HIỆU QUẢ của CHẤT điều hòa SINH TRƯỞNG BA, NAA và TDZ lên sự tái SINH CHỒI cà CHUA ( lycopersicum esculentum mill) IN VITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÂM THỊ MỸ AN HIỆU QUẢ CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG BA, NAA VÀ TDZ LÊN SỰ TÁI SINH CHỒI CÀ CHUA Lycopersicum esculentum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÂM THỊ MỸ AN

HIỆU QUẢ CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

BA, NAA VÀ TDZ LÊN SỰ TÁI SINH CHỒI CÀ CHUA

( Lycopersicum esculentum Mill) IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cần Thơ, 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HIỆU QUẢ CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

BA, NAA VÀ TDZ LÊN SỰ TÁI SINH CHỒI CÀ CHUA

( Lycopersicum esculentum Mill) IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ KHOA HỌC CÂY TRỒNG CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

…………  ………

của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và TDZ lên sự tái sinh chồi cà chua

(Lycopersicum esculentum Mill) in vitro.” do sinh viên Lâm Thị Mỹ An thực hiện Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

viên Lâm Thị Mỹ An thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp và

đã được thông qua

Luận văn được hội đồng đánh giá ở mức:

iii

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

(ký tên)

Lâm Thị Mỹ An

Quý Thầy Cô và toàn thể các bộ môn Sinh Lý – Sinh Hóa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

v

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ và Tên: Lâm Thị Mỹ An

Ngày sinh: 15/0501990

Nơi sinh: huyện Càng Long – tỉnh Trà Vinh

Họ và tên cha: Lâm Ngọc Tâm

Họ và tên mẹ: Nguyễn Thị Út

Quê quán: Xã Mỹ Cẩm – Huyện Càng Long – Tỉnh Trà Vinh

Quá trình học tập:

1996 - 2001: Trường tiểu học Càng Long B

2001 – 2005: Trường trung học cơ sở Càng Long

2005 - 2008: Trường trung học phổ thông Nguyễn Đáng

2008 -2012: Trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng Khóa 34

Người khai

(ký tên)

Lâm Thị Mỹ An

vi

LÂM THỊ MỸ AN, 2012 “Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và

tốt nghiệp kỹ sư khoa học cây trồng, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Trường Đại Học Cần Thơ

Người hướng dẫn: PGs.TS Lâm Ngọc Phương

TÓM LƯỢC

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao và có nhiều công dụng trong y học Nhiều nghiên cứu nuôi cấy in vitro trên cây cà chua được

thực hiện trên cơ quan và giống khác nhau Đề tài “Hiệu quả của chất điều hòa sinh

in vitro” được thực hiện nhằm tìm nồng độ BA, NAA và TDZ thích hợp cho sự tái sinh

chồi trực tiếp từ tử diệp cà chua Đề tài được thực hiện gồm 2 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố; 5 lần lặp lại, mỗi lần lập lại 2 keo; mỗi keo 3 mẫu

Kết quả thí nghiệm cho thấy: Môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

BA 2 mg/l cho tỷ lệ tái sinh cao 100% chồi với số chồi cao nhất 5,2 chồi và chiều cao 2,09 cm Tiếp tục bố trí thí nghiệm tái sinh chồi với sự kết hợp giữa BA và TDZ Qua thí nghiệm cho thấy môi trường TDZ 0,1 mg/l cho tỷ lệ chồi tái sinh cao nhất 96,6% và cho số chồi cao là 3,2 chồi qua 6 tuần nuôi cấy

Chương 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

viii

Chương 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

2.1.1 Vật liệu 15

2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 16 2.2.3 Bố trí thí nghiệm 16 2.2.4 Phương pháp phân tích số liệu 18

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Hiệu quả BA và NAA lên sự tái sinh chồi từ tử diệp cà chua 19

3.1.2 Tỉ lệ mẫu lá tạo chồi 20

x

DANH SÁCH BẢNG

sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4

tuần nuôi cấy

20

sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6

tuần nuôi cấy

22

sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 2

tuần nuôi cấy

24

sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4

tuần nuôi cấy

25

sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6

tuần nuôi cấy

26

và AA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4 tuần nuôi cấy

28

NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6 tuần nuôi cấy

29

xi

sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4

tuần nuôi cấy

30

sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6

tuần nuôi cấy

31

BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4 tuần

nuôi cấy

32

BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6 tuần

nuôi cấy

33

BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 2 tuần

nuôi cấy

35

BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4 tuần

nuôi cấy

36

BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6 tuần

nuôi cấy

38

và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 2 tuần nuôi

cấy

39

xii

và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4 tuần nuôi

cấy

40

và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6 tuần nuôi

cấy

41

bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 2

tuần nuôi cấy

42

bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4

tuần nuôi cấy

43

bổ sung BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6

tuần nuôi cấy

44

BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4 tuần

nuôi cấy

45

BA và TDZ với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6 tuần

nuôi cấy

46

xiii

DANH SÁCH HÌNH

nồng độ khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy

19

nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

21

nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy

22

BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy

26

NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy

29

sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy

31

trường có bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 2

tuần nuôi cấy

34

BA và TDZ ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

37

TDZ ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy

41

ĐHST Điều hòa sinh trưởng

dụng trong việc cải thiện cây trồng đó là kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy in vitro là một công cụ quan trọng của công nghệ sinh học và được ứng

dụng rộng rãi trên thế giới vì đem lại giá trị thương mại cao đối với nền nông nghiệp Trong đó, cây cà chua cũng được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện trong nuôi

cấy in vitro (Chaudhry, 2001; A A Ali., 2012) trên cơ quan và giống khác nhau (Cassells, 1979; Zapata et al, 1981) như tái sinh chồi trực tiếp từ tử diệp hoặc trục

hạ diệp (Bhatia, 2004; Abd-almajid, 2010), sản xuất cây sạch bệnh (Moghaieb et

al., 1999), tạo sẹo và tái sinh chồi bằng phương pháp nuôi cấy túi phấn (Rabello

Brasileiro et al., 1999) và trong chuyển gen (Sarker, 2009; Sung Hun Park, 2003)

Với đề tài “ Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và TDZ lên sự

tái sinh chồi cà chua (Lycopersicum esculentum Mill) in vitro” được thực hiện

nhằm mục đích xác định hiệu quả của BA, NAA và TDZ thích hợp trên sự tái sinh

chồi từ tử diệp cà chua góp phần hoàn thiện hơn hệ thống tái sinh in vitro cây cà

chua và phục vụ cho các nghiên cứu chuyển gen

Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây cà chua

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Cà chua có tên khoa học là Lycopersicon ensculentum Mill thuộc họ cà

(Solanaceae), có nguồn gốc ở vùng Trung và Nam Mỹ (Phạm Hồng Cúc, 1999) Theo Tạ Thu Cúc (2004), cà chua có nguồn gốc ở Pêru và Ecudor, trước khi Crixtop Colong tìm ra Châu Mỹ thì cà chua được trồng nhiều ở Pêru và Mêhicô Cuối thế kỷ 19, có trên 2000 dòng, giống cà chua được trồng phổ biến và rộng rãi

Cà chua là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, chứa nhiều vitamin: A, C, B1, B2, và chất khoáng: Ca, Fe, P, S, Na, K, Mg và đường Ngoài ra, cà chua có nhiều công dụng chữa bệnh như nhuận da, bảo vệ huyết quản, giảm huyết áp, hỗ trợ tiêu hoá Vì vậy, cà chua được trồng rộng rãi trên thế giới Theo tổ chức Fao 2009, diện tích trồng cà chua trên thế giới khoảng 4,9 triệu ha và sản lượng đạt 141,4 triệu tấn Theo Fas (2007) châu Á là khu vực đứng đầu về sản xuất cà chua, thứ hai là châu

Âu Trung Quốc là nước có diện tích trồng xuất khẩu cà chua lớn nhất thế giới với sản lượng 36,5 triệu tấn vào năm 2006 với 85% sản lượng dùng tươi và xuất khẩu sang các nước khác dạng nước ép là 675 ngàn tấn Mỹ có mạng lưới nhập khẩu cà chua rộng khắp Nhìn chung châu Á vẫn có diện tích trồng cà chua lớn nhất nhưng năng suất vẫn còn thấp, nơi tiêu thụ cà chua lớn nhất là châu Âu rồi đến châu Á, Bắc Mỹ và Nam Mỹ Ở Việt Nam, cà chua được trồng trên 1000 năm nay với diện tích trồng hàng năm biến động 15.000-170.00 ha với sản lượng 280.000 tấn (Tạ Thu Cúc, 2005)

1.1.2 Đặc tính thực vật

 Rễ

Cà chua có rễ chùm ăn sâu phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn Trong diều kiện tối hảo, những giống tăng trưởng mạnh có rễ ăn sâu 1-1,5 m và

rộng 1,5-2,5 m vì vậy cà chua là cây chịu hạn tốt nhất (Trần Thị Ba et al., 1999) Bộ

rễ ăn sâu hay cạn đều có liên quan tới mức độ phân cành Do đó, khi trồng cà chua

mà tỉa cành, bấm ngọn bộ rễ thường ăn cạn và hẹp hơn (Phạm Hồng Cúc, 2008) Khi gieo thẳng, rễ cà chua có thể ăn sâu tới 1,5 m nhưng ở độ sâu dưới 1 m rễ ít có khả năng hút nước và chất dinh dưỡng

 Thân

Cà chua có thân tròn thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần dần hoá gỗ (Phạm Hồng Cúc, 2007) Thân cà chua phân nhánh mạnh, số lượng cành giao động 3-19 cành và trên thân có nhiều đốt có khả năng ra rễ bất định

(Mai Thị Phương Anh, 1996; Nguyễn Văn Viên et al., 2003) Chiều cao thân cây cà

chua thay đổi trong quá trình sinh trưởng tuỳ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh

và chất dinh dưỡng (Tạ Thu Cúc, 2004)

Theo Phạm Hồng Cúc (2007), tuỳ khả năng sinh trưởng và phân nhánh các giống cà chua được chia thành 4 hình dạng:

- Dạng sinh trưởng hữu hạn (determinate): là cây ngừng sinh trưởng về chiều cao khi có chùm hoa tận cùng ở ngọn, thường cây thấp hơn 65 cm Chùm hoa thứ nhất thường xuất hiện khi cây 8-9 lá Sau đó cứ 1-2 lá lại có chùm hoa kế tiếp Nhóm này thường các giống sớm, cho hoa tập trung nhưng sớm tàn, năng suất không cao

- Dạng sinh trưởng vô hạn (indeterminate): Cây thành lập chùm hoa thứ nhất khi có 9-11 lá Sự sinh trưởng được xem là tiếp tục khi cây ra hoa nhờ vào sự sinh trưởng mạnh của chồi nách ở lá trên cùng và có chiều cao từ 120-200 cm thân lá sinh trưởng mạnh cần tỉa cành tạo tán

- Dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semideterminate): Những giống thuộc dạng sinh trưởng về căn bản cũng giống như dạng sinh trưởng hữu hạn nhưng cây sản xuất nhiều chùm hoa ở ngọn hơn trước khi kết thúc bằng chùm hoa tận ngọn, lúc này cây mới ngừng tăng trưởng

- Dạng bụi (dwart): Cà chua có lông rất ngắn, đâm chồi mạnh, ít chùm hoa, cho trái tập trung, phục vụ cho trồng dày và thu hoạch cơ giới

 Lá

Lá cà chua thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3-4 đôi lá chét, rìa lá chét có răng cưa, phiến lá thường phủ lông tơ (Phạm Hồng Cúc, 2007) Tuỳ theo đặc tính giống mà lá có màu sắc, kích thước khác nhau và lá thể hiện đầy đủ nhất sau khi cây

có chùm hoa đầu tiên (Phạm Hồng Cúc, 2008; Trần Thị Ba et al., 1999) Bộ lá có ý

nghĩa quan trọng đối với năng suất, số lá trên cây ít khi cây bị bệnh sẽ ảnh hưởng

đến năng suất quả (Tạ Thu cúc, 2004)

 Hoa

Hoa mọc thành từng chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Theo Tạ Thu Cúc (2004), cà chua tự thụ phấn do cấu tạo hoa, hoa cà chua nhờ màu sắc không sặc sỡ, không có mùi thơm nên không hấp dẫn côn trùng và quá trình phát triển mầm hoa

Số lượng hoa trên chùm thay đổi tuỳ theo giống và thời tiết, thường từ 5-20 hoa

(Trần Thị Ba et al., 1999) Hoa cà chua thuộc loại hoa hoàn chỉnh gồm: lá đài, cánh

hoa, nhị và nhụy (Tạ Thu Cúc, 2004) Số lượng hoa trên chùm dao động 2-26 hoa,

có nhiều giống số hoa trên chùm lên tới hàng trăm hoa (Mai Thị Phương Anh, 1996;

Nguyễn Văn Viên et al., 2003)

 Quả

Cà chua thuộc loại quả mọng nước, hình dạng thay đổi từ tròn đến dài (Phạm Hồng cúc, 2008) Theo Nguyễn Văn Viên và Đỗ Tấn Dũng (2003), dạng trái có thể dẹt, tròn dẹt, tròn hoặc elip, bầu dục

Theo Chu Thị Thơm et al., (2005) và Trần Thị Ba (1999) thì màu sắc của trái cà

chua phụ thuộc vào màu sắc của vỏ trái và thịt trái, màu sắc của trái thay đổi và đặc trưng theo từng giống Theo Tạ Thu Cúc (2002), trái cà chua cấu tạo từ hai đến nhiều ngăn, hầu hết các loại cà chua thuộc loại quả trung bình có 3 vách ngăn và số lượng quả trên cây là do đặc tính di truyền của giống nhưng chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng

 Hạt

Hạt nhỏ, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối Hạt nằm trong buồng chứa dịch bào kiềm chế sự nảy mầm (Phạm Hồng Cúc, 2008) Hạt nhỏ đường kính từ 1-2

mm, trọng lượng 1000 hạt từ 3-6 gam (Nguyễn Mạnh Chinh et al., 2007) Hạt khô

giữ ở độ ẩm 5,5% có thể nảy mầm tốt sau nhiều năm tồn trữ trong kho (Phạm Hồng Cúc, 2002)

1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vât

1.2.1 Tình hình nuôi cấy mô thực vật trong nước

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô thực vật đã được nghiên cứu trên 30 năm Công nghệ nuôi cấy mô thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thật sự phát triển vào 1980 Lĩnh vực được phát triển rộng rãi là lĩnh vực nhân giống là bảo quản nguồn gen cây trồng Nhiều phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia, các trung tâm công nghệ sinh học và các trang thiết bị hiện đại cũng được xây dựng ở các thành phố lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Bên cạnh đó còn có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và bảo vệ thực vật cũng được xây dựng ở các trường học, viện nghiên cứu, sở khoa học và công

nghê các tỉnh và thành phố (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

Phương pháp chọn giống nuôi cấy mô đã được áp dụng lâu đời bởi các nhà trồng hoa vì có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển Nhờ kết quả này mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây hồng/năm từ một gốc hồng

Ở miền Bắc, nhân giống vô tính thực vật được ứng dụng ở hầu hết các nông, lâm sản, bảo tồn thành công nguồn gen của các loại gỗ quý như: Vù hương, cây Đăng lấy gỗ, Chè vang Kĩ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn

DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía…

Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô Bước sang năm 2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài duy nhất có hương thơm trên thế giới Viện Sinh học Nông nghiệp Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong 50 cơ sở chuyên môn nuôi cấy mô tế bào, bước đầu cơ sở này đã

đạt những kết quả tốt: nuôi cấy các loài Phong lan, dứa Cayen, khoai tây giống siêu sạch bệnh… Hầu hết các phòng nuôi cấy mô đều có ưu thế là có sản phẩm đầu ra liên tục và ổn định (Nguyễn Thị Huyền và Lê Thị Mỹ Hạnh, 2009)

1.2.2 Định nghĩa nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô và tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ, việc nuôi cấy được duy trì dưới điều kiện kiểm soát

1.2.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô thực vật

Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4 giai doạn khác nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

In vitro Giai đoạn 0: chọn và chuẩn bị cây mẹ

In vitro Giai đoạn 1: tiệt trùng mẫu cấy

Giai đoạn 2: nhân Giai đoạn 3a: kéo dài Giai đoạn 3b: tạo rễ và tiền thuần dưỡng

In vitro Giai đoạn 4: thuần dưỡng

 Giai đoạn 0

Ta cần phải cẩn thận việc chọn lựa cây phải sạch bệnh hoặc đảm bảo điều kiện vệ sinh của cây mẹ mang đặc trưng cho giống loài và đang ở trong giai đoạn trưởng thành mạnh nhất (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Giai đoạn 1

Khử trùng đây là giai đoạn rất quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy

trình nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn nguyên liệu thật sạch không bị nhiễm để đưa vào nuôi cấy in vitro Tùy thuộc vào loại mô

thực vật và từng loại cây mà lựa chọn loại, nồng độ và thời gian xử lý hóa chất cho

thích hợp (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Một số chất thường dùng để khử trùng mẫu cấy: HgCl2, Ca(ClO)2, Na(OCl), H2O2….

 Giai đoạn 2

Chủ yếu nhân để tiếp tục cho giai đoạn 3, chồi và cây con ở giai đoạn 2 còn nhỏ chưa đủ khả năng để phát triển ngoài tự nhiên Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của chồi nách hay thông qua việc tạo cây từ phôi

vô tính

 Giai đoạn 3

Ở giai đoạn 3 là rất quan trọng đối với nuôi cấy mô vì ở giai đoạn này cây con sẽ được hình thành hoàn chỉnh và để đảm bảo cho hiệu quả sau này, vì vậy việc xác định môi trường thích hợp để cây phát triển tối ưu là rất quan trọng để có thể đem cây ra ngoài nhà lưới để thuần dưỡng Sự kéo dài các chồi ở giai đoạn 2 nhằm đạt kích thước thích hợp cho việc tạo rễ đầy đủ, nhưng ít loài thực vật nào có khả năng hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy này Nguyên nhân là do ở giai đoạn này có sự hiện điện của cytokinin đã ứng chế quá trình hình thành rễ, vì vậy cần một môi trường chuyên biệt để cảm ứng tạo rễ Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ là chất hữu cơ, chất điều hòa sinh trưởng, đa vi lượng và than hoạt tính…(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Giai đoạn 4

Giai đoạn này cây đã hoàn chỉnh (có đủ rễ, thân, lá) đưa từ ống nghiệm ra đất

là bước cuối cùng của nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ

trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo được điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể…phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.2.4 Sự hình thành mô sẹo

Xét về mặt cấu trúc mô sẹo là một khối vô định hình của các tế bào nhu mô

có vách mỏng và được sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Hay nối một cách khác là những tế bào nhu mô không có tổ chức

Xét về mặt chức năng mô sẹo là một tổ chức tế bào không phân hóa (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Mô sẹo khi hình thành sẽ gồm hai loại:

- Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất lỏng và không bào to

- Loại cứng: các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ Hình thái của sẹo phụ thuộc rất lớn vào thành phần cũng như nồng các chất ĐHST thực vật hiện diện Nồng độ auxin tăng cao kích thích mô sẹo dạng bở nhưng

khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Ceriani et al., 1992 trích từ

Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2000)

1.2.5 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy được coi là rất quan trọng trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào trong nuôi cấy Về nguyên tắc mô thực vật nuôi cấy trong môi trường cũng cần các chất dinh dưỡng giống như cây cần từ đất Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tuỳ loại cây và bộ phận nuôi cấy Tuỳ theo mục đích của nhà nghiên cứu mà cấy mô được duy trì ở trạng thái tạo mô sẹo, tạo mầm, tạo rễ hay muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh Tuy nhiên tất cả môi trường nuôi cấy bao gồm các thành phần cơ bản là nước, các nguyên tố khoáng đa-vi lượng, nguồn carbohidrate, vitamin và các chất điều hoà sinh trưởng thức vật Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một vài chất hữu cơ có thành phần xác định như amino acid, EDTA và một số chất có thành phần không xác định như: nước dừa, dịch trích nấm men, chuối, khoai tây, cà chua…

 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy mô Nước sử dụng pha môi trường nuôi cấy phải có độ tinh khiết cao Nước sử dụng trong môi trường nuôi cấy thường là nước cất một lần Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

 Khoáng

Có nhiều nguyên tố khoáng sử dụng trong môi tường nuôi cấy, mỗi nguyên tố có một vai trò riêng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Nhu cầu khoáng trong nuôi cấy mô không khác nhiều so với cây tự nhiên, cũng được cung cấp đầy đủ các khoáng đa vi lượng thiết yếu

Khoáng đa lượng

Khoáng đa lượng rất cần thiết cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của

mô cấy và chúng không gây độc (Lê Văn Hòa et al., 1999) Các nguyên tố đa lượng

cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lưu Huỳnh (S), Sodium (Na+), Choloride (Cl-) Các chất đóng vai trò rất quan trọng đối với cây trồng như Mg2+ là thành phần quan trọng trong cấu trúc diệp lục tố, Ca2+ là thành phần cấu trúc của vách tế bào

Khoáng vi lượng

Vi lượng là thành phần khoáng chiếm tỷ lệ nhỏ nhưng không thể thiếu đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của các enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molybden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe)

 Nguồn carbohydrate

Carbohyrate là nguồn cung cấp năng lượng chính cho tế bào để mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia (Lâm Ngọc Phương,

2009) Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức

dị dưỡng nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là

đều bắt buộc (Lê Trần Bình et al., 1997) Hai dạng đường thường gặp nhất trong

môi trường nuôi cấy in vitro là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử

dụng phổ biến hơn trong khoảng 2-5% (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

 Vitamin

Vitamin được sử dụng như là coenzyme và được sử dụng một lượng rất nhỏ (mg/l) (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Các vitamin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của mô cấy, nhất là khi sử dụng kết hợp với kích thích tố Các vitamin thường được

sử dụng trong nuôi cấy mô thường là các vitamin nhóm B như thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridoxin (B6), myo- inositol (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Ngoài

ra, vitamin C còn được sử dụng có nồng độ cao như là một chất chống oxy hóa

 Agar

Agar là một polysaccharide được trích từ tảo Agar được sử dụng làm giá thể trong nuôi cấy Agar trộn với nước tạo thành gel và tan ở nhiệt độ 60-1000C và đặc lại ở nhiệt độ giảm xuống 450C Do không phản ứng với chất trong môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật nên được sử dụng rộng rãi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng tới thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề của mẫu cấy như thừa nước và sự hoạt động của cytokinin (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

 pH

pH môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion khoáng, sự tạo gel của agar khi hấp khử trùng và quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Theo Murashige và Skoog (1962) nhận thấy rằng, pH 5,7-5,8 thích hợp cho sự duy trì độ hòa tan của các chất khoáng trong môi trường MS

 Nước dừa

Nước dừa bổ sung và môi trường nhằm cung cấp thêm một số chất hữu cơ cần thiết giúp tăng trưởng và phát triển Một số chất cần thiết có trong nước dừa như myo-inosytol, chất béo và một số chất điều hòa sinh trưởng như cytokinin

 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (còn gọi là các hoormone sinh trưởng) là những chất được sinh ra trong cây để điều khiển các quá trình sinh trưởng phát triển của cây Nó giữ vai trò quan trọng quyết định trong hầu hết các trường hợp nuôi cấy

in vitro (Lê Văn Hòa et al., 1997) Khả năng ảnh hưởng của chúng rất khác nhau

tùy theo nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và loại mẫu cấy Có 7 nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được phân loại là: Auxin, Gibbegellin (GA), Cytokinin, Abscisic acid (ABA), Ethylene, Brassinosteroid (BR), Salicylate (SA) (Nguyễn Minh Chơn, 2010) Trong đó hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến và có hiệu quả cao trong nuôi cấy mô là Auxin và Cytokinin (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

có tính cách phân cực

Auxin có vai trò trong nuôi cấy mô thực vật, auxin được dùng cho sự phân chia

tế bào, phân hóa rễ và ức chế sự hình thành chồi bên (Bùi Bá Bổng, 1999) Ngoài ra trong thực tiễn còn có tác dụng, để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch của quả (Dương Công Kiên, 2002)

Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là 2,4-D (Dichlophenoxy acetic acid), NAA (Naphthlen acetic acid), IBA (3- Indole butyric acid), IAA (Indole acetic acid)….Trong đó, IAA là hợp chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật nên có hoạt tính yếu hơn so với các auxin tổng hợp khác như NAA, IBA, 2,4-D Trong đó, NAA có tác dụng tạo rễ, làm tăng khả năng hô hấp

của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính của enzyme và khả năng trao đổi chất của nitơ tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường (Nguyễn Đức Thành, 2000) Auxin thường được dùng phối hợp với cytokinin để nhân chồi hay tạo rễ Nhưng đôi khi việc phối hợp cả hai loại kích thích tố trong môi trường nuôi cấy sẽ ức chế sự phát triển của chồi

Cytokinin

Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng làm tăng sự phân chia tế bào Ngoài ra, cytokinin còn kích thích pha dãn dài lẫn pha chuyên hóa, làm lá trẻ hóa (trì hoãn sự già cỗi) (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

Việc phát hiện ra cytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1955 Miller and Skoog phát hiện và chiết suất từ tinh dịch cá thu, một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ trong nuôi cấy mô gọi

là kinetin (6-furfuryl-aminopurin- C10H9N5O) Letham và Miller (1963) lần đầu tiên

đã tách được cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin Hiện nay, người ta đã phát hiện ra nhiều loại cytokinin trong các bộ phận đang sinh trưởng của cây như rễ, chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại cytokinin có nhiều ở trong nước dừa Việc thêm nước dừa vào môi trường nuôi cấy làm thuận lợi cho việc phân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô

là Kinetin, BAP (6- benzel aminopurin), BA (benzel andenin), TDZ (Thidiazuron) Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và hạn chế sự già hóa của tế bào Ngoài ra các chất này còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzyme

TDZ được xem là chất có hiệu quả trong nhân giống các loại cây thân gỗ (Malik

và Saxena, 1992), ít bị phân hủy bởi các enzyme nội sinh và có hoạt tính cao khi sử dụng ở nồng độ thấp so với các loại cytokinin khác Ở nồng độ thấp nó có thể kích thích mẫu cấy hình thành mô sẹo, chồi bất định hoặc chồi soma Tuy nhiên, TDZ lại

ức chế sự vương dài của chồi (Huettemam & Preece, 1993)

Theo Eckhaut et al., (2010) là cytokinin kích thích sự nhân chồi đỗ quyên, tuy nhiên các chồi tạo ra thường cứng và không hình thành rễ trong đều kiện invitro Vì

vậy TDZ ít được sử dụng trong giai đoạn nhân chồi nhưng TDZ lại thường được sử dụng trong tái sinh chồi

Theo nghiên cứu của Miller và Skoog (1953), không phải các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh nội sinh Tác dụng phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của mô và tế bào Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích thích sự phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự hình thành mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Das (1958) và Nitsch (1968) chỉ khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA và cảm ứng cho sự phân chia tế bào

1.2.6 Một số nghiên cứu về tái sinh chồi

Việc tái sinh cà chua bằng phương pháp in vitro phụ thuộc rất lớn kiểu gen, mẫu cấy và chất điều hòa sinh trưởng (Bhatia et al., 2004a)

Mẫu cấy được sử dụng nuôi cấy in vitro được áp dụng trên nhiều bộ phận khác nhau của cà chua: rễ (White et al., 1934), lá (McCormic et al., 1986; Gaffer et al., 1997; Öktem et al., 1999), tử diệp (VanRoekel et al., 1993), trục hạ diệp (Pozueta-

Romero et al., 2001) và hạt phấn (Lilia Willadino et al., 1999)

Nghiên cứu của Gubis et al (2004) cho thấy, môi trường nuôi cấy MS có bổ sung Zeatin 1 mg/l và IAA 0,1 mg/l cho sự tái sinh chồi từ tử diệp là tốt nhất và đạt tỷ lệ

tái sinh là 100% Một nghiên cứu khác của Chaudhry et al., (2004) cho thấy tỷ lệ

phần trăm tạo chồi cao nhất ở môi trường MS bổ sung IAA 2 mg/l + BAP 5 mg/l hoặc IAA 2 mg/l + Kn 4 mg/l với trục hạ diệp là 45,8% và tử diệp là 30,8%

Kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Mohamed et al, (2010) cho thấy môi

trường MS có bổ sung BA 2 mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo chồi tử diệp của cây

cà chua và theo Harish et al., (2010) qua nghiên cứu thấy rằng nồng độ thích hợp

thường được sử dụng để tạo mô sẹo từ tử diệp là NAA 0,5 mg/l + BAP 2 mg/l và tái sinh chồi tốt nhất ở nồng độ BAP 3 mg/l

Ngoài ra, theo báo cáo của Capote-Rodriguez et al., (2000) đã tìm ra môi trường tái sinh chồi từ lá tốt nhất trong điều kiện in vitro là môi trường MS có bổ sung

NAA 0,175 mg/l và BA 1,5 mg/l

Theo kết quả Lâm Trường Phúc (2008), đã cho thấy môi trường tốt nhất để tái sinh chồi từ lá cà chua là ở môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l Trần Thị Thủy Tiên (2011) cũng cho rằng môi trường BA 1 mg/l trên tái sinh chồi từ lá cát tường Theo Phạm Lê Tuấn (2007), trong thí nghiệm tái sinh chồi từ lá hoa cúc cho thấy môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l + IAA 4 mg/l cho tỷ lệ tái sinh cao nhất Nghiên cứu của Trần Quốc Cường (2011) thì môi trường có bổ sung thêm BA 2 mg/l + NAA 0,5 mg/l cho tỷ lệ chồi tái sinh chồi từ lá tốt nhất 88,9% và môi trường

có bổ sung TDZ 0,2 mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi, số chồi và chiều cao chồi từ lá yên

dã thảo cao nhất

Theo báo cáo của Ali et al., (2012) thì sự kết hơp giữa hai chất cytokinin BA 1

mg/l và Kin 1 mg/l là tốt nhất cho sự tái sinh chồi từ tử diệp cà chua

Theo Li et al., (2011) trên tái sinh tử diệp dưa hấu cho rằng môi trường MS có

bổ sung BA 2 mg/l + IAA 0,2 mg/l cho tỷ lệ tái sinh cao nhất 89,67% và cho số chồi cao nhất là 7,69 chồi

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Phương tiện

2.1.1 Vật liệu

Thí nghiệm được tiến hành trên giống cà chua TN 576 được cung cấp bởi công

ty giống Trang Nông

Cây con được nuôi cấy từ hạt cà chua vô trùng và có độ tuổi từ 15 ngày sau khi cấy trong môi trường MS được dùng làm vật liệu thí nghiệm

Hình 2.1 Cây con cà chua trong môi trường MS 15 ngày sau khi cấy hạt

2.1.2 Trang thiết bị và hoá chất

Trang thiết bị: Cân điện tử, nồi thanh trùng, máy đo pH, tủ sấy giấy, tủ cấy vô trùng và các dụng cụ thuỷ tinh dùng cho thí nghiệm: ống đong, keo, ống nghiệm… Hoá chất: Môi trường cở bản MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung thêm: nước dừa, vitamin (thiamin, pyridoxine, nicotinic acid), myo-inosytol Chất điều hoà sinh trưởng benzel adenin (BA), β-Naphthalen acetic acid (NAA) Các chất khác như: đường sucrose, agar, nước dừa tươi

2.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Địa điểm: phòng thí nghiệm nuôi cấy mô (nhiệt độ 26 ± 20C, cường độ chiếu sáng 1.500 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày) thuộc bộ môn Sinh Lý-Sinh Hoá, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ 01/01/2011 đến 30/4/2012

2.2 Phương pháp

2.2.1 Mẫu cấy

Hạt cà ngâm trong nước ấm 30 phút và được khử bằng Ca(OCl)2 10% trong 10 phút, sau đó được rửa lại 3 lần với nước cất đã khử trùng Hạt giống được gieo trong môi trường MS không chất điều hòa sinh trưởng, đặt trong tối 5 ngày; sau đó cây con được đem ra ngoài sáng, cây con 15 ngày tuổi được chọn lấy mẫu tử diệp (bỏ phần cuống lá) Dùng dao cắt trên mặt lá tạo vết thương rồi cấy vào môi trường thí nghiệm trong điều kiện vô trùng

2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS có bổ sung đường (30 g/l), agar (7 g/l), nước dừa tươi 10%, vitamin: Thiamin (B1) 1 mg/l, nicotinic acid (B3) 1 mg/l, pyridoxine HCl (B6) 1 mg/l, myo-inositol (0,1 g/l) và các chất điều hoà sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tuỳ theo thí nghiệm Môi trường nuôi cấy có pH từ 5,7-5,8 Mỗi keo chứa 40 ml môi trường và được hấp khử trùng

ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm trong 20 phút

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố gồm 3 nồng độ BA (0; 1; 2 mg/l) và 3 nồng độ NAA (0; 0,2; 1 mg/l), 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo 3 mẫu, gồm 9 nghiệm thức (NT) sau:

Bảng 2.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1

Nồng độ NAA (mg/l) Nồng độ BA (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi

+Tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo

- Chiều cao chồi được đo tới lá cao nhất và đo chồi cao nhất

- Số chồi được đếm là những chồi có kích thước > 0,2 mm

- Số lá được tính khi lá mở ra hoàn toàn

 Thí nghiêm 2: Hiệu quả TDZ và BA lên sự tái sinh chồi từ tử diệp cà chua

Mục đích: Tìm ra môi trường BA và TDZ thích hợp cho sự tạo chồi từ tử diệp cà chua

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố gồm 3 nồng độ BA (0; 1; 2 mg/l) và 2 nồng độ TDZ (0,05; 0,1 mg/l) với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 2 keo, mỗi keo 3 mẫu, gồm 6 nghiệm thức (NT) sau

Bảng 2.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2

Nồng độ TDZ (mg/l) Nồng độ BA (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi

- Chiều cao chồi được đo tới lá cao nhất và đo chồi cao nhất

- Số chồi được đếm là những chồi nhìn rõ và có kích thước > 0,2 cm

- Số lá được tính khi lá mở ra hoàn toàn

2.2.4 Phương pháp phân tích số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC Phân phương sai ANOVA, so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp kiểm định LSD và Duncan với mức ý nghĩa 5% hoặc 1%

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hiệu quả BA và NAA lên sự tái sinh chồi từ tử diệp cà chua

3.1.1 Ghi nhận tổng quát

Sau 2 tuần nuôi cấy thì có sự cảm ứng chồi, rễ và mô sẹo từ các vết cắt trên mẫu lá (Hình 3.1) Mô sẹo được tạo thành là những sẹo xanh chắc (Hình 3.1B) hay trắng xốp (Hình 3.1C), tùy theo các nghiệm thức có bổ sung chất ĐHST khác nhau Trong đó, sự hình thành chồi, chiều cao và lá được ghi nhận cụ thể ở tuần 4 vì sự cảm ứng của mẫu cấy với môi trường nuôi cấy tương đối chậm

Hình 3.1 Tử diệp cà chua trên môi trường có bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy: (A; B) BA 2 mg/l; (C) BA 2 mg/l + NAA 1 mg/l; (D) NAA 0,2 mg/l

D

C

3.1.2 Tỉ lệ mẫu tử diệp tạo chồi

Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, có sự khác biệt thống kê ở thời điểm 4 tuần SKC, hai nồng độ BA đều ảnh hưởng lên tỉ lệ tái sinh không khác biệt nhau về mặt phân tích thống kê, trong đó nồng độ BA 2 mg/l cho tỷ lệ tái sinh cao nhất 45,5% Đối với nồng độ NAA thì ở nghiệm thức không có bổ sung nồng độ NAA thì cho hiệu quả tái sinh cao nhất với 48,9%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức còn lại

Bảng 3.1 Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi từ tử diệp cà chua trên môi trường có bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 4 tuần nuôi cấy

Nồng độ NAA (mg/l) Nồng độ BA (mg/l)

so với các nghiệm thức còn lại Từ kết quả cho thấy, sự bổ sung thêm nồng độ NAA làm giảm đi tỷ lệ tạo chồi

Theo thí nghiệm của Trần Quốc Cường (2011) trong tái sinh chồi từ mẫu lá

dã yên thảo thì tỷ lệ tái sinh cao nhất với môi trường có bổ sung BA 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l cho tỷ lệ tái sinh là 88,9 %, trong khi ở nồng độ BA 2 mg/l + NAA 1 mg/l thì chỉ cho tỷ lệ tái sinh có 25% Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để

tạo chồi, trong khi auxin lại có vai trò ngược lại Tỷ lệ Auxin/cytokinin thấp sẽ kích thích sự tạo chồi (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Hình 3.2 Tử diệp cà chua trên môi trường có bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy: (A) BA 2 mg/l; (B) BA 2 mg/l + NAA 0,2 mg/l

Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy, đến thời điểm 6 tuần SKC, nồng độ BA có hiệu quả trên tỷ lệ tái sinh chồi, trong đó nồng độ BA 2 mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức còn lại Sự tương tác của NAA so với tuần 4 không có sự khác biệt qua phân tích thống kê, khi không bổ sung NAA thì cho tỷ lệ tái sinh cao nhất và khác biệt ở mức ý nghĩa 1%

so với các nghiệm thức còn lại

Có sự tương tác giữa BA và NAA (Bảng 3.2) lên tỷ lệ tạo chồi về mặt phân tích thống kê Nghiệm thức cho tỷ lệ tái sinh tốt nhất khi không có bổ sung NAA Trong đó, nghiệm thức BA 2 mg/l cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất 100%, khác biệt thống kê với các nghiệm thức còn lại, nhưng với nghiệm thức BA 1 mg/l thì không

khác biệt thống kê (Hình 3.3) Theo Li et al., (2011) trên tái sinh tử diệp dưa hấu

cho rằng môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l + IAA 0,2 mg/l cho tỷ lệ tái sinh cao nhất 89,67%

Bảng 3.2 Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi từ tử diệp cà chua trên môi trường có bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau ở thời điểm sau 6 tuần nuôi cấy

Nồng độ NAA (mg/l) Nồng độ BA (mg/l)

D

B

A

C

Từ kết quả trên và Hình 3.3 cho thấy ở nghiệm thức chỉ có bổ sung NAA thì các mẫu lá sau khi cấy chỉ hình thành rễ (Hình 3.3B) và phát triển rễ mạnh ở nghiệm thức NAA 0,2 mg/l Các mẫu lá chỉ cảm ứng chồi ở các nghiệm thức có nồng độ BA riêng lẻ hoặc kết hợp giữa BA/NAA với nồng độ NAA thấp Khi nồng

độ NAA tăng thì tỷ lệ cảm ứng chồi giảm, các mẫu lá phần lớn chỉ hình thành sẹo không phát triển thành chồi qua 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.3A)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) thì tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích thích sự phát sinh chồi Tương tự, theo báo cáo của Phạm Lê Tuấn (2007) trên tái sinh chồi từ cây hoa cúc cho thấy, khi sử dụng nồng độ auxin cao hơn cytokinin cho tỷ lệ tái sinh chồi rất thấp 4% ở nghiệm thức

BA 0,5 mg/l + NAA 1 mg/l

3.1.3 Tỉ lệ mẫu tạo sẹo

Thời điểm 2 tuần SKC (Bảng 3.7) cho thấy, thì nồng độ BA 1 mg/l cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 74,4%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nồng độ còn lại Ngoài ra, nồng độ NAA cũng có ảnh hưởng lên sự cảm ứng tạo sẹo, ở môi trường không bổ sung NAA cho tỷ lệ tái sinh sẹo thấp nhất 43,3%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với nghiệm thức NAA 0,2 mg/l và NAA 1 mg/l

Có sự tướng tác giữa BA và NAA sau 2 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức có bổ sung NAA 0,2 mg/l không có sự cảm ứng tạo sẹo trên mẫu lá sau 2 tuần nuôi cấy, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nhiệm thức còn lại Trong đó, các nghiệm thức BA 1 mg/l, BA 2 mg/l, BA 1 mg/l + NAA 0,2 mg/l và NAA 1 mg/l điều cho tỷ lệ mẫu lá tạo sẹo cao lần lượt là 83,2%, 89,8%, 86,6% và 90%, các nghiệm thức không có sự khác biệt với nhau về mặt phân tích thống kê

Từ đó cho thấy, tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới sự tạo chồi, rễ hay sẹo Một tỷ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi Trong khi tỷ lệ cao auxin và cytokinin thấp thích hợp cho sự tạo rễ,