Xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là ung thư hay gặp ở các nước phát triển, tỷ lệ mắc đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi. Ở khu vực Đông Nam Á, hàng năm có hơn 300.000 bệnh nhân UTĐTT mới mắc với gần 200.000 trường hợp tử vong [1]. Các nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy UTĐTT đứng hàng thứ năm sau ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư vú ở nữ giới và ung thư vòm, với tỷ lệ mắc khoảng 7,5/100.000 dân/năm, tỷ lệ nam/nữ là 1,4/1 [2]. Hiện nay, sự phát triển của ngành nội soi kết hợp sinh thiết để xét nghiệm mô bệnh học đã giúp cho bệnh UTĐTT được phát hiện sớm hơn, từ đó giúp bệnh có tiên lượng tốt hơn [3]. Ở Việt Nam, hiện đã có nhiều công trình nghiên cứu UTĐTT, về tỷ lệ mắc bệnh, nguyên nhân, một số phương pháp chẩn đoán và điều trị mà chưa đi sâu nghiên cứu cơ chế phát sinh ung thư hay sự tương tác điều hòa gen và protein trong khối u [1],[4]. Các nước có nền y học hiện đại đã áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân ung thư và đem lại những kết quả nổi bật. Khoa học đã xác định được sự ảnh hưởng của các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào cũng như sự tương tác gen đối với quá trình sinh trưởng, biệt hóa và chết theo chương trình của tế bào. Mỗi một biến đổi gen có thể làm thay đổi hoạt động sống của tế bào, biến một tế bào lành thành một tế bào ác tính hoặc gây chết tế bào [4],[5]. Bên cạnh đó, các biến đổi gen cũng làm các tế bào trở nên nhạy cảm hoặc kháng lại các tác nhân ngoại bào như các thuốc điều trị ung thư. Đây là cơ sở để các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng các loại thuốc mới, tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bào nhằm ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào ung thư, gọi là liệu pháp điều trị trúng đích [6],[7],[8]. Phương pháp này có rất nhiều ưu điểm như liều điều trị thấp, ít độc hại, hiệu quả được nâng cao một cách rõ rệt, thể trạng bệnh nhân và thời gian sống của bệnh nhân tốt hơn so với các phương pháp truyền thống như hóa trị, xạ trị. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy mức độ đáp ứng với thuốc điều trị trúng đích ở bệnh nhân UTĐTT phụ thuộc phần lớn vào tình trạng một số gen như KRAS, BRAF, NRAS [9],[12],[13]. Trong bệnh UTĐTT, đột biến gen KRAS chiếm tỉ lệ cao nhất khoảng 35% - 45%, đột biến BRAF chiếm khoảng 10% - 15% còn đột biến NRAS chiếm khoảng 3% - 6% [12],[14], [15],[16]. Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu tiến hành xác định đột biến gen KRAS, BRAF tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến hành xác định đột biến cả 3 gen KRAS, BRAF và NRAS trên bệnh nhân UTĐTT. Hiện nay, số lượng bệnh nhân mắc UTĐTT ngày càng tăng, trên thị trường đã có một số dược phẩm điều trị đích được lưu hành, việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cũng như theo dõi hiệu quả của liệu pháp điều trị đích phải dựa trên việc xác định tình trạng các gen KRAS, BRAF và NRAS. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu ‘‘Xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng’’ được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen xác định những đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS có ý nghĩa quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị đích ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. 2. Xác định tỉ lệ các dạng đột biến trên của các gen KRAS, BRAF, NRAS ở nhóm nghiên cứu.

NGễ QUỲNH DIỆP

Xác định đột biến gen KRAS, BRAF,

NRAS trong bệnh ung th đại trực tràng

Chuyờn ngành : Húa sinh

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS TRẦN VÂN KHÁNH

TS BS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa

kỹ thuật Y học, Phó Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, TrườngĐại học Y Hà Nội, người Thầy đã tận tình dìu dắt, trực tiếp hướng dẫn và tạomọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoànthành luận văn này

GS TS BS Tạ Thành Văn, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein,

Trưởng bộ môn Hóa Sinh, Phó Hiệu trưởng Trường Đại Học Y Hà Nội, đã tạođiều kiện tốt nhất cho tôi được học tập và tham gia nghiên cứu tại Trung tâm

PGS TS Nguyễn Thị Hà, nguyên Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y

Hà Nội, PGS TS Phạm Thiện Ngọc, nguyên Trưởng Bộ môn Hóa sinh, TS.BS Trần Huy Thịnh Phó Trưởng Bộ môn Hóa sinh và các Thầy, Cô Bộ

môn Hóa sinh đã luôn giúp đỡ, tận tình giảng dạy cho tôi trong suốt quá trìnhhọc tập và làm luận văn này

Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau Đại học Trường Đại học Y Hà Nội

đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong những năm học tại trường

Tôi cũng xin cảm ơn đến cử nhân Trần Quốc Đạt, cử nhân Trịnh Thị Thanh Hương cùng toàn thể các Thầy Cô, các Anh, các Chị và các bạn học

viên trong Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đãtạo mọi điều kiện và hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại Trungtâm

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và cơ quan tôi đã luônchia sẻ và động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2015

Ngô Quỳnh Diệp

Tôi là Ngô Quỳnh Diệp, học viên cao học khóa XXII Trường đại học Y

Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướngdẫn của Cô TS.BS Trần Vân Khánh

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,

trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2015

Ngô Quỳnh Diệp

ATP : Adenosine triphosphate

BRAF : Gen thuộc họ v-Raf murine sarcoma viral oncogene, mã hóa

cho protein serine/threonine – protein kinase B-raf

CT : Chụp cắt lớp vi tính hóa (computerised tomography)

CEA : Kháng nguyên ung thư phôi

EGFR : Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô

(Epidermal Growth Factor Receptor)

FDA : Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food Drug

MAPK : Mitogen-activated protein kinase

MEK : protein thuộc nhóm serine/threonine-selective protein kinase

MRI : Chụp cộng hưởng từ (magnetic resonance imaging)

mRNA : RNA thông tin (messenger RNA)

NST : Nhiễm sắc thể

PCR : Phản ứng khuếch đại chuỗi (polymerase chain reaction)

PI3K : Phosphatidyl inositol 3-kinase

PET-CT : Chụp cắt lớp phát xạ positron (positron emission tomography)

TMN : T: tumor – khối u; M: metatase-di căn; N-lymph node: hạch

lympho)

UTĐTT : Ung thư đại trực tràng

15-PGDH : 15-prostaglandindehydrogenase

LỜI CAM ĐOAN 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

MỤC LỤC 6

DANH MỤC CÁC BẢNG 10

DANH MỤC HÌNH 11

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về ung thư đại trực tràng 3

1.1.1 Dịch tễ 3

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 4

1.1.3 Chẩn đoán 6

1.1.4 Điều trị UTĐTT 11

1.1.5 Tiên lượng bệnh [49] 14

1.2 Vai trò của gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng 14

1.2.1 Con đường tín hiệu nội bào liên quan đến protein RAS/RAF 14

1.2.2 Các loại đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng16 1.2.3 Vai trò của đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong liệu pháp điều trị trúng đích bệnh UTĐTT 20

1.3 Các kỹ thuật xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS 22

1.3.1 Kỹ thuật PCR 22

1.3.2 Phương pháp giải trình tự gen 23

1.3.3 Kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 27

1.3.4 Kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions-Amplification Refractory Mutation System) 28

CHƯƠNG 2 30

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 30

2.2.2 Phương pháp tiến hành nghiên cứu 30

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất trong nghiên cứu 32

2.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị 32

2.3.2 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 32

2.4 Các quy trình kỹ thuật 33

2.4.1 Thu thập mẫu 33

2.4.2 Tách chiết DNA 34

Phương pháp quang phổ: kiểm tra độ tinh khiết của DNA tách chiết 35

2.4.3 Khuếch đại exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2, exon 3 gen NRAS bằng phương pháp PCR 36

2.4.4 Giải trình tự gen đoạn exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2, exon 3 gen NRAS 39

Thành phần 40

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 44

2.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 44

CHƯƠNG 3 45

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45

3.1 Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư 45

3.2 Kiểm tra chất lượng DNA bằng cặp mồi gen nội chuẩn GAPDH 47

3.3 Kết quả khuếch đại exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2, exon 3 gen NRAS 47

3.4 Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen 49

3.4.1 Kết quả giải trình tự gen KRAS 49

3.4.2 Kết quả giải trình tự gen BRAF 52

3.4.3 Kết quả giải trình tự gen NRAS 53

3.5 Kết quả xác định tỷ lệ đột biến gen KRAS, BRAF và NRAS 54

4.1 Bàn luận về kỹ thuật xác định đột biến 57 4.2 Bàn luận về tỷ lệ đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh UTĐTT 61 Đột biến gen BRAF trong bệnh UTĐTT: Hiện nay có hơn 30 loại đột biến BRAF

được công bố, trong đó chiếm tới 90% là kiểu đột biến V600E, xảy ra trên codon 600 chuyển acid amin Valine thành Glutamate [12] Nghiên cứu này bằng kỹ thuật giải trình tự gen đã phát hiện được 03 trường hợp mang đột biến gen BRAF chiếm tỷ lệ 6%, và tất cả đều là kiểu đột biến V600E xảy ra trên codon 600 exon 15 của gen BRAF Kết quả của nghiên cứu này là phù hợp với một số nghiên cứu khác khi thấy đột biến gen BRAF chủ yếu là kiểu Val600Glu (V600E) Như trong nghiên cứu của Jolien và cs sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen xét nghiệm cho 519 bệnh nhân UTĐTT, phát hiện 45 trường hợp mang đột biến BRAF chiếm tỷ lệ 8,7%, và 90% là kiểu đột biến điểm Val600Glu (V600E) [61] 63 Đột biến gen NRAS trong bệnh UTĐTT: Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật giải trình

tự gen xét nghiệm 50 bệnh nhân UTĐTT thể biểu mô tuyến thấy có 01 bệnh nhân mang đột biến gen NRAS kiểu Gly12Val (G12V), đột biến chuyển acid amin Glycine thành Valine tại codon 12, chiếm tỷ lệ 2% Nghiên cứu này của chúng tôi có kết quả phù hợp với một số nghiên cứu khác về tỷ lệ thấp đột biến gen NRAS trong bệnh UTĐTT Nghiên cứu của Vaughn và cs năm 2011

đã chỉ ra 21 trường hợp mang đột biến NRAS trong tổng số 513 bệnh nhân UTĐTT được lựa chọn để tiến hành xét nghiệm, chiếm tỷ lệ 4,09% [62] Nghiên cứu của Natsumi và cs năm 2010 cũng thấy đột biến gen NRAS ở bệnh nhân UTĐTT khá hiếm, phát hiện 5 trường hợp mang đột biến NRAS trong tổng số 225 bệnh nhân Nhưng nghiên cứu này phát hiện được nhiều dạng đột biến gen NRAS hơn, bao gồm Gly12Asp, Gly12Ser, Gly12Val trên codon 12; Glu61Lys (Q61K) trên codon 61, không phát hiện được đột biến nào trên codon 13 [63] Sự khác biệt này có thể do cỡ mẫu, chủng tộc và lối sống 63

KẾT LUẬN 64

LỜI CAM ĐOAN 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

MỤC LỤC 6

Bảng 1.1 Phân giai đoạn bệnh theo AJCC 2010 11

Phương pháp quang phổ: kiểm tra độ tinh khiết của DNA tách chiết 35

Bảng 2.1 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR 36

Bảng 2.2 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR 36

khuếch đại exon 2 gen KRAS 36

Bảng 2.3 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR 37

khuếch đại exon 15 gen BRAF 37

Bảng 2.4 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR 38

khuếch đại exon 2 gen NRAS 38

Bảng 2.5 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR 39

khuếch đại exon 3 gen NRAS 39

Thành phần 40

Bảng 3.1 Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA được tách chiết từ mẫu mô ung thư 46

Bảng 3.2 Tỷ lệ các dạng đột biến gen KRAS (n=15) 55

Bảng 3.3 Kết quả giải trình tự 3 gen KRAS, BRAF và NRAS 55

Bảng 4.1 Tỷ lệ các kiểu đột biến gen KRAS theo một số nghiên cứu 62

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

MỤC LỤC 6

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do UTĐTT trên thế giới 3

Hình 1.2 Đột biến gen hoạt hóa và áp chế các con đường tin hiệu trong sự phát sinh và phát triển ung thư đại trực tràng 6

Hình 1.3 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 16 Hình 1.4 Vị trí gen KRAS trên NST số 12 17

Hình 1.5 Vị trí gen BRAF trên NST số 7 17

Hình 1.6 Vị trí gen NRAS trên NST số 1 18

Hình 1.7 Tỷ lệ các dạng đột biến KRAS, NRAS, BRAF 19

trong UTĐTT theo nghiên cứu của Douliard và cs (năm 2013) [50] 19

Hình 1.8 Vai trò của đột biến gen RAS trong việc hoạt hóa gây ung thư các con đường truyền tín hiệu nội bào 22

Hình 1.9 Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP 24

Hình 1.10 Minh họa phương pháp giải trình tự gen 24

Hình 1.11 Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP 26

Hình 1.12 Giải trình tự bằng máy tự động 27

Hình 1.13 Các bước tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP [43] 28

Phương pháp quang phổ: kiểm tra độ tinh khiết của DNA tách chiết 35

Thành phần 40

Hình 3.1 Minh họa đo OD của mẫu DNA tách chiết 45

bằng máy Nanodrop 1000 của bệnh nhân mã số C12 45

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi GAPDH 47 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 2 gen KRAS (A), exon 15 gen BRAF (B), exon 2 gen NRAS (C) và exon 3 gen NRAS (D)

nhân 48 Hình 3.4 Hình ảnh đột biến G12A exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C27) 49 Hình 3.5 Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G12C exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C11) 50 Hình 3.6 Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G12D exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C41) 50 Hình 3.7 Hình ảnh đột biến G12S exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C39) 51 Hình 3.8 Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G12V exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C33) 51 Hình 3.9 Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G13D exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C16) 52 Hình 3.10 Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến V600E exon 15 gen BRAF bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C01) 52 Hình 3.11 Kết quả xác định đột biến G12V exon 2 gen NRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số mã số C17) 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là ung thư hay gặp ở các nước pháttriển, tỷ lệ mắc đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi Ở khu vực Đông Nam Á,hàng năm có hơn 300.000 bệnh nhân UTĐTT mới mắc với gần 200.000 trườnghợp tử vong Các nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy UTĐTT đứng hàng thứ nămsau ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư vú ở nữ giới và ung thư vòm, với tỷ lệmắc khoảng 7,5/100.000 dân/năm, tỷ lệ nam/nữ là 1,4/1

Hiện nay, sự phát triển của ngành nội soi kết hợp sinh thiết để xétnghiệm mô bệnh học đã giúp cho bệnh UTĐTT được phát hiện sớm hơn, từ

đó giúp bệnh có tiên lượng tốt hơn

Ở Việt Nam, hiện đã có nhiều công trình nghiên cứu UTĐTT, về tỷ lệmắc bệnh, nguyên nhân, một số phương pháp chẩn đoán và điều trị mà chưa

đi sâu nghiên cứu cơ chế phát sinh ung thư hay sự tương tác điều hòa gen vàprotein trong khối u [1], Các nước có nền y học hiện đại đã áp dụng các kỹthuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân ung thư vàđem lại những kết quả nổi bật Khoa học đã xác định được sự ảnh hưởng củacác con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào cũng như sự tương tác gen đối vớiquá trình sinh trưởng, biệt hóa và chết theo chương trình của tế bào Mỗi mộtbiến đổi gen có thể làm thay đổi hoạt động sống của tế bào, biến một tế bàolành thành một tế bào ác tính hoặc gây chết tế bào Bên cạnh đó, các biến đổigen cũng làm các tế bào trở nên nhạy cảm hoặc kháng lại các tác nhân ngoạibào như các thuốc điều trị ung thư Đây là cơ sở để các nhà khoa học nghiêncứu và ứng dụng các loại thuốc mới, tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bàonhằm ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào ung thư, gọi là liệu pháp điều trịtrúng đích Phương pháp này có rất nhiều ưu điểm như liều điều trị thấp, ítđộc hại, hiệu quả được nâng cao một cách rõ rệt, thể trạng bệnh nhân và thờigian sống của bệnh nhân tốt hơn so với các phương pháp truyền thống nhưhóa trị, xạ trị

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy mức độ đáp ứng với thuốc điềutrị trúng đích ở bệnh nhân UTĐTT phụ thuộc phần lớn vào tình trạng một sốgen như KRAS, BRAF, NRAS , Trong bệnh UTĐTT, đột biến gen KRASchiếm tỉ lệ cao nhất khoảng 35% - 45%, đột biến BRAF chiếm khoảng 10% -15% còn đột biến NRAS chiếm khoảng 3% - 6% , Tại Việt Nam, đã có một

số nghiên cứu tiến hành xác định đột biến gen KRAS, BRAF tuy nhiên chưa

có nghiên cứu nào tiến hành xác định đột biến cả 3 gen KRAS, BRAF vàNRAS trên bệnh nhân UTĐTT Hiện nay, số lượng bệnh nhân mắc UTĐTTngày càng tăng, trên thị trường đã có một số dược phẩm điều trị đích được lưuhành, việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cũng như theo dõi hiệu quả củaliệu pháp điều trị đích phải dựa trên việc xác định tình trạng các gen KRAS,BRAF và NRAS

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu ‘‘Xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng’’ được thực hiện với

hai mục tiêu sau:

1 Áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen xác định những đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS có ý nghĩa quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị đích ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

2 Xác định tỉ lệ các dạng đột biến trên của các gen KRAS, BRAF, NRAS ở nhóm nghiên cứu.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Tổng quan về ung thư đại trực tràng

1.1.1 Dịch tễ

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những ung thư phổ biếnnhất, mỗi năm trên toàn thế giới có gần một triệu ca mới mắc bệnh, chiếm từ9-10% các loại ung thư Tại Mỹ, UTĐTT là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng thứhai (sau ung thư phổi) trong các loại ung thư và đứng thứ ba về mặt tần suấtxuất hiện ở cả hai giới nam và nữ ,[19] Tỷ lệ mắc bệnh này cao nhất tại châu

Âu, Mỹ, Úc và New Zealand, thấp nhất được ghi nhận tại Ấn Độ, Nam Mỹ vàcác tiểu vương quốc Ả Rập Ở các nước Đông Nam Á, tỷ lệ mắc UTĐTTngày càng tăng cao Tại Singapore, tỷ lệ mắc bệnh hiện nay đã tăng gấp đôi sovới những năm 1980 Tại Việt Nam, theo Nguyễn Văn Hiếu (2007), tỷ lệ mắcUTĐTT là 7,5/100.000 dân, đứng thứ năm sau ung thư phế quản, ung thư dạdày, ung thư gan và ung thư vú ở nữ giới

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do UTĐTT trên thế giới

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh

1.1.2.1 Yếu tố nguy cơ

Nguyên nhân chính xác của bệnh hiện nay vẫn chưa rõ, nhưng một sốyếu tố làm tăng nguy cơ của bệnh đã được xác định gồm:

- Tuổi tác: bệnh thường gặp ở những người trên 50 tuổi Một số trườnghợp có thể gặp ở những người trẻ hơn, thậm chí là thanh niên

- Lối sống: hút thuốc lá, có chế độ ăn nhiều thịt đỏ, nhiều mỡ, ít chất xơ

sẽ có nguy cơ cao bị UTĐTT

- Polyp đại trực tràng : Các polyp mọc trên thành bên trong của đạitràng hoặc trực tràng và thường gặp ở người trên 50 tuổi Hầu hết các polyp làlành tính nhưng một số có thể trở thành ung thư

- Tiền sử cá nhân và gia đình: theo một số nghiên cứu, phụ nữ có tiền

sử ung thư buồng trứng, tử cung hay ung thư vú sẽ có tỷ lệ phát triển UTĐTTcao hơn Khoảng 20% những người UTĐTT có ít nhất một người thân tronggia đình cũng bị UTĐTT

1.1.2.2 Tính nhạy cảm di truyền

Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng xấp xỉ 20% - 25% các trườnghợp UTĐTT có liên quan đến di truyền Nhiều biến đổi cấu trúc và chức nănggen gây rối loạn một số con đường tín hiệu tế bào đã được chứng minh một cách

rõ ràng và có liên quan trực tiếp đến sự phát sinh, phát triển UTĐTT (hình 1.2).Trong giai đoạn sớm, sự gia tăng hoạt động của prostaglandin đóng vai trò rấtquan trọng trong sự hình thành khối u Tác động này có thể được tăng cườngbởi tình trạng viêm mạn tính tại chỗ hoặc sự biểu hiện quá mức của COX2 Đây

là enzym xúc tác sự tổng hợp prostaglandin E2, một chất có liên quan chặt chẽtới UTĐTT Hoạt động của prostaglandin E2 có thể gia tăng tương ứng với sự

giảm sút của 15-PGDH (15-prostaglandindehydrogenase) Khoảng 2/3 trườnghợp UTĐTT có sự gia tăng của COX2 đồng thời khoảng 80% trường hợp có sựgiảm sút hàm lượng 15-PGDH tại các tế bào ung thư

Nhiều nghiên cứu cho thấy sự rối loạn con đường tín hiệu Wnt được coi

là yếu tố bắt nguồn cho việc phát sinh ung thư Đột biến thường gặp nhấttrong UTĐTT là bất hoạt gen mã hóa protein APC Khi đó, thông tin qua conđường tín hiệu Wnt được tăng cường, dẫn đến sự gia tăng hoạt động quá mứccủa các tế bào ung thư Các tín hiệu được khởi đầu khi oncoprotein β-cateninbám vào phối tử của nó trong nhân, hoạt hóa các yếu tố điều hòa gen làm giatăng hoạt động phân bào Lượng β- catenin trong tế bào được kiểm soát bởiphức hợp chứa protein APC thông qua phản ứng ly giải protein, hơn nữa,phức hợp này còn ức chế sự tồn tại của β-catenin trong nhân tế bào

Sự bất hoạt của con đường tín hiệu p53 do đột biến trên gen kháng ungthư TP53 được coi là yếu tố quan trọng thứ hai trong sự phát triển UTĐTT.Đột biến này xảy ra với tần suất khoảng 35-55% trong tổng số người bệnhung thư Sự bất hoạt p53 là yếu tố quan trọng thúc đẩy khối u từ chuyển từgiai đoạn khởi đầu sang giai đoạn tiến triển ung thư

Ngoài ra đột biến làm bất hoạt con đường tín hiệu TGF-β cũng đóngvai trò quan trọng trong sự phát triển ung thư Khoảng 1/3 trường hợpUTĐTT chứa đột biến gây bất hoạt thụ thể TGF-β2 Thông thường, các độtbiến làm mất hoạt tính kinase của TGF-β2 hoặc làm bất hoạt các phân tử tiếptheo trong con đường tín hiệu TGF-β như SMAD4 hay SMAD2/3 và thúc đẩykhối u từ dạng biệt hóa cao thành ung thư

Một con đường tín hiệu liên quan đến bệnh sinh UTĐTT đang đượcquan tâm trong thời gian gần đây là con đường tín hiệu tyrosine kinase khởinguồn từ phân tử thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR Nếu các gen trong

con đường tín hiệu RAS/RAF xuôi dòng EGFR bao gồm KRAS, BRAF,NRAS bị đột biến sẽ dẫn đến sự rối loạn chức năng của các protein liên quan,thông qua đó khởi động quá trình hình thành ung thư Ngoài ra, đột biến gen

mã hóa các protein trong trục PI3K/AKT xuôi dòng EGFR xảy ra ở khoảng1/3 trường hợp UTĐTT Trục tín hiệu này được kiểm soát bởi PTEN Mặc dù

ít gặp nhưng đột biến PTEN cũng được tìm thấy trên những người bệnhUTĐTT ,

Hình 1.2 Đột biến gen hoạt hóa và áp chế các con đường tin hiệu trong sự

phát sinh và phát triển ung thư đại trực tràng 1.1.3 Chẩn đoán

1.1.3.1 Lâm sàng

Ung thư đại tràng: Giai đoạn sớm có triệu chứng thường nghèo nàn,thông thường được phát hiện được khi soi kiểm tra đại tràng Ở giai đoạn tiếptheo, các triệu chứng thường gặp là : đau bụng, táo bón, thay đổi thói quen đingoài, đi ngoài ra máu, khối u ổ bụng; kèm theo những biểu hiện toàn thânnhư thiếu máu, sụt cân

Ung thư trực tràng: Triệu chứng hay gặp nhất là đi ngoài ra máu (60%)

và rối loạn đi ngoài (43%) Thăm trực tràng có thể sờ thấy khối u, mức độxâm lấn và tình trạng của cơ thắt bị ảnh hưởng [1]

1.1.3.2 Cận lâm sàng

* Nội soi đại trực tràng kèm sinh thiết:

Là phương pháp cận lâm sàng chẩn đoán chính xác nhất và có thể tiếnhành ở nhiều cơ sở y tế chuyên khoa để xác định UTĐTT Nội soi đại trựctràng có thể xác định chính xác vị trí khối u, tiến hành sinh thiết để xétnghiệm tế bào và thực hiện các thủ thuật can thiệp như cắt bỏ polyp Nhữngtiến bộ trong kỹ thuật nội soi hiện nay cho phép khám, phát hiện sớm nhữngtrường hợp UTĐTT dù khối u còn rất nhỏ

* Giải phẫu bệnh:

Hình ảnh đại thể là một trong 4 dạng:

- Ung thư thể sùi hay dạng polyp: Tổn thương có thể rộng, lồi ra ngoài

và thường có hình nhú nhiều nhung mao

- Ung thư thể loét sùi: có hình ảnh loét trên khối sùi

- Ung thư thể thâm nhiễm: Nhiễm cứng và dày vách đại tràng màkhông có loét trên niêm mạc

- Ung thư thể hỗn hợp

Mô bệnh học UTĐTT gồm 5 loại: ung thư biểu mô tuyến, u thần kinh nội tiết, u hắc tố đại, sarcoma (cơ trơn, mạch máu, mỡ, sợi) và lymphoma.Trong đó, thể ung thư biểu mô tuyến chiếm hơn 95% ung thư đại trực tràng.Thể ung thư biểu mô tuyến của ống hậu môn chiếm 1-2%, còn lại là sarcom

-cơ trơn, u hắc tố hoặc u lympho ác tính

* Chụp X quang đại tràng có thụt Barium:

Hình ảnh khối u là khối nhô vào lòng đại tràng với đường bờ khôngđều, lòng đại tràng bị hẹp Phương pháp này thường chỉ phát hiện thấy nhữngkhối u đã có kích thước lớn Kỹ thuật chụp đối quang kép có thể phát hiệnkhối u ở giai đoạn sớm

* Chụp cắt lớp vi tính hóa (CT) hoặc chụp cộng hưởng từ (MRI):

Hai kỹ thuật này giúp đánh giá mức độ xâm lấn và tình trạng di căn củakhối ung thư Với những người bệnh không chấp nhận soi đại trực tràng hoặcnhững người bệnh có khối u trực tràng lấp kín đường vào thì CT và MRI rấthữu ích cho chẩn đoán và tiên lượng phẫu thuật

* Siêu âm nội soi:

Siêu âm kết hợp nội soi giúp đánh giá mức độ xâm lấn của ung thư quathành đại trực tràng và đánh giá di căn hạch vùng

* Siêu âm bụng:

Siêu âm bụng có thể phát hiện được khối u một cách gián tiếp qua hìnhảnh thành đại tràng dầy lên Kỹ thuật này còn được chỉ định để phát hiện dicăn của ung thư đến các tạng khác như gan, tuỵ

* Chụp cắt lớp bức xạ positron (PET): Năm 1961, James Robertson

và cộng sự lần đầu tiên sử dụng kỹ thuật PET tại phòng thí nhiệmBrookhaven Hiện nay, PET sử dụng 18F-FDG (2-fluoro-2-deoxy-D-glucose)

được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng để chẩn đoán, xác định giai đoạn bệnh,phát hiện di căn, chẩn đoán tái phát, theo dõi đáp ứng điều trị và lập kế hoạch

xạ trị

* Xét nghiệm các dấu ấn ung thư

- CEA (Carcinoembryonic antigen): kháng nguyên ung thư phôi

CEA là một glycoprotein có liên quan đến sự kết dính tế bào Việc sảnxuất CEA hình thành trong quá trình phát triển của thai nhi, và dừng lại trướckhi trẻ chào đời Xét nghiệm định lượng CEA không được sử dụng độc lập đểchẩn đoán xác định UTĐTT vì nó còn tăng cao trong nhiều bệnh khác mà chỉđược dùng để theo dõi ung thư tái phát hoặc di căn sau khi phẫu thuật loại bỏkhối u

- CA 19-9 (Carbohydrate antigen 19-9)

CA 19-9 là một kháng nguyên ung thư được phát hiện ở người bệnhUTĐTT vào năm 1981 [50] Theo Takada và cộng sự (1993), CA19-9 cònđược tìm thấy trong ung thư tụy, ung thư dạ dày, ung thư bàng quang

* Xét nghiệm tìm máu trong phân (FOBT- Fecal Occult Blood Tests):

Xét nghiệm này nhằm phát hiện hồng cầu trong phân và được sử dụng

để khám sàng lọc UTĐTT Tuy nhiên, xét nghiệm này cũng được sử dụng đểchẩn đoán một số bệnh lý khác của đường tiêu hóa có gây chảy máu

1.1.3.3 Chẩn đoán giai đoạn

Phân độ TNM theo AJCC (2010) :

T3: khối u xâm lấn qua lớp cơ nhưng chưa qua lớp thanh mạc.

T4a: khối u xâm lấn vào các phúc mac tạng

T4b: Khối u xâm lấn hay di căn đến các cơ quan, cấu trúc khác

- Hạch N (Node):

No: không có di căn hạch khu vực

N1: di căn 1-3 hạch khu vực

N1a: di căn một hạch khu vực

N1b: di căn 2-3 hạch bạch huyết khu vực

N1c: Khối u mới xâm lấn lớp dưới thanh mạc, mạc treo, hoặc các môquanh đại trực tràng nhưng chưa có di căn hạch khu vực

N2: di căn 4 hạch khu vực trở lên

N2a: di căn 4 – 6 hạch khu vực

N2b: di căn từ 7 hạch khu vực trở lên

- Di căn M (Metastasis):

Mo: chưa di căn

M1: di căn xa

M1a: di căn chỉ giới hạn ở một cơ quan khác

M1b: di căn nhiều hơn một cơ quan, phúc mạc

Phân giai đoạn bệnh theo AJCC 2010 :

Bảng 1.1 Phân giai đoạn bệnh theo AJCC 2010

* Phân giai đoạn bệnh theo Dukes

Dukes A: khối u còn giới hạn ở lớp niêm mạc hoặc chạm tới lớp cơthành đại tràng

Dukes B: khối u vượt qua lớp niêm mạc vào tới lớp cơ nhưng chưa dicăn hạch

Dukes C: ung thư đã lan đến ít nhất một hạch bạch huyết khu vực.Dukes D:ung thư đã lan đến một cơ quan khác trong cơ thể

1.1.4 Điều trị UTĐTT

1.1.4.1 Lựa chọn biện pháp điều trị UTĐTT

* Giai đoạn 0:

Cắt bỏ polyp ung thư qua nội soi đại trực tràng hoặc phẫu thuật cắt bỏkhu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư.

* Giai đoạn I:

Phẫu thuật cắt bỏ khu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư

* Giai đoạn II:

Phẫu thuật cắt bỏ khu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư, loại bỏhạch khu vực có thể kèm theo hóa trị liệu hoặc điều trị ức chế EGFR

* Giai đoạn III:

Phẫu thuật cắt bỏ khu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư, loại bỏhạch kèm theo hóa trị liệu, xạ trị hoặc điều trị ức chế EGFR

* Giai đoạn IV và ung thư tái phát:

Phẫu thuật cắt đại trực tràng, các cơ quan khác có di căn ung thư kèmtheo hóa trị, xạ trị hoặc thuốc ức chế EGFR

1.1.4.2 Các phương pháp điều trị UTĐTT

* Cắt polyp qua nội soi:

Phương pháp này sử dụng những dụng cụ cắt polyp thông qua máy nộisoi đại trực tràng, nhằm loại bỏ những polyp ung thư hóa được phát hiện sớm,chưa phát triển xâm lấn và không có di căn

* Phẫu thuật:

Phẫu thuật cắt bỏ khối u là phương pháp điều trị triệt căn, rất có hiệuquả với những người bệnh UTĐTT phát hiện sớm Phẫu thuật cắt đại tràngcùng với các mạch máu nuôi dưỡng tương ứng, có thể nạo vét hạch kèm theo

Có thể nối hai đầu đại trực tràng ngay hoặc làm hậu môn nhân tạo đại tràng

* Hóa trị:

Là phương pháp sử dụng hóa chất để tiêu diệt các tế bào ung thư Hóachất trị UTĐTT thường được đặt ra sau khi phẫu thuật nếu ung thư đã lan đếncác hạch bạch huyết nhằm mục đích ngăn ngừa tái phát ung thư Tuy nhiên,

hóa chất cũng làm các tế bào lành bị tổn thương nên phương pháp này luôn cónhững tác dụng không mong muốn như giảm miễn dịch, viêm niêm mạc, rụngtóc, suy tủy… Mỗi truyền hóa chất thường chỉ có một lượng nhỏ tế bào ungthư bị tiêu diệt nên điều trị phải lặp lại các liều hóa chất theo chu kỳ để làmnhỏ dần khối u Người bệnh phải điều trị kéo dài, chịu ảnh hưởng rất lớn vềsức khỏe do độc tính của thuốc Các hóa chất thường được sử dụng trongUTĐTT như Fluororyrimydines và Leucovorin, Oxaliplatin

* Xạ trị:

Xạ trị là phương pháp sử dụng năng lượng phóng xạ ion hoá để diệt tếbào ung thư và làm teo nhỏ khối u Tia xạ làm tổn thương và hủy hoại các tếbào ung thư bằng cách làm tổn thương vật chất di truyền của chúng, khiếnchúng không thể phát triển và phân chia Mặc dù xạ trị làm tổn thương cả tếbào ung thư và tế bào lành, hầu hết các tế bào lành có thể hồi phục và hoạtđộng bình thường Vai trò của xạ trị trong điều trị UTTT rất quan trọng vì nógiúp giảm tỷ lệ tái phát và tăng tỷ lệ sống còn Xạ trị giúp kiểm soát khối uđối với những người bệnh không thể thực hiện phẫu thuật hoặc khối ung thưtiến triển gây ra các biến chứng Xạ trị có thể tiến hành từ bên ngoài hay bêntrong cơ thể

* Liệu pháp ức chế EGFR:

Trong những năm gần đây, thành công của chuyên ngành sinh học phân

tử đối với bệnh ung thư đã mở ra những phương pháp điều trị mang lại nhiều

hy vọng cho người bệnh ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng

Sự phát hiện ra thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR và các conđường tín hiệu tế bào liên quan với EGFR đã giúp cho các nhà khoa học làmsáng tỏ các cơ chế phát sinh và phát triển của một số loại tế bào ung thư, từ đóthúc đẩy quá trình tìm ra các loại thuốc chống ung thư mới Cetuximab(Erbitux) và Panitumumab (Vectibix) đã được Cơ quan quản lý dược phẩm và

thực phẩm Mỹ (FDA) chấp nhận để điều trị cho người bệnh UTĐTT vào năm

2009 [51]

1.1.5 Tiên lượng bệnh [49]

Tại châu Âu tỷ lệ sống sót sau năm năm đối với UTĐTT là ít hơn 60%

Ở các nước phát triển, khoảng 1/3 số người mắc UTĐTT tử vong vì bệnh.Tỷ

lệ sống sót đối với UTĐTT được phát hiện ở giai đoạn sớm cao gấp năm lần

so với UTĐTT được phát hiện ở giai đoạn muộn Theo thống kê của Hiệp hộiUng thư Mỹ năm 2006, hơn 20% số người mắc UTĐTT đến can thiệp y tế khibệnh đã ở giai đoạn IV, và hơn khoảng 25% trong nhóm này đã có di căn gan

Tỷ lệ sống từ 1 năm cho đến 5 năm tùy thuộc vào giai đoạn phát hiệnbệnh Những người có khối u ở giai đoạn Tis, N0 , M0 có tỷ lệ sống sót saunăm năm là 100%, trong khi những người có ung thư xâm lấn giai đoạn T1(bên trong lớp dưới niêm mạc) và T2 ( trong lớp cơ) có tỷ lệ sống sót sau nămnăm trung bình là 90% Những người có ung thư xâm lấn hơn nhưng chưa cóhạch T3-4, N0, M0 thì tỷ lệ sống sót trung bình sau 5 năm là xấp xỉ 70%.Những bệnh nhân đã có hạch, N1-3, M0 tỷ lệ sống sau 5 năm trung bình là40%, trong khi những người đã có di căn xa M1 thì tỷ lệ này chỉ khoảng 5%

1.2 Vai trò của gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng

1.2.1 Con đường tín hiệu nội bào liên quan đến protein RAS/RAF

Ở các tế bào có nguồn gốc biểu mô, trong đó có tế bào biểu mô đại trựctràng, quá trình tăng sinh, tăng trưởng bình thường của tế bào được kiểm soátchặt chẽ bởi con đường tín hiệu tysokine kinase nội bào mà khởi nguồn từphân tử EGFR trên màng tế bào Yếu tố phát triển biểu mô EGF (epidermalgrowth factor) có ái lực cao với thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) trên

bề mặt tế bào Yếu tố này có khả năng kích hoạt hoạt tính tyrosine kinase nộibào của thụ thể Tiếp theo các tyrosine kinase sẽ khởi động dòng thác tín hiệu

để tác động lên nhiều quá trình hóa sinh trong tế bào như: tăng nồng độ Ca+

nội bào, tăng cường quá trình đường phân và sinh tổng hợp protein, tăngcường quá trình biểu hiện một số gen kể cả gen mã hóa EGFR, thúc đẩy quátrình tái bản DNA và quá trình phân chia tế bào

EGFR khi được hoạt hóa sẽ kích hoạt hai trục tín hiệu là trục PI3K/AKT

và trục RAS/RAF/MEK/ERK , tạo ra hàng loạt các tín hiệu đến nhân tế bào,giúp tế bào phân chia, tăng trưởng, biệt hóa, chết theo chương trình, tăng sinhmạch Đặc biệt, con đương RAS/MAPK liên quan đến sự phát triển và phânchia, biệt hóa của tế bào, và đặc biệt là sự chết theo chu trình của tế bào(apoptosis) Tín hiệu hóa học theo con đường này rất cần thiết cho sự pháttriển bình thường của tế bào… Tuy nhiên, khi các con đường tín hiệu này bịkích hoạt liên tục từ EGFR không phụ thuộc phối tử hoặc từ một phân tửtruyền tin hạ nguồn không phụ thuộc EGFR thì tế bào sẽ chuyển dạng ác tính Các gen KRAS, BRAF, NRAS là những gen có tỷ lệ đột biến cao trongcác bệnh ung thư ở người Gen RAS/RAF mã hóa cho các protein Ras/Rafđóng vai trò truyền tín hiệu nội bào xuôi dòng từ EGFR (Hình 1.3) Cácprotein này có hoạt tính serine/threonine kinase với chức năng truyền tín hiệu

từ các thụ thể bề mặt tế bào tới những mục tiêu nội bào thông qua các dòngthác tín hiệu (bao gồm con đường RAS/RAF) Trong tế bào, protein Ras/Rafđược giữ cân bằng thông qua sự hình thành hai phức hợp tương ứng với cáctrạng thái hoạt động, gồm phức hợp RAS-GTP (protein Ras/Raf hoạt hóa) vàphức hợp RAS-GDP (protein Ras/Raf bất hoạt) Protein Ras/Raf được hoạthóa nhờ yếu tố chuyển nucleotid guanine (guanine nucleotide exchangefactors, GEFs) Việc truyền tín hiệu của protein Ras/Raf bị ức chế khi phứchợp RAS-GTP bị thủy phân thành phức hợp RAS-GDP nhờ một loại protein

có chức năng hoạt hóa GTPase (GAPs) Ở điều kiện sinh lý, nồng độ GTP trong cơ thể được kiểm soát chặt chẽ nhờ sự hoạt động nhịp nhàng củahai yếu tố GEFs và GAPs [51],[52],[54]

RAS-Hình 1.3 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 1.2.2 Các loại đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng

Gen KRAS có tên chính thức là “Kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog” Gen KRAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 12, nằm tại

vị trí 12.1, mã hóa cho protein K-ras Cụ thể hơn, gen KRAS nằm từ đôi base25,205,245 đến đôi base 25,250,922, gồm có 6 exon

Hình 1.4 Vị trí gen KRAS trên NST số 12

Gen BRAF có tên chính thức là “B-raf proto-oncogene, serine/threoninekinase” Gen BRAF nằm trên nhánh dài của NST số 7, ở vị trí 34, mã hóa choprotein B-raf Cụ thể hơn gen BRAF nằm từ đôi base 140,719,333 đến đôibase 140,924,763, gồm có 22 exon

Hình 1.5 Vị trí gen BRAF trên NST số 7

Gen NRAS nằm trêm nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1 ở vị trí 13.2 mãhóa cho protein N-ras Cụ thể hơn gen NRAS nằm từ đôi base 114,704,463 đếnđôi base 114,716,893 trên nhiễm sắc thể số 1, gồm có 7 exon

Hình 1.6 Vị trí gen NRAS trên NST số 1

Gen KRAS, NRAS bị đột biến sẽ mã hóa những protein Ras mới cókhả năng chống lại hoạt tính GTPase của GAPs Do đó, những protein Ras độtbiến này luôn luôn tồn tại ở trạng thái hoạt hóa RAS-GTP Không giống nhưcác protein Ras lành tính luôn bị bất hoạt sau một khoảng thời gian rất ngắn.Gen BRAF bị đột biến sẽ hoạt hóa tính năng serin/threonine kinase lafmd tăngcường tín hiệu được truyền đến MAPK Các protein Ras/Raf đột biến có khảnăng kích hoạt vĩnh viễn các con đường truyền tín hiệu nằm xuôi dòng nó (conđường MEK-ERK và con đường PI3K/AKT) bất kể có sự hoạt hóa của thụ thểEGFR hay không [53] Đây chính là cơ sở ở mức độ phân tử giải thích việc cácliệu pháp ức chế EGFR trở nên vô tác dụng một khi gen RAS/RAF bị đột biến,bởi lúc này protein Ras/Raf không còn bị phụ thuộc vào sự hoạt hóa từ EGFR[55],[56]

Đột biến vĩnh viễn kích hoạt các protein Ras/Raf được tìm thấy trong xấp

xỉ 25% các khối u của người, và lên đến 90% trong các bệnh ung thư nhất định

Hình 1.7 Tỷ lệ các dạng đột biến KRAS, NRAS, BRAF

trong UTĐTT theo nghiên cứu của Douliard và cs (năm 2013) [50]

NT (Not tested): Vùng không được xác định đột biến

Theo thống kê, tỷ lệ đột biến gen KRAS gặp ở khoảng 37% - 40% cáctrường hợp ung thư đại tràng Cho đến nay có hơn 3000 đột biến điểm gen đãđược báo cáo, trong đó đột biến hay gặp nhất là đột biến thay thế nucleotid ởcodon 12 (chiếm 82%) và codon 13 (chiếm 17%) ở exon 2 trên gen KRAS ,[50] Đột biến tại codon 12 và 13 đã được chứng minh đóng một vai trò quantrọng trong quá trình tiến triển ung thư và nguy cơ kháng thuốc ức chế EGFRcủa khối u Đột biến tại các vị trí khác như tại codon 61 và 146 cũng đã đượcbáo cáo nhưng thường chiếm tỷ lệ nhỏ và ảnh hưởng của những dạng đột biếnnày trên lâm sàng chưa được làm sáng tỏ Các dạng đột biến gen KRAS là:c.34G>T(G12C), c.34G>C(G12R), c.34G>A(G12S), c.35G>C(G12A),c.35G>T(G12V), c.37G>T(G13C), c.37G>C(G13R), c.37G>A(G13S),c.38G>C(G13A), c.38G>A(G13D), c.38G>T(G13V), c.181C>A(Q61K),c.182A>T(Q61L), c.182A>G(Q61R), c.183A>C(Q61H), c.183A>T(Q61H),c.351A>C(K117N), c.351A>T(K117N), c.436G>C(A146P), c.436G>A(A146T),c.437C>T(A146V)…

Đối với gen BRAF có hơn 30 loại đột biến khác nhau được mô tả Khoảng 8% 15% đột biến gen BRAF được phát hiện trên những người bệnh UTĐTT Phần lớn độtbiến xảy ra trên exon 15, codon 600 (V600E) chuyển axit amin Glucin thành Valin nằmtrên exon 15 với tỷ lệ hơn 90% Đột biến này gia tăng hoạt tính kinase đến MEK thúcđẩy phân chia tế bào và tăng khả năng kháng thuốc ức chế EGFR của tế bào ung thư.Một số dạng đột biến được tìm thấy như: c.1397G>T(G466V), c.1406G>C(G469A),c.1406G>A(G469E), c.1406G>T(G469V), c.1781A>G(D594G), c.1781A>T(D594V),c.1786G>C(G596R), c.1799T>A(V600E)… , [50].

-Theo nghiên cứu của Chan E và cộng sự, tần suất đột biến genNRAS trong bệnh UTĐTT chiếm 1-6% Đột biến tại exon 2 (codon 12, 13)

và exon 3 (codon 61) đã được chứng minh đóng một vai trò quan trọngtrong quá trình tiến triển ung thư và nguy cơ kháng thuốc ức chế EGFR củakhối u Một số dạng đột biến NRAS được tìm thấy như: c.34G>T(G12C),c.34G>A(G12S), c.35G>C(G12A), c35G>A(G12D), c.35G>T(G12V),c.182A>G(Q61R)… ,[50]

1.2.3 Vai trò của đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong liệu pháp điều trị trúng đích bệnh UTĐTT

Đột biến KRAS được cho là gây nên tình trạng đề kháng với cetuximab

ở bệnh nhân UTĐTT Lievre và cộng sự là nhóm nghiên cứu đầu tiên đã báocáo mối quan hệ giữa đột biến gen KRAS và sự đề kháng của khối u với cácthuốc ức chế EGFR [46] Kết quả này được củng cố bằng nghiên cứu củaBenvenuti và cộng sự khi các tác giả tiến hành chuyển nhiễm gen KRAS độtbiến (G12V) vào dòng tế bào UTĐTT kiểu dại DiFi và nhận thấy toàn bộ tếbào xuất hiện tính kháng với cetuximab (kháng thể đơn dòng kháng EGFR)[47] Năm 1985, Drebin và cộng sự lần đầu tiên đã dùng kháng thể đơn dòngmAbs p185her2/neu làm phong tỏa EGFR làm ức chế quá trình phân bào của tếbào khối u trong môi trường thạch mềm Nghiên cứu này đã đặt nền móng

cho những nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng phong tỏa EGFR để điềutrị ung thư [46] Tháng 7 năm 2009, cơ quan quản lý dược phẩm và thựcphẩm của Mỹ đã chấp nhận 02 loại thuốc điều trị ung thư có bản chất là khángthể đơn dòng nhằm mục tiêu EGFR là cetuximab (Erbitux) và panitumumab(Vertibix) chỉ định để điều trị UTĐTT di căn [18],[47] Trên lâm sàng, liệupháp trúng đích EGFR đã mang lại những hy vọng mới cho người bệnhUTĐTT khi mà những phương pháp điều trị trước đó còn nhiều hạn chế Tuynhiên, với giá thành rất cao của các thuốc ức chế EGFR trên thị trường hiệnnay là một trở ngại rất lớn đối với cả thầy thuốc và người bệnh Việc chỉ địnhđiều trị các thuốc ức chế EGFR cho người bệnh UTĐTT khi không được kiểmtra các gen thuộc họ RAS/RAF đã gây lãng phí rất lớn về tài chính, thời gian vàảnh hưởng đến sức khỏe cũng như tinh thần của người bệnh Chính vì vậy, việcxét nghiệm đánh giá tình trạng gen RAS/RAF cần được thực hiện trước khi cóchỉ định điều trị bằng thuốc ức chế EGFR cho người bệnh nhân UTĐTT.

Cho đến nay, nhiều nỗ lực nhằm xác định các chất ức chế RAS/RAFđặc hiệu, có hiệu quả điều trị khối UTĐTT mang đột biến họ gen RAS/RAFđều chưa thành công Các dược chất đang được thử nghiệm bao gồm các chất

ức chế enzym farnesyltransferase và ức chế RNA Mục tiêu của LPĐTTĐ đốivới bệnh nhân UTĐTT có đột biến RAS/RAF là ức chế các phân tử kích hoạt

hạ nguồn từ RAS/RAF hoạt hóa Hướng nghiên cứu này rất có triển vọng đốivới các bệnh nhân UTĐTT mang đột biến RAS/RAF khi một nghiên cứu thựcnghiệm trên chuột bị u phổi có đột biến KRAS (+) cho thấy: kích thước khối

u đã giảm đáng kể khi được cho sử dụng kết hợp các chất ức chế MEK vàPI3K dạng phân tử nhỏ như selumetinib và trametinib [48]

Hình 1.8 Vai trò của đột biến gen RAS trong việc hoạt hóa gây ung thư các

con đường truyền tín hiệu nội bào

1.3 Các kỹ thuật xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS

1.3.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) được phát minh vào năm

1985 và nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu Y-sinh học vìnhờ kỹ thuật PCR, quá trình nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm

mà không cần nhờ đến các tế bào chủ như vi khuẩn hay nấm men

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồitính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNApolymerase

Kỹ thuật PCR thực hiện qua nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Chuỗi xoắn kép DNA

khuôn bị biến tính bởi nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy của phântử), thường là 94 – 95oC trong vòng 30 – 60s, DNA tách khỏi nhau thành 2chuỗi đơn

Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing) nhiệt độ được hạ thấp cho phép

các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 – 70oC và kéo dài khoảng

30 – 60s

Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (exteision) Nhiệt độ lại được nâng lên đến

nhiệt độ tối ưu của enzym DNA polymerase, xúc tác cho quá trình kéo dài

Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhạy, từ một lượng DNA rất ítban đầu, với cặp mồi tương ứng, đặc hiệu, sau khi áp dụng phương pháp PCR sẽ

có một lượng lớn DNA đủ dùng cho những chẩn đoán, nghiên cứu

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuônDNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau khi kết thúc phản ứng

sẽ có đủ số lượng DNA để có thể tách ra khi điện di và có thể phát hiện đượcsau khi nhuộm và có thể tạo dòng hoặc giải trình tự Trong quá trình thực hiệnphản ứng PCR, ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng nhưng lượng mồi vàdNTP tự do giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cầntính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kếtquả tốt nhất

1.3.2 Phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắpxếp của các nucleotid trong phân tử DNA Hiện nay, người ta thường sử dụnghai phương pháp giải trình tự đó là phương pháp dideoxynucleotid và giảitrình tự bằng máy tự động

Giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid

Phương pháp này do F Sanger, Smith và Coulson phát hiện ra năm

1977 Nguyên lý của phương pháp này như sau: Dideoxynucleotid (ddNTP)

là một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tử deoxynucleotid(dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là nhómhydroxyl (-OH) mà là –H (hình 1.9)

Hình 1.9 Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP

Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắnvào chuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’ phosphat với nhóm3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi Tuy nhiên, nếu một ddNTPđược gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng lại

do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotid tiếp theo(hình 1.10)

Hình 1.10 Minh họa phương pháp giải trình tự gen

Quy trình giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid gồm các bước:

- Thực hiện 4 phản ứng tổng hợp DNA trong 4 ống nghiệm, mỗi ốngđược cung cấp thêm DNA polymerase, 4 loại dNTP tự do và một trong bốndideoxynucleic (một trong bốn loại ddNTP này được đánh dấu phóng xạ).Nồng độ của mỗi ddNTP thường chỉ một lượng nhỏ, khoảng 1% Trong quátrình tổng hợp chuỗi, enzym DNA polymerase sẽ gắn các dNTP vào để kéodài chuỗi Do hàm lượng rất thấp nên thỉnh thoảng mới có 1dideoxynucleotidđược gắn vào chuỗi và lúc đó phản ứng tổng hợp chuỗi bị dừng lại Nhưvậy trong mỗi ống phản ứng chứa các mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau,

và ở đầu 3’ của các đoạn DNA chứa một ddNTP tương ứng đã cho vào ống đó(hình 1.11)

- Tiến hành điện di 4 ống phản ứng trên 4 hàng của một bản gel để phântách các đoạn DNA

- Do một trong 4 ddNTP có đánh dấu phóng xạ nên khi dùng kỹ thuậtphóng xạ tự ghi, các mạch đơn trên sẽ tạo các vạch sáng trên phim X quang

- Tổng hợp kết quả ở cả 4 ống, thu được các mạch đơn có kích thướchơn kém nhau 1 nucleotid Đoạn DNA ngắn nhất sẽ di chuyển xa nhất Trên ví

dụ ở hình 1.11, đoạn ngắn nhất xuất hiện ở ống chứa ddATP, như vậynucleotid đầu tiên được tổng hợp ở chuỗi bổ sung là Adenin Đoạn DNA ngắnthứ 2 xuất hiện ở ống chứa ddCTP, như vậy nucleotid thứ 2 của mạch DNA bổsung là Cytosin Phân tích tương tự, chúng ta sẽ biết được trình tự đoạn mạchđơn mới được tổng hợp và xác định được trình tự của mạch DNA khuôn

Hình 1.11 Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP

Giải trình tự bằng máy tự động

Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc

sử dụng ddNTP do F Sanger và cộng sự phát minh Với các máy thế hệ mớisau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loạiddNTP Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ốngnghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhaunhư trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản Mỗi khi có mộtvạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát

ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển

về máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được lànucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích

Hình 1.12 Giải trình tự bằng máy tự động 1.3.3 Kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Phát hiện đột biến gen bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên nguyên tắccủa kỹ thuật PCR cổ điển, kết hợp với enzym cắt giới hạn Sau khi đượckhuếch đại, codon đột biến của gen cần phân tích sẽ được xử lý với enzym cắtgiới hạn Do trình tự các nucleotide kiểu dại trên codon cần phân tích có vị trínhận biết của enzym cắt, đột biến tại codon đó sẽ làm mất vị trí cắt củaenzym, sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzym cắt giới hạn và được nhận diệnkhi điện di trên gel agarose

Đây là phương pháp truyền thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả

và cho độ tin cậy cao trong trường hợp xác định đột biến điển hình

Hình 1.13 Các bước tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP [43]

1.3.4 Kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions-Amplification Refractory Mutation System)

Scorpion ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen độtbiến (ARMS) và công nghệ Scorpion trong phản ứng real-time PCR để pháthiện các đột biến Trong đó, nguyên lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alenđột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase chỉ khếch đại hoànchỉnh một phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung hoàntoàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn phản ứngPCR bị ức chế hoàn toàn Dựa trên nguyên lý này, kỹ thuật cho phép khuếchđại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đóchiếm một tỉ lệ rất nhỏ (1%) trong tổng số sợi khuôn DNA

Scorpions là phân tử có cấu tạo một đầu mang trình tự của đoạn mồiđặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với mộtđầu dò Phần kích thích phát tín hiệu huỳnh quang (Fluorophore) của đầu dòđược gắn với phần ức chế (Quencher) có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh

quang của phần kích thích Trong phản ứng PCR, khi đầu dò bám với đoạntrình tự khuếch đại, phần kích thích được giải phóng khỏi phần ức chế, pháttín hiệu đến cảm biến của máy Realtime-PCR.

Hiện nay, kỹ thuật Scorpion ARMS đã được ứng dụng để xác định độtbiến gen KRAS, BRAF, tuy có độ nhạy tốt nhưng kỹ thuật Scorpion ARMSđòi hỏi thiết kế đoạn mồi và đoạn dò phức tạp, đồng thời chỉ tập trung xácđịnh những đột biến gen đã được công bố, không khảo sát được toàn bộ độtbiến đã biết lẫn đột biến mới như kỹ thuật giải trình tự gen và giá thành xétnghiệm khá đắt