ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG cây cà CHUA và KHẢNĂNG KÍCH KHÁNG CHỐNG BỆNH héo RỦDO nấm FUSARIUM OXYSPORUM của một số CHỦNG PGPR TRONG điều KIỆN NHÀ lưới

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN THỊ HỪNG TÍM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG CÂY CÀ CHUA VÀ KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CHỐNG BỆNH HÉO RỦ DO NẤM F

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ HỪNG TÍM

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG CÂY

CÀ CHUA VÀ KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CHỐNG BỆNH

HÉO RỦ DO NẤM FUSARIUM OXYSPORUM CỦA MỘT SỐ

CHỦNG PGPR TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

(K30: 2004-2008)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Nông Học với tên đề tài:

“ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG CÂY CÀ

DO NẤM FUSARIUM OXYSPORUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG PGPR

TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI”

Do sinh viên Nguyễn Thị Hừng Tím thực hiện

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày 30 tháng 5 năm 2008

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn kỹ sư ngành Nông Học với tên:

“ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG CÂY CÀ

DO NẤM FUSARIUM OXYSPORUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG PGPR

TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI”

Do sinh viên Nguyễn Thị Hừng Tím thực hiện và bảo vệ trươc hội đồng

Ý kiến của hội đồng chấm luân văn tốt nghiệp:

Luận văn tốt nghiệp được hội đồng đánh giá ở mức:

DUYỆT KHOA Cần Thơ, ngày 30 háng 5 năm 2008

Chủ tịch Hội Đồng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: Nguyễn Thị Hừng Tím

Ngày sinh: 27/01/1985

Nơi sinh: Xã Nhuận Phú Tân Huyện Mỏ Cày Tỉnh Bến Tre

Họ tên cha: Nguyễn Văn Trưởng

Họ tên mẹ: Lê Thị Giác

Quê quán: Ấp Trung Xuân, Xã Nhuận Phú Tân, Huyện Mỏ Cày, Tỉnh Bến Tre

2000 - 2003 là học sinh trường THPT Cheguevara, Huyện Mỏ Cày, Tỉnh Bến Tre

2004 - 2008 là sinh viên trường Đại Học Cần Thơ, học ngành Nông Học khoá 30, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Chân thành biết ơn

Anh Nguyễn Chí Cương, Chị Phan Thị Hồng Thuý và các anh chị trong bộ môn bảo

vệ thực vật đã tạo cho em hoàn thành tốt thí nghịêm

MỤC LỤC

Nội dung: .Trang Tiểu sử cá nhân iii

Lời cảm tạ iv

Mục lục v

Danh sách bảng ix

Danh sách hình x

Tóm lược xi

Mở đầu 1

Chương1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Đặt tính thực vật cây chua 3

1.1.1 Rễ 3

1.1.2 Thân 4

1.2 Một số sâu bệnh hại quan trọng trên cà chua .4

1.2.1 Sâu hại 4

1.2.2 Bệnh hại 4

1.3 Bệnh héo rủ do nấm Fusarium oxysporum f.sp lycopersici 5

1.3.1 Tác nhân triệu chứng và thiệt hại .5

1.3.2 Phân loại 5

1.3.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố 6

1.3.3.1 Đặc điểm sinh học 6

1.3.3.2 Sinh thái 6

1.3.3.3 Phân bố 8

1.3.3.4 Ký chủ 8

1.3.4 Sự lưu tồn của nấm Fusarium oxysporum .8

1.4 Mối quan hệ giữa cái vi sinh vật vùng rễ .8

1.4.1 Sự phân bố vi sinh vật quanh vùng rễ cây 8

1.4.2 Vai trò của vi sinh vật vùng rễ 8 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1.4.3 Tác động qua lại giữa các chủng trong đất 9

1.4.3.1 Không có tác động lẫn nhau ( neutralism) 9

1.4.3.2 Cạnh tranh (competition) 9

1.4.3.3.Tác động hỗ trợ hay tương trợ (mutalism) 9

1.4.3.4.Tác động tích cực một chiều (commennsalism) 9

1.4.3.5 Tác động tiêu cực một chiều (amensalism) 9

1.4.3.6 K í sinh (parasitism) và làm mồi (predation) 10

1.5 Một số khái nịêmvề kích kháng 10

1.5.4.1 Khái niệm 10

1.5.4.2 Kích kháng theo cơ chế phụ thuộc salisylic acid (SA) 11

1.5.4.3 Kích kháng theo cơ chế không phụ thuộc Salicylic acid (SA) 11

1.6 Kích thích tính kháng bằng vi khuẩn 11

1.6.1.Một số tiêu chuẩn nhằm đánh giá kích thích tính kháng lưu dẫn bằng vi khuẩn 12

1.6.1.1 Độc tố của tác nhân gây kích thích không ảnh hưởng đến mầm bệnh 12

1.6.1.2 Sự cần thiết cuả khoảng thời gian giữa áp dụng chất kích thích và chủng mầm bệnh 12

1.6.1.3 Sự tương quan của nồng độ vi khuẩn kích khámg và khả năng kháng bệnh 13

1.6.1.4 Sự bảo vệ không đặc hiệu 13

1.6.1.5 Kích kháng tùy thuộc vào kiểu gen của cây 13

1.6.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến kích kháng lưu dẫn 14

1.7 Khả năng kích thích sinh trưởng của vi khuẩn 15

1.8 Cơ chế đối kháng của vi khuẩn 16

1.9 Những nghiên cứu dung vi khuẩn vủng rễ kích thích tăng 17

trưởng để phòng trị bệnhcó nguồn gốc từ đất trong nông nghiệp 17

CHƯƠNG2:PHƯƠNG TIỆN-PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện 19

2.1.1 Thời gian và địa điềm 19

2.1.2 Vật liệu 19

2.2 Phương pháp 19 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.2.1 Điều tra và thu mẫu 19

2.2.2 Chuẩn bị nguồn gây bệnh và kích kháng 20

2.2.2.1 Phân lập nấm Fusarium spp.từ mẫu rễ 20

2.2.2.2 Phân lập vi khuẩn kích kháng thuộc chi Bacillus và vi khuẩn phát huỳnh quang 20

2.2.3 Thí nghiệm 1:khảo sát khả năng kích kháng của vi khuẩn PGPRs với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trong điều kiện nhà lưới 21

2.2.4 Thí nghiệm 2:Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng và đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bênh héo rũ của vi khuẩn PGPRs trong điều kiện nhà lưới 22

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của các chủng vi khuẩn PGPR 25

3.1.1 Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của các chủng vi khuẩn PGPR ở thí nghiệm kích kháng 25

3.1.2 Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng của các chủng vi khuẩn PGPR ở thí nghiệm đối kháng 38

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

Kết luận 42

Đề nghị 43

Tài liệu tham khảo Phụ chương

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG

Bảng Tựa Trang

1 Khả năng kích thích tăng trưởng của một số chủng vi khuẩn ở thí nghiệm

2 Khả năng kích thích tăng trưởng của một số chủng vi khuẩn ở thí nghiệm

3 Khả năng kích thích tăng trưởng của một số chủng vi khuẩn ở thí nghiệm

4 Khả năng kích thích tăng trưởng thí nghiệm kích kháng đợt 2 qua trọng

5 Khả năng kích thích tăng trưởng thí nghiệm kích kháng đợt 3 chiều cao cây 36

6 Khả năng kích thích tăng trưởng thí nghiệm kích kháng đợt 3 trọng lượng

7 Khả năng kích thích tăng trưởng của một số vi khuẩn thí nghiệm kích kháng

8 Khả năng kích thích tăng trưởng của một số vi khuẩnđợt thí nghiệm đối

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tựa Trang

1 Khuẩn lạc của nấm Fusarium oxysporum spp chủng F 10 mặt trên 44

2 Khảo sát khả năng gây bệnh của nấm Fusarium 5 ngày sau khi chủng 44

3 Khả năng kích thích tăng trưởng của vi khuẩn ở thí nghiệm kích kháng đánh

4 Khả năng kích thích tăng trưởng của vi khuẩn ở thí nghiệm kích kháng đánh

Nguyễn Thị Hừng Tím, 2008 Đánh giá khả năng các dòng vi khuẩn vùng rễ kích thích

tăng trưởng (PGPRs) và khả năng đối kháng, kích kháng nấm Fusarium oxysporum

gây bệnh héo rủ cà chua Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học Giáo viên hướng dẫn Th.S Trần Vũ Phến

TÓM LƯỢC

Đề tài “ Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng cây cà chua và phòng trị

bệnh héo rủ do nấm Fusarium oxysporum của một số chủng PGPR trong điều kiện nhà

lưới” được thực hiện từ tháng 02/2008 đến 5/2008 với hai thí nghiệm trong nhà lưới ở

Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ Đề tài được thực hiện nhằm tiếp tục chọn các dòng PGPRs có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật, đồng thời giúp cây kiểm soát bệnh héo rũ theo cơ chế kích kháng và đối kháng Ngoài ra đề tài cũng tìm hiểu cơ chế kích thích tăng trưởng

và cơ chế kháng bệnh bằng vi khuẩn

Vật liệu khảo sát của hai thí nghiệm được thu thập từ những mẫu cây trồng cạn

ở Cần Thơ (Viện cây trồng của Trường Đại Học Cần Thơ), Bến Tre, Tiền Giang và

Vĩnh Long gồm 17 chủng nấm Fusarium oxysporum được phân lập từ mẫu bệnh héo

rũ; và 140 chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (PGPR) phân lập từ những mẫu rễ và đất của cây khỏe, ngoài ra còn có các chủng vi khuẩn nội sinh (endophytes) được phân lập từ những mẫu rễ cây khỏe đã khử trùng bề mặt

Qua quá trình thực hiện các thí nghiệm :

Thí nhgiệm: Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng và kích kháng nấm

Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ của vi khuẩn PGPR trong điều kiện nhà lưới

Tiến hành với 22 nghiệm thức tương ứng 10 chủng vi khuẩn (theo phương pháp tách rễ một nửa rễ ở mỗi bên chậu đôi) Thí nghiệm này được thực hiện qua ba đợt với mỗi đợt 10 chủng vi khuẩn và qua bốn lần lấy chỉ tiêu (cao thân, cao cây, trọng lượng thân, rễ)) Trong đó có hai nghiệm thức đối chứng đó là: đối chứng không chủng nấm cũng không chủng vi khuẩn để so sánh các nghiệm thức chỉ chủng vi khuẩn

PGPR, đối chứng chỉ chủng nấm Fusarium oxysporum để so sánh với các nghiệm thức

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vừa có chủng vi khuẩn PGPRs & nấm Fusarium oxysporum Trong suốt 4 lần lấy chỉ

tiêu thu được kết quả sau có 4 chủng vi khuẩn có khác biệt so với đối chứng ở mức nghĩa 1% theo phép thử Duncan đó là Tbt 1.18.5.1 et, Tbt 1.20.1t, T13.3f, T1.12g, P24.1tf Bên cạnh đó ta thấy nghiệm thức có chủng vi khuẩn T18.3 đều có chỉ tiêu cao hơn so với tất cả các nghiệm thức khác trong suốt 4 lần chỉ tiêu và chỉ tiêu cao cây nghiệm thức này cao gấp 1.2-1.3 lần chiều cao cây ở nghiệm thức đối chứng chỉ chủng

vi khuẩn Khi so sánh giữa các nghiệm thức chủng vi khuẩn & nấm với đối chứng chỉ chủng nấm thì kết quả cho thấy không có khác biệt thống kê Các chủng khả năng kích thích tăng trưởng rễ như: Tbt.1.6.4tf, Tbt 2.1.1.et, P4.10.7t, Tbt 1.12.7.et, Tbt 1.17.2, Tbt 1.18.2t

Thí nghiệm : Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng và khả năng đối kháng

với nấm Fusarium oxysporum

Tiến hành với 22 nghiệm thức Kết quả cho thấy có 1 chủng vi khuẩn có biểu hiện kích thích tăng trưởng tốt mặc dù không khác với đối chứng ở mức ý nghĩa 1% theo phép thử Duncan

Tóm lại qua hai thí nghiệm ta thấy có 11 chủng vi khuẩn có biểu hiện kích thích tăng trưởng và có khả năng kích thích tạo tính kháng bệnh của cây nhờ hiệu lực của

vi khuẩn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỞ ĐẦU

Trong mỗi bửa ăn của chúng ta, rau cũng đóng vai trò quan trọng vì nó có hàm lượng dinh dưỡng mà đặc biệt là vitamin Cà chua được trồng rất phổ biến trên khắp thế giới nhưnng không đũ cung cấp vì kĩ thuật trồng khắt khe và điều kiện thích hợp Ở điều kiều kiện nhiệt đới có ẩm độ cao, cà chua còn dễ bị bệnh hại do nhiều loại bệnh

như thán thư, héo xanh… trong đó gây thiệt hại nặng nhất héo rũ do nấm Fusarium oxysporum

Lợi ích cà chua không những được dùng như rau xanh mà nó còn dược chế biến theo nhiều hình thức mà hàm lượng dinh dưỡng vẫn còn cao như cà chua cô đặc, tương cà chua.….Cà chua quan trọng thế mà không đủ đáp ứng thật là một vấn đề cần quan tâm Tuy việc phòng trị nấm nay thường khó khăn do chúng có phạm vi kí chủ rộng, có khả năng bán kí sinh, hoại sinh nên lưu tồn rất hữu hiệu trong đất (Đỗ Tấn Dũng, 2001)

Biện pháp phòng trị bằng hóa học thường có hiệu quả không như mong muốn, với phương pháp luân canh cây họ khác hay sử dụng gốc ghép có hiệu qủa nhưng tốn nhiều công, chi phí và phức tạp lại không ứng dụng rộng rãi cho các loại cây họ khác,

từ đó biện pháp sinh học là một hướng đi mới nhằm phòng trị héo rũ cũng là các mầm bệnh trong đất

Biện pháp sinh học đã được nghiên cứu từ lâu và đã phân lập từ đất không bị nhiễm bệnh trong tự nhiên và ghi nhận có nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng (plant growth-promting rhizobacteria (PGPR) trong số đó có những chủng còn có khả năng giúp giảm bệnh có nguồn gốc từ đất theo cơ chế đối kháng và cả theo

cơ chế kích kháng lưu dẫn (induced systemic resistance) = ISR Trong các khảo sát về ISR, đa số các nghiên cứu đã bắt đầu và tập trung chủ yếu trên vi khuẩn phát huỳnh

quang Pseudomonas fluorescens và các vi khuẩn gram âm khác Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được ứng dung nhiều trong sản xuất (Nelson, 2004) Chủng PGPR Pseudomonas fluorescens WCS17R đã được chứng minh là kích thích tạo ra

ISR trên nhiều loại cây trồng giúp bảo vệ chống lại nhiều lại nhiều tác nhân gây bệnh

(Van Loon et al, 1998, Pieterse et al, 2001) Tuy nhiên biện pháp phòng trị bệnh héo

rũ vẫn chưa có hiệu quả ở Việt Nam Theo Võ Minh Luân, 2007 ghi nhận có những Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

chủng vi khuẩn PGPR có triển vọng trong quản lí bệnh này, tuy nhiên đánh giá cũng

ở bước đầu

Từ đó đề tài “Đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng và khả năng kích

kháng chống bệnh héo rũ do nấm Fusarium oxysporum của một số chủng PGPR

trong điều kiện nhà lưới nhằm chọn lọc ra những dòng vi khuẩn có khả năng chống lại bệnh nguy hiểm này Việc ứng dụng các chủng PGPR có khả năng kích kháng hoặc đối kháng với sinh vật gây bệnh trong quản lí các bệnh có nguồn gốc từ đất, trước

mắt là bệnh héo rũ do Fusarium oxysprum là việc cần thiết nhằm giúp cây tăng trưởng

và phát triển tốt đạt hiệu quả kiểm soát bệnh cao, bền vững hơn giúp sản xuất hiệu quả kinh tế hơn làm giảm ảnh hưởng xấu cho môi trường thong qua viêc giảm lượng thuốc phòng trừ bệnh từ đất

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG I: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT CỦA CÂY CÀ CHUA

Tên tiếng Anh: Tomato

Tên khoa học: Lycopersicum esculentum Mill

Cây cà chua là cây hằng niên, tuy nhiên trong điều kiện tối hảo nhất định cà chua thể là cây nhiều năm

Một số đặc điểm của cây cà chua có liên quan đến phản ứng đối với vi sinh vật đất được ghi nhận

1.1.1 Rễ

Rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn Trong điều kiện tối hảo những giống tăng trưởng mạnh ăn sâu 1 - 1.5m và rộng 1.5 - 2.5m vì vậy cà chua chịu hạn tốt Khi cấy, rễ chính vị đứt, bộ rễ phụ phát triển và phân

bố rộng nên cây cũng chịu được điều kiện khô hạn Bộ rễ ăn sâu, cạn, mạnh hay yếu điều liên quan đến mức độ phân cành và phát triển của bộ phận trên mặt đất, do đó khi trồng cà chua tỉa cành, bấm ngọn, bộ rễ thường ăn nông và hẹp hơn so với điệu kiện trồng tự nhiên

Trên thân cà chua, ở bất cứ nơi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi cũng tạo rễ bất định, vì vậy kích thích ra rễ của các phần của cây chẳng hạn như chồi nách đều có thể tạo cây mới để trồng

1.1.2 Thân

Tùy khả năng tăng trưởng và phân nhánh các giống cà chua được chia làm bốn dạng hình:

- Dạng sinh trưởng hữu hạn (derterminate)

- Dạng sinh trưởng vô hạn (inderterminate)

- Dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semiderterminate)

- Dạng lùn (dwart)

Giống: Giống trồng trong sản xuất hiện nay phần lớn là giống lai F1 Hầu hết

giống được nhập từ các nước; Đài Loan Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản Trung Quốc,

Mỹ, Thái Lan Nhưng hiện nay có hai giống thích hợp trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long là gống TN523 được nhập từ Ấn Độ và giống Red Crown 250 giống nhập

từ Đài Loan Ngoài ra còn một số giống nguồn gốc không rõ chỉ biết là thích hợp với Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

điều kiện riêng của từng vùng mùa và mang tên địa phương

1.2 MỘT SỐ SÂU BỆNH HẠI QUAN TRỌNG TRÊN CÀ CHUA

Theo Trần Thị Ba và ctv, 1999, thì cà chua có một số sâu bệnh hại quan trọng như sau:

1.2.1 Sâu hại

- Rầy mềm Aphis gossypii Glover và rầy Myzus persicae Sulzer Rầy phá hại

trên nhiều loại cây Do đó cần chú ý khi bố trí cây trống Các thuốc sát trùng thông

dụng đều phòng trị rầy hiệu quả

- Sâu đục trái Heliothis armigera: Thành trùng đẻ trứng rải rác trên lá non

hay hoa, trưng nở ra sâu phá hoại tại chỗ, sâu lớn đục lỗ chui vào trái ăn phá bên trong, vết đục bị thối bởi vi khuẩ và nấm ký sinh gây thiệt hại khoảng 30% năng suất trái Sâu hại nhiều vào mùa nắng khi nhiều loại cây ký chủ được canh tác (thuốc lá, bắp, đậu)

1.2.2 Bệnh hại

- Bệnh héo vi khuẩn (bacterial wilt): do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây

ra Vi khuẩn gây hại mạnh trong điều kiện nhiệt độ cao Vi khuẩn có ký chủ rộng rãi trong 25 họ thực vật, trong đó có nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, thuốc lá,

cà tím, đậu phộng, chuối, đậu nành sự thiệt hại do vi khuẩn gây ra không thể tính toán

được

Thường cây bệnh héo chết nhanh nên lá không kịp vàng do đó còn gọi bệnh là héo tươi, hệ thống mạch dẫn hóa nâu và sự phát triển rễ bất định dọc theo thân có thể gia tăng trên cây bệnh Cắt ngang thân cây bệnh dịch nhớt có thể tiết ra từ bó mạch và nếu nhúng mặt cắt vào trong nước vài phúc, dòng vi khuẩn màu trắng sữa sẽ tuôn chảy

ra từ mặt cắt Bệnh không gây đốm trên trái và lá

Vi khuẩn ở trong đất (soil-born pathogen) do đó khó phòng trừ Phương pháp hữu hiệu nhất là trồng giống kháng tuy nhiên do vi khuẩn có nhiều dòng gây hại nên khả năng kháng của gống thay đổi theo điều kiện môi trường

- Bệnh héo Fusarium do nấm Fusarium oxysporum f.sp lycopersici Lá cây trở

nên vàng, cây héo từ từ, triệu chứng bắt đầu từ lá bên dưới hay một nhánh của cây Bó mạch cây cũng hoá nâu đậm, hệ thống rễ cũng bị nhiễm nhưng không thối rữa Hai dòng sinh lý (race 1 và 2) của nấm được phân biệt tùy theo cách gây hại trên cây Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Phương pháp sử dụng giống kháng là phương pháp phòng trừ có ý nghĩa thực tiễn

- Bệnh virus có khoảng 35 loài virus gây hại trên cà chua được tìm thấy, trong

đó có các loài quan trọng như sau:

ToMV (tomato masaic virus) có nhiều dòng gây hại trên cà chua và làm thiệt hại năng suất 20-30% đôi khi đến 50% Bệnh làm mất màu lá lá xanh vàng loang lổ (masic), lá méo mó (leaf distortion) hay nhăn nheo (leaf punckering)

CMV (cucumber masaic virus) được truyền chủ yếu bởi rầy Aphis gossypii Glover và rầy Myzus persicae Sulzer Triệu chứng nhận diện CMV là phiến lá cà nhỏ

như sợi chỉ (fern leaf) CMV cũng có nhiều dòng gây hại khác nhau như CMV - RNAL., 2,.3, 4 và CMV - S (south African strain)

Nhiều loài khác cũng được ghi nhận gây hại trên cà chua như TSWV (tomato spotted wilt virus) làm nghẽn mạch, hoại tử trên thân, trái, gây héo chết cây TYDV ( tomato yellow dratf virus) làm cây bị lùn, gân lá có màu xanh đậm, lá vãnh và vặn vẹo Hiện nay chỉ có thể dùng giống kháng

1.3 BỆNH HÉO RỦ DO NẤM Fusarium oxysporum f sp Lycopesici

1.3.1 Tác nhân, triệu chứng và thiệt hại

- Tác nhân: Do nấm Fusarium oxysporum f sp lycopersici (Sace) Snyder

&Hasen

- Triệu chứng: Nấm Fusarium oxysporum f sp lycopersici có thể tấn công tất

cả các bộ phận và các giai đoạn sinh trưởng của cây Tuy nhiên, triệu chứng biểu hiện

rõ ở giai đoạn ra hoa, mang quả Ở cây trưởng thành bộ trể và mạch dẫn cây không phục hồi được Triệu chứng ban đầu là các lá dưới bị biến thành màu vàng, rồi đến các

lá oẻ trên, sau cùng toàn bộ cây héo và chết Cắt dọc gốc thân đến mô gỗ cho thấy mô bệnh mất màu chuyển sang đỏ hoặc nâu sậm (CABI, 2003) Cây con nhiễm bệnh ngoài những triệu như trên còn bị lùn và biểu hiện triệu chứng héo có chu kỳ theo nhiệt độ trong ngày Nguyên nhân là một phần do tăt mạch, một phần do chất độc của nấm Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện khí hậu ấm áp, triệu chứng thường biểu hiện rõ khi điều kiện nóng trong ngày trên đất axit, đất cát và đất thiếu đạm và lân (Vũ Khắc Nhượng và Hà Mạnh Trung, 1983)

- Thiệt hại: Nấm bệnh có phạm vi ký chủ rộng, xuất hiện gây hại ở nhiều nơi

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

nhất là vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới v.v Bệnh gây hại cho sản xuất cà chua, có thể gây thất thu 100% năng suất canh tác trong điều kiện nhà kính hoặc ngoài đồng (CABI, 2003)

1.3.2 Phân loại

Fusarium oxysporum f.sp lycopersici thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) Giai đoạn hữu tính chưa được xác định rõ ràng đối với Fusarium oxysporum Tuy nhiên, một số kết quả nghiên cứu về đặc điểm di truyền cho thấy loài

này gần với nhóm Liseola có giai đoạn hữu tính là Gibberella (Ascomycota)

Bộ: Hypocreales

Họ: Hypocreaceae

Loài Fusarium oxysporum f sp lycopersici gây hại chủ yếu trên cây cà chua

và trong số 3 nòi (Race) đã biết nòi 1 và 2 có phân bố rộng rãi nhất (CABI, 2003)

Trên môi trường PDA, nấm phát triển nhanh và lắp đầy đường kính 9 cm của

dĩa petri chỉ trong khoảng 7 ngày Khuẩn ty nấm Fusarium oxysporum f sp lycopersice khuẩn ty thường có màu hồng, cam, đỏ, tím, xanh hoặc tuỳ thơ giai đoạn

phát triển Nấm có thể tạo ra 3 dạng bào tử vô tính: đại bào tử, tiểu bào tử và bào tử áo Đại bào tử thường có dạng hình liềm, dà, vách mỏng, với nhiều vách ngăn Tiểu bào tử một tế bào thường có dạng bầu dục, tiểu bào tử được tạo ra trên từng thể bình ngắn là

đặc điểm phân biệt đối với Fusarium oxysporum Bào tử áo vách dày, tròn, hình thành

từng cái hoặc một cặp (CABI, 2003)

Theo Burgess et al (1994) dựa vào các chỉ tiêu cơ bản như: màu sắc tản nấm,

màu môi trường, hình thái sợi, thể bình, hình dạng bào tử lớn, bào tử nhỏ, bào tử hậu Đồng thời tiến hành lây nhiễm nhân tạo trên các cây ký chủ nhằm xác định tính gây bệnh và nguyên nhân gây bệnh thì có thể tiến hành phân loại, giám định các loài

nấm Fusariumm sp Nhiên cứu và phân lập

1.3.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố

1.3.3.1 Đặc điểm sinh học

Fusarium oxysporum f sp lycopersici là nấm sống trong đất, có thể lưu tồn

trong đất dưới dạng bào tử áo trong thời gian dài Nấm có thể xân nhiễm và ký sinh trên mô rễ của nhiều loại cây trồng và cỏ, tuy nhiên trên các loại cây này thì cây bị bệnh không thể biện rõ triệu chứng điển hình Trên cà chua bào tử áo mẩy mầm và Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

xâm nhiễm vào vỏ rễ qua các rễ lông hút, sau đó nấm xâm nhiễm vào hệ mạch dẫn xytem (mạch gỗ) Đính vào tử sinh ra sau đó có thể di chuyển thụ động theo hệ thống mạch gổ và lan đến toàn cây (CABI, 2003)

Nấm có thể tạo ra nhiều hoạt chất làm ảnh hưởng trên cây chủ Cây phản ứng với sự tấn công của nấm bằng cách tạo ra các tylose hoặc vách làm nước không thể di chuyển được trong cây nên cây biêu hiện triệu chứng héo Dưới điều kiện mưa nhiều hoặc ẩm độ cao nấm có thể lây nhiễm qua không khí (CABI, 2003)

Các nhên cứu về sinh học phân tử cho thấy Fusarium oxysporum f sp lycopersici rất đa dạng di truyền Hầu hết các dạng hình thường bao gồm các nhóm

phụ khác nhau về mặt di truyền Nấm có thể lây qua hạt, tuy nhiên chủ yếu được phát tán qua bộ phận cây nhiễm, đất, nơi có mang nguồn bệnh (CABI, 2003)

1.3.3.2 Sinh thái

Các yếu tố như hệ vi sinh vật đất, ẩm độ đất ảnh hưởng đếan sự phát triển nấm

Fusarium Ẩm độ đất có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của mầm bệnh hay gián tiếp thông qua tính nhiễm của cây ký chủ Thí dụ: nấm Fusarium moniliform

thường là nguyên nhân gây bệnh nghiêm trọng chỉ xảy ra khi cây ký chủ bị ngập úng ở

giai đoạn sinh trưởng (Bugess.et al, 1994)

Nhiệt độ tối hảo cho nấm Fusariumm moniliform phát triển là 27-300C, tối đa là 36-400C và tối thiểu là 7-80C, nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 350C Giữa những loài khác nhau thì tốc độ phát triển cũng khác nhau thận chí những dòng khác nhau trong cùng một loài cũng có sự khác nhau khi nuôi cùng một nhiệt độ (Agrios, 1997)

Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện khí hậu ấm áp, trên đất acid, đất cát và đất thiếu đạm và lân Nấm tồn tại rất lâu trong đất (Vũ Khăc Nhượng và Hà Mạnh Trung 1983) Theo Lại Văn Ê (2003) thì Thomas (1937) nghiên cứu bênh lúa von (rice bakanae) ở Ấn Độ cho thấy rằng khi bón phân đạm (nitrogen) vào đất thì kích thích bệnh phát triễn và ảnh hưởng này không thay đổi được bằng cách bón thêm phân kali (potassium) hay lân (phoshorus) Sự sinh trưởng của lòai nấm này cũng bị kích thích trên môi trường dinh dưỡng nếu môi trường có thêm ammonium sulphate hoặc asparagin

Fusarium oxysporum có phân bố rất rộng trong đất các vùng sinh thái Nấm lưu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

tồn trong đất thường dưới dạng bào tử áo (CABI, 2003)

1.3.3.3 Phân bố

Chi nấm Fusarium phân bố khắp nơi trên thế giới và hiện diện tiêu biểu ở tất cả

những vùng đất chủ yếu trên trái đất Một vài loài phân bố khắp thế giới trong khi những loài khác có xu hướng xuất hiện chủ yếu ở vùng nhiệt đới và bàn nhiệt đới hay vùng ôn đới Một ít loài và vài loài phụ có phân bố hạn chế, chúng hiện diện ở một vùng cụ thể nào đó và xuất hiện với một loài hay nhóm cây quen thuộc nào đó

(Burgess et al, 1994)

Bệnh héo rủ cà chua do Fusarium oxysporum f sp lycopersici được ghi nhận đầu tiên

từ năm 1895 Đến nay bệnh được ghi nhận xuất hiện ở hơn 30 nước trên thế giới và có thể tất cả các vùng trồng cà chua trên thế giới (CABI, 2003)

1.3.3.4 Ký chủ

Ở nước ta, bệnh do Fusarium spp Gây hại đã được nghiên cứu phát hiện trên

nhiều loại cây trồng ở nhiều vùng sản xuất khác nhau: bệnh lúa von, bệnh mốc hồng ngô bệnh héo vàng khoai tây, v.v Kết quả khảo sát tình hình bệnh hại do nấm

Fusarium sp, ở vùng Hà Nội, cho thấy trong số 11 loại cây trồng nhiễm bệnh, thì có 5 loài cây trồng được xác định nhiễm bệnh nấm Fusarium spp Đó là các loại bệnh: bệnh

héo vàng khoai lang, bệnh véo vàng cây gừng, bệnh héo vàng hoa loa kèn, cây hoa thuý, héo vàng cây đinh lăng và bệnh vết xám cỏ lồng vực (Đỗ Tấn Dũng, 2001)

Trong 11 loài đã giám định được, F oxysporum được ghi nhận gây hại trên nhiều cây

ký chủ với các loại hình triệu chứng khác nhau Ngoài ra các loài F solani và F moniliforme cũng là những loài nấm phổ biến rộng rãi ở vùng Hà Nội

Fusarium oxysporum f sp lycopesirsici được ghi nhân chỉ gây hại điển hình

trên các cây thuộc nhóm cà (Lycopercian Spp) chủ yếu là cà chua Tuy nhiên nấm cũng có khả năng xâm nhiễm và phát triển trên nhiều loại cây trồng khác, nhưng không tạo triệu chứng rõ rệt (CABI, 2003)

1.3.4 Sự lưu tồn của nấm Fusarium

Hầu hết những mầm bệnh có nguồn gốc từ đất bị giới hạn khả năng hoạt động trong đất bởi sự cạnh tranh hay đối kháng với những vi sinh vật khác Sự cạnh tranh và đối kháng này là định hướng ngăn chặn hoạt động của mầm bệnh ngoại trừ những nơi mầm bệnh có điều kiện thuận lợi trong sự cạnh tranh (Burgess và ctv, 1994)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1.4 MỐI QUAN HỆ GIỮA CÁC SINH VẬT TRONG VÙNG RỄ

1.4.1 Sự phân bố vi sinh vật quanh rễ cây

Khái niệm về vùng rễ được Hiltner đề ra từ năm 1940, tuy nhiên cho đến nay chúng ta vẫn chưa có phương pháp thống nhất xác định phạm vi của hệ rễ Bộ rễ của cây rất phức tạp đồng thời ảnh hưởng của bộ rễ đối với môi trường chung quanh cũng thay đổi tuỳ theo loại cây và thời kì sinh trưởng của cây (Phạm Văn Kim, 2006)

Qua khảo sát cho thấy vùng rễ non cho thấy vùng quanh đầu rễ có bao gồm chất do đầu rễ và vi khuẩn sống trong vùng đó tiết ra (Phạm Văn Kim, 2006) Phân tích các chất này thấy gồm có nhiều chất hữu cơ cần thiết cho vi sinh vật như đường, amino acid, acid hữu cơ, vitamin vv vì vùng quanh rễ chứa nhiều chất hữu cơ như vậy nên

vi sinh vật tập trung quanh rễ nhiều hơn ở xa

1.4.2 Vai trò của vi sinh vật vùng rễ

Vi sinh vật ở hệ rễ thực vật giữ vai trò khá quan trọng:

- Vi sinh vât tiết ra CO2, các acid hữu cơ và acid vô cơ, trong quá trình hoạt động của chúng, có tác động lớn đối với việc làm cho các khoáng chất hoặc các chất như P dưới dạng không tan sự chuyển biến thành dạng đơn giản, dễ tan và dễ được

cây hấp thụ (Phạm Văn Kim, 2006)

- Các tác giả chứng minh điều này bằng cách so sánh năng suất cây trên đất đã thanh trùng và đất không thanh trùng Ở hai trường hợp đều bón cùng lượng P khó tan Kết quả cho thấy cây trồng ở đất không thanh trùng có năng suất cao hơn vì hấp thu nhiều P hơn (P được vi sinh vật giúp chuyển biến từ dạng khó tan sang dạng dễ tan và được cây hấp thụ)

- Vi sinh vật tiết ra các chất kích thích tố tăng trưởng của thực vật giúp rễ thực

vật phát triển được tốt Một số loại trong chi Pseudomonas và Agrobacterium có khả

năng tiết ra chất idol-acetic-acid (IAA), là chất kích thích sự ra rễ của cây trồng Các chất kích thích tố sinh trưởng này có trong đất với nồng độ rất thấp, chưa có ảnh hưởng đến cây, tuy nhiên nếu bón phân hữu cơ cho đất, chúng ta làm gia tăng mật số

vi sinh vật trong đất tức gia tăng nồng độ chất kích thích tố sinh trưởng này có ảnh hưởng tốt đối với bộ rễ của thực vật

1.4.3 Tác động qua lại giữa các chủng vi sinh vật trong đất

Có 6 nhóm tác động như sau:

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1.4.3.1 Không có tác động lẫn nhau (neutralism): các chủng gần như không có tác

động lẫn nhau hoặc tác động qua nhỏ không đáng kể

1.4.3.2 Cạnh tranh (competition): hai chủng tranh nhau nguồn dinh dưỡng hoặc

không gian phát triễn Thí dụ: nuôi hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và Acobacter nerogenes bằng phương pháp nuôi liên tục trong môi trường có lượng muối Mg++ hạn chế, nhận thấy tốc độ phát triển của hai chủng vi khuẩn này trái ngược nhau Hiện tượng này xảy ra do sự khác biệt về khả năng hấp thụ ion Mg giữa hai chũng vi khuẩn

Bacillus subtilis đã cạnh tranh, hấp thu hết Mg++ nên Acrobacter nerogenes không phát

triển

1.4.3.3 Tác động hổ trợ hay tương trợ (mutalism): hai chủng tác động tích cực lẫn

nhau, làm cho sự phát triển của cả hai tăng lên so với lúc ssóng riêng lẽ Thí dụ: nuôi

hai chủng Azôtbacter và Rhodopseudomonas chung trong một môi trường thì khả năng

cố định N của chúng tăng lên nhiều so với trường hợp nuôi riêng lẽ

1.4.3.4 Tác động tích cực một chiều (commensalism): một chủng tác động tích cực

lên chủng thứ hai và không ngược lại Thí dụ: nuôi vi khuẩn Pseudomonas hoặc Xanhthomonas chung với tảo Chlorolla pỷenoidosa thì nhận thấy mật số của vi khuẩn

tăng lên theo sự gia tăng của mật độ tảo

1.4.3.5 Tác động tiêu cực một chiều (amensalism): chủng này tác động tiêu cực lên

chủng kia và không ngược lại Thí dụ: có nhiều loài Steptomyces tiết ra kháng sinh làm trở ngại cho sự phát triễn của nhiều vi sinh vật khác

1.4.3.6 Kí sinh (parasitism) và lam mồi (predation): chủng này sống nhờ chủng kia

Thí dụ: nấm Piptocephalis sống kí sinh trên các nấm thuộc bộ Mucorales Các loại

protozoa ăn vi khuẩn trong đất Các Bacteriophage kí sinh và gây vi khuẩn trong đất

Nấm Arthrobotrys conoides bắt và giết tuyến trùng trong đất bằng vòng tròn chính

chúng tạo ra (Phạm Văn Kim, 2006)

1.5 MỘT SỐ KHÁI NIỆM VỀ KÍCH KHÁNG

1.5.1 Cơ nguyên của tính kháng bệnh thụ động ở cây trồng

Ở một số giống cây trồng có mang tính kháng bệnh, khi bị mầm bệnh tấn công, cây sẽ có phản ứng để chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh, nhờ đó cây thoát khỏi bệnh hoặc chỉ bị bệnh nhẹ, không bị ảnh hưởng đáng kể đến năng suất và phẩm chất Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Cơ nguyên kháng bệnh này do nhiều cơ chế khác nhau, trong đó có thể do cây tiết ra các chất chống với sự xâm nhiễm của mầm bệnh hoặc do phản ứng tự chết của mô cây, nhờ đó cây không bị mầm bệnh gây hại (Phạm Văn Kim, 2000)

1.5.2 Cây tiết ra kháng sinh thực vật để chống lại mầm bệnh

Trong tế bào cây có gen sản sinh ra chất kháng sinh thực vật (phytoalexin) Khi không có mầm bệnh tấn công, gen này bị kìm hãm hoạt động bởi gen ức chế Nhưng khi không có mầm bệnh tấn công, gen này bị kìm hãm hoạt động bởi gen ức chế Nhưng khi có mầm bệnh tấn công, sẽ bất hoạt gen ức chế và kích thích gen kích kháng hoạt động tạo ra chất kháng sinh thực vật Đối với giống kháng bệnh, nơi tế bào bị xâm nhiễm hàm lượng chất kháng sinh thựuc vật được tế bào cây tiết ra ở nồng độ cao làm ngăn cản sự phát triển sủa sợi nấm Ở giống nhiễm bệnh, hàm lượng chất kháng sinh thực vật tiết ra loãng hơn, không đủ để ngăn cản sự xâm nhiễm của nấm và ngược lại chúng kích thích sự phát triển của sợi nấm (Phạm Văn Kim, 2000)

1.5.3 Phản ứng tự chết của mô cây kháng bệnh

Trên một số giống kháng bệnh còn thấy phản ứng đặc biệt của cây khi bị nấm bệnh tấn công, từng đám tế boà bị nhiễm tự chết, cô lập mầm bệnh, khiến mầm bệnh chết theo Trong khi đó ở giống nhiễm, phản ứng tự chết chậm hơ, khi tế bào bị nấm xâm nhiễm bắt đầu chết thì sợi nấm đã lan sang tế bào khác và tiếp tục phát triển (Phạm Văn Kim, 2000)

1.5.4 Sự kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng (tính kháng bệnh chủ động) 1.5.4.1 Khái niệm

Kích thích tính kháng thường gọi tắt là “kích kháng”, là sự kích thích tính kháng bệnh của thực vật Hiện tượng này làm cho cây trồng bi nhiễm trở nên có khả năng kháng được bệnh ở mức độ nào đó sau khi xử lý chất kích kháng Phương pháp kích kháng không có tác dụng loại trừ trực tiếp mầm bệnh như những thuốc trừ dịch hại thông thường mà dựa trên sự kích thích tính kháng của những cơ chế tự nhiên của cây trồng Chất kích kháng có thể là một loài vi sinh vât không gây bệnh, không mang tính độc đối với cây trồng hoặc có thể là một loại hoá chất nào đó không độc và không

có tác động trực tiếp như nông dược (Phạm Văn Kim, 2000)

1.5.4.2 Sự kích kháng theo cơ chế phụ thuộc Salicylic acid (SA) (Systemic Acquired Resistance = SAR)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Sự kích kháng tại chỗ (Local Acquired Resistance (LAR) Khi mầm bệnh

xâm nhiễm vào bộ phận nào của cây có tiếp xúc chất kích kháng sẽ kích thích cây sản sinh ra các hoá chất để tạo ra sự kháng bệnh tại nơi ấy Các hoá chất chỉ có tác dụng tại nơi kích kháng (Phạm Văn Kim, 2000)

- Sự kích kháng lưu dẫn (Systemic Acquired Resistance (SAR) Kích kháng

lưu dẫn là hiện tượng khi cây trồng được xử lý bởi các tác nhân kích kháng mà còn phát triển đến mô cây cách xa điểm kích thích hoặc toàn cây, giúp cho cây trồng có khả năng tự vệ và chống lại với mầm bệnh (Phạm Văn Kim, 2000)

Theo Lăng Cảnh Phú (2001) thì Lawton (1994) báo cáo rằng kích kháng lưu dẫn xuất hiện trong một vài ngày sau khi lây nhiễm với vật kích thích và kết thúc trong một vài tuần

1.5.4.3 Sự kích kháng theo cơ chế không phụ thuộc Salicylic acid (SA) (Induced Systemic Resistance = ISR)

Vi khuẩn và nầm thường được sử dụng như tác nhân sinh học trong nghiên cứu kích kháng bệnh cây trồng Các vi sinh vật này phải không tác dụng đối kháng với mầm bệnh ISR thường được kích thích hình thành do vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thựcvật (plant growth promoting rhizocbacteria) nên còn đươc gọi là PGPR- mediated resistance ISR cũng có thể biểu hiện tại chỗ (Local Acquired Resistance) hoặc lưu dẫn (Induced Systemic Resistance) (Van Loon, 1998)

ức chế trực tiếp sinh trưởng của mầm bệnh do đó để đánh giá khả năng kích kháng lưu dẫn, vi khuẩn phải không có mặt ở vị trí tấn công của mầm bệnh (SAR) cho thấy mức

độ ngăn bệnh như nhau (Van Loon, 1998)

Sự kích kháng lưu dẫn không phụ thuộc vào sự phát triển của phản ứng siêu nhạy cảm nhưng có khả năng ngăn chặn tối đa việc kích thích của mầm bệnh gây ra Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vết hoại tử Trái lại, việc kích thích do vi khuẩn vùng rể không gây ra bất kỳ một triệu

chứng nào trên cây ký chủ, và tăng cường sự sinh trưởng của cây (Van Loon et al,

1998)

Theo Van Loon et al, 1998 việc đánh giá tính kích kháng lưu dẫn bằng vi

khuẩn thường cần được dựa trên một số chỉ tiêu như sau:

1.6.1 Độc tố của tác nhân gây kích thích không ảnh hưởng lên mầm bệnh

Kích kháng lưu dẫn có thể do vi khuẩn kích thích sinh ra chất trao đổi ức chế mầm bệnh, chất trao đổi sinh ra bởi vi khuẩn vùng rễ có thể di chuyển qua cây, ức chế trực tiếp mầm bệnh Một số kháng sinh sinh ra bở vi khuẩn vùng rễ như 2.4-diacetyphloro gluciol (DAP) hay phenazin-1-carboxylic acid (PCA) là độc tố đối với

cây trồng ở nồng độ cao và nó có thể kích kháng lưu dẫn (Van Loon et al 1998)

Bằng chứng tốt nhất cho kích kháng lưu dẫn là những chất trung gian của vi khuẩn vùng rễ không đối kháng với mầm bệnh trong nuôi cấy Trong 6 dòng vi khuẩn

có khả năng kích kháng lưu dẫn chống bệnh thán thu trên cây bầu bí dưa thì 5 dòng

không ức chế mầm bệnh Colletotrichum orbiculare trên môi trường muôi cấy (Van Loon et al, 1998)

1.6.2 Sự cần thiết của khoảng thời gian giữa áp dụng chất kích thích và chủng mầm bệnh

Cây trồng cần thời gian để dẫn đến trạng thái kích thích Do đó, ảnh hưởng tức thì của việc áp dụng vật kích thích lên phản ứng bảo vệ của cây là không thể tạo ra ngay Nhiều nghiên cứu cho thấy kích kháng SAR hoặc ISR thường biểu hiện trong

vài ngày đến một tuần Tính kháng ISR của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

WCS374 mồi trạng thái kích kháng lưu dẫn trong cây củ cải chống lại bệnh héo Fusarium chỉ thể hiện kcíh kháng ít nhất một ngày sau khi áp dụng vi khuẩn Trái lại,

khi dùng vi khuẩn Pseudomonas corrugata 13 và P fluoresecens C15 kích kháng lưu dẫn cây bầu bí dưa chống lại bệnh gây ra bởi Pythium aphanidermatum cho thấy khi

áp dụng vi khuẩn một tuần trước khi chủng mầm bệnh không làm giảm bệnh cũng như khi chủng đồng thời vi khuẩn và mầm bệnh Kết quả này cho thấy khoảng thời gian giữa áp dụng vi sinh vật kích thích và chủng nhiễm mầm bệnh là vấn đề cần được

nghiên cứu thêm (Van Loon et al, 1998) Gần 100 chủng vi khuẩn và 100 chủng nấm được thử chỉ có 10-15% có khả năng kích kháng trong cây đậu (Phaseolus vulgaris)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

chống lại nấm Uromyces phaseoli Kích kháng tuỳ thuộc vào thời gian giữa áp dụng

vật kích kháng và mầm bệnh, ít nhất sau hai ngày khi chủng là có phản ứng kháng Kích kháng có hiệu quả chống lại nấm ký sinh và không đặc hiệu Kích kháng giúp cho sự xâm nhập, phát triển của nấm trong mô ký chủ và sự sinh bào tử đều giảo

Schonbeck (1980) ghi nhận rằng ức chế sự nẩy mầm của bào tử nấm Uromyces phaseoli, mặc dù không tìm thấy có Phytoalexin trong dịch trích này (Van Loon et al,

1998)

1.6.3 Sự tương quan của nông độ vi khuẩn kích kháng và khả ngăng kháng bệnh

Khả năng kháng bệnh của cây chỉ thể hiện sau khi được kích thích bằng vi khuẩn kích kháng với nồng độ thích hợp Tính kháng bệnh không gia tăng thêm dù được kích thích với nồng độ vi khuẩn tăng cao hơn SAR thường duy trì trong suốt thòi gian sống của cây và mặc dù mức độ kháng bệnh biểu hiện giới hạn trong một giai đoạn sinh trưởng nhanh nhất của cây, những lá được kích thích thì duy trì tính kháng kéo dài đến giai đoạn sau, mặc dù chất kích thích thông cần hiện diện trong suốt giai đoạn sinh trưởng của cây trồng Trong quá trình tương tác, có một giai đoạn ở đó kích thích quần thể của vi khuẩn phát triển cao hơn trên ngưỡng một số yêu cầu đủ để kích kháng lưu dẫn (ISR) và nó vẫn duy trì hoạt động ngay cả nếu quần thể bị suy thoái đi Điều này trái ngược với sự ngăn chặn bệnh bằng chất ức chế trực tiếp mầm bệnh (kích thước quần thể của vật đối kháng phải cao và kéo dài với sự tồn tại của mầm bệnh)

(Van Loon et al, 1998)

Khi P.Putida 89B-27 ha y Serratia marcescens 90-166 được chủng trên hạt của

bầu bí dưa trước khi trồng, quần thể của dòng 89B-27 và dòng 90-166 suy giảm theo thời gian: Ở 1 tuần sau khi trồng mật số vi khuẩn là trên 108 CFU/g rễ nhưng sau 3 tuần chỉ còn 103 CFU/g rễ Mặc dù mật số quần thể bị giảm ở rễ nhưng kích kháng lưu

dẫn vẫn duy trì (Van Loon et al, 1998)

1.6.4 Sự bảo vệ không đặc hiệu

Kích kháng bằng vi khuẩn vùng rễ có khả năng tăng cường tính bảo vệ chống lại nấm vi khuẩn và virus cũng như chống lại côn trùng và tuyến trùng Khi kích

kháng bằng Pseudomonas fluorescens WCS417 trên cây cải củ có hiệu quả chống lại bệnh héo rủ Fusarium và làm giảm sự hình thành vết bệnh hoại tử gây ra bởi vi khuẩn Pseudomonas syringae pv Tomato và nấm trên lá Alternaria brassicicola và những

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

dòng khác nhau của F oxysporum cucưmrinum Trên cây dưa, bệnh trên rễ gây ra do hai loại nấm F oxysporum f.sp cucumerinum Colletotrichum orbicullare và hai loại

được ngăn chặn bởi cùng những dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng liên quan sự kích thích kháng lưu dẫn Những kết quả này cho thấy vi khuẩn vùng rễ kích

kháng lưu dẫn hiệu quả chống lại nhiều bệnh tương tự như SAR (Van Loon et al,

1998)

1.6.5 Kích kháng tuỳ thuộc vào kiểu gen của cây

Khảo sát tính kích kháng trong cây dưa chống lại bệnh thán thư đựơc nghiên

cứu với một giống kháng và ba giống nhiễm trên cho thấy kích kháng lưu dẫn bằng Pseudomona putida 89B-27 biểu hiện trên ba giống nhiễm, trong khi kích kháng bằng Serratia marcescénc 90-166 chỉ xảy ra trong hai giống nhiễm Cả hai dòng vi khuẩn

này đều không tạo tính kháng cảm ứng trên giống kháng Những kết quả này cho thấy khả năng kích kháng thay đổi tuỳ giống trồng trọt Ngược lại, trên cây cẩm chướng khi

dùng pseudomonas fluorescens WCS417 kích kháng sẽ giúp giảm bệnh héo Fuarium

đối với giống kháng trung bình Pallas và ít kháng trong giống nhiễm Lena Những kết quả này cho thấy có sự khác nhau trong mức độ kích kháng của PGPR trong những

giống khác nhau (Van Loon et al, 1998)

Tuy nhiên, sự khác nhau về kiểu gen trong tính kích thích được quan sát trong

cải củ khi dùng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens WCS374 kích thích tìh viểu hiện cùng mức độ kháng chóng lại bệnh héo Fusarium trong 6 giống có tính kháng từ kháng đến nhiễm cao (Van Loon et al, 1998)

1.6.6 Những yếu tố của vi khuẩn liên quan đến tính kích kháng lưu dẫn ISR

- Lipopolysaccharid (LPS), trong tính kháng ISR hình thành trên cây cẩm

chướng qua xử lý với P.fluorescens WCS 417, vi khuẩn bị giết chết bằng nhiệt độ

hoặc vỏ ngoài LPS được tinh khiết đều giúp cây có hiệu quả kích kháng tương tự như

xử lý với vi khuẩn sống Điều này cho thấy LPS của vi khuẩn là một yếu tố quyết định

tính kháng của cây đối với nấm gây bệnh héo Fusarium (Van loon et al, 1998)

- Siderophores là các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp được vi khuẩn tổng hợp dưới các điều kiện mô trường nghèo sắt Chúng tạo phức với Fe3+ và hợp chất

được chuyển vào trong tế bào qua các thụ thể Siderophores của vi khuẩn P fluorescens thường là pseudobactin hoặc pyoverdins (Boopolhi & Rao, 1999)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Siderophores tinh khiết từ P fluorescens WCS347 cũng kích kháng hinh thành tính

kháng tương đương LPS vi khuẩn Như vậy siderophores cũng là nhân tố quyết định

hình thành tính kháng ISR, nhất là dưới điều kiện môi trường thiếu sắt (Van Loon et

al, 1998) Kết quả nghiên cứu trên đậu và cà chua cho thấy LPS và pseudobactín từ Pseudomonas putida WCS358 đã kích thích cây kháng bệnh theo cơ chế ISR Ngoài ra một số kháng sinh cũng có thể liên quan đến ISR (Meziane et al, 2005)

1.7 KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VI KHUẨN

Nhiều vi sinh vất sống trong vùng rễ có khả năng kích thích cây trồng phát triển gọi là nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng Nhóm vi sinh vật này giúp cây trồng cải thiện sự tăng trưởng thực vật vớ hai cơ chế: gián tiếp và trực tiếp Trong đó cơ chế gián tiếplà hạn chế sự phát triển vi sinh vật gây hại, đôi khi còn giết chết mầm bệnh còn cơ chế trực tiếp là cố định đạm, hoà tan lân khó tan, đôi khi còn giết chết mầm bệnh, còn cơ chế trực tiếp là cố định đạm, hoà tan lân khó tan, sản

xuất ra auxin hay cytokinin kích thích cây trồng phát triển (Kloepper et al, 2004)

Một trong những nguyên nhân vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật là khả năng sinh tổng hợp phytohocmon, một đặc tính phổ biến vi khuẩn liên kết thực vật Một mắt xích quan trọng trong cả quá trình bắt đầu từ việc vi khuẩn bám vào rễ đến thể hiện hiệu ứng kích thích sự phát triển của cây là phản ứng kiểm soát phytohocmon

Có 80% vi khuẩn phân lập từ vùng rễ có khả năng sản sinh IAA , chúng được nghiên cứu không chỉ vì hiệu ứng sinh lý của chúng lên cây trồng, mà còn có thể do vai trò

của phytohocmon đáp ứng sự tương tác giữa vi khuẩn - thực vật Vi khuẩn Bacillus

được phân lập từ đất trồng có khả năng sinh tổng hợp indol-acetic-acid (IAA) Khả năng sinh tổng hợp IAA trong điều kiện bất lợi có thể có vai trò chức năng rất lớn, tăng khả năng tạo mối liên kết “cây - vi sinh vật” Tạo thành mối liên kết là phương páp vấn đề dinh dưỡng bảo toàn khả năng sống sót và cuối cùng là tạo ưu thế đối với các loại vi sinh vật khác trong vùng rễ Việt IAA của vi khuẩn tham gia vào quá trình hình thành mối quan hệ “cây - vi sinh vật” ngày càng được khẳng định (Phạm Việt Cường và ctv 2003)

1.8 CƠ CHẾ ĐỐI KHÁNG CỦA VI KHUẨN

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Vi khuẩn đối kháng hạn chế sự phát triển của tác nhân gây bệnh thực vật bằng nhiều cơ chế như bằng cách tiết kháng sinh, các enzym phân huỷ vách tế bào và một

số cơ chế khác như cạnh tranh thức ăn và nơi ở với vi sinh vật gây bệnh

Theo Nguyễn Ngọc Dũng và ctv (2003) đưa ra bốn giả thuyết về cơ chế đối kháng

nấm gây bệnh của vi khuẩn Pseudomonas là: i Do vi khuẩn Pseudomonas có khả năng

tổng hợp các phức liên kết ion sắt; ii tổng hợp cyaní; iii Các chất kháng sinh và iv tổng hợp enzyme glucanase hoặc chitinase Tuy nhiên chưa xác định chúng có khả năng đối kháng theo cơ chế nào

Vi khuẩn tiết ra enzym phân huỷ vách tế bào

Vách tế bào nấm gồm nhiều thành phần như glucan chitin protein (Phạm Văn Kim, 2000) Vi khuẩn đối kháng có khả năng tiết ra các enzym có khả năng phân huỷ thành phần glucan hay chitin hoặc thành phần protein (proteolytic) của vách tế boà của nấm gây bệnh

* Nhóm vi khuẩn tiết ra enzym phân huỷ glucan (glucanlytic enzym)

Các dòng vi khuẩn Paenibcillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus sp Có

khả năng tiết ra enzyme thuộc nhóm phân giải glucan ngư cellulose, mannse và

xylannase và các enzyme phân huỷ protein của vách tế bào nấm Aphamyces cochlioides gây bệnh thối rễ trên cây củ cải đường (Nielsen và ctv 1997 được trích bở

Lại Văn Ê, 2003)

Theo Nguyễn Thị Thu Nga (2003) thì Valois và ctv, (1996) báo cáo nhóm xạ khuẩn

(Streptomyces) cũng tiết ra nhiều enzymeβ-1.3 vàβ-1.4-gluacanase phân huỷ vách tế

bào của nấm Phytophthora gây thối rễ trên cay mâm xôi (raspberry) và người ta đã tìm

được 11 chủng có khả năng làm giảm chỉ số bệnh thối rễ do nấm này khi chủng chúng lên cây con trong vườn ươm

Theo Nguyễn Thị Thu Nga (2003) thi Fridlender và ctv (1993) báo cáo rằng vi

khuẩn Pseudomonas cepacia có khả năng tiết ra enzym β-1.3-gluacanase từ môi trường tổng hợp có laminarin là nguồn cacbon Vi khuẩn này hạn chế được chỉ số bệnh

gây ra bởi cac nấm Rhizoctonia salani Sclerotia rolfsii và Pythium theo tuần tự là

85,48 và 71% Enzym được xác định có liến quan là β-1.3-gluacanase Nhiệt độ và

pH thuận hợp cho enzym này là 600C

* Nhóm vi khuẩn tiết ra enzym phân huỷ chitin (chitinlytic enzym)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Vi khuẩn tiết ra enzym phân huỷ ra chitin được tìm thấy một số chi vi khuẩn

như Micrococus, Bacillus, Streptomyces, Serratia, Acromonas, Chromobacterium, Enterobacter v.v

Theo Hamed và ctv (1996) vi khuẩn Micrococus được sử dụng trong phòng trị sinh học nấm Fusarium solani gây thối rễ trên cây cà chua Micrococus có khả năng

phân giả chitin mạnh, khi phủ hạt băng vi khuẩn này thì thấy chỉ số bệnh do nấm

F.solani và F oxysporum gây ra giảm một cách có ý nghĩa (được trích bởi Nguyễn Thị

Thu Nga, 2003)

Theo Nguyễn Thị thu Nga (2003) thì Pheban, 1997, báo cáo vi khuẩn Bacillus cereus strain 65 có khả năng tạo enzyme chitinase có khống lượng phân tử 36kDa chitinase này giúp phân giải điacetychitoibose Khi áp dụng B.cereus str 65 trực tiếp vào đất thì bảo vệ cây bông cải khỏi bệnh thối rễ do nấm Rhizoctonia solani

Cũng theo Nguyễn Thị thu Nga (2003) thì Gonzalez và ctv, 1996 báo cáo rằng vi khuẩn Serratia marescens R1 và A23 tiết ra enzym chitinase làm giảm chiều dài ống mầm nấm Mycosphaerella fijiensis

Có hơn 130 chủng vi khuẩn được phân lập có khả năng phân giải chitin đựơc

định danh gồm Acrmonas hydrophila, Serratia marrescens, Chromonasbacterium violaceum strain C-61 và C-72 Trong đó C.violaceum strain C-61 có khả năng tiết chitinase cao nhất và hạn chế được sự phát triển của nhiều loại nấm như Rhizoctoni solani., Sclerotiorum, Phytophora capsici, Pythium ultimum (park và ctv, 1995) Và

theo Chet và ctv (1991) thì vai trò của chitinase được khẳng định khi gen mã hoá

chitinase của vi khuẩn Serratia marrescens, được chuyển vào plasmid vi khuẩn Escherechia coli để thu được lượng chitinase thuần, và chitinase thuần này được chủng lên nấm Sclerotium rolfii thì thấy chóp sợi nấm bị vỡ ra rất nhanh, và chỉ số bệnh do nấm Sclerotium rolfii gây ra trên đậu, và Rhizoctonia solani trên cây bông vải

giảm có ý nghĩa trong điều kiện nhà kính (đựơc trích bởi Nguyễn Thị Thu Nga, 2003)

1.9 NHỮNG NGHIÊN CỨU DÙNG VI KHUẨN VÙNG RỂ KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG ĐỂ PHÒNG TRỊ BỆNH CÂY CÓ NGÙÔN GỐC TỪ ĐẤT TRONG NÔNG NGHIỆP

Các loài thuộc chi Bacillus như B amyloliquefaciens, B subtilis,

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

B.pasteurii.,B.cereus, B pumilus, B.mycoides, and B sphaericus được biết là có khả

năng kích kháng hay đối kháng giúp giảm bệnh do nhiều tác nhân và trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Kloepper et al 2004) Các chủng PGPR đã báo cáo thuộc chi

pseudomonas và Bacillus đều có khả năng kích thích tạo ISR, được đánh giá trong

những điều kiện khác nhau như trong nhà kính, ngoài đồng trên cà chua, ớt, dưa hấu,

dưa leo, đậu với các tác nhân gây bệnh là nấm (chết chây con Pythium sp Héo rũ Fusarium oxysporum, mốc sương Phytopthora spp đốm phấn Peronospora parasitica, đốm lá (Alternaria sp ) vi khuẩn (P syringae pv Tomato và Xanthomonas campestris pv Amoracia, và cả bệnh vius (pieterse et al 2001; Kloepper et al, 2004; Meziane et al 2005) Tuy có ít báo cáo về chi Bacillus nhưng

đa số các nghiên cứu mang tính chất ứng dụng Sản phẩm yield Shield với thành phần

hoạt chất là nội bào tử của B pumilus, chủng GB34 được đăng ký tại Mỹ năm 2003

để chống lại bệnh héo trên dưa do Erwina tracheiphila, cũng như bệnh do nấm Rhizoctonia và Fusarium Sản phẩm BioYield® với thành phần hoạt chất là 2 chủng

Bacillus: B.amyloliquefaciens GB 99 và Bacillus subtilis GB 122, được khuyến cáo

dùng để kích kháng trên cải bắp, cải bong, dưa leo, dưa hấu, ớt, cà chua chống lại nhiều tác nhân gây bệnh và kích thích tăng trưởng của cây Bioyield còn được ghi

nhận là có hiệu quả đối với bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum trên cây trồng cà chua nhiễm (Kloepper et al, 2004) Chế phẩm phòng trừ nấm gây bệnh

hại cây trồng mang tên thương mại Cedemon của Thuỵ Điển được sản xuất từ vi khuẩn

Pseudomonas Chế phẩm này được sử dụng rộng rãi ở Thuỵ Điển từ năm 1998 và từ

năm 1999 được sử dụng nhiều nước khác thuộc Cộng đồng Châu Âu Ở Việt Nam, khi

phân tích mẫu đất trồng hoặc rễ cây trồng thì sự hiện diện của Pseudomonas không cao vì vậy có htể sử dụng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang trong phòng chống

nấm gây bệnh cây trông có nguồn gốc từ đất mang lại hiệu quả (Nguyễn Ngọc Dũng

và ctv, 2003) Do đó, việc phối hợp các chủng vi khuẩn có tác động kích thích kháng theo các cơ chế khác nhau thì rất triển vọng trong cải thiện hiệu quả kiểm soát bệnh

(Pieterse et al, 2001)

Ở nước ta, chủ yếu là Trường Đại Học Cần Thơ, các nghiên cứu về SAR đã đạt được những kết quả đáng kể (Phạm Văn Kim, 2002) Tuy nhiên, chưa có những kết quả nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng nhằm quản lý bệnh Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

hại trên cây trồng Giữa tính kích kháng ISR và SAR (systemic acquired resistance, hình thành qua tác động của các tác nhân kích thích là hoá chất hoặc có nguồn gốc sinh vật, nhưng không là (PGPR) tuy có phổ tác động trùng lấp nhưng vẫn có những phổ hiệu lực riêng, và hiệu quả bảo vệ cây sẽ tăng cường khi cả hai cơ chế kháng được

kích hoạt cùng một lúc (Verhagen et al, 2004) Bên cạnh đó, Đỗ Tấn Dũng (2001)

nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn và các biện pháp sinh học để phòng trị thì sử

dụng hai vi khuẩn đối kháng đó là Bacillus subtilis (B.subtilis) và Pseudomonas fluorescens (P fluorescens) Theo ông thì hai loại vi khuẩn này thì có khả năng cạnh tranh, đối kháng, ức chế sự xâm nhiễm gây hại của Ralstonia solanacearum Tuy

nhiên, hai loại vi khuẩn này thu thập từ trường Đại học Bách khoa Zurich, Thuỵ Sĩ và được nuôi tại trường Đại Học Nông nghiệp I Hà Nội nhưng có một loại vi khuẩn nào

có khả năng cạnh tranh, đối kháng, ức chế sự xâm nhiễm gây hại của Ralstonia solanacearum được thu thập trong nước và nghiên cứu để phòng trị cây có nguồn gốc

từ đất, đặc biệt là bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum) trên cây họ cà

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP

- Dụng cụ: Thu thập mẫu: bọc, dao, phiếu điều tra và ký hiệu mẫu

- Vật liệu: Đĩa Petri, ống nghiệm, đất, môi trường

- Thiết bị:

+ Tủ lạnh dùng trữ mẫu bệnh

+Tủ cây dùng cho phân lập vi sinh vật

+ Tủ định ôn được sử dụng nuôi vi sinh vật

- Hoá chất: Pepton, K2HPO4,MgSO4

- Môi trường dinh dưỡng gồm: Môi trường khoai tây (PDA), môi trường King’B

(KB), môi trường nước trích thịt bò Công thức của các môi trường được trình bày ở phần phụ chương

Giống cà chua TN 323

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Điều tra và thu mẫu

- Chọn ruộng điều tra những ruộng có diện tích > 1000m2, có trồng các loại cây Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

trồng cạn như cà chua, ớt

- Thu thập mẫu: Chọn thu 10 điểm (mẫu)/ruộng, mỗi mẫu là một cây sinh trưởng phát triển vượt trội nhất trong ruộng coa bệnh héo rủ gồm rễ (10-20g) & đất bám vào rễ, cho vò bọc nylon riêng, ghi ký hiệu (= ký hiệu phiếu điều tra) và 1 mẫu cây bệnh Mẫu được tồn trữ ở 2-50C

2.2.2 Chuẩn bị nguồn gây bệnh và kích kháng:

2.2.2.1 Phân lập nấm Fusarium spp từ mẫu rễ

Mẫu rễ mới bị nhiễm bệnh được chọn và cắt ra thành từng đoạn khoảng 5 cm, sau khi được rửa với nước cất 3 lần và đem khử trùng bề mặt bằng dugn dich sodium hypochlorite 0.5% khoảng 1 phút, được vớt ra cho vào đĩa petri có lót giấy thấm và nước cất vô trùng, ủ trong tử định ôn 300C Sợi nấm mọc và phát triển sau 2-7 ngày được nhận dạng và cấy truyền sang môi trường PDA, có thể tiếp tục bước tách

Ròng, kế đế kiểm tra lại dưới kính hiển vi Khi xác định chính xác là nấm Fusarium

spp Thì chuyển sang môi trường PDA mặt nghiêng trong ống nghiệm, nuôi tiếp 72 giờ trước khi mang tồn trữ Sau đó tiến hành thực hiện qui trình Koch (Vũ Khắc

Nhượng và Hà Minh Trung, 1983) để khẳng định tác nhân gây bệnh

1 Khẳng định sự có mặt của vi sinh vật trong mô bệnh của cây sau khi xem bằng kính hiển vi

2 Phân lập được vi sinh vật thuần khiết

3 Tiên hành gây bệnh cho cây ký chủ dễ nhiễm bệnh nhằm mục đích đạt được triệu chứng ban đầu

4 Tái phân lập vi sinh vầt ở tổ chưc mô đã được gây bệnh

5 So sánh vi sinh vật thuần khiết ban đầu và tái phân lập: giám định

2.2.2.2 Phân lập vi khuẩn kích kháng thuộc chi Bacillus và vi khuẩn phát huỳnh quang

Đất và rễ (1g) thu từ các cây khoẻ được cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml

nướccất vô trùng, sau đó lắc trong 20 phút Vi khuẩn được phân lập từ huyền phù được tách ròng theo phương pháp chà trên mặt môi trường trong đĩa petri chứa môi trường King’s B có agar, sau đó ủ ở 300C (riêng để phân lập Bacillus, trước khi xử còn được

xử lý ở 900C trong 15 phút)

- Các dạng khuẩn lạc khác nhau được chọn và chuyển sang môi trường King’s Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

B trong ống ngiệm, nuôi ở nhiệt độ 300C, sau đó kiểm tra lại sự tinh ròng

-Tiến hành nhuộm vi khuẩn (nội bào tử) để xác định vi khuẩn thuộc chi

2.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng và đối kháng với

nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ của vi khuẩn PGPR trong điều kiện

nhà lưới

o Mục đích

- Chọn lọc các chủng vi khuẩn PGPR có khả năng kiểm soát nấm Fusarium

oxysporum gây bệnh héo rủ trên cà chua bằng cơ chế đối kháng

o Chuẩn bị

Đất trộn đều, thanh trùng ở 1210C trong 45 phút

-

- Cho đất đã thanh trùng vào chậu sành tưới cho thật ướt Hạt giống cà chua

TN-323 sạch bệnh được xử lý (tùy theo nghiệm thức) được ngâm ủ và chọn những hạt nảy mầm tốt gieo thẳng vào chậu với 5 hạt/chậu Sau khoảng 1 tuần tỉa cây còn lại 4 cây/chậu

- Các vi khuẩn để đánh giá khả năng kháng bệnh héo rũ được nhân trong môi trường King’B lỏng trong ống nghiệm ở 36 giờ trước khi xử lý kích kháng

- Nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ được nhân mật số trong đĩa petri

trên môi trường PDA trong 7 ngày Sau đó dùng lam đếm để xác định mật số (107

cfu/ml) trước khi đem chủng tấn công

o Tiến hành

- Thí nghiệm được tiến hành với 22 nghiệm thức (10 PGPR và 12 đối chứng):

I Đối chứng 1:Không chủng bệnh & không xử lý vi khuẩn đối kháng

Đối chứng 2:Chủng bệnh & không xử lý vi khuẩn đối kháng

II

III Đối chứng 3-12: Không chủng bệnh và có xử lý vi khuẩn đối kháng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu