối với côn trùng là qua thức ăn vào

cơ thể Khi vi khuẩn vào ruột giữa của côn trùng không hình thành enzyme mà gây độc chủ yếu là do chất độc tinh thể Sau khi tinh thể hòa tan trong ruột côn trùng chỉ mấy phút là côn trùng tê liệt, chỉ 55 phút là vách ruột bị vỡ, làm cho tế bào thượng bì ruột giữa rụng, để lộ màng đáy mỏng tạo điều kiện cho tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn xâm nhập (Trần Văn Mão, 2002)

nước ta, việc sử dụng virus NPV để phòng trừ sâu xanh hại bông vải, sâu tơ cũng

đem lại kết quả tốt Chính vì thế việc lựa chọn virus SpltNPV làm tác nhân sinh

học nhằm thúc đẩy sự tiến bộ trong nông nghiệp đem lại an toàn cho người sử dụng đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Bên cạnh đó theo Phạm Thị Thùy (2004) thì virus gây bệnh trên côn trùng là một trong những nhóm

vi sinh vật gây bệnh có nhiều triển vọng trong việc phòng trừ sâu hại cây trồng Hiện nay, virus được xếp vào 13 họ và có khoảng 30 loài virus RNA và một loài virus DNA chưa được phân loại (Quang Chân Chân, 2002) Trong đó, Baculovirus thuộc họ Baculoviridae là nhóm virus tạo thể vùi Họ Baculoviridae hiện gồm hai

giống, virus đa nhân diện (NPVs) và virus hạt (GVs), (Murphy et al., 1995) Trong

đó giống được quan tâm nhiều nhất trong việc sử dụng virus như một công tác quản lý dịch hại đó chính là NPVs NPVs là một nhóm siêu vi khuẩn đã và đang được các nhà khoa học khắp mọi nơi trên thế giới quan tâm do các ưu điểm vốn có của chúng mà thuốc hóa học cũng như các loài thiên địch khác không có được, chẳng hạn như tính đặc hiệu đối với ký chủ, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, tác dụng nhanh hơn nhiều loại virus khác…

Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus gây bệnh côn trùng là một trong những nhóm

vi sinh vật có nhiều triển vọng trong việc phòng trừ sâu hại cây trồng Đây là nhóm virus có kích thước rất nhỏ (siêu vi khuẩn) có khả năng sống và sinh sản trên các mô và tế bào sống, nhưng chúng không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo Virus gây bệnh côn trùng có đặc điểm nổi bật là tính chuyên tính cao nghĩa là virus chỉ gây bệnh riêng cho từng loại côn trùng gây hại, chúng chỉ gây bệnh trên những mô nhất định của côn trùng đó và mỗi loại virus có một phổ ký chủ riêng,

ví dụ như virus gây bệnh trên Spodoptera litura thì chỉ gây bệnh cho Spodoptera litura, virus sâu xanh bông thì chỉ gây bệnh trên sâu xanh bông, virus sâu tơ chỉ

gây bệnh trên sâu tơ… Do đó tên virus thường gắn với tên ký chủ ví dụ như: loài

virus SpltNPV- Splt là tên viết tắt của Spodoptera litura, NPV được viết tắt từ tên

chi Nucleopolyhedrosis virus (George O.Poin ar, Jr., and Gerard M Thomas, 1984)

Khi nghiên cứu để xác định loài virus, các nhà khoa học thường dựa vào sự xuất hiện của các thể protein khác nhau, bởi virus côn trùng thường có vỏ protein bao bọc để tạo nên các thể vùi (virion) với hình khối đa diện hoặc hình hạt, không phải virus gây bệnh trên côn trùng đều tạo thành những thể vùi mà cũng có những virus không tạo thể vùi (George O.Poin ar, Jr., and Gerard M Thomas, 1984)

Virus tạo thể vùi (OBs) thuộc ba họ virus, mỗi họ phát triển độc lập với nhau và đều có khả năng sinh sản ra thể vùi (OBs) gồm một hoặc nhiều virus nằm trong một khung protein Những (OBs) cho phép virus tồn tại một khoảng thời gian dài trong môi trường Kể từ lúc có nhiều loài ấu trùng của côn trùng xuất hiện cho đến thời điểm giới hạn trong năm, virus phải hoàn thành chu trình nhân giống của nó trong khoảng thời gian sống của ấu trùng, sau đó nhờ thể vùi (OBs) mà nó sống sót nhiều tháng với sự vắng mặt của ký chủ mẫn cảm (Frances R.Hunter-Fujita và ctv, 1998).

1.2 Virus gây bệnh côn trùng

1.2.1 Lịch sử về virus gây bệnh côn trùng

Lịch sử cổ đại đã ghi nhận những phát hiện về bệnh do virus trên tằm dâu và ong khi con người bắt đầu nuôi dưỡng hai loài côn trùng có ích này để phục vụ đời sống Năm 384 – 322 trước công nguyên Aristotle đã miêu tả bệnh của ong, tuy nhiên người Trung Quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2.700 năm trước Công Nguyên (Tanada và Kaya, 1993)

Sau đó năm 1856 hai nhà khoa học trên thế giới là Cornilia và Maestri đã mô tả thật kỹ lưỡng bệnh này trên tằm nghệ Chính hai nhà khoa học đã này tìm thấy thể

đa diện trên cơ thể tằm (Weiser, 1972; Simmonds et al., 1976) Tuy nhiên, vào

năm 1898 Bolle lại là người đầu tiên phát hiện ra sự hòa tan thể đa diện (thể vùi) trong ruột tằm và giải phóng ra các hạt virus nhỏ (thể siêu vi) Tiếp sau đó Akkva (1919), Komarek và Breindl (1924) đã tiến hành lọc chất dịch từ tằm và sâu róm

(Lymantria monacha) bị bệnh và khẳng định bản chất virus của các bệnh tạo nên

thể đa diện ở côn trùng (Phạm Văn Lầm, 1995)

Đến năm 1975, Martignoni và Iwai đã đưa ra danh sách 647 loài côn trùng thuộc các họ khác nhau bị virus tấn công Đến những năm giữa thập niên 80, các nhà khoa học đã mô tả hơn 700 virus gây bệnh cho 800 loài côn trùng khác nhau (Jayaraj, 1985)

Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định có khoảng hơn 1.450 loài virus gây bệnh khác nhau thuộc 13 họ siêu vi khuẩn thiên địch được phân lập từ côn trùng và ve bét, trong đó khoảng 90% là thể vùi (Georghe và Gerard, 1984)

Virus học trên côn trùng là một lĩnh vực đã và đang được nghiên cứu kỹ lưỡng để phát hiện ra những virus mới và những mối quan hệ mới giữa ký sinh và ký chủ Hiện nay, những virus gây bệnh đã được biết đến một cách tương đối rõ ràng

Theo Hunter – Fujita et al., 1998 thì nét đặc trưng của virus gây bệnh là không ảnh

hưởng đến thực vật hay động vật có xương sống và các virus này có thể kết hợp lại với nhau thông qua những thể siêu vi (virion), những thể siêu vi này kết dính với nhau cùng nằm bên trong một khung có cấu tạo bằng protein, được gọi là thể vùi Thể vùi có kích thước đường kính từ 0,5 – 20 µm, có thể nhìn thấy dưới kính hiển

vi phản quang

Virus gây bệnh côn trùng chỉ có khả năng sống, sinh sản ở trong các mô, tế bào sống, không thể nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo được Virus gây bệnh côn trùng có đặc điểm nổi bật khác với nhóm khác là tính chuyên hóa rất cao, chỉ gây bệnh cho côn trùng, ngay ở côn trùng chúng cũng chuyên hóa ở

những mô nhất định của ký chủ

1.2.2 Cấu tạo và đặc điểm của NPV

NPV có dạng hình que, đường kính 0,15 - 15 µm, chứa hàng trăm tiểu thể virus, mỗi tiểu thể gồm một hoặc nhiều nucleocapsid Mỗi nucleocapsid có cấu tạo bên trong là DNA và bên ngoài được bao bọc bằng một capsid protein Các virion dính lại với nhau để tạo thành thể vùi là nhờ vào một chất nền cũng được cấu tạo bằng

protein (Hunter – Fujita et al., 1998; Adams et al., 1991; McCarthy et al., 1986)

NPV thuộc họ Baculoviridae nên nó mang những đặc điểm cấu tạo đặc trưng của

họ này Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước từ 40 – 70 nm x 250 – 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), bên trong có chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 - 11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid và

số polypeptide còn lại kết hợp với capside DNA ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 100 x 106 kDa, các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein (Evans và Shapiro, 1997)

Cũng theo trích dẫn của Kelly (1985) và Smith (1976) cho rằng, virus có dạng hình que (gậy) có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắt là DeoxyriboNucleo- Protein – DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPV đơn Nucleocapsid - Single Nucleocapsid (NPV-SNPV); nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid - Multiple Nucleocapsid (NPV – MNPV) Khi pha loãng thấy chúng tạo huyền phù màu trắng

đục, để quan sát thể vùi thì thường quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 15.280 - 20.000 lần, ở độ phóng đại này thì có thể thấy thể vùi đa diện là những khối kết tinh có nhiều cạnh, có dạng gần giống như hình cầu

Hình 1.2 Cấu tạo của virus

Theo Russell và Consigli (1985) thì vỏ bao bên ngoài của các nucleocapsid dễ tạo thành một tiểu thể virus được biết là có cấu tạo từ glucoside Các thể vùi virus

NPV trên Spodoptera litura (SpltNPV) có đặc điểm là dễ bị kiềm hóa Dùng dung

dịch NaOH 0,1N có thể phá vỡ lớp protein bao bên ngoài để giải phóng các virion Chính vì vậy, trong ruột côn trùng, dịch vị ruột mang tính kiềm nên các thể đa diện dễ bị phá hủy, phóng thích các virion để lây nhiễm vào các nhân tế bào khác

(Vialard et al., 1990; Murphy et al., 1995)

1.2.3 Đặc tính của NPV

Theo Phạm Thị Thùy (2004), NPV có các đặc tính sau:

NPV có kích thước rất nhỏ dưới 1,4 chiều dài của sóng ánh sáng, nên các dụng cụ quang học cổ điển không nhìn thấy được

NPV là sự ký sinh trong tế bào nghĩa là NPV chỉ ký sinh, phát triển và sinh sản trong tế bào sâu chủ và bị hủy hoại, cuối cùng làm cho sâu chủ chết

NPV mang tính đặc thù, chúng có thành phần hóa học nhất định có khả năng gây

ra phản ứng miễn dịch được xác định ngay tên cơ thể sâu chủ NPV thể hiện tính chọn lọc cao

NPV có tính mềm dẻo, có khả năng biến đổi khi cơ thể thay đổi

Những đặc tính của virus đều phụ thuộc vào thành phần hóa học và chủ yếu là acid nucleic Thành phần hóa học nucleoprotein là đặc tính cơ bản của virus vì nó qui định hoặc giải thích được kích thước của virus Sự phụ thuộc của virus vào một hệ

tế bào, vào tính đặc thù về kháng nguyên của chúng, về phương thức sinh sản và đặc tính của virus

1.2.4 Sự lây nhiễm, xâm nhập và phát triển của virus NPV trong cơ thể ký chủ

1.2.4.1 Cơ chế lây nhiễm và triệu chứng của bệnh virus trên côn trùng

Theo Kunimi và Nakai (2001) cho biết sự xâm nhập của virus vào cơ thể ký chủ

và sự phát triển của NPVs trong cơ thể ký chủ được mô tả như sau: khi côn trùng

bị nhiễm bởi virus NPVs thì virus sẽ xâm nhập vào ruột non sau đó phá vỡ lớp vỏ virus, các phần tử virus sẽ phân tán tự do và sẽ tái tạo ra axit nucleic Từ đó hình thành vỏ bọc chứa axit nucleic, các virus này sẽ vào trong nhân của các tế bào mô

mỡ và nó sẽ tái tạo lại axit nucleic Từ đó tạo ra các virus mới và các phần tử virus này tập hợp lại với nhau hình thành thể đa diện nhân hoàn chỉnh

Theo Ignoffo et al (1971) sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, virus thường

bám vào các tế bào dễ mẫn cảm, xâm nhập vào các tế bào cơ thể và được nhân lên trong đó, các virus mới sinh ra lại được phóng thích từ các tế bào bị nhiễm bệnh và xâm nhập vào các tế bào chưa bị nhiễm, các thể vùi polyhedral inclusion body (PIB) được tạo ra trong nhân của tế bào sâu chủ bị nhiễm, các polyhedral inclusion body và nhân được tăng dần về kích thước, chúng phá hủy các tế bào bị nhiễm bệnh và lan truyền vào khắp các khoang cơ thể của ký chủ, làm cho ký chủ xuất hiện triệu chứng bệnh rồi chết

1.2.4.2 Cơ chế gây bệnh của virus lên ký chủ

Theo Vũ Mai Nam (2001) khi giải thích về cơ chế xâm nhiễm của NPVs như sau:

virus SpltNPV xâm nhập vào cơ thể sâu qua thức ăn, vào đến ruột giữa do tác

động của dịch ruột, vỏ protein vỡ ra Các virion phóng ra ngoài tấn công tế bào

thành ruột sau đó nhân nhanh khối lượng Sâu bị nhiễm có màu trắng bệch, lờ đờ Hai hoặc ba ngày sau khi bị nhiễm, sâu không ăn, nằm bất động cho đến khi cơ thể sưng lên, vỡ dịch chảy ra ngoài và sâu chết hẳn

Thời gian từ lúc virus xâm nhập vào cơ thể cho đến khi sâu chết thay đổi tùy theo tuổi và loài sâu Cơ chế giết sâu là ký sinh trên ký chủ và bắt đầu quá trình ký sinh khác làm bệnh lây nhiễm nhanh chóng và lan rộng không ngừng Mặt khác, xác sâu chết trở thành thức ăn cho sâu sống vì thế sự lây nhiễm càng nhanh hơn (Vũ Mai Nam, 2001)

Hoàng Thị Việt (2002) cho rằng ngay khi ấu trùng ăn phải thức ăn bị nhiễm NPVs, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa, các thể vùi của virus bị hòa tan và giải phóng các virion, các virion xuyên qua ruột giữa đến dịch máu và nhập vào bên trong các tế

bào, điều này sẽ gây bệnh cho vật chủ

Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi thức ăn có chứa virus NPVs vào ruột sâu non,

cũng như Bacillus thuringiensis bằng con đường tiêu hóa virus đã thực hiện quá

trình phá hủy toàn bộ chức năng của sâu làm sâu chết Cơ chế được mô tả như sau: Khi vào ruột các thể vùi polyhedral inclusion body của virus sẽ giải phóng ra các virion, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa, qua biểu bì mô ruột giữa, các virion xâm nhập vào dịch huyết tương, chúng tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong để thực hiện quá trình gây bệnh cho sâu hại, quá trình này trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài từ 6 - 12 giờ, đây là giai đoạn xâm nhập của các thể vùi polyhedral inclusion body xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng thích ra, chúng tự dính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột của sâu

Giai đoạn tăng trưởng (sinh sản): kéo dài 12 - 48 giờ, đây là giai đoạn tăng nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu, những sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32 giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần

Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn tạo thể vùi tức là các thể virion được bao bọc

trong thể protein, côn trùng trong giai đoạn này có màu sáng bóng, màu sắc nhạt

và đôi khi có màu hồng Sự phân giải tế bào và sự phân giải của mô cơ thể bắt đầu ngay sau khi virus tạo thể vùi

Sâu tuổi nhỏ chết trong khoảng 3 – 5 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm virus Nhưng sâu tuổi lớn thời gian ủ bệnh từ 4 - 6 ngày, có khi dài hơn, vì quá trình ủ

bệnh còn phụ thuộc vào tuổi sâu, điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và lượng thức ăn khi lây nhiễm… Ngay sau khi sâu chết sâu trở nên mềm nhũn, da bị vỡ và giải phóng

ra hàng tỷ thể vùi bám trên các bộ phận của cây trồng, đó là nguồn virus lan truyền

sang cá thể khác

1.2.4.3 Triệu chứng của bệnh

Theo Yoshinori và Harry (1993) cho rằng trong thời gian 2 - 3 ngày đầu của thời

kỳ ủ bệnh, sâu non bị nhiễm bệnh không biểu hiện về triệu chứng bệnh rõ rệt và không có sự thay đổi về thức ăn Sâu nhiễm bệnh 5 - 7 ngày thì thấy các đốt thân của sâu non bị sưng phồng lên, căng phồng và mọng nước, cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở dễ bị vỡ

Trước khi chết sâu thường trèo lên ngọn cây, bám chân lên ngọn cây, bám chân vào cành cây, treo đầu xuống phía dưới hay còn gọi là triệu chứng chết treo Dịch trắng chảy ra ngoài sâu chết, hiện tượng sâu chết treo, dịch trắng có mùi hôi

(Miller et al., 1997)

Thời gian từ khi cơ thể sưng phồng và mọng nước đến khi sâu chết không quá một ngày Thời gian ủ bệnh của sâu ăn tạp thường kéo từ 4 - 10 ngày Đối với nhộng trong thời kỳ ủ bệnh, triệu chứng bị bệnh không rõ, nhưng vào giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh thân nhộng xuất hiện màu đục, da dễ vỡ, dịch trắng có mùi hôi chảy

ra và nhộng cũng bị chết (Erlandson et al., 1984)

* Bệnh lý

Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi sâu mới bị nhiễm bệnh virus NPVs thì các chromatin tụ tập và các hạt rất nhỏ chuyển động tròn mạnh ở vùng quanh thân được gọi là propolyhedral Propolyhedral có đường kính 0,2 - 0,4 µm; đây là những hạt trong giai đoạn tiền phát triển của polyhedral Kích thước nhân tế bào bị nhiễm bệnh tăng lên là do sự sinh sản tràn đầy của các polyhedral và cuối cùng làm cho tế bào bị phá vỡ, phần lớn các polyhedral được hòa lẫn vào trong huyết tương

Smith (1953) cho biết rằng trong nhân toàn bộ polyhedral được tạo ra 1 lần và sau

đó kích thước tăng dần Ở các ký chủ thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, các polyhedral được tạo ra trong nhân của tế bào máu, tế bào thể béo, gian bào ống và biểu bì, không có trong các tế bào thần kinh Polyhedral có đường kính 0,5 - 15

µm, kích thước và hình dạng của chúng phụ thuộc vào từng loại virus của các loài côn trùng

Theo Phạm Thị Thùy (2004) tác nhân gây bệnh của virus đa diện nhân là do các thể vùi Polyhedral Inclusion Body (PIB) và virus hạt do thể vùi Occlusion Body

(OBs) gây ra

1.2.5 Phương pháp chẩn đoán và định danh virus gây bệnh côn trùng

Virus thường được đặt tên sau khi phân lập từ ký chủ, tuy nhiên có nhiều trường hợp nhiều virus tấn công một ký chủ, nhưng cũng có một virus tấn công nhiều ký

chủ, như virus Autographa californica (Payne, 1986)

Mặc dù đã có sự đồng ý chung nên có phương pháp tốt hơn để giám định virus, nhưng lại chưa nhất trí về cách thực hiện Vì vậy việc giám định virus vẫn dựa vào đặc điểm của nó, cộng với phạm vi ký chủ và các triệu chứng khi nhiễm do căn

bệnh đó gây nên (Murphy et al., 1995)

1.2.5.1 Chẩn đoán căn cứ vào triệu chứng

Đa số trường hợp, cơ sở để nhận dạng virus gây bệnh côn trùng là dựa vào triệu chứng bị bệnh của côn trùng, đây còn được gọi là triệu chứng học Căn cứ vào triệu chứng bên ngoài để xác định sự có mặt của virus côn trùng Thông thường thì người ta sẽ so sánh giữa côn trùng khỏe và côn trùng bị bệnh dựa vào các tiêu

chuẩn được áp dụng như sau:

Bảng 1.1 Một số tiêu chuẩn so sánh nhận dạng virus gây bệnh côn trùng

TT Tiên chuẩn Cách đánh giá, so sánh với sâu khỏe

1 Tuổi của sâu Các giai đoạn phát triển của sâu, sâu bị nhiễm thường

xảy ra ở giai đoạn ấu trùng, các giai đoạn nhộng, trưởng thành ít khi bị nhiễm bệnh

2 Kích thước Chiều rộng, dài, đầu : những dấu hiệu về kích thước

không bình thường so với sâu khỏe

3 Thời gian kéo

dài tuổi của

sâu

Khi đã biết thời gian kéo dài tuổi của sâu thì có thể so sánh sự phát triển các giai đoạn của sâu Thông thường một số virus CPV và NPV làm kéo dài giai đoạn phát triển của ấu trùng

4 Tập tính Hoạt động của sâu, khả năng ăn của sâu

5 Các biểu hiện Màu của cơ thể sâu, những biến đổi bất thường bên

ngoài của sâu Các triệu chứng biểu hiện màu sắc vùng bụng, mỡ, cơ và hạ bì

Bằng phương pháp đánh giá các triệu chứng bên ngoài của sâu có thể phân biệt được các nhóm virus gây bệnh cho côn trùng Trên cở sở những quan sát bằng thực nghiệm, với số mẫu quan sát lớn, có thể xây dựng được một khóa phân loại đơn giản để xác định các nhóm virus gây bệnh côn trùng (hình 1.3)

Bên cạnh đó theo Kunimi và Nakai (2001) thì sử dụng phương pháp nhuộm màu bằng Amido black cả hai (NPV, CPV) đều ăn màu của thuốc nhuộm này nên khi phân biệt giữa NPV, CPV thì cũng được phân biệt thuốc nhuộm là Bromphenol blue 0,1% trong 15 phút những thể vùi của CPV thì bắt màu xanh, NPV thì không bắt màu của thuốc nhuộm

Hình 1.3 Khóa xác định một số nhóm virus bằng phương pháp nhận dạng

triệu chứng bên ngoài của ký chủ (Nguồn: Evans và Shapiro, 1997)

Ruột vàng hoặc trắng, chết nhanh

Phát triển kéo dài, ngừng ăn, nhộng và sâu

Bị liệt, ruột bị phá hủy, giảm trọng lượng

Mẫn cảm với CO 2

Densonucleosis

virus (DNV ) Parvoviridae

Drosophila

Rhabdoviridae

1.2.5.2 Chẩn đoán qua kính hiển vi điện tử

Khi triệu chứng có nghi ngờ là do virus tấn công, thì mô bào ký chủ sẽ được khảo sát dưới kính hiển vi, đối với virus tạo thể vùi, thì sẽ khảo sát bệnh trên thể vùi Dưới kính hiển vi, những thể vùi của NPV và CPV xuất hiện chiết quang (trắng sáng) trong phạm vi sáng và pha tương phản, còn capsule của GV thì xuất hiện trắng trong phạm vi trắng và xuất hiện sáng trong pha trong tương phản Những thể vùi có thể có lối chuyển động Brownian trong nền ướt Trong côn trùng bị bệnh, các tinh thể acid uric thường xuất hiện nên rất dễ lầm với thể vùi Thể vùi giống với thể mỡ hình cầu của côn trùng, tuy nhiên có thể phân biệt bằng cách nhuộm màu trong môi trường Sudan III thời gian 10 - 15 phút, lúc đó thể mỡ có màu đỏ còn thể vùi không màu; chú ý thể vùi bị phân hủy trong môi trường kiềm (NaOH 1N) Những virus không tạo thể vùi thì được khảo sát ở kính hiển vi điện

tử (George và Thomas, 1984)

Nhuộm mẫu soi trên kính hiển vi quang học có thể phát hiện được các thể vùi nhưng không phân biệt được virus có thể vùi (virus NPV) hay không có thể vùi (virus GV) vì vậy cần phải dùng kính hiển vi điện tử quét (Scaning Electron microscopy – SEM) hoặc kính hiển vi truyền qua (Transmission Electron Microscopy – TEM) để xác định Kính hiển vi điện tử là công cụ hữu hiệu để phân biệt được những nét đặc trưng của từng nhóm virus Có thể dùng mẫu để soi thẳng bằng SEM, hoặc cắt lát mỏng (microtom) để quan sát (George và Thomas, 1984; Sapiro, 1987)

Dưới kính hiển vi điện tử, các thể siêu vi được dựa vào có hay không có vỏ bao, hình dạng vỏ bao (Roi; Hạt đậu; Bầu dục; Sợi chỉ; Cầu; Đồng đều hay không đồng đều hoặc không cân), hay khác nhau về kích thước hoặc biến đổi trên bề mặt của thể siêu vi (lồi, lõm, có gai,…) Thông tin về kích thước, hình dạng là chưa đủ để chẩn đoán chính xác tất cả virus mà cần thêm về acid nucleic cộng với sự phân tích cấu trúc protein và các đặc điểm lý hóa khác Loại mô bào nhiễm bệnh cũng như bất kỳ một triệu trứng khác thường nào cũng trợ giúp hữu ích cho việc chẩn đoán (George và Thomas, 1984; Sapiro, 1987)

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được tiến hành từ tháng 5/2010 đến tháng 9/2011 tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật (BVTV), khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ

Thu thập một số chủng virus được thực hiện tại các tỉnh An Giang, Kiên Giang, Đồng Tháp, và Thành phố Cần Thơ

Ly tâm virus tinh khiết, được thực hiện tại phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học (NEDO), Bộ môn BVTV, trường ĐHCT

Thí nghiệm: đánh giá hiệu lực của các dòng virus SpltNPV thu thập được,và đánh giá hiệu quả của chế phẩm virus SpltNPV được thực hiện tại phòng thí nghiệm

phát triển chế phẩm sinh học (NEDO), Bộ môn BVTV, trường ĐHCT

2.2 Phương tiện và phương pháp

2.2.1 Thu thập và định danh virus gây bệnh trên sâu ăn tạp tại một số tỉnh

của Đồng Bằng Sông Cửu Long

Mục tiêu thí nghiệm

Thu thập một số chủng virus gây bệnh trên SAT Từ đó, định danh virus qua quan sát triệu chứng kết hợp mô tả

Nguyên vật liệu và thiết bị

Dụng cụ: hộp nuôi sâu, beaker, bình tam giác, nước cất, giấy thấm, kẹp inox, cọ lông, kéo, keo dán, bút lông, lame đếm hồng cầu (Thoma, Japan), lame, pipette các loại, cồn 70% để khử trùng dụng cụ, bọc giấy, dụng cụ đo nhiệt độ ẩm độ…và một số dụng cụ dùng cho nghiên cứu vi sinh

Thiết bị: Kính hiển vi huỳnh quang, máy ly tâm lạnh siêu tốc (Hitachi CR21GII)

Phương pháp nghiên cứu

Thu thập ấu trùng sâu ăn tạp, gây hại trên rau màu tại Tp Cần Thơ, tỉnh Kiên Giang, Đồng Tháp, An Giang và Vĩnh Long đem về phòng thí nghiệm theo dõi để xác định virus gây bệnh Mẫu virus được đặt tên theo từng loại ký chủ và địa điểm thu mẫu (ví dụ: mẫu trên sâu ăn tạp thu thập được ở Cần Thơ sẽ được ký hiệu là

Splt - CT)

Quan sát triệu chứng và cách thức gây bệnh của những cá thể bị nhiễm virus, mô

tả các triệu chứng sâu bị chết do nhiễm virus, kiểm tra, xác định thể vùi và chụp hình vi mẫu dưới kính kiển vi huỳnh quang (phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học, BVTV)

Những mẫu virus gây bệnh cho SAT, sẽ được ly tâm thu virus sạch tinh khiết theo quy trình của Kunimi và Nakai (2001) Xác định nồng độ của virus gốc bằng cách đếm mật số thể vùi với lame đếm hồng cầu dưới kính hiển vi pha tương phản, trữ nguồn các chủng virus với nước cất ở điều kiện lạnh 40C đến khi sử dụng

2.2.2 Đánh giá hiệu lực của các dòng virus SpltNPV trên sâu ăn tạp tuổi 2

trong điều kiện phòng thí nghiệm

Mục tiêu thí nghiệm

Chọn lựa chủng virus cho hiệu quả cao đối với SAT để sản xuất chế phẩm virus

dạng bột khô đen ứng dụng ngoài đồng ruộng

Nguyên vật liệu và thiết bị

Nguồn virus: các dòng virus SpltNPV đã được ly tâm sạch pha ở nồng độ 5 x

107OBs/ml + 10% nước đường (w/v) + 1% phẩm màu đỏ (Kyoritu Food Co Ltd., Tokyo)

Sâu sạch (tuổi 2): SAT được thu ngoài đồng nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với thức ăn nhân tạo được nghiên cứu là tốt nhất cho sự phát triển của sâu

do Bộ môn BVTV sản xuất (Trần Thị Thùy Dung, 2008), nuôi sâu ăn tạp trong hộp nhựa (10 x 20 x 20 cm) Khi sâu hóa nhộng và vũ hóa sẽ được chuyển sang bọc giấy có bổ sung 3% nước đường để bướm đẻ trứng, cắt những ổ trứng và khử bằng formalin 3% sau đó rửa ổ trứng qua nước sạch, làm khô ráo các ổ trứng này

và để trứng vào trong hộp nhựa (70 ml) đến khi trứng nở sâu non Tuy nhiên, để loại bỏ tác nhân nguyên sinh động vật (protozoa) thì sẽ tiến hành kiểm tra bướm

bố mẹ để loại bỏ những ổ trứng có bướm bố mẹ nhiễm nguyên sinh động vật nhằm

thu được các thế hệ sâu non sạch bệnh

Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức sử dụng nguồn virus thu thập tại bốn tỉnh của ĐBSCL như Cần Thơ, Kiên Giang, Đồng Tháp, An Giang và nghiệm thức đối chứng (sử dụng nước cất thanh trùng), tất cả các nghiệm thức bổ sung 10% nước đường + 1% phẩm màu đỏ (Kyoritu Food Co Ltd., Tokyo), mỗi nghiệm thức với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 24