quy trình phân tích VSV theo phương pháp hiện đại

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI GVHD: Mai Thị Kim Phượng Nhóm: 3 – K2DCNTP Trần Thị Xuân Thư Hoàng Thị Thúy... Phương pháp phát quang sinh học Phương pháp ELISA

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

THEO PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI

GVHD: Mai Thị Kim Phượng Nhóm: 3 – K2DCNTP Trần Thị Xuân Thư Hoàng Thị Thúy

Phương pháp phát quang sinh

học

Phương pháp ELISA

Phương pháp lai phân tử

Phương pháp PRC Phương pháp dùng

- Được ứng dụng trong 3 lĩnh vực :

+ Giám sát vệ sinh

+ Kiểm tra các loại chất lỏng

+ Đánh giá chất lượng

- Phương pháp này dựa trên nguyên tắc quang sinh học ở đom đóm dưới xúc tác enzym.

- ATP hiện diện ở tất cả các tế bào sinh vật

sống, là dấu hiệu nhận biết vật chất đang tồn tại.

- ATP của tế bào được tích chiết ra khỏi tế bào

và được định hướng dựa vào cường độ ánh

sáng.

I Phương pháp phát quang

sinh học ATP

- Dựa trên nguyên tắc là phản ứng kết hợp giữa 1 tế bào với 1 kháng thể đặc hiệu Chúng có thể nhận biết thông qua sự

ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên hoặc những kháng thể đã được đánh dấu

- Nguyên tắc cơ bản là : Kháng nguyên đã hòa tan trong dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic Quá trình này có thể trực tiếp hoặc thông qua một kháng thể Khi

huyết thanh được tiêm vào, các kháng thể có thể kết hợp với kháng nguyên ở pha được

II Phương pháp ELISA

- Xét nghiệm ELiSA được thực hiện trong đĩa plastic 8cm x 12cm, chứa 8 x 12 miếng Mỗi miếng cao 1cm, đường kính 0,7 cm

Hình 1.2: Đĩa plastic sử dụng để tiến hành thí nghiệm

- Kháng thể được gắn với enzym bằng liên kết đồng hóa trị

 Độ màu tạo thành tỉ lệ với enzym bám ở giếng plastic, suy

ra lượng kháng thể tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên

 Tính nhạy là do sự khuyech đại bởi hoạt tính enzym

Hình 4: Quy trình thực hiện ELISA

- Còn được gọi là mẫu dò

- Dùng để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật

- Cơ sở :

+ Là quá trình lai phân tử, bao gồm sự tách rời 2 mạch đôi của chuỗi kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy + Hai mạch DNA bổ sung được cố định trên 1 giải thể rắn hoặc mềm trên tế bào hay mô

- Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố :

nồng độ, nhiệt độ, thời gian , kích thước

III Phương pháp lai phân tử

( Hybridizatim )

- Là phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là 1 trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao

thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym

- Phương pháp này tổng hợp rất nhanh và chính xác dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA

4.1 Các thành phần chủ yếu

+ DNA mẫu

+Mồi là đoạn DNA cần thiết, là yếu tố qan trọng của PCR

+ Enzym polymerasa chịu nhiệt

+ Các loại nuclêôtit

+ Nước

+ Dung dịch đậm

+ Ion Mg ^2+

IV Phương pháp PCR

( Polymerase Chain Reactim )

4.2 Ba giai đoạn trong một chu kì

+ Giai đoạn biến tính: mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao, tất cả các liên kết hydro bị bẻ gãy tạo thành DNA sợi đơn

+ Giai đoạn lai

+ Giai đoạn kéo dài

Hình 6: Ba giai đoạn phản ứng PRC

Hình 7:Đồ thị mối quan hệ thời gian và

nhiệt độ

Hình 8: Phản ứng PCR với

lượng sản phẩm

Hình 9: Mô hình máy PRC

- Petrifilm là màng quét lên 1 lớp chất dinh dưỡng và tác nhân tạo gel

 Chất màu trôi trên đĩa khiến khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường

 Kỹ thuật này được dùng trong các ứng dụng kiểm tra tổng

vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc,…

- Ưu điểm: là dễ thao tác, tiết kiệm thời gian ủ và bảo quản

V Phương pháp dùng PETRIFILM