XÁC ĐỊNH cấu TRÚC và KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN của CHIẾT CHẤT CHỨA TRONG CAO XUÂN HOA được LY TRÍCH BẰNG CHLOROFORM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD ………… ………… LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ CHĂN NUÔI THÚ Y ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHIẾT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD

………… …………

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ CHĂN NUÔI THÚ Y

ĐỀ TÀI

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHIẾT CHẤT CHỨA TRONG CAO

XUÂN HOA (PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM)

ĐƯỢC LY TRÍCH BẰNG CHLOROFORM

Giáo Viên Hướng Dẫn Sinh Viên Thực Hiện

MSSV: 3022072

Cần Thơ, 2/2007 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD

BỘ MÔN THÚ - Y

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHIẾT CHẤT CHỨA TRONG CAO

XUÂN HOA (PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM)

ĐƯỢC LY TRÍCH BẰNG CHLOROFORM

Cần Thơ, Ngày… Tháng… Năm 2007 Cần Thơ, Ngày… Tháng… Năm 2007

HUỲNH KIM DIỆU

Cần Thơ, Ngày… Tháng… Năm 2007 DUYỆT KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay vấn đề chăm sóc sức khoẻ cộng đồng đang được đặt biệt quan tâm Nhiều loại bệnh mới lạ xuất hiện, một vài loại ung thư, một số bệnh mãn tính hầu như các loại thuốc tổng hợp không còn tác dụng đặc trị Một trong những tác nhân làm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người là việc kháng thuốc của các loài vi khuẩn Đây là vấn đề hết sức nghiêm trọng, thêm vào đó dư lượng thuốc, kháng sinh còn tồn đọng trong các sản phẩm động vật được xem là mối nguy hiểm tiềm ẩn cho sức khoẻ con người

Trên thế giới cây Xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum) chưa được nghiên cứu cả về

hoạt tính sinh học và hoá học.Tuy nhiên các nghiên cứu bước đầu ở Việt Nam cho thấy lá Xuân hoa có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mốc và nấm men, đặc biệt là kháng vi

khuẩn Escherichia coli ở đường tiêu hoá Ngoài ra cao đặc lá xuân hoa còn có tác dụng ức

chế quá trình peroxy hoá màng tế bào và có xu hướng bảo vệ tế bào gan Loài cây nầy có thể chữa được rất nhiều bệnh như vết xước, chấn thương, đau dạ dày, viêm ruột kết, cao huyết áp, viêm thận và tiêu chảy không những ở người mà còn ở động vật

Với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu sâu hơn cho việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên nhằm giảm hoặc thay thế vai trò của các thuốc kháng sinh dùng trong chăn nuôi cũng như bảo vệ sức khoẻ con người Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định cấu trúc và khả năng kháng khuẩn của chất chiết chứa trong cao Xuân Hoa

(Pseuderathemum palatiferum) được ly trích bằng chloroform”.Thử tính kháng khuẩn của

hợp chất tìm được, từ đó làm nền tảng cho những nghiên cứu sâu hơn

1.2 Mục tiêu của đề tài

Tìm ra những phân đoạn của cao chloroform có tác dụng kháng khuẩn và từ đó tinh sạch chất có hoạt tính trong những phân đoạn này, định danh và xác định cấu trúc hoá học của chúng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Tên thường gọi: Cây xuân hoa, cây hoàn ngọc, cây con khỉ

Cây xuân hoa là loại cây bụi cao 1-2 mét sống nhiều năm, thân non màu xanh lục, phần già hoá gỗ màu nâu, phân thành nhiều cành mảnh Lá mọc đối có cuống, phiến lá hình mũi mác, hai đầu nhọn, dài 12-17 cm, rộng 3.5-5 cm, mép lá nguyên, gốc lá hơi men xuống, hai mặt phiến lá có ít lông che chở đa bào ngắn và lông tiết có chân đơn bào, đầu

đa bào dọc gân giữa có nhiều lông hơn, cuống lá dài 1.5-2 cm

Cụm hoa dài 10-16 cm, ở kẻ lá hoặc đầu cành gồm các xim ngắn ở các mấu, hoa lưỡng tính không đều, năm lá đài rời tồn tại đến khi quả già Tràng hợp màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 25 mm, có năm thuỳ chia làm hai môi, môi trên gồm hai thuỳ nhỏ dính liền nhau đến nữa chiều dài của thuỳ, môi dưới gồm ba thuỳ to, thuỳ màu tím, hai nhuỵ lép nhỏ đính ở hai gốc hai chỉ nhụy, bầu trơn nhẵn dài khoảng1.5 mm, hai lá noãn liền nhau tạo thành bầu hai ô, vòi nhuỵ dài khoảng 25-27 mm, nữa dưới của vòi có lông, hai phần ba vòi phía trên có màu tím nhạt, quả nang hai ô, mỗi ô chứa hai hạt, cây ra hoa từ tháng tư đến tháng năm.( hình1 )

Hình 1: Cây Xuân Hoa

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.1.2 Vùng phân bố

Hiện nay cây xuân hoa được trồng ở nhiều nơi như một loại thuốc gia đình Cây mọc hoang ra hoa gần như quanh năm.Gần đây được phát hiện mọc hoang ở vườn quốc gia Cúc Phương(Ninh Bình),rừng Bình Nguyên (Phạm Hoàng Hộ,1999)

2.2 Thành phần hoá học

Hiện nay, trên thế giới chưa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hoá học của cây xuân hoa, chỉ có một số công trình nghiên cứu bước đầu về cây nầy ở Việt Nam Trong các công trình nghiên cứu về thành phần hoá học của lá xuân hoa người ta đã tìm thấy β-sitosterol, Phytol, 3-O-( β- D glucopyranosyl)-Sitosterol, hỗn hợp gồm hai đồng phân epime stigmasterol và poriferasterol, n-pentacosan -1- ol và hỗn hợp của kaumpferol 3-methyl ether 7-O – β-glucoside và apigenin 7-O - β -glucoside

Theo Nguyễn Văn Hùng et al (2004), đã phân lập đươc tiếp theo là:1-triacontanol glycerol 1-hexdecanoate, axit palmitic và axit salicylic

Tám hợp chất Dotriacontan, Phytol, Squalen, 24 - metylencyloartanol, Loliolide, sitosterol, β-sitosterol 3 β-O-D-glucopyranoside và stigmasterol 3β-O-D-glucopyranosid

β-lần đầu tiên được cô lập trong lá cây xuân hoa Pseuderanthemum palatiferum(Nees)

Radlk, họ Ô rô (Ancathaceae) của Trần Kim Thu Liễu et al, (2006)

= Triacontanol: Là chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 87-88 0

C, là một Ancol no bậc một, không phân nhánh với công thức phân tử là: C30H62O

= Glycerol 1- hexadecanoate: Dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 65-67 0

C Glycerol 1- hexadecanoate là một mono-ester của glycerin với acid Pamitic và công thức phân tử là C19H38O34, trọng lượng phân tử 344

= Axit Palmitic: Là chất rắn màu trắng, nóng chảy ở 48-510

C, có đặc trưng của một acid béo no mạch thẳng

= Acid Salicilic: Thu được dưới dạng tinh thể hình kim,không màu nóng chảy ở

140-142 0C, phân tử đơn giản chỉ gồm 7 nguyên tử cacbon, trong đó 6 nằm trong nhân

Benzen, cacbon còn lại nằm trong nhóm carboxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm.Công thức phân tử là : C7H6O3

Một số công thức cấu tạo được phân lập từ cây xuân hoa:

= Lolilide: C12H18O2

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

HO OH

OHTrung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Glycoside Tim tan trong nước và cồn loãng, ít tan trong các dung môi không phân cực Glycoside tim phân bố trong khoảng 10 họ thực vật đặc biệt trong hai họ trúc đào (Apocynaceae) và họ thiên lí (Aselepiadaceae)

Cardenoid: Vòng lacton 5 cạnh, có một nối đôi

Bufadienolid: Vòng lacton 6 cạnh, có hai nối đôi

Phần đường được gắn vào C3 Cho đến nay người ta biết khoảng 40 loại đường khác nhau Ngoài những đường thông thường như glucose, rhamnose, xylose, fucose, còn có Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3 Sự liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của glycoside tim

Liên hệ giữa vòng A/B: Đa số glycoside tim có vòng A/B là cis, A/B là trans ít gặp hơn Người ta cũng ghi nhận là nếu vòng A/B có cấu tạo trans thì hoạt tính sinh học giảm hẳn với cấu tạo cis

Cấu tạo vòng lacton: Phần quyết định tác dụng lên tim là phần aglycon bao gồm nhân steroid và vòng lacton chưa bão hòa, cả hai phần này đều quan trọng

Nếu vẫn giữ lại vòng lacton, thay nhân steroid bằng nhân benzen naphtalen,…thì mất tác dụng

Nếu vẫn giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton như: bão hòa nối đôi, mở vòng lacton, thay vòng lacton bằng vòng lactam thì tác dụng mất và giảm đi rất nhiều

Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng, ruột non phụ thuộc vào số lượng nhóm OH của phần aglycon hay nói nột cách khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó Digitoxin dễ hấp thu qua đường tiêu hóa và tái hấp thu qua thận và gan vì chỉ có một nhóm OH tự do trong phần aglycon Digitoxin tích lũy trong cơ thể

Nhóm OH ở vi trí C14 rất quan trọng , không có nhóm này thì tác dụng giảm đi rất nhiều Nhóm OH ở vị trí C3 hướng a thì giảm tác dụng đi nhiều Qua quá trình chuyển hóa trong cơ thể, OH b ở vị trí C3 bị epimer hóa sang OH a để thải ra ngoài

Nếu ở dạng aglycon thì hoạt tính của nhóm bufadienolid mạnh hơn hẳn chất cardenolid Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

tương ứng

Đối với phần đường thì tác dụng sinh học của Glycoside không những chỉ phụ thuộc vào bản chất của đường mà còn phụ thuộc vào vị trí của phần đường nối vào nhân steroid Ngoài ra, người ta thấy rằng liều chết khác nhau tùy động vật Đối với mèo thì liều chết gấp đôi thỏ và khoảng 60 lần chuột cống trắng Ếch là động vật thích hợp để làm các thí nghiệm thuốc độc lên tim nhưng cóc thì hầu như miễn dịch đối với chất này Thí dụ dịch chiết của hạt Strophathus Kombe đối với mèo và chó thì độc như nhau nhưng digitoxin thì ít độc lên chó hơn lên mèo

4 Tính chất

Glycoside Tim là những chất kết tinh, không màu vị đắng, có năng suất quay cực, tan trong nước, cồn, không tan trong benzen, ether Những glycoside tim nào có đường 2-desoxy thì rất dễ bị thủy phân khi đun với acid vô cơ 0.05 N trong methanol 30 phút, trong khi những glycoside khác trong điều kiện đó thì không thủy phân được

Glucoside thì dễ bị thủy phân bởi các enzime Thường thì các enzime này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớt các đơn vị đường cuối mạch (xa aglycon) để chuyển thành các glycoside thứ cấp

Vòng lacton dễ bị mở vòng bởi tác dụng của kiềm rồi tạo thành dẫn chất iso không có tác dụng

2.2.2 Đại cương về hợp chất Flavonoid

1 Đại cương

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid Cho đến nay có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc Chỉ riêng hai nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là OH hoặc OCH3 thì theo lí thuyết có thể gặp 38627 chất Phần lớn các chất Flavonoid có màu vàng Tuy nhiên, một

số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không có màu

Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không phụ thuộc flavonoid nhưng lại

có màu vàng như carotenoid, anthranoid, Xanthon

2 Cấu trúc hóa học

Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3 Tác dụng sinh học của Flavonoid

Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như OH -, ROO - Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt của một số flavonoid theo thứ tự: Myricertin > quercetin > rhammetin > diosmtin >naringenin > apigenin > catechin > 5.7-dihydroxy-

3’,4’,5’-trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon

Flavonoid tạo được phức với các kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa Các flavonoid có 3,5,3’,4’-hydroxy có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonyl hoặc 3’,4’-orthodioxyphenol Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxyid hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào Đưa ra các chất chống oxy hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như: xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan

Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzim oxy hóa - khử Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase Enzim này làm tăng tính thấm của mao mạch, khi enzim này thừa thì gây hiện tượng xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P Các chế phẩm chứa flavonoid chiết từ các loài Citrus như

γ- pyron Dihydro γ- pyron

O

O

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Cemaflavon, Circularine…flavonoid từ lá bạc hà như Daflon, Diosmin, Flavonoid từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dược khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính “dòn” và tính thấm của mao mạch Tính dụng này được hợp lực cùng với acid ascorbic Flavonoid được dùng trong các trường hợp bị rối lọan chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, các bệnh trong nhãn khoa như xung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc Các dẫn chất anthocyanisid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm

Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc đưa vào cơ thể xúc vật thí nghiệm (CCL4, benzen, CHCL3, quinin, norarsenol…) dưới tác dụng của flavonoid ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan Việc sử dụng một số cây cỏ trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan rất hiệu quả như: cây artiso, có biệt dược là chophytol, cây bụt dấm - Hibiscus sabdariff… Tác dụng kích thích tiết mật thể hiện các chất thuộc nhóm flavanon, flavon, flavonol và flavan -3 -ol

Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản….) Thí dụ apigenin có tác dụng làm giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, acethylcholin

Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavnon, flavonol thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt

Tác dụng chống loét của flavonon và chalcon glycoside của rễ cam thảo đã được ứng dụng và chữa đau dạ dày Một số dẫn chất khác như catechin, 3-O -methycatechin cũng

đã được thử thấy có tác dụng chống loét

Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol….đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất flavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp Prostaglandin Người ta đã sử dụng rutin, citrin, leucođelphinidin, quercetin để điều trị ban đỏ, viêm da tổn thương da và màng nhày Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan 3-ol, anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, hỗn hợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp Thí nghiệm làm phục hồi tim khi bị ngộ độc bởi CHCL3, quinin, methanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp Cao chiết từ cây bạch quả Ginko biloba chứa các dẫn chất 3-rutinosid của kaempferol, quercetin, isorham metin đã được một số hãng của pháp bào chế thành biệt dược “Ginkogink” “Tanaka” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

khả năng làm việc bằng trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáo gắt

Trên hệ thần kinh một số flavon glycoside của hạt táo Ziziphus vulgarisvar, Spinosus có tác dụng an thần rõ rệt

Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất leucocyanidin, leucopelargonidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như Chrysin, Acacetin 7-O-b-D- galactopyranoside

2.2.3 Đại cương về Triacontanol

Theo Bùi Trọng Đạt (2000), triacontanol là một alcol dây thẳng, bậc nhất, bão hoà Công thức phân tử C30H62O , trọng lượng phân tử M = 438, nhiệt độ nóng chảy 85-860C(MeOH) Được cô lập lần đầu tiên từ cỏ linh lăng (Alfalfa), Medicago Sativa L Người ta tìm thấy nó trong lớp sáp của tế bào thực vật, sáp ong, lúa mì, gạo

= Triacontanol là chất điều hoà tăng trưởng thực vật,nó có khả năng kích thích tăng trưởng trên tế bào của cây thuốc lá Catomat, khoai tây, đậu

= Triacontanol không tan trong nước, tan nhiều trong ether dầu hoả, benzene, chloroform, alcol nóng, ít tan trong alcol lạnh

= Triacontanol đã cô lập từ cây Phyllanthusa urinari: phyllanthin, hypophyllanthin, triacontanol và triacontanal từ cao hexan, trong đó phyllanthin, hypophyllanthin và triacontanol được chứng minh là có hoạt tính chống lại độc tính trên tế bào gan chuột được nuôi cấy và gây độc bởi CCL4 và cả galactosamin, còn triacontanal chỉ có hoạt tính chống lại độc tính tế bào gây ra do galactosamin

Người ta cô lập được 1- triacontanol từ cao ether dầu hoả của phyllanthus urinaria

Theo Lê Thị Lan Oanh et al,1999, trong lá xuân hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu aspastis acid, acid glutamid, aparagin, serin, glutamin, histidin, glucin, threonin, alanin, arginin, tyrosin, cystein + cystin,valin, methyonin, tryptophan, phenyllanin, isoleusin, leuocin, lysin, 4-hydroxy prolin, prolin, với hàm lượng tổng hợp khá cao (751-

1365 mg %) Đặc biệt hàm lượng isoleusin và leusin rất cao(25-150 mg % và 46-85 mg

%) Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mệt mỏi cỏ thể, thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh Với acid amin valin ảnh hưởng

sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt và hoạt động của tuyến tụỵ, một tuyến tiêu hoá quan trọng Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây xuân hoa khá cao so với các loại cây khác Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như: cd, pd, As, Cr Đáng chú ý là hàm lượng Vanadi khá cao (3,75 mg/100g lá tươi)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá xuân hoa

Chất khoáng đa

lượng

Hàm lượng (mg/100g lá tươi)

Chất khoáng vi lượng

Hàm lượng (mg/100g lá tươi)

Fe của con vẹm (24mg), 3 lần gan lợn (13mg) và 4 lần đậu tương (11mg) và gần bằng hàm lượng Fe trong củ tam thất (48,6mg).(Oanh,1999) Đây có thể l à nguồn Fe dinh dưỡng rất quí, có thể cải thiện tình trạng sinh lí tuần hoàn máu, vì Fe cần cho lợn con trong quá trình tạo hồng cầu, đặt biệt là hemoglobin Các thành phần nầy đóng vai trò quan trọng trong quá trình hô hấp và vận chuyển các chất dinh dưỡng

2.3 Hoạt tính sinh học của cây xuân hoa

Trên thế giới cây xuân hoa chưa được nghiên cứu về cả hoạt tính sinh học và hoá học Các nghiên cứu bước đầu ở việt nam cho thấy lá xuân hoa có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mốc và nấm men, đặt biệt là kháng vi khuẩn E.coli ở đường tiêu hoá Ngoài

ra cao đặc lá xuân hoa còn có tác dụng ức chế quá trình Peroxy hoá màng tế bào và có xu hướng bảo vệ tế bào gan (Nguyễn Văn Hùng et al, 2003)

2.3.1 Theo kinh nghiệm dân gian

Trong dân gian, cây Xuân Hoa được gọi là cây hoàn ngọc, cây con khỉ dùng để chữa các bệnh như: tiêu chảy, kiết lỵ, đái rắt, tiểu ra máu, viêm đại tràng

- Các bệnh về đường tiêu hoá, bệnh kèm theo chảy máu: Chảy máu dạ dày, đường ruột, phân có máu…

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh, các bệnh u xơ tiền liệt tuyến

- Các bệnh về gan, thận: viêm gan, xơ gan cổ trướng, suy thận, viêm thận cấp

- Điều chỉnh huyết áp ổn định thần kinh

- Chữa viêm loét, chấn thương: loét dạ dày, hành tá đại tràng, trĩ nội ngoại, chấn thương

sọ não,va đập gãy xương hay bắp thịt, cầm máu

2.3.2 Thử độc tính của cây xuân hoa

Theo Lê Thị Lan Oanh (1998), lá xuân hoa được nghiền trong nước cất hoặc dung dịch đệm Phosphat theo tỉ lệ 1:7, bột lá khô được chiết trong dung môi hữu cơ theo tỉ lệ 1:10 Thể huyền phù được ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 20 phút, chiết lấy dung dịch trong Dịch thu được có dạng keo sánh và gọi là dịch chiết đặc Từ dung dịch này, chuẩn bị các dịch chiết có nồng độ 50%, 25%, 10% và thử trên cá chọi Mỗi công thức thử 10 con, tỉ lệ

cá chết được theo dõi trong 5 ngày, kết quả như sau:

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 2 : Kết quả thử độc tính cây xuân hoa trên cá chọi

STT Công Thức Thời Gian(ngày) Tỉ lệ cá chết (%)

Các liều cao hơn 5,56 g/kg, 9,19g/kg,11,5g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc chuột chết, chuột có giảm hoạt động nhưng sau một giờ trở lại bình thường, chuột nằm rút vào nhau mắt lim dim thở nhẹ nhàng Qua đêm rãi rác có chuột ỉa phân nát Tất cả các chuột thí nghiệm đều không chết, chuột sống hoàn toàn khoẻ mạnh sau 48 giờ Như vậy, trên độc tính cấp cao toàn phần lá xuân hoa không thể hiện độc tính, không có LD 50

2.3.3 Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao đặc toàn phần lá cây xuân hoa

Chuột nhắt trắng nặng 25±1 g, không phân biệt giống, chia làm sáu lô mỗi lô từ 8-12 con, đảm bảo tiêu chuẩn sinh lí để thử nghiệm, chuột đem về nuôi ổn định một tuần trước khi thử nghiệm

Cao toàn phần lá xuân hoa, đã loại chlorophyl, được hoà với nước cất thành một hỗn dịch đồng nhất có hàm lượng 10mg/ml

Mô hình gây độc gan: Gây tổn thương gan chuột nhắt bằng cacbon tetrachloride (CCL4) với liều lượng: 1ml CCL4 / kg thể trọng (liều cao) hoặc 0,5 ml CCL4 / kg thể trọng (liều thấp) thấp

Chia 6 ô thành hai nhóm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Lô 1 (đối chứng sinh học): Chuột bình thường, không gây mô hình viêm gan, không dùng thuốc xuân hoa

Lô 2 (gây mô hình viêm gan dối chứng)

Ngày 1 và ngày 2: Cho mỗi chuột uống 0,5 ml dung dịch Nacl 0,9%

Ngày 3: Cho mỗi chuột uống 0,5 ml xuân hoa được 1 giờ thì tiêm CCL4(1 ml/kg thể trọng chuột cho nhóm 1 và 0,5ml/kg thể trọng chuột cho nhóm 2)

Ngày 4: Giết chuột ở các lô, lấy gan làm vi thể và làm dịch treo đồng thể, tiến hành kĩ thuật xác định khả năng ức chế Peroxy hóa Lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA

Nguyên lí của phương pháp này là xác định hàm lượng malonic dialdehyde (MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình Peroxy hóa lipid màng tế bào Sản phẩm MDA

có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở 530-532 nm

Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ MDA

Hàm lượng MDA được tính theo công thức

X = E * 30,8

Trong đó: X = Hàm lượng MDA (nm)

E = Độ hấp thụ ở 532 nm

30,8 là hệ số tắt phân tử

Kết quả: Kết quả đo MDA trong gan chuột được tóm tắt ở các bảng sau

Bảng 3: Hàm lượng MDA trong gan chuột ở liều gây mô hình là 1 ml CCL 4 / kg thể trọng

Hàm lượng men gan (AST,ALT) quá cao không đo được trên máy

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Xét nghiệm vi thể: Chưa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do thuốc điều trị

Bảng 4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng

Bảng 5: Hàm lượng men gan

Hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể

Xét nghiệm vi thể: lô chuột được uống cao toàn phần lá xuân hoa và gây mô hình nhận thấy: vùng hoại tử xung quanh tĩnh mạch trung tâm trên thùy vẫn tồn tại, các tế bào ở vùng thoái hóa đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hướng hồi phục

Kết luận: Ở liều gây ngộ độc gan 1ml CCL4/kg thể trọng, gan chuột bị hoại tử nặng, các giá trị AST, ALT tăng lên quá cao, không đọc được trên máy, nhưng hàm lượng MDA có giảm rõ rệt (14,1156-10,7091) và chưa thấy có dấu hiệu bình phục của tế bào gan Ở liều gây độc 0,5ml/kg CCl4 thể trọng, hàm lượng MDA cũng giảm rất rõ từ 11,574 xuống 6,2463 hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể, có dấu hiệu bình phục của tế bào gan.(Nguyễn Thị Minh Thu et al, 1999)

Như vậy: Cao toàn phần lá xuân hoa có tác dụng ức chế quá trình Peroxid hóa lipid màng

tế bào nghĩa là có xu hướng tác dụng bảo vệ tế bào gan

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.3.4 Ảnh hưởng bột lá xuân hoa lên sự tăng trưởng và tiêu chảy ở heo con

Theo Huỳnh Kim Diệu et al, (2006), tiến hành nghiên cứu tác dụng của cây xuân hoa, một dược thảo mới lên sự tăng trọng hàng ngày và bệnh tiêu chảy ở lợn con, thí nghiệm được thực hiện với tổng số 644 lợn con (396 lợn theo mẹ và 248 lợn cai sữa ) được lập lại

ba lần, mỗi lần 30 ngày Lá tươi hoặc bột lá khô của cây xuân hoa được cho lợn ăn hàng ngày với những lượng khác nhau với những khoảng thời gian khác nhau Liều lượng của cây xuân hoa dùng cho cả lợn theo mẹ và lợn cai sữa có thể cải thiện những thông số như tốc độ sinh trưởng tăng cao hơn, tỉ lệ tử vong, bệnh tiêu chảy và sự chậm phát triển giảm,

số lần và khoảng thời gian bệnh tiêu chảy ra cũng giảm

Liều dùng trong suốt thời gian 30 ngày có hiệu quả tốt hơn so với chỉ dùng trong 7 ngày, liều dùng bột lá 0,2g /kg thể trọng /ngày cho kết quả tốt hơn so với liều 0,1g /kg thể trọng /ngày Tác dụng của lá khô cho kết quả tương tự lá tươi

Lá xuân hoa còn có tác dụng giúp cho sinh lí lợn con khỏe mạnh Đồng thời không có phản ứng phụ của việc áp dụng cây xuân hoa trên heo con trong suốt quá trình thử nghiệm

Nghiên cứu này cho thấy khả năng dùng cây xuân hoa, đặc biệt là bột lá, có thể thay thế hoặc giảm lượng kháng sinh dùng trong chăn nuôi lợn trong tương lai

Lượng xuân hoa có tác dụng điều trị là ở mức 0,75-1,5 g lá tươi hoặc 0,15-0,3 g bột lá /kg thể trọng.(Khánh et al,1998) Mặc dù cây xuân hoa được dùng để ngăn ngừa bệnh nhưng lượng dùng trong những thử nghiệm trên ở mức thấp hơn lượng tác dụng tối thiểu

có thể tránh được các tác dụng phụ.Việc áp dụng lá tươi hoặc bột lá có thể cải thiện các thông số tính toán Những kết quả có lẽ được giải thích từ các thành phần trong cây xuân hoa như sau:

Đầu tiên là trong lá có chứa tỉ lệ các protein thô (30,8% DM) cao hơn so với cỏ voi (18,6% DM) và cây Kuzu (18,4% DM), nên có thể dùng với lượng thấp trong chế độ ăn Thứ hai lá chứa hàm lượng cao một số thành phần muối khoáng như Ca (6,5%DM ), K(4,4%DM), Mg(6,3%DM) và Fe (0,3% DM) các thành phần này có vai trò trong quá trình hô hấp và giải thích điều kiện tạo thành hồng cầu

Thứ ba là lá chứa một loại proteinase bền với nhiệt tên là pseuderantin (chiếm 0.4% protein cơ bản) có hoạt tính cao lên sự phân giải casein và do đó việc tiêu hóa sữa có thể được cải thiện bởi việc bổ sung thành phần lá

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Thứ tư là các thành phần hóa học khác hiện diện trong cây như b-Sitosterol (0,1%DM), triterpenosid saponin, 1-triacontanol (0.8g/95g dịch trích bằng Hexane), và một số tác nhân kháng khuẩn khác có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng miễn dịch của

cơ thể lợn con Tuy nhiên người ta vẫn chưa xác định rõ thành phần nào là quan trọng nhất hoặc cơ chế tác dụng như thế nào của lá tươi và bột lá xuân hoa lên cơ thể lợn con (Huỳnh Kim Diệu et al,2006)

2.4 Đại cương về vi khuẩn đường ruột

2.4.1 Định nghĩa

Họ vi khuẩn đường ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có men oxidase, lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì

có nhiều lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào

2.4.2 Hình thể

Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-) Kích thước trung bình 2-4

mm x 0,4-0,6 mm Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi Những

vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào Các thành viên của

họ vi khuẩn đường ruột không bao giờ sinh nha bào Mộ số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường

2.4.3 Tính chất nuôi cấy

Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường, có thể phát triển thành váng trên bề mặt, nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn

ở dưới đáy ống

Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc:

1 Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng

2 Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng

3 Dạng M: Hình thức phát triển này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc

có xu hướng hòa vào nhau

2.4.4 Đặc tính sinh hoá

Những đặc tính sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột: Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Di động hoặc không di động

- Lên men hoặc không lên men một số loại đường Hai loại đường thường

được xác định nhất là glucose và lactose

- Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường

- Có hay không có một số enzym Hai enzym thường được xác định

nhất là urease và tryptophanase

- Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin

hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh

- Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường

tổng hợp Ví dụ: khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons

Dựa vào tính chất chung của họ vi khuẩn đường ruột, ta có thể loại trừ hoặc xếp một vi khuẩn nào đó vào họ này Ngoài các tính chất đó, nhiều đặc tính sinh hóa khác cũng được dùng để phân loại Enterobateriaceae

2.4.5 Sức đề kháng

Vì không có khả năng hình thành nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trường Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 1000C và bởi các hoá chất sát khuẩn thông thường Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền

2.4.6 Độc tố

Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có nội độc tố Bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị li giải

Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100000 đến 500000 dalton Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhưng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ) Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị tích cực kịp thời, để chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong Nội độc tố không

bị mất tính độc ở 100oC trong 30 phút Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngoại độc tố như

S.Shiga, E.Coli loại Enterotoxigenic E.Coli (ECET) Ngoại độc tố của S.Shiga làm cho

bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này

Kháng nguyên O không bị phá huỷ ở 1000C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%

Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan

Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị che lấp bới kháng nguyên này Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để phân loại vi khuẩn Dựa vào kháng nguyên O người ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá huỷ, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn

Kháng nguyên K:

Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân

Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông

thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.Typhy)

Kháng nguyên K nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra Trong trường hợp này cần phải phá huỷ kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra được kháng nguyên này

2.4.8 Phân loại

Vấn đề phân loại của Enterbacteriaceae đã từng được tranh luận rất nhiều ngoài cách phân loại của Bergey có ba cách phân loại khác:

Cách phân loại của tiểu ban về Enterbacteriaceae thuộc Hội Vi sinh học quốc tế năm

1958 đã chia họ này thành 12 giống

Cách phân loại của Kauffmann năm 1966 Enterobateriaceae thành 3 tộc và 12 giống Cách phân loại của Ewing, năm 1986, chia Enterobacteriaceae thành 8 tộc và 14 giống Nhiều tác giả cho rằng cách phân loại của Ewing là hợp lý hơn vì nó giúp ích nhiều trong chuẩn đoán vi sinh vật và trong nghiên cứu dịch tể học Dưới đây là sơ đồ phân loại họ Enterobacteriaceae của Ewing

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 6: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột

Tộc III: Salmonelleae Giống I: Samonella

Tộc IV: Citrobactereae Giống I: Citrobacter

GIỐNG : KLEBSIELLA

Giống II: Enterobacter Giống II: Enterobacter Giống III: Hafnia Tộc V: Klebsielleae

Giống IV: Serratia Giống I: Proteus Giống II: Morganella Tộc VI: Proteae

Giống Providencia Tộc VII: Yersinieae Giống I: Yersinia

Tộc VIII: Erwinieae Giống I: Erwinia

2.4.9 Khả năng gây bệnh:

Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tuỳ theo từng giống, từng loài

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột

2.5 Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm

2.5.1 Staphyllococcus aureus

- Là vi khuẩn gram dương, không giáp mô, không tạo bào tử

- Sức đề kháng: nhạy cảm với Penicillin, Authromycin và Ampicilin

- Khả năng gây bệnh: + Sưng mủ trên da, niêm mạc

+ Gây ung nhọt, áp xe + Viêm vú ở bò cừu + Gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi,viêm thận cấp, viêm tuyến sữa và viêm tủy xương

2.5.2 Pseudomonas aeruginosa

- Là vi khuẩn gram âm, cótiêm mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh

- Khả năng gây bệnh:+ Gây bệnh mủ xanh ở động vật và người

+ Viêm bàng quang,viêm tai có mủ ở người

2.5.3 Escherichia coli

- Là vi khuẩn gram âm, không bào tử

- Sức đề kháng: nhạy cảm với chloraphenicol, Streptomycin, Sunfamid, Trimethroprim

- Khả năng gây bệnh: E.coli có sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm

thì E.coli mới gây bệnh:

+ Gây tiêu chảy

+ Bệnh phù thủng ở heo con + Viêm ruột

2.5.4 Steptococcus faecalis

- Là vi khuẩn gram dương, không di động

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Liên cầu khuẩn có ở khắp nơi trên cơ thể người và động vật, bình thường chúng cư trú ở họng và ruột, một số liên cầu khuẩn có khả năng gây bệnh cho người và động vật

- Ở người thường gặp trong nhiều bệnh nhiễm khuẩn như Eczema, mưng mủ ở phủ tạng, viêm họng, mẫn đỏ

- Ở động vật thường gây nên những chứng nung mủ, những bệnh biến chung hay cục bộ (viêm vú)

- Ở ngựa liên cầu khuẩn gây bệnh viêm hạch truyền nhiễm Adenitis Equorum

- Ở bò gây bệnh viêm buồng vú truyền nhiễm của bò sữa, bệnh bại huyết của bê

- Ở dê gây chứng nung mủ, viêm vú, viêm phổi và ngoại tâm mạc

2.6 Các phương pháp xác định tính kháng khuẩn

Theo Nguyễn Đức Minh (1975), các phương pháp xác định tính kháng khuẩn cho ta thấy

rõ phạm vi tác dụng và những hiểu biết sơ bộ về khả năng của các loại kháng khuẩn tố đang còn ở giai đoạn thô

2.6.1 Phương pháp trộn thuốc vào môi trường thạch

Chất chiết được pha loãng với dung dịch đệm có nồng độ xác định Dung dịch này trộn đều với môi trường nuôi cấy, ở nhiệt độ 48-500

C, sau đó đổ ra từng hộp chứa với một lượng nhất định Khi thạch đông lại ta cấy chủng vi sinh vật đã được chuẩn bị từ trước Dùng que cấy vô trùng cấy các chủng vi sinh vật gốc cấy lên trên bề mặt môi trường thạch thành từng vạch thẳng Để hộp chứa trong điều kiện thích hợp 370C, từ 18-20 giờ cho vi khuẩn mọc lên chúng ta nhận định kết quả bằng sự quan sát vi khuẩn mọc thành từng khuẩn lạc, hay không mọc được so với mẫu đối chứng

2.6.2 Phương pháp đục lỗ trong môi trường thạch

Trong hộp chứa đổ môi trường thạch nóng chảy, để đông lại, sau đó cấy vi khuẩn điều khắp mặt thạch Dùng ống khoan lổ có kích thước qui định khoan vào thạch để tạo ra một

lổ tròn Đổ mẫu thuốc cần nghiên cứu vào lổ tròn đó rồi để vào tủ ấm 370C sau18 giờ, đọc kết quả

Phương pháp này cho kết quả rõ ràng, do chất kháng khuẩn ngấm trực tiếp vào môi trường

2.6.3 Phương pháp thấm giấy:

Giấy thấm cắt thành hình tròn, có đường kính khoảng 33,5-34 mm, sấy vô trùng, cho các mẫu này thấm vào dung dịch có chưa chất kháng khuẩn, rồi hong khô Đặt các giấy nầy Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

lên mặt môi trường thạch đã cấy vi khuẩn, cất vào tủ ấm 370C sau 18-20 giờ đem ra đọc kết quả, chỗ thạch có chất kháng khuẩn ngấm ra vi khuẩn không phát triển được

Phương pháp này chỉ thích hợp khi phát hiện vi khuẩn có hoạt tính mạnh Ngoài ra còn ảnh hưởng khá nhiều đến lượng vi khuẩn cho vào môi trường mỗi thí nghiệm không hằng định

2.6.4 Phương pháp ống trụ của “Heatley”

Dùng hộp chứa có đường kính 10cm, đáy bằng đổ vào khoảng 10 ml môi trường thạch đã đun chảy, để cho đặc lại Đun chảy một bình môi trường trở về 42-440

C, cho vào 0,2 ml

vi khuẩn đã cấy vào canh thang mọc tốt trước đó 12 giờ, lắc đều môi trường và vi khuẩn rồi đổ ra hộp thạch nói trên một lớp mỏng khoảng 4 ml Lớp này sẽ đông lại sau 10-15 phút Đặt lên mặt thạch những vòng kim loại không rỉ, vòng này cao 9.6mm, đường kính ngoài 7,2mm, đường kính trong 5mm, mỗi vòng kim loại có khối lượng không nhẹ quá 1,7g để đảm bảo độ lún vào thạch Đổ dung dịch cần nghiên cứu vào vòng nói trên với nồng độ và khối lượng nhất định rồi nhẹ nhàng để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ Sau thời gian này ta sẽ thấy vi khuẩn phát triển thành một màu trắng đục, đều khắp mặt môi trường, còn quanh vòng kim loại có thể có một vùng trong, vùng này chứng tỏ vi khuẩn không mọc được

Phương pháp này rất thường dùng cho việc phát triển tính kháng khuẩn, có ưu điểm đảm bảo an toàn cho người thực hành kĩ thuật, ít bị nhiễm trùng, kết quả rõ rang

2.6.5 Phương pháp đào rãnh của Fleming

Phương pháp này dùng để thử nghiệm tính kháng khuẩn của các giống điều chế ra Penicillin Môi trường thạch nấu chảy đổ vào các hộp chứa, chờ cho đông lại, dùng dao nhỏ vô trùng cắt hai đường song song gần giữa hộp (hai đường này cách nhau 0,3 cm), bỏ thỏi thạch ở giữa, đổ dung dịch thuốc định thử vào rãnh, cấy vi khuẩn thành đường thẳng góc với rãnh Để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ Đọc kết quả bằng cách đo vòng vô khuẩn từ chân rãnh trở ra

2.6.6 Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ (1956)

Các mẫu thuốc thử được nghiền nát, ép thành viên hình trụ, cao 0,8 cm, đường kính 2cm Đặt những viên đó lên trên môi trường thạch, đặt hộp này vào tủ lạnh 40C trong 6 giờ Để hoạt chất kháng khuẩn từ dược liệu khuyếch tán vào môi trường Sau đó lấy ra,

1-mở nắp hộp chứa đặt vào chuông thuỷ tinh và dùng một dụng cụ đặt biệt phun lên trên mặt môi trường thạch một lớp vi khuẩn, đậy nắp lại để vào tủ ấm 370C trong 12-13 giờ Đọc kết quả bằng cách đo vùng vô khuẩn quanh viên nén

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Phương pháp này tránh được phải dùng nhiều vòng kim loại nhưng phải dùng những thiết

bị cồng kềnh khác.Cũng cần phải rất thận trọng để tránh lây lan khi phải dùng những loại

vi khuẩn độc để thí nghiệm

2.6.7 Phương pháp thử những chất kháng khuẩn bay hơi

Phương pháp này được Rundat đề xuất lần đầu tiên khi nghiên cứu chất kháng khuẩn bay hơi từ hạt đu đủ

Nội dung của phương pháp này là: dùng hai nữa hộp chứa có đường kính bằng nhau, đổ môi trường thạch nóng chảy vào nữa hộp chứa phía đáy, để cho môi trường đông lại, cấy

vi khuẩn thành từng đường thẳng, nửa hộp chứa kia để những chất tinh dầu hay những thực vật có chất bay hơi giã dập Gắn khe hở bằng băng dính hoặc parafin để vào tủ ấm

370C, sau 12-18 giờ đọc kết quả, so sánh với đối chứng, chất bay hơi có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật đem thử

Phương pháp này cho phép phát hiện được những chất bay hơi mang tính kháng khuẩn

mà các phương pháp kể trên không thể phát hiện được

2.6.8 Phương pháp sắc kí kháng khuẩn

Việc phân tích kháng khuẩn tố ở giai đoạn đầu trong quá trình nghiên cứu bằng phương pháp sắc kí giấy được nhà bác học Ichida áp dụng trước tiên, sau đó đã được nhiều người cải tiến thêm Mặc dù có rất nhiều tài liệu đề cập đến việc sử dụng phương pháp sắc kí trên giấy nhưng cho đến nay vẫn chưa có một quan điểm thống nhất về hệ thống hoá các khuẩn tố bằng phương pháp này

Phương pháp tóm tắt như sau: chất đem thử được hoà tan trong dung môi thích hợp, sau

đó dùng loại dụng cụ đặc biệt để lấy chất thử, chấm nhiều lần vào một điểm trên giấy (loại giấy riêng biệt để làm sắc kí ), đường kính của vết không quá 6-8mm Cho chạy thăm dò với từng hệ dung môi trong một bình thuỷ tinh kín đã được bão hoà trước tường không di động Trong sắc kí ngược, tờ giấy được giữ ở phía trên bình và thả đầu kia (đầu

có chấm chất thử) xuống màng đựng tường di động ngập tới 2-3 cm, cách điểm chấm thử 3-4 cm Có thể dùng phương pháp sắc kí xuôi hoặc phương pháp sắc kí vòng Sau khi đã chạy xong phần sắc kí giấy được đuổi hết dung môi và hong khô Đặt các băng giấy trên môi trường thạch đã cấy vi khuẩn, để ở nhiệt độ 37oC trong 12 giờ cho vi khuẩn phát triển ta sẽ được vùng vô khuẩn ở vết sắc kí mang hoạt tính kháng khuẩn

Phương pháp này có ưu điểm tách biệt được chất kháng khuẩn ra khỏi nhiều chất khác Xác định được chỉ số Rf của vết kháng khuẩn, cho phép ta đi sâu nghiên cứu thành phần

và cấu trúc của chúng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.6.9 Phương pháp hiện đại của Vanden Benergher và Vlietlinck

Theo thuyết minh thử hoạt tính sinh học, phương pháp này tiến hành thử hoạt tính kháng

vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các mẫu chiết theo hai bước:

Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết có hoạt tính

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

Vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ)

Mẫu thử được hoà tan các chiết phẩm trong dung môi Dimethyl Sulfoxid (DMSO) 100

%, với 4-10 thang nồng độ được pha loãng từ dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng vi sinh vật kiểm định sau khi được hoạt hoá, pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị Mc FacLand (khoảng108 vi sinh vật /ml)

Để trong tủ ấm 37 0

C trong thời gian 24 giờ đối với vi khuẩn.Sau đó đọc kết quảvà tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC)

Mẫu thô có MIC <= 200 mg/ml, mẫu tinh có MIC <= 50 mg/ml, là có hoạt tính

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Phần 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian thí nghiệm

3.1.1 Nguyên liệu

Cây xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum)

Bộ phận dùng lá

Thu hái tại trại chăn nuôi thực nghiệm trường Đại Học Cần Thơ

3.1.2 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Đề tài được thực hiện qua 4 giai đoạn :

Giai đoạn 1: Phân lập các chất có trong cao chiết chloroform bằng phương pháp sắc kí cột và sắc kí bản mỏng Thực hiện tại phân viện Hoá Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên TPHCM Từ ngày 10/9/2006-25/9/2006

Giai đoạn 2: Thử hoạt tính sinh học của các phân đoạn thu được trên cao chiết Chloroform được điều chế từ lá xuân hoa Thời gian thực hiện từ 30/9/2006-7/10/2006 Tại phòng vi sinh cơ sở Dược Trường Đại Học Y Dược TPHCM

Giai đoạn 3: Tiếp tục chạy sắc kí cột và sắc kí bản mỏng trên các phân đoạn có hoạt tính sau khi thử tính kháng khuẩn Tại phân viện Hoá Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên TPHCM từ ngày 10/10/2006-30/11/2006

Giai đoạn 4: Gởi mẫu chạy phổ tại Phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học, Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội

3.1.3 Hoá chất cần thiết

Hoá chất dùng cho phân tích thành phần hoá học

· Xăng dung môi

- Máy cô quay : Buchi Rotavapor R-20

- Máy đo điểm chảy: Electrothermal 91000C

- Cân phân tích: Precisa XB 220A

· Max: 220g e =0,001

· Min: 0.01g d =0,0001

- Máy đo UV: Model UVGL-55

- Máy sấy bản mỏng:ROD Dryer TK-8: 1100C